Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль белков теплового шока HSP70 и оксида азота в защитных эффектах адаптации к теплу

На правах рукописи

Г5Г5 ОД

2 9 :::сл ¡о

БАЙДА ЛЮДМИЛА АНАТОЛЬЕВНА

РОЛЬ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА НЗР70 И ОКСИДА АЗОТА В ЗАЩИТНЫХ ЭФФЕКТАХ АДАПТАЦИИ К ТЕПЛУ

14.00.16- патологическая физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена в лаборатории стресса и адаптации Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН и в лаборатории клеточной и молекулярной биологии Утрехтского Университета (Утрехт, Голландия)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор И.Ю. Малышев доктор биологических наук Е.Б. Манухина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Глебов доктор медицинских наук, профессор В.Г. Пинелис

Ведущее учреждение: Государственный Университет Дружбы

Народов

Автореферат разосланмая 2002 года

Защита диссертации состоится « 20 » июня 2002 года в 13°° на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва, Балтийская улица, дом 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская

/>% ЪО А п

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Длительная и интенсивная гипертермия вызывает тепловой шок, который фактеризуется острой гипотензией, почечной недостаточностью, поражением ;чени, повышением уровня ферментов в плазме крови и нарушением процесса ¡ёртывания крови (Semenza, 1999; Diehl et al., 2000; Berger et al., 2000; Hall et ., 2001). Для теплового шока характерна гиперпродукция оксида азота (NO), угорый является наиболее мощным из всех эндогенных вазодилататоров /Ганухина и др., 1996а; Malyshev et al., 1995; Alzeer et al., 1999). яперпродукция NO при теплом шоке приводит к глубокому падению АД, зторое может стать необратимым (Манухина и др., 1996в; Hall et al., 2001). щиту от теплового шока может обеспечивать небольшое предварительное эвышение уровня NO в организме, вызванное стимулированием синтеза NO 7И введением доноров NO (Манухина и др., 1997). Механизм такой защиты сончательно не установлен. Предполагается, что он связан либо с NO-висимым ограничением избыточной активности NOS по принципу грицательной обратной связи, либо с NO-зависимой индукцией синтеза щогенных протекторных факторов, например белков теплового шока Малышев, Манухина, 1998).

Не вызывает сомнения, что для предупреждения тепловых повреждений и «ранения работоспособности в условиях высокой температуры, необходима юфилактика путем повышения теплоустойчивости самого организма за счет эстепенной индивидуальной адаптации. Такой подход возможен лишь при шичии ясных представлений о механизмах адаптации к высокой температуре.

Молекулярные механизмы формирования адаптации, клеточной защиты и ^становления после повреждения в значительной степени зависят от наличия клетке протекторных белков теплового шока (HSPs). Среди HSPs наибольшее шмание привлекают белки семейства HSP70 вследствие высокой юыщенности ими тканей. Участие HSP70 в акклиматизации к теплу и гособность обеспечивать термотолерантность хорошо известна. Главные 1утриклеточные механизмы защитного действия HSP70 от повреждений, ■гзванных тепловым шоком, состоят в участии HSP70 в дезагрегации юмальных белковых комплексов, участии в утилизации и репарации )врежденных белков, в регуляции синтеза белка de novo (Benjamin, McMillan, '98; Schoffl et al., 1998; Sharp et al., 1999), a также способности ограничивать перпродукцию оксида азота (Heneka et al., 2000; Bhora et al., 2000) и юапоптотические механизмы (Beere, Green, 2001).

Одним из факторов, играющих важную роль в активации экспрессии генов р70 является NO. Многочисленные данные о сочетанной и взаимозависимой тивации синтеза NO и HSP70 позволили выдвинуть и обосновать гипотезу о м, что NO и HSP70 образуют единую эндогенную протекторную систему 1алышев, Манухина, 1998). Показано, что при адаптации организма к таким нсторам среды, как гипоксия, стресс и физическая нагрузка, синтез HSP70

активируется под влиянием N0 (Аймашева и др., 1998; Зенина и др., 1998 Смирин и др., 2000). Однако роль системы МО/ШР70 при адаптации к тепл; клетки и организма в целом не изучена, поскольку в настоящее врем отсутствуют данные о продукции N0 при этом виде адаптации. Кроме тоге несмотря на большое количество исследований по акклиматизации целоп организма, создать адекватную клеточную модель адаптации к теплу пока н удавалось, и это затрудняет изучение механизмов адаптации и возможност] направленного влияния на этот процесс (Мозе1еу, 1997).

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования состояла в изучении роли МО-зависимы: механизмов индукции НБР70 в формировании адаптации к теплу ] адаптационной защиты на уровне целого организма и изолированных клеток.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Оценить и сопоставить роль N0 в регуляции синтеза НБР70 при адаптаци организма и клеток к теплу.

2. Разработать модель дозированной адаптации животных к теплу и использованием этой модели оценить возможность адаптационной защит! организма от гиперпродукции N0, острой гипотензии и повреждений клетот вызванных тепловым шоком.

3. Изучить влияние адаптации животных к теплу на синтез N0 и БКР70 различных органах.

4. Изучить влияние ингибитора синтеза НБР70, ингибитора >Ю-синтазы донора N0 на антигипотензивный эффект адаптации к теплу и адаптивно накопление ШР70.

5. Разработать модель дозированной адаптации к теплу культур кардиомиоцитов и изучить возможность адаптационной защиты о повреждений, вызванных тепловым шоком

6. Изучить внутриклеточные механизмы гиперпродукции N0 при теплово шоке.

7. Изучить влияние ингибитора КО-синтазы и донора N0 на синтез НБР70 пр адаптации клеток к теплу и при тепловом шоке.

Научная новизна исследования определяется следующими основным результатами.

Впервые показано, что дозированная адаптация крыс к теплу эффективн ограничивает гиперпродукцию N0, острую гипотензию и смертност животных при тепловом шоке. Защитный эффект адаптации проявлялся такж в ограничении массивной индукции в тканях стресс-белков Н8Р70, котора является маркером повреждения клеток.

Обнаружено, что формирование защитного эффекта адаптации к тепл сопровождается умеренным стимулированием синтеза N0 и ЩР7 Накопление НБР70 происходит с одинаковой динамикой во все исследованных органах - печени, сердце, аорте и мозге, что позволя!

редположить сходный механизм регуляции этого процесса. Ингибирование интеза ШР70 отменяло антигипотензивный эффект адаптации. Тем-самым ыло доказано, НБР70 является одним из факторов адаптационного граничения гиперпродукции N0

Впервые продемонстрировано, что N0 вовлечен в синтез Н5Р70 и юрмирование защитных эффектов при адаптации к теплу. Это подтверждается ем, что курсовое введение донора N0 той же продолжительности, что и даптация к теплу, воспроизводило антигипотензивный защитный эффект даптации, вызывало накопление Н8Р70 и ограничивало ответ ШР70 на епловой шок. Ингибирование синтеза N0 отменяло адаптивное накопление 1БР70 и антигипотензивный эффект адаптации.

Впервые разработана модель дозированной адаптации к теплу культуры ардиомиоцитов. Адаптация клеток, проводимая с использованием этой [одели обеспечивала защиту клеток от повреждающего действия теплового юка, но не сопровождалась накоплением Н8Р70. Защитный эффект адаптации роявлялся в ограничении падения общего синтеза белка и уровня АТФ и [ассивного накопления Н8Р70, которые являются прямыми маркерами овреждения клеток.

