Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Роль апоптоза и оксида азота в патогенезе ревматоидного артрита

На правах рукописи

ДУБИКОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ

РОЛЬ АПОПТОЗА И ОКСИДА АЗОТА В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

14.00.39 - Ревматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена во Владивостокском государственном медицинском университете

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Шуматова Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сперанский Анатолий Илларионович доктор медицинских наук, профессор Чичасова Наталья Владимировна доктор медицинских наук, профессорЯрилин Александр Александрович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится 15 апреля 2005 г. в 13:00 на заседании Диссертационного совета Д 001.018.01 при Институте ревматологии Российской академии медицинских наук по адресу: 115522, г. Москва, Каширское шоссе, д. 34-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ревматологии РАМН.

Автореферат разослан 15 марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^

кандидат медицинских наук V ДыдыкинаИ.С.

ЖЪЪЧС

Актуальность проблемы

Ревматические заболевания (РЗ) в последние годы привлекают все большее внимание ученых в силу своей высокой распространенности и социальной значимости. Поражая преимущественно лиц трудоспособного возраста, они приводят к ранней инвалидизации, имеют тенденцию к про-грессированию, значительно укорачивают продолжительность жизни. Среди РЗ особое теоретическое и медико-социальное значение имеет ревматоидный артрит (РА), классический пример хронических воспалительных заболеваний человека [Насонов Е.Л., 2001]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется около 300 тысяч больных РА, а болезненность по этому заболеванию по данным статистики составляет 2,75 на 1000 лиц 18 лет и старше [Насонова 8.А., Фоломеева О.М., 2001; Насонова В.А. и др., 2003; Шостак H.A. и др., 1999].

Высокая социально-экономическая значимость РА связана с тем, что на лечение больных расходуются огромные средства, существенно превышающие бюджет других хронических заболеваний [Лила А.М., 2001]. Распространенность РА в мире составляет 0,5 - 1% [Насонова В.А., 1997; Эр-дес Ш. и др., 1999; Harris E.D., 1997; Silman A.J., 1988]. Прямые медицинские затраты на лечение больных РА в США оцениваются, согласно различным источникам, от 3,7 до 8,6 млрд. долларов в год [Bloom B.C., 1988]. При этом пациенты, страдающие РА, используют ресурсы здравоохранения в значительно большей степени, чем страдающие другими заболеваниями внутренних органов. Так, в Швеции стоимость медицинского обеспечения больных РА в 2,5 раза выше, чем прямые затраты на обслуживание пациентов, не страдающих PA [Jonsson В. et al., 1992]. Показано также, что средняя продолжительность жизни при РА достоверно на 10 - 15 лет короче ожидаемой возрастных уровней, а 5-летняя выживаемость у больных с системными вариантами не превышает 50% [Насонов Е.Л., 2002]. Прогноз заболевания при РА со значительной деструкцией суставов сравним с таковым у больных атероскперотическим поражением трех коронарных сосудов и у больных с IV стадией ходжкинской лимфомы [Насонов Е.Л., 2003].

Существенными звеньями или составляющими элементамиборьбы с РЗ являются их своевременная диагностика, выяснение этиологии и патогенеза заболеваний, их профилактика и лечение. Многие аспекты этих вопросов при РА остаются неясными и, как следствие этого, сохраняется запоздалая диагностика, хронизация течения, отсутствие надежной этиопа-тогенетической терапии, позволяющей в ранние сроки прервать прогрес-сирование патологического процесса и, тем более, привести к регрессу наступивших патологических органических изменений. Исследования в этом направлении не потеряли актуальности.

Проведенный анализ литературы показал, что развитие научно-обоснованной концепции патогенеза РА за последние годы достигло заметных успехов. Они связаны, главным образом, с выяснением ряда важных патогенетических звеньев аутоиммунного процесса, свойственного этому заболеванию, и возможностью их нейтрализации с помощью специфических антител. В то же время, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, удовлетворительной общей концепции патогенеза РА не существует, что иллюстрируется недостаточной клинической эффективностью используемых терапевтических подходов [Си-гидин Я .А., Лукина Г.В., 2001].

Раскрытие механизмов гиперплазии синовиальной оболочки, сопровождающейся появлением пренеопластических характеристик у синовиальных макрофагов и фибробластов в виде экспрессии протоонкогенов и особой инвазивности [Smith M.D., 2004] невозможно без уточнения следующих проблем:

- роль апоптоза в развитии РА на ранней и поздней стадиях патологического процесса;

- роль NO-CHнтазной компоненты на разных этапах развития РА;

- взаимосвязь продукции оксида азота и апоптоза в процессе эволюции РА;

- взаимоотношения цитокиновой сети сфеноменом апоптоза и продукцией оксида азота при РА.