Впервые доказано, что N0 вносит вклад в формирование защитного ффекта адаптации клеток к теплу за счет активации механизмов, не связанных накоплением Н8Р70. Это подтверждается тем, что ингибитор 1\т0-синтазы тменял эффект адаптивного ограничения индукции Н8Р70, вызванной епловым шоком. В то же время донор N0 сам по себе не индуцировал Н8Р70, о при трехкратном введении воспроизводил защитный эффект адаптации к еплу, который проявлялся в ограничении индукции ШР70 в ответ на тепловой юк.

Полученные данные позволили впервые сопоставить роль N0 в регуляции интеза Н8Р70 при адаптации к теплу на уровне целого организма и на нутриклеточном уровне. Доказано, что N0 вносит существенный вклад в юрмирование защитных эффектов адаптации на разных уровнях регуляции, [ринципиальное различие состоит в том, что роль N0 в адаптации организма вязана с активацией защитных Н8Р70, тогда как при адаптации клеток N0-ависимое накопление Н8Р70 отсутствует и ЫО-зависимые защитные эффекты еализуются через другие механизмы. Очевидно, накопление ШР70 редставляет собой лишь один из адаптивных механизмов, триггером которых лужит N0. С другой стороны, синтез Н8Р70 при адаптации к теплу может ыть индуцирован и другими факторами, помимо N0, которые отсутствуют в золированных клетках.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней впервые азработана модель адаптации к теплу клеточной культуры, доказана важная оль эндогенных протекторных факторов N0 и ШР70 в формировании даптации к теплу и адаптационной защиты от теплового шока и сопоставлены

>Ю-зависимые механизмы адаптивного синтеза ШР70 на уровн изолированных клеток и целого организма..

Практическое значение работы состоит в том, что в не продемонстрирована возможность направленного влияния на формировани адаптации к теплу с помощью фармакологических модуляторов синтеза N0 : НБР70.

Положения, выносимые на защиту;

1. Адаптация организма к теплу эффективно защищает организм о гиперпродукции N0 и связанной с ней острой гипотензии при теплово шоке.

2. Защитный эффект адаптации к теплу на уровне организма опосредован N0 зависимой индукцией синтеза ШР70.

3. Адаптация к теплу изолированных клеток защищает клетки от повреждени? вызванных тепловым шоком.

4. N0 играет важную роль в защитном эффекте адаптации к тепл изолированных клеток, но, в отличие от целого организма, механиз действия N0 не опосредован индукцией синтеза Н8Р70.

Апробация работы. Основные результаты проведенных исследовани были доложены на VI Международной встрече по биологии оксида азот (Стокгольм, Швеция, 1999), XVIII Съезде Физиологического общества имен И.П. Павлова (Казань, Россия, 2001), Национальной научно-практическо конференция с международным участием «Свободные радикаль антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, Россия, 200 Г межлабораторном семинаре Отдела молекулярной и клеточной биологи Утрехтского университета (Утрехт, Голландия, 2001), VI Всемирном Конгресс Международного общества по адаптационной медицине (Лион, Франци 2001), XVII Всемирном Конгрессе Международного общества по изученш сердца (Виннипег, Канада, 2001). Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из введения, обзор литературы, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводо Список литературы содержит 184 источника. Диссертация иллюстрирована таблицами и 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на 374 крысах-самцах линии Виста массой 230-250 г. и культуре кардиомибластов Н9с2 (АТСС СЯЬ 1446). Эксперименты на животных

Тепловой шок воспроизводили путем прогревания бодрствующи животных в термостате в течение 20 минут при ректальной температуре 41,5 0,5°С. Выживаемость животных после теплового шока оценивали в течение 2

[асов. Через 1 час после теплового шока животным измеряли АД непрямым »ескровным методом на хвостовой артерии с помощью установки Physiograph DMP-4F (Narco Bio-Systems, США).

Адаптацию животных к теплу проводили в течение 6 дней. В 1-й день рыс помещали в термостат на 5 минут, во второй день - 7 минут и далее с ретьего по шестой ежедневно по 10 минут прогрева, при этом ректальная •емпература составляла 40,0+0,5°С. Все сеансы адаптации проводили утром. Эффективность адаптации оценивали через 1час (по изменению АД) и 24 часа юсле последнего термического сеанса по изменению устойчивости к -епловому шоку и по содержанию HSP70 в органах крыс.

В качестве блокатора синтеза HSP70 использовали ингибитор ранскрипции гена hsp кверцетин, который вводили внутрибрюшинно в дозе 5 лг/кг ежедневно в течение 6 дней за 30 минут до каждого сеанса теплового юздействия в ходе адаптации (Зенина и др., 1998)

В качестве донора NO использовали динитрозильный комплекс железа ДНКЖ), который вводили в дозе 200 мкг/кг в хвостовую вену ежедневно в 'ечение 6 дней. (Malyshev et al., 1996)

В качестве ингибитора NO-синтазы использовали №-нитро-Ь-аргинина L-NNA, Sigma, США). L-NNA вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг за 1 iac до теплового шока или перед каждым адаптирующим воздействием в ходе сурса адаптации (Malyshev et al., 1996)

Тканевую продукцию NO в печени, мозге и миокарде методом шектронного парамагнитного резонанса (ЭПР) по включению N0 в тарамагнитный комплекс с "ловушкой" NO - Fe 2+-диэтилдитиокарбаматом Vanin et al., 1984).

Продукция NO в организме оценивалась спектрофотометрически по ¡уммарному содержанию в плазме метаболитов N0 - нитритов и нитратов, при 1линс волны 540 нм (Moshage et al., 1995). Концентрацию нитритов шределяли по калибровочной кривой (5-50 мкМ NaN02).

Эксперименты на культуре клеток

Тепловой шок проводили при 43.5°С в течение 30 минут на водяной бане. Лоследующее восстановление клеток проводили при обычных условиях сультивирования.

Адаптацию к теплу с помощью мягких температурных воздействий в течение трех дней по 30 минут в день при температурах 41,0°С, 41,5°С, 42,0°С. ía четвертый день проводили тестирующий тепловой шок, как описано выше.

Ингибитор NO-синтазы L-NNA вводили с культуральной средой в конечной концентрации 2 мМ за 1 час до адаптирующего воздействия или теплового шока. Дальнейшие исследования проводили через 8 часов после юследнего теплового воздействия или добавления L-NNA..

В качестве донора NO на культуре клеток использовали NOC-18. Клетки сультивировали в среде содержащей NOC-18 в концентрации 200цМ в течение

8 часов каждый день, после чего ее заменяли на свежую среду, не содержащук NOC-18.

Определение содержания фактора транскрипции NFkB i индуцибельной NO-синтазы проводили иммунофлуоресцентным методом < соответствующими антителами, вторые антитела были конъюгированы < техасским красным. Препараты заключали в смесь глицерин/PBS i фотографировали на флуоресцентном микроскопе.

Определение общего синтеза белка проводилось ауторадиографическт методом по включению радиоактивной метки [35Б]-метионина и [35Б]-цистеин; Для включения метки культуры клеток инкубировали в течение 8 часов ] модифицированной среде LI5 с использованием 5 мкКи радиоактивной метю на 1 мл среды. Радиоактивность определяли во фракции, осажденной горяче] трихлоруксусной кислотой.

Определение уровня АТФ использовалось в качестве индикатор; выживаемости клеток после теплового шока. Клетки промывали фосфатньн* буфером, затем лизировали в 250 мкМ реакционной смеси с люциферазой люциферином. Фотонную эмиссию измеряли при 25°С в течение 30 мин., затем добавляли 3 мкл 10 мМ АТФ в качестве внутреннего стандарта. Дл оценки эффекта теплового шока среду заменяли сразу после окончани воздействия и оставляли культуру на 20 часов до измерения АТФ.

Определение HSP70 проводили методом Вестерн-блот анализа реактивами и оборудованием фирмы "Bio-Rad", USA. После лизировани (лизис - буфер: модифицированный по Forstermann, 1996) центрифугирования клеток или ткани полученный супернатант соединяли с х sample-буфером и инкубировали 7 мин. при 95°С на водяной бане Концентрацию белка в образце предварительно определяли по методу Фолинг Лоури. Электрофорез проводили в 12% SDS полиакриламидном геле п Laemmli. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроэлюцие{ Проявление исследуемых белков проводили при помощи иммуноферментно хемилюминесценции с использованием первых моноклональных антите против индуцибельной формы HSP70 (SPA-810, Stress Gen) и вторых антите. конъюгированными с пероксидазой хрена (NA-931, Amersham). Дл визуализации антигенной мишени использовали набор ECL (RPN 210 Amersham). Экспонирование осуществляли на пленку Hyperfilm ЕС (Amersham Pharmacia Biotech, Великобритания). О содержании HSP70 судил по ширине и интенсивности окрашивания полосы связывания антите Количественная обработка полученных иммуноблотов проводилась путе сканирования с помощью программы ONEDSCAN.

Статистическая обработка данных. Полученные данные обрабатывали« статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали) достоверными при р<0,05. Результаты представлены в виде М+т. Для оценк достоверности различий по смертности использовали точный метод Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ Результаты экспериментов на животных

Защитные эффекты адаптации к теплу при тепловом шоке

Тепловой шок приводил к гибели 59% крыс в течение 24 часов после кончания прогрева. Адаптация крыс в течение 6 дней приводила к величению выживаемости с 41% до 81%.

На рис. 1 видно, что тепловой шок вызывал острую гипотензию. Если в онтроле АД составляло 113+3 мм рт.ст, (рис. 1, К) то в течение 1 часа оно :адало до 88+1 мм рт. ст (рис.1, ТШ) (р<0,05). Адаптация сама по себе не ызывала достоверных изменений АД. После 6-го сеанса адаптации АД у датированных крыс, перенесших тепловой шок, практически не отличалось т контроля и составляло 112+3 мм рт. ст. (рис. 1, А6+ТШ) (р>0,05 по равнению с контролем).

АД м м рт. ст. 140 п

Рис. 1. Влияние кверцетина на антигипотензивный эффект адаптации к еплу.

ТШ - тепловой шок, А6 - адаптация 6 дней, А6+С? - адаптация на фоне урсового введения кверцетина, <3 - курсовое введение кверцетина

*- р < 0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом на основании оценки устойчивости животных к овреждающему действию тяжелого теплового шока было установлено, что птимальная продолжительность адаптации к теплу, которая обеспечивает ыраженный стойкий защитный эффект, составляет 6 дней. Эта модель была спользована в дальнейших исследованиях для изучения механизмов даптационной защиты.

Данные, приведенные в таблице 1, отражают динамику продукции N0 в рганизме. Начиная с первого сеанса этот показатель был достоверно увеличен, к 6-му дню адаптации вернулся к исходному показателю.

Таблица 1. Определение содержания нитритов/нитратов в плазме крыс

Экспериментальные группы мкМ

Контроль, (п=10) 12,2+2,6

Адаптация к теплу, 1 день, (п=10) 20,4+4,5 а

Адаптация к теплу, 3 дня, (п=10) 19,8+2,5а

Адаптация к теплу, 6 дней, (п=10) 11,3+2.3

а Достоверные отличия от контроля, р<0.05

Для оценки продукции N0 в условиях острой гипертермии мь использовали ЭПР - анализ, который, в отличие от предыдущего метода позволяет определить быстрые изменения скорости продукции N0 и обладает тканеспецифичностью.

Таблица 2. Влияние теплового шока и адаптации к теплу на продукцию N0 I

органах крыс (ЭПР-анализ)

Экспериментальные группы Продукция N0 нг/г влажной ткани

Печень Мозг Сердце

Контроль, (п=10) 40.3+8.2 43.7+10.5 0

Тепловой шок, (п=10) 233.2+16.1а 83.1+12.2* 7+2"

Адаптация + тепловой шок, (п=10) 29.7+10.1 45.5+7.4 0

а Достоверные отличия от контроля, р<0.05

В таблице 2 представлены количественные данные полученные методо1 ЭПР, по тканевой продукции N0. Тепловой шок приводил к гиперпродукци N0 в печени, сердце и мозге крыс. Адаптация полностью предупреждал гиперпродукцию N0, вызванную тепловым шоком, во всех исследованны органах. Эти данные указывают на то, что адаптация к теплу индуцирус механизмы ограничения гиперпродукции N0, которые могут лежать в основ антигипотензивного эффекта адаптации.

Важно отметить, что результаты анализа продукции N0 в разных органах при адаптации к теплу и тепловом шоке полностью соответствовали физиологической оценке защитного эффекта адаптации, поскольку они подтвердили отсутствие гиперпродукции N0 у адаптированных животных, подвергнутых тепловому шоку.

Анализируя механизм защитного действия адаптации против 'иперпродукции N0, можно предположить, что именно предварительная /меренная стимуляция синтеза N0 служит одним из протекторных факторов в условиях теплового шока. Можно предположить, что избыток N0, образовавшийся в процессе адаптации, ограничивает гиперпродукцию NO при тепловом шоке по механизму отрицательной обратной связи или индуцирует :интез вторичных протекторных факторов. Такой механизм адаптивного ограничения гиперпродукции N0 был убедительно продемонстрирован для адаптации к мягким, неповреждающим стрессорным воздействия (Смирин и пр., 2000).

Роль N0 и HSP70 в защитных эффектах адаптации к теплу

Для изучения роли активации синтеза HSP70 при тепловом шоке и адаптации к теплу было необходимо выбрать время максимальной индукции этих белков после воздействия. Результаты изучения динамики индукции HSP70 показали, что после однократного интенсивного прогрева (теплового пока) максимальное накопление HSP70 происходит к 24 часам. В то же время адаптация к умеренным термическим воздействиям, каждое из которых при однократном применении не вызывает индукции HSP70, приводит к максимальному накоплению HSP70 к 6-му дню. Накопление HSP70 1роисходило с одинаковой динамикой во всех исследованных органах -печени, сердце, аорте и мозге, что позволяет предположить сходный механизм зегуляции этого процесса.

Поскольку именно накопление в клетках HSP70 в значительной степени обеспечивает устойчивость к перегреву, достижение максимального уровня HSP70 соответствует развитию наиболее эффективной защиты от теплового пока (Maloyan et al., 1999; Yang, Lin, 1999). Доказано, что индукция HSP70, зызванная прогревом крыс, прямо коррелирует с защитой от теплового шока то гистологическим, биохимическим и гемодинамическим показателям (Yang, Lin, 1999).

На рис. 2 видно, что адаптация приводила к постепенному умеренному накоплению индуцибельной формы HSP70 в сердце (рис. 2, блот и диаграмма >). Тепловой шок приводил к резкому увеличению содержания HSP70 (рис. 2, олот и диаграмма 5). Видно, что 6-дневный курс адаптации ограничивает индуцированный тепловым шоком синтез HSP70 в сердце (рис.2, блот и диаграмма 6).

Таким образом, адаптация к теплу защищает от теплового шока, что проявляется в антигипотензивном эффекте, ограничении гиперпродукции N0 и

ШР70, снижении смертности животных. Эти данные позволяю' предположить, что N0 и ШР70 могут играть роль в защитном эффект! адаптации.

1 23 45678

1 800 _

л 1600 -I П

g 1400 -

g 1200 - Í !

S 1000 - И

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 2 Влияние введения кверцетина на защитный эффект адаптации

1 - Контроль, 2 - Адаптация, 3 - Адаптация на фоне курсового введени кверцетина, 4 - Курсовое введение кверцетина, 5 - Тепловой шок, 6 Адаптация + тепловой шок, 7 - Адаптация на фоне курсового введени кверцетина + тепловой шок, 8 — Курсовое введение кверцетина + тепловой шо:

Подтверждение этого предположения было получено путем оценки влияни ингибиторов синтеза HSP70 и N0 на защитный эффект адаптации. Результат Вестерн-блот анализа, представленные на рис. 2, показывают, что ингибито синтеза HSP70 кверцетин действительно подавлял синтез HSP70 как во врем адаптации к теплу (рис. 2, блот и диаграмма 3), так и после теплового шок (рис. 2, блот и диаграмма 8). У бодрствующих животных кверцетин сам по себ не влиял на АД (рис. 1, Q), но практически полностью устраня антигипотензивное действие адаптации при тепловом шоке (рис. 1, AQ+ТШ).

Учитывая, что избыток NO представляет собой одну из главных причи резкого падения АД при тепловом шоке (Hall et al., 2001), можн предположить, что адаптивное накопление HSP70 является одним из факторо участвующих в ограничении гиперпродукции N0.

Для оценки роли N0 в активации синтеза HSP70 при адаптации к тепл было изучено влияние ингибитора NO-синтазы L-NNA и донора N0 ДНКЖ j антигипотензивный эффект адаптации и накопление HSP70.

АД мм рт. ст.

160 п

Рис. 3. Влияние курсового введения L-NNA на антигипотензивный эффект адаптации к теплу

ТТЛ - тепловой шок, А6 - адаптация 6 дней, A6+L-NNA- адаптация на фоне курсового введения L-NNA, L-NNA - курсовое введение L-NNA

*р < 0,05 по сравнению с контролем, **р < 0,05 по сравнению тепловым шоком

Тот факт, что L-NNA отменял антигипотензивный эффект адаптации, называет на вовлечение самого NO в адаптивное ограничение гиперпродукции ЧО. Один из возможных механизмов участия NO упоминался выше и состоит в шгибировании NOS по механизму отрицательной обратной связи :интезирующимся или высвобождающимся из депо N0 (Смирин и др., 2000). другой механизм может состоять в том, что N0 является индуктором ряда тротекторных факторов - простагландинов (Uno et al., 1997; Patel et al., 1999), штиоксидантов (Dobashi et al., 1997) и, что особенно важно для интерпретации юлученных нами данных, HSP70 (Malyshev et al., 1995; Xu et al., 1997).

Данные, представленные на рис. 3, показывают, что курсовое введение L-4NA не оказывало достоверного влияния на АД бодрствующих крыс. Однако ¡ели адаптация проводилась на фоне L-NNA, который вводился перед каждым адаптирующим прогревом животных, то антигипотензивное защитное действие щаптации отсутствовало. Видно, что падение АД при тепловом шоке у крыс, юлучавших инъекцию L-NNA перед каждым сеансом адаптации, не шшчалось от такового у неадаптированных животных.

3 4 5

ц

№

и *

О 1-» о. <л X

1800 1600 1400 1200 1000 800 6 0 0 400 200 О

I

3 4 5

Рис. 4. Влияние курсового введения Ь-КГЫА на содержание ШР70 в сердц крыс.

1 - Контроль, 2 - Адаптация 6 дней, 3 - Адаптация 6 дней на фоне О^А, 4 Курсовое введение Ь№4А, 5 - Тепловой шок, 6 - Адаптация 6 дней + Теплово шок, 7 - Адаптация 6 дней на фоне 1_МЫА+ Тепловой шок, 8 - Курсово введение Ь№ч[А+ Тепловой шок

На рис. 4 видно, что введение Ь-ЫЫА само по себе не приводило накоплению ШР70 (рис. 4, блот и диаграмма 4). В то же время поел адаптации, проводимой на фоне постоянного введения Ь-№ЧА (рис. 4, блот диаграмма 3), уровень ШР70 оказался гораздо ниже, чем у крыс, н получавших Ь-ЫЫА во время адаптации (рис. 4, блот и диаграмма 2), и бы лишь незначительно больше, чем у неадаптированных животных (рис. 4, блот диаграмма 1). Аналогичный эффект наблюдался у крыс, которым пере тепловым шоком проводили курсовое введение Ь-№1А: существенн

ограничивал вызванную тепловым шоком индукцию синтеза НБР70 как адаптированных (рис. 4, блот и диаграмма 7), так и у неадаптированных кры (рис. 4, блот и диаграмма 8).

Факт, что Ь-№ЧА не полностью, хотя и в значительной степени, устранил шдукцию ШР70 при адаптации и тепловом шоке, говорит о том, что в силение синтеза ШР70 в этих условиях вовлечены и другие механизмы, юмимо N0.

АД, мм рт. ст.

140 п

контроль ДНКЖ ТШ ДНКЖ+ТШ

Рис. 5. Влияние курсового введения ДНКЖ на величину АД после

теплового шока *- р < 0,05 по сравнению с контролем

Рис. 6. Влияние курсовоп введения ДНКЖ на защитны! эффект адаптации к теплу 1 сердце крыс.

100 1 юо -!

■00 Н

.оо -( 00 -00 -00 -!

00 - 1' 3

00 N

0 - ш

у

1. Контроль

2. Курсовое введение ДНКЖ

3. Тепловой шок

4. ДНКЖ + тепловой шок

Курсовое введение донора N0 ДНКЖ не вызывало достоверных изменен] АД (рис. 5), но практически полностью предупреждало падение АД п] тепловом шоке. Другими словами, курс инъекций ДНКЖ оказывал защити действие, которое было качественно и количественно сходно с защитнь эффектом адаптации к теплу.

Курс инъекций ДНКЖ, как и адаптация, вызывал накопление HSP70 ткани (рис. 6). Одновременно ДНКЖ, как и адаптация, предупрежд гиперактивацию синтеза HSP70, вызванную тепловым шоком. Эти данш показывают, что N0 играет важную роль в активации синтеза HSP70 как п] адаптации, так и при тепловом шоке.

Показано, что NO-зависимая индукция HSP70 опосредована активаци фактора транскрипции HSF1 (Xu et al., 1997). Такой же механизм действует при тепловом шоке (Schoffl et al., 1998). Поэтому одна из гипотез о триггерш факторах NO-зависимой индукции HSP70 состоит в том, что N0, будучи цит и протеотоксичным фактором, как и тепловой шок, вызывает в той или hhi степени накопление в клетке фрагментов поврежденных белков (Fukuo et г 1995; Matsumoto et al., 1999), которые, в свою очередь, являют индуцирующим фактором синтеза HSP70.

Независимо от механизма NO-зависимой индукции HSP70, полученш результаты позволяют сделать вывод, что N0 вовлечен в синтез HSP70 формирование защитных эффектов адаптации к теплу. Этот выв подтверждается тем, что курсовое введение донора N0 ДНКЖ той продолжительности, что и адаптация к теплу, воспроизвод антигипотензивный защитный эффект адаптации, вызывал накопление HSP и ограничивал ответ HSP70 на тепловой шок.

Ранее при оценке роли N0 в защитных эффектах адаптации к друг факторам среды - стрессу (Смирин и др., 2000), гипоксии (Зенина и др., 199 физической нагрузке (Аймашева и др., 1998) - было установлено, ч ингибиторы NOS отменяют адаптационную защиту, а доноры N0 воспроизводят. В наших исследованиях мы впервые показали, что это явлен наблюдается также и при адаптации к теплу.

Таким образом, N0 вовлечен преимущественно в неспецифическ механизмы адаптационной защиты, ключевая роль в которых принадлеж HSP70. По всей вероятности, NO-зависимая активация ранних регуляторн генов, к которым относится ген HSP70, вносит вклад в активац: генетического аппарата в процессе перехода срочной адаптации долговременную (Малышев, Манухина, 1998). Внутриклеточные механиз1 этих процессов изучены мало. Это связано, в частности, с тем, что моде дозированной адаптации к теплу клеточной культуры, которая была адекватна модели на животных, до настоящего времени отсутствовала. В свя с этим задачей следующего этапа наших исследований была разработка так модели адаптации к теплу изолированных кардиомиоцитов.

результаты экспериментов на культуре клеток

Защитные эффекты адаптации к теплу при тепловом шоке При выборе температуры адаптирующих воздействий мы исходили из того, [то 1) однократное применение такого воздействия не должно вызывать начительных повреждений клетки и 2) курс адаптирующих воздействий [олжен ограничивать индукцию ШР70 при тепловом шоке. На основании этих ритериев в качестве модели адаптации к теплу клеточной культуры для ;альнейших исследований была выбрана схема, в соответствии с которой летки подвергались воздействию температуры 41,5°С по 30 минут в день в ечение 3 дней подряд.

^ 500

| 400

1 300

I" 200

Й 100 х

1 2

'"'ШМ^тУ' '" ".'-У*

1:1

I я

7 8

Рис. 7. Влияние адаптации к теплу на индукцию ШР70 при тепловом шоке

1 - Контроль, 2 - тепловой шок, 3-1 день адаптации, 4 - 1 день адаптации + тепловой шок, 5 — 2 дня адаптации, 6-2 дня адаптации + тепловой шок, 7-3 дня адаптации, 8-3 дня адаптации + тепловой шок

На рисунке 7 видно, что адаптация клеток к теплу не сопровождалась «соплением ШР70 (блоты и диаграммы 3, 5, 7), однако приводила к

ограничению индукции HSP70 под действием теплового шока, причем эт ограничение становилось все более выраженным после каждого последующег адаптирующего воздействия (блоты и диаграммы 4, 6, 8).

Общепринятыми прямыми маркерами повреждения клеток являютс степень угнетения общего биосинтеза белка и АТФ в клетках (van Wijl Wiegant, 1997). Поэтому эти показатели были использованы для оценк цитопротекторного эффекта адаптации. Полученные результаты полность подтвердили защитное действие адаптации к теплу при выбранной нам температуре (41,5°С).

.На рисунке 8 показано, что тепловой шок приводил к снижению общег синтеза белка в неадаптированных клетках примерно на 45% от контрольног уровня. Адаптация клеток к температуре 41,5°С практически не влияла î исследуемый показатель. После однократного прогрева клеток при 41,5° (первое адаптирующее воздействие) синтез белка под действием теплово! шока снижался на 32%, после двукратного - на 22% и после трехкратного только на 18% от уровня в адаптированных клетках. Полученный результ, можно интерпретировать как адаптивное повышение резистентности клеток повреждающему действию теплового шока.

Другим показателем степени повреждения клеток при тепловом moi служил уровень АТФ (рис. 9). В неадаптированных клетках, подвергнуть тепловому шоку, уровень АТФ падал на 72% от контрольного значения. I-одно из тепловых воздействий в ходе адаптации не вызывало изменен! уровня АТФ. После первого адаптирующего воздействия тепловой ш вызывал снижение АТФ на 61%, после второго - на 54%, после третьего -36%. Следовательно, адаптация клеток к теплу эффективно предупрежда падение уровня АТФ, вызванное тепловым шоком.

Таким образом, адаптация кардиомиобластов к теплу в наш экспериментах сама по себе не приводила к изменению базального уров HSP70, не оказывала угнетающего действия на общий синтез белка и АТФ, i оказывала выраженное защитное действие против повреждений, вызванш тепловым шоком.

Поскольку индукция iNOS опосредована активацией фактора транскрипц NFkB (Xie, Nathan, 1994), для оценки возможности гиперпродукции N0 клетке при тепловом шоке был проведен иммуннофлуоресцентный анал активации NFkB и индукции ¡NOS. Тепловой шок вызывал транслокащ NFkB из цитоплазмы в ядро клетки и появление в клетках iNC Следовательно, тепловой шок с большой вероятностью может приводить гиперпродукции N0.

Оценка защитного эффекта адаптации клеток к теплу проводилась степени угнетения общего синтеза белка (рис. 8) и снижению уровня А' (рис.9), которое является нарушением, характерным для теплового шока (\ Wijk, Wiegant, 1997).

Рис 8. Оценка защитного эффекта адаптации по степени угнетения общего синтеза белка.

Рис 9. Оценка защитного эффекта адаптации по снижению уровня АТФ в

кардиомиобластах Подписи к рис 8 и 9:

1 - Контроль, 2 - тепловой шок, 3-1 день адаптации, 4-1 день адаптации + тепловой шок, 5-2 дня адаптации, 6-2 дня адаптации + тепловой шок, 7-3 дня адаптации, 8-3 дня адаптации + тепловой шок

Роль N0 и HSP70 в защитных эффектах адаптации к теплу Для сопоставления роли N0 в механизмах адаптации к теплу клеточнс культуры и целого организма было изучено влияние ингибитора NOS L-NNA донора N0 N0C-18 на индукцию HSP70, вызванную тепловым шоком адаптированных и неадаптированных клетках.

Результаты Вестерн-блот анализа, представленные на рис. 10, показываю что курсовое введение L-NNA ослабляло индукцию HSP70 при тепловом шо] (блот и диаграмма 3). Адаптация клеток к теплу на фоне L-NNA не вызыва) накопления HSP70 (блоты и диаграммы 4, 6, 8). Более того, при адаптации i фоне L-NNA не происходило постепенного ограничения индукции HSP70 i тепловой шок (блоты и диаграммы 5, 7,9).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

600 -

? 500 -

с

0) g 400 -

s

с 300 -

о

N. CL 200 -

(0

X 100 •

О

123456789

Рис. 10. Влияние курсового введения Ь-М^А на содержание Н5Р70 кардиомиобластах

1.1- Контроль, 2 - тепловой шок, 3 - ТШ на фоне Ь-ЫЫА, 4 - 1день адаптации, 5 - 1 день адаптации+ Ь-ША + тепловой шок, 6-2 дня адаптации, 7-2 дня адаптации + Ь-ША + тепловой шок, 8-3 дня адаптации, 9-3 дня адаптации + Ь-№4А + тепловой шок

5 С О О X 5

О

ь-о.

от

X

400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 50 -0

3

4

5

6

Рис.11. Влияние донора N0 - N00-18 на содержание ШР70 в кардиомиобластах.

1- Контроль, 2 - Тепловой шок (ТШ), 3-1 день инкубации с N00-18, 4 - 1 день инкубации с N00-18+ТШ ,5 - 2 дня инкубации с N00-18, 6-2 дня инкубации с N00-18+ ТШ, 7 - 3 дня инкубации с N00-18,8 - 3 дня инкубации с N00-18 +ТШ, 9 - Однократное введение N00-18

На рисунке 11 видно, что однократная, двукратная и трехкратная инкубация ардиомиоцитов с донором N0 N00-18 не вызывала увеличения уровня 18Р70. После первого сеанса инкубации клеток с N00-18 индукция НБР70 в твет на тепловой шок значительно усилилась. Однако после двух сеансов нкубации с N00-18 ответ на тепловой шок не отличался от ответа клеток, не одвергавшихся воздействию донора N0. После трех сеансов инкубации с ЮС-18 наблюдалось существенное ослабление синтеза Н8Р70 под действием еплового шока.

Таким образом, курсовое введение на фоне адаптации клеток к

еплу устраняло эффект ограничения индукции Н8Р70, вызванной тепловым

шоком в адаптированных клетках. В то же время донор N0, в целом ослабл; синтез Н8Р70, вызванный тепловым шоком. Этот эффект был сходен действием адаптации клеток к теплу. Полученные данные свидетельствуют различной роли N0 в регуляции синтеза ШР70 в целом организме и изолированных клетках.

В целом эти данные означают, что N0 вносит вклад в формирован] защитного эффекта адаптации клеток к теплу за счет активации механизмов, ] связанных с накоплением ШР70. Это предположение подтверждается тем, ч-донор N0 N00-18 сам по себе не индуцировал Н8Р70, но при трехкратно введении, по существу, воспроизводил защитный эффект адаптации к тепл который проявлялся в ограничении индукции ШР70 в ответ на тепловой шок Полученные данные позволяют сопоставить роль N0 в регуляции синте НБР70 при адаптации к теплу на уровне целого организма и ) внутриклеточном уровне. Главное сходство между механизмам адаптационной защиты организма и клеток состоит в том, что в обоих случа: N0 вносит существенный вклад в ее формирование. Принципиальное различ состояло в том, что защитный эффект N0 при адаптации организма к теп сопровождался накоплением Н8Р70, тогда как в клетках NO-зaвиcим накопление НБР70 при адаптации отсутствовало. Можно предположить, чт накопление протекторных белков ШР70 представляет собой лишь один адаптивных механизмов, триггером которых служит N0. С другой сторон N0 не является единственным индуктором синтеза НБР70 при адаптации теплу. Повышенная температура действует на клетки только непосредствен как физический фактор, а в организме прямое действие этого факто дополняется включением многих нейрогуморальных процессов. В результате организме синтез ШР70 при адаптации к теплу может регулироваться многи физиологическими факторами, которые отсутствуют в изолированных клетк например, изменениями АД или уровня стресс-гормонов (Ма1оуап е1 а1., 1999 Таким образом, использование впервые разработанной нами моде адаптации к теплу изолированных клеток позволило провести сравнительн анализ механизмов этого вида адаптации и ее защитных эффектов. Полученн результаты открывают перспективу изучения возможности направленно влияния на адаптационный процесс с помощью фармакологическ модуляторов синтеза N0 и Н8Р70.

ыводы

Дозированная адаптация организма к теплу снижает смертность животных эффективно защищает организм от гиперпродукции N0 и острой гипотензии ри тепловом шоке. При этом такая адаптация ограничивает массивную ндукцию в тканях стресс-белков НБР70, значительное накопление которых зляется маркером клеточного повреждения.

Адаптация крыс к теплу вызывает умеренное накопление Н8Р70. Курсовое зедение ингибитора синтеза ГОР70 кверцетина на фоне адаптации отменяло ггигипотензивное действие адаптации при тепловом шоке.

Адаптация крыс к теплу умеренно стимулировала синтез N0. Курсовое 5едение ингибитора МО-синтазы Ь-МЧА на фоне адаптации отменяло ггигипотензивный эффект адаптации и ограничивало адаптивное накопление БР70. Оксид азота и МО-зависимая активация Н8Р70 вовлечены в механизмы щптивного ограничения гипотензивного эффекта теплового шока.

Курсовое введение донора N0 ДНКЖ оказывало такое же шшиготезивное действие, как адаптация к теплу, так же, как адаптация, лзывало умеренное накопление ШР70 и ограничивало массивную индукцию БР70 при тепловом шоке. Эти данные подтверждают важную роль N0 в .щитных эффектах адаптации к теплу.

Впервые разработана модель дозированной адаптации к теплу культуры фдиомиобластов курсом умеренных тепловых воздействий, каждое из угорых не вызывало повреждений клетки. Эта адаптация приводила к эвышению устойчивости изолированных клеток по параметрам ограничения эдепия общего синтеза белка, снижения уровня АТФ и индукции НБР70 при :пловом шоке.

Курсовое введение ингибитора синтеза N0 в культуральную среду на фоне (аптации клеток к теплу отменяло адаптивное ограничение индукции НБР70 ж тепловом шоке, другими словами, устраняло защитный эффект адаптации, то же время курсовое введение донора N0, как и адаптация к теплу, шабляло накопление Н8Р70 при тепловом шоке. Это подтверждает участие О в клеточных механизмах адаптации к теплу.

Полученные данные свидетельствуют о различной роли N0 в регуляции штеза Н8Р70 при адаптации организма и клеток к теплу. В обоих случаях N0 юсит существенный вклад в формирование адаптационной защиты, но в [етках, в отличие от целого организма, адаптационная защита не связана с О-зависимым накоплением ШР70.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. NO paradox in adaptation of the organism. // Biology of Nitric Oxide, 6th International Meeting, Acta Phys. Scand, - 1999. - P. S43. (соавт. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., Голубева Л.Ю., Зенина Т.А., Аймашева Н.П., Маленюк Е.Б., Трифонов А.И., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

2. Cross-talk between nitric oxide and HSP70 in the antihypotensive effect of adaptation to heat. // Physiol. Res. - 2000. - V, 49. - P. 99-105. (соавт. Малышев И.Ю., Трифонов А.И., Ларионов Н.П., Кубрина Л.Н., Микоян В.Д., Ванин А.Ф., Манухина Е.Б.)

3. Роль стресс-белков HSP 70 и адренергической системы в различной устойчивости к инфаркту миокарда крыс генетических линий Август и Вистар. // Российский физиол. журнал - 2001. - Т. 87. - № 9. - С. 1171-1177. (соавт. Пшенникова М.Г., Белкина Л.М., Бахтина Л.Ю., Попкова Е.В., Малышев И.Ю.)

4. Устойчивости к инфаркту миокарда связана с врожденными особенностями адренергической системы и системы стресс-белков HSP70. // XVIII Съезд Физиологического общества имени И.П. Павлова. - Казань -2001. - С. 413. (соавт. Пшенникова М.Г., Белкина Л.М., Бахтина Л.Ю., Попкова Е.В., Малышев И.Ю.)

5. Стресс-белки HSP70, оксид азота и устойчивость к инфаркту миокарда у крыс линий Август и Вистар. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2001. - Т. 132. -№ 8. - С. 153-155. (соавт. Пшенникова М.Г., Белкина Л.М., Бахтина Л.Ю., Смирин Б.В., Малышев И.Ю.)

6. HSP 70 and NO in rats with different resistance to myocardial infarction // J. Mol. Cell. Card. - 2001. - V.. 33. - Ко. 6. - P. A97. (соавт. Пшенникова М.Г., Белкина Л.М., Бахтина Л.Ю., Смирин Б.В., Малышев И.Ю.)

7. Anihypotensive effect of adaptation to heat: the role of NO and HSP70. // J. Mol. Cell. Card. - 2001. - V.. 33. - No. 6. - P. A9. (соавт. Малышев И.Ю., Трифонов А.И., Ларионов Н.П., Кубрина Л.Н., Микоян В.Д., Ванин А.Ф., Манухина Е.Б.)

Актуальность исследования.

Хорошо известно, что длительная и интенсивная гипертермия приводит к тепловому шоку, который характеризуется острой гипотензией, почечной недостаточностью, поражением печени, повышением уровня ферментов в плазме крови и нарушением процесса свёртывания крови (Semenza, 1999; Diehl et al., 2000; Berger et al., 2000; Hall et al., 2001). Для теплового шока характерна гиперпродукция оксида азота (NO), который является наиболее мощным из всех эндогенных вазодилататоров (Манухина и др., 1996а; Malyshev et al., 1995; Alzeer et al., 1999). Гиперпродукция NO при теплом шоке приводит к глубокому падению АД, которое может стать необратимым (Манухина и др., 1996в). Защиту от теплового шока может обеспечивать небольшое предварительное повышение уровня NO в организме, вызванное стимулированием синтеза NO или введением доноров NO (Манухина и др., 1997). Механизм такой защиты окончательно не установлен. Предполагается, что он связан либо с NO-зависимым ограничением избыточной активности NOS по принципу отрицательной обратной связи, либо с NO-зависимой индукцией синтеза эндогенных протекторных факторов, например белков теплового шока (Малышев, Манухина, 1998).

Для предупреждения тепловых повреждений и сохранения работоспособности в условиях высокой температуры, необходима профилактика путем повышения теплоустойчивости самого организма за счет постепенной индивидуальной адаптации. Такой подход возможен лишь при наличии ясных представлений о механизмах адаптации к высокой температуре.

Молекулярные механизмы формирования адаптации, клеточной защиты и восстановления после повреждения в значительной степени зависят от наличия в клетке протекторных белков теплового шока (HSPs).

Среди HSPs наибольшее внимание привлекают белки семейства HSP70 вследствие высокой насыщенности ими тканей. Участие HSP70 в акклиматизации к теплу и способность обеспечивать термотолерантность хорошо известна. Главные внутриклеточные механизмы защитного действия HSP70 от повреждений, вызванных тепловым шоком, состоят в участии HSP70 в дезагрегации аномальных белковых комплексов, участии в утилизации и репарации поврежденных белков, в регуляции синтеза белка de novo (Benjamin, McMillan, 1998; Schoffl et al., 1998; Sharp et al., 1999), а также способности ограничивать гиперпродукцию оксида азота (Heneka et al., 2000; Bhora et al., 2000) и проапоптотические механизмы (Beere, Green, 2001).

Одним из факторов, играющих важную роль в активации экспрессии генов hsp70 является NO. Многочисленные данные о сочетанной и взаимозависимой активации синтеза NO и HSP70 позволили выдвинуть и обосновать гипотезу о том, что NO и HSP70 образуют единую эндогенную протекторную систему (Малышев, Манухина, 1998). Показано, что при адаптации организма к таким факторам среды, как гипоксия, стресс и физическая нагрузка, синтез HSP70 активируется под влиянием NO (Аймашева и др., 1998; Зенина и др., 1998; Смирин и др., 2000). Однако роль системы NO/HSP70 при адаптации к теплу клетки и организма в целом не изучена, поскольку в настоящее время отсутствуют данные о продукции NO при этом виде адаптации. Кроме того, несмотря на большое количество исследований по акклиматизации целого организма, создать адекватную клеточную модель адаптации к теплу пока не удавалось, и это затрудняет изучение механизмов адаптации и возможности направленного влияния на этот процесс (Moseley, 1997).

В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении роли NO-зависимых механизмов индукции HSP70 в формировании адаптации к теплу и адаптационной защиты на уровне целого организма и изолированных клеток.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Оценить возможность адаптационной защиты организма от гиперпродукции N0, острой гипотензии и повреждений клеток, вызванных тепловым шоком.

2. Изучить влияние адаптации животных к теплу на синтез NO и HSP70.

3. Изучить влияние ингибитора синтеза HSP70 на антигипотензивный эффект адаптации к теплу при тепловом шоке.

4. Изучить влияние ингибитора NO-синтазы и донора NO на антигипотензивный эффект адаптации к теплу и адаптивное накопление HSP70.

5. Разработать модель дозированной адаптации к теплу культуры кардиомиоцитов.

6. Изучить влияние адаптации к теплу на внутриклеточные механизмы гиперпродукции N0 при тепловом шоке.

7. Изучить возможность адаптационной защиты изолированных клеток от повреждений, вызванных тепловым шоком.

8. Изучить влияние ингибитора NO-синтазы и донора N0 на синтез HSP70 при адаптации клеток к теплу и при тепловом шоке.

9. На основе полученных данных сопоставить роль NO в регуляции синтеза HSP70 при адаптации организма и клеток к теплу.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Впервые показано, что дозированная адаптация крыс к теплу эффективно ограничивает гиперпродукцию N0, острую гипотензию и смертность животных при тепловом шоке. Защитный эффект адаптации проявлялся также в ограничении массивной индукции в тканях стресс-белков HSP70, которая является маркером повреждения клеток.

Обнаружено, что формирование защитного эффекта адаптации к теплу сопровождается умеренным стимулированием синтеза N0 и HSP70. Накопление HSP70 происходит с одинаковой динамикой во всех исследованных органах - печени, сердце, аорте и мозге, что позволяет предположить сходный механизм регуляции этого процесса. Ингибирование синтеза HSP70 отменяло антигипотензивный эффект адаптации. Тем самым было доказано, HSP70 является одним из факторов адаптационного ограничения гиперпродукции N0

Впервые продемонстрировано, что N0 вовлечен в синтез HSP70 и формирование защитных эффектов при адаптации к теплу. Это подтверждается тем, что курсовое введение донора N0 той же продолжительности, что и адаптация к теплу, воспроизводило антигипотензивный защитный эффект адаптации, вызывало накопление HSP70 и ограничивало ответ HSP70 на тепловой шок. Ингибирование синтеза N0 отменяло адаптивное накопление HSP70 и антигипотензивный эффект адаптации.

Впервые разработана модель дозированной адаптации к теплу культуры кардиомиоцитов. Адаптация клеток, проводимая с использованием этой модели обеспечивала защиту клеток от повреждающего действия теплового шока, но не сопровождалась накоплением HSP70. Защитный эффект адаптации проявлялся в ограничении падения общего синтеза белка и уровня АТФ и массивного накопления HSP70, которые являются прямыми маркерами повреждения клеток.

Впервые доказано, что N0 вносит вклад в формирование защитного эффекта адаптации клеток к теплу за счет активации механизмов, не связанных с накоплением HSP70. Это подтверждается тем, что ингибитор NO-синтазы отменял эффект адаптивного ограничения индукции HSP70, вызванной тепловым шоком. В то же время донор N0 сам по себе не индуцировал HSP70, но при трехкратном введении воспроизводил защитный эффект адаптации к теплу, который проявлялся в ограничении индукции HSP70 в ответ на тепловой шок.

Полученные данные позволили впервые сопоставить роль NO в регуляции синтеза HSP70 при адаптации к теплу на уровне целого организма и на внутриклеточном уровне. Доказано, что N0 вносит существенный вклад в формирование защитных эффектов адаптации на разных уровнях регуляции. Принципиальное различие состоит в том, что роль NO в адаптации организма связана с активацией защитных HSP70, тогда как при адаптации клеток NO-зависимое накопление HSP70 отсутствует и NO-зависимые защитные эффекты реализуются через другие механизмы. Очевидно, накопление HSP70 представляет собой лишь один из адаптивных механизмов, триггером которых служит N0. С другой стороны, синтез HSP70 при адаптации к теплу может быть индуцирован и другими факторами, помимо NO, которые отсутствуют в изолированных клетках.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней впервые доказана важная роль эндогенных протекторных факторов N0 и HSP70 в формировании адаптации к теплу и адаптационной защиты от теплового шока и сопоставлены NO-зависимые механизмы адаптивного синтеза HSP70 на уровне изолированных клеток и целого организма.

Практическое значение работы состоит в том, что в ней продемонстрирована возможность направленного влияния на формирование адаптации к теплу с помощью фармакологических модуляторов синтеза N0 и HSP70.

Положения, выносимые на защиту:

1. Адаптация организма к теплу эффективно защищает организм от гиперпродукции NO и связанной с ней острой гипотензии при тепловом шоке.

2. Защитный эффект адаптации к теплу на уровне организма 9 опосредован NO-зависимой индукцией синтеза HSP70.

3. Адаптация к теплу изолированных клеток защищает клетки от повреждений, вызванных тепловым шоком.

4. NO играет важную роль в защитном эффекте адаптации к теплу изолированных клеток, но, в отличие от целого организма, механизм действия N0 не опосредован индукцией синтеза HSP70.

Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований были доложены на VI Международной встрече по биологии оксида азота (Стокгольм, Швеция, 1999), XVIII Съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, Россия, 2001), Национальной научно-практической конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, Россия, 2001), межлабораторном семинаре Отдела молекулярной и клеточной биологии Утрехтского университета (Утрехт, Голландия, 2001), VI Всемирном Конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (Лион, Франция, 2001), XVII Всемирном Конгрессе Международного общества по изучению сердца (Виннипег, Канада, 2001)

ВЫВОДЫ

1. Дозированная адаптация организма к теплу снижает смертность животных и эффективно защищает организм от гиперпродукции N0 и острой гипотензии при тепловом шоке. При этом такая адаптация ограничивает массивную индукцию в тканях стресс-белков HSP70, значительное накопление которых является маркером клеточного повреждения.

2. Адаптация крыс к теплу вызывает умеренное накопление HSP70. Курсовое введение ингибитора синтеза HSP70 кверцетина на фоне адаптации отменяло антигипотензивное действие адаптации при тепловом шоке. Следовательно, умеренное накопление HSP70 является фактором адаптивного ограничения гиперпродукции N0.

3. Адаптация крыс к теплу умеренно стимулировала синтез NO. Курсовое введение ингибитора NO-синтазы L-NNA на фоне адаптации отменяло антигипотензивный эффект адаптации и ограничивало адаптивное накопление HSP70. Таким образом N0 и NO-зависимая активация HSP70 вовлечены в механизмы адаптивного ограничения гипотензивного эффекта теплового шока.

4. Курсовое введение донора NO ДНКЖ той же длительности, что и адаптация к теплу, воспроизводило защитный эффект адаптации к теплу и оказывало влияние на синтез HSP70, аналогичное влиянию адаптации. Эти данные подтверждают важную роль N0 в защитных эффектах адаптации к теплу.

5. Впервые разработана модель дозированной адаптации к теплу культуры кардиомиоцитов курсом умеренных тепловых воздействий, каждое из которых не вызывало повреждений клетки. Эта адаптация приводила к повышению устойчивости изолированных клеток по параметрам ограничения падение общего

94 синтеза белка, снижения уровня АТФ и индукции HSP70 при тепловом шоке. Таким образом адаптация и ее защитные эффекты могут развиваться в клетках при непосредственном действии факторов среды независимо от нейрогуморальных механизмов, активирующихся при адаптации организма.

6. Курсовое введение ингибитора синтеза NO в культуральную среду на фоне адаптации клеток к теплу устраняло эффект ограничения индукции HSP70, вызванной тепловым шоком. В то же время курсовое введение донора N0, как и адаптация к теплу, ослабляло накопление HSP70 при тепловом шоке. Таким образом N0 вовлечен в клеточные механизмы адаптации к теплу.

7. Полученные данные свидетельствуют о различной роли N0 в регуляции синтеза HSP70 при адаптации организма и клеток к теплу. В обоих случаях N0 вносит существенный вклад в формирование адаптационной защиты, но в клетках, в отличие от целого организма, адаптационная защита не связана с N0-зависимым накоплением HSP70.

5. Заключение

Таким образом, к настоящему времени можно считать доказанным, что как прекондиционирующие термические воздействия, так и акклиматизация к теплу обеспечивают эффективную защиту клетки и организма в целом от повреждающего действия теплового шока. В основе этой защиты лежит активация синтеза HSPs и в особенности HSP70. Поскольку акклиматизация в природе является неконтролируемым процессом, изучение ее закономерностей требует наличия стандартной модели адаптации к теплу, с помощью которой действие данного фактора можно дозировать как по продолжительности, так и по интенсивности. Отсутствие такой модели в настоящее время сдерживает исследование механизмов адаптации к теплу.

Хотя известно, что при адаптации организма к таким факторам среды, как гипоксия, стресс и физическая нагрузка, синтез HSP70 активируется под влиянием N0, который вместе с HSP70 рассматривается как компонент эндогенной протекторной системы, роль этой системы при адаптации к теплу клетки и организма в целом не изучена. Одной из причин того, что этот вопрос до сих пор остается открытым, является отсутствие данных о продукции NO при этом виде адаптации. Другая причина отсутствия четкого представления о механизмах адаптивной индукции синтеза HSP70 состоит в том, что, несмотря на большое количество исследований по акклиматизации целого организма, создать клеточную модель адаптации к теплу пока не удавалось (Moseley, 1997). Между тем хорошо известно, что острая гипертермия является сильным стимулятором синтеза N0 (Matsumoto et al., 1999; Hall et al., 2001), и, следовательно, можно предположить, что изменения метаболизма NO должны происходить также и при прекондиционирующих или адаптирующих термических воздействиях. В связи с этим настоящее исследование было направлено на выяснение возможной роли защитной системы NO/HSP70 и механизмов индукции HSP70 с использованием разработанной нами моделей адаптации к теплу целого организма и изолированных клеток.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование включало 4 этапа.

На первом этапе была разработана оптимальная модель адаптации крыс к умеренным тепловым воздействиям. Выбор модели для использования в дальнейшей работе проводился по эффективности адаптационной защиты при тяжелом тепловом шоке. Степень повреждения и защиты организма оценивали по падению АД и выживаемости животных после теплового шока.

На втором этапе на выбранной модели с использованием ингибитора синтеза HSP была изучена роль HSP70, а с применением ингибитора NO-синтазы и донора N0 - роль NO-зависимого синтеза HSP70 в защитных эффектах адаптации к теплу при тепловом шоке.

На третьем этапе была разработана оптимальная модель адаптации культуры клеток к умеренным тепловым воздействиям. Выбор модели для использования в дальнейшей работе проводился по эффективности адаптационной защиты клеток при тепловом шоке. Степень повреждения и защиты клеток оценивали по изменению общего синтеза белка и уровня АТФ.

На четвертом этапе на выбранной модели с применением ингибитора NO-синтазы и донора N0 была оценена роль NO-зависимого синтеза HSP70 в защитных эффектах адаптации к теплу при тепловом шоке. Было проведено сопоставление данных, полученных на культуре клеток и целом организме.