Изучение этих механизмов даст новое, более целостное, концептуальное представление о патогенезе РА, особенно ранних стадий, что позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторинга и лечения этого тяжелого заболевания.

Цель работы: определить значение апоптоза и оксида азота в механизмах развития ревматоидного артрита и оценить возможность прогнозирования течения, эффективности проводимой терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние и динамику NO-синтазной функции убольных РА.

2. Определить роль про- (Fas, р53) и антиапоптотических (Вс1-2) механизмов в развитии РА.

3. Установить характер изменения нитрооксидпродуцирующей функции клеток синовиальной оболочки в условиях экспериментального адъ-ювантного артрита.

4. Выяснить роль апоптоза (Fas, р53, Вс1-2 опосредованные звенья) в развитии экспериментального адъювантного артрита.

5. Оценить взаимосвязь между нитрооксидпродуцирующей функцией, феноменом апоптоза и цитокиновым профилем у больных РА.

6. Установить соотношения между продукцией оксида азота, апоптозом, синтезом цитокинов и кпинико-лабораторнымихарактеристиками РА.

7. Установить влияние различных терапевтических программ на нитро-оксидлродуцирующую функцию, апоптоз, цитокины у больных РА.

Научная новизна работы

В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота и апоптоза у больных РА.

Впервые выявлены специфические особенности экспрессии про- и ан-тиапоптотических маркеров на ранней и поздней стадиях патологического процесса, что проясняет роль апоптоза в эволюции РА.

Впервые установлена протективная роль индуцибельной нитрооксид-синтазы в развитии аутоиммунного воспаления суставов.

Представлены в динамике взаимоотношения между продукцией оксида азота, апоптозом и цитокиновым профилем, что позволило выяснить новые звенья патогенеза РА.

Продемонстрирована возможность прогнозирования степени тяжести и течения РА путем мониторинга маркеров апоптоза (Вс1-2, вРав).

Оценена динамика нитроксидсинтетической функции, апоптоза и цито-кинового профиля в зависимости отпроводимойтерапии. Показана возможность использования биохимических и иммуноцитохимических показателей для объективизации контроля за эффективностью проводимой терапии.

Практическая ценность

Проведенные исследования показали, что установленная закономерность экспрессии Вс1-2, р53 и эРаэ молекул апоптоза на ранних и поздних стадиях РА позволяет прогнозировать течение патологического процесса и, соответственно, подбирать адекватные терапевтические программы.

Доказанная протективная роль индуцибельной нитрооксидсинтазы на ранних стадиях аутоиммунного воспаления суставов определяет нецелесообразность использования в лечебных схемах селективных блокаторов последней и определяет необходимость синтеза противовоспалительных препаратов доноров оксида азота.

Продемонстрирована способность некоторых базисных препаратов инициировать апоптоз синовиальных клеток и положительно влиять на цитокиновый профиль у больных РА.

С новых позиций обоснована необходимость как можно более ранней базисной терапии у больных РА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интенсивность апоптоза клеточных элементов синовиальной оболочки значительно различается на ранней и поздней стадиях развития РА.

2. Основным механизмом, определяющим активность апоптоза на разных стадиях эволюции РА является различный уровень экспрессии молекул р53, Вс1-2 и sFas.

3. Активная фаза РА сопровождается присутствием в синовиальной оболочке всех трех изоформ NOS с различным паттерном экспрессии в зависимости от длительности течения заболевания.

4. Цитокиновый профиль синовиальной жидкости на разных стадиях РА отличается гетерогенностью и наличием связей с нитрооксидпроду-цирующей функцией синовиальной оболочки, атакже клиническими индексами активности заболевания.

5. Определение активности про- и антиапоптотических молекул, метаболитов оксида азота, цитокинов синовиальной жидкости у больных РА позволяет прогнозировать течение заболевания и эффективность проводимой терапии.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Приморского краевого терапевтического общества (Владивосток, 2001-2003), на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2004; Владивосток, 2004), в рамках научной сессии ДВО РАН и СО РАМН «Новыетехнологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Владивосток, 2004), IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, 2004), Конгрессе европейской противоревматической лиги (EULAR, Берлин, 2004), Конгрессе международной ассоциации по остеоартрозу (0AS1, Чикаго, 2004).

Публикация результатов работы

По теме диссертации опубликовано 18 статей в отечественных и международных журналах и сборниках (8 - в центральной и 2 - в зарубежной печати), а также 1 монография.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя.

Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и иллюстрирована 47 таблицами, 28 рисунками, 1 схемой. Библиографический указатель содержит 346 источников из них 48 отечественных и 298 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных

В исследование были включены 174 больных, общая характеристика которых представлена в Табл. 1. Средний возраст больных составил 42,34±1,49лет, средняя продолжительность заболевания - 5,32±0,75 лет. Диагноз РА у всех больных соответствовал критериям Американской Ревматологической Ассоциации [Агпей ЯС. ег а!., 1988]. У всех больных был «классический» серопозитивный РА, течение которого отличалось стойко сохраняющейся активностью, несмотря на применение НПВП и отсутствием спонтанных и лекарственно индуцированных ремиссий.

Условия отбора больных были следующими:

- наличие признаков активной фазы заболевания;

- серопозитивность по ревматоидному фактору;

- наличие показаний для применения базисной терапии;

- отсутствие противопоказаний для всех применявшихся базисных средств;

- отсутствие базисной терапии в течение двух предшествовавших месяцев.

В исследование не включались больные с функциональными нарушениями 4 класса, тяжелыми сопутствующими заболеваниями (сахарный диабет 1 или 2 типа, хроническая сердечная недостаточность 3, 4 функционального класса, хроническая почечная недостаточность в терминальной стадии, дыхательная недостаточность 2, 3 степени, злокачественные опухоли), требующими активного лечения. Так же не включались больные с синдромом Фелти, болезнью Стилла, синдромом Шегре-на, вторичным амилоидозом, цитопениями. Исключались больные, получавшие системную глюкокортикоиднуютерапию, а в случае локального введени я стероидов соблюдался перерыв в течение 6 месяцев после последней инъекции.

Больные отбирались по мере поступления в стационар, после клинического, лабораторного и инструментального обследования. В этот период проводилась симптоматическая терапия только нестероидными противовоспалительными препаратами. За сутки до забора исследуемого материала симптоматическая терапия отменялась.

Активным признавался такой вариант РА, при котором число воспаленных суставов составляло не менее 6 (при отсутствии необратимых нарушений со стороны этих суставов), число болезненных суставов - не менее 9, длительность утренней скованности - не менее 45 мин., СОЭ - не менее

21 мм/час (обязательным считалось наличие первого признака и любых 2 из 3 других) [Paulus Н.Е. et al., 1990].

Стадии РА оценивались на основании изменений, выявляемых на рентгеновских снимках суставов кистей и дистальных отделов стоп, в соответствии с критериями Steinbroker [Steinbroker О. et al., 1949].

Для характеристики активности воспаления использовался индекс активности болезни DAS28 [Prevoo M.L.L. et al., 1995], в котором оценивались болезненность и припухлость 28 суставов, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), общее состояние здоровья пациента по 100 мм визуальной аналоговой шкале (ВАШ). Низкая активность соответствовала значениям индекса DAS28 < 3,2, средняя - 3,2 -5,1, высокая - >5,1.

Функциональный класс больных РА оценивался по классификации Американской коллегии ревматологов [Hochberg М.С. et al., 1992].

Больных разделяли на две группы: с ранним РА (длительность течения от 2 месяцев до 3 лет) и поздним РА (более 3 лет), соответственно. В группе раннего РА различали очень ранний РА (длительность течения от 2 до 9 месяцев) и поздний ранний РА (9 месяцев до 3 лет) [Nell V.R et al., 2004].

В зависимости от наличия или отсутствия эрозий костных структур в суставах кистей или стоп, по истечении 24 месяцев от начала заболевания, выделяли неэрозивный РА и эрозивный PA [Larsen А. et al., 1977; Vencovsky J., 2003].

Таблица 1

Общая характеристика больных

Пол (женщины/мужчины) 144/30

Возраст больных к началу исследования (годы/количество) 20-29 30-39 40-49 50-59 >60

28 36 56 30 24

Длительность РА (годы/количество) до1года1-3 4-6 7-9 >10

35 35 47 28 29

Серолозитивность по ревматоидному фактору (% больных) 100%

Активность РА (% больных) 1 степень 2 степень 3 степень 5,17% 72,99% 21,84%

Рентгенологическая стадия (% больных) 12 3 4 17,24% 42,53% 37,93% 2,30%

Функциональный класс (% больных) 12 3 24,13% 68,97% 6,90%

Внесуставные проявления (% больных) 33,33%

Внесуставные проявления РА имели место у 60 больных. Повышение температуры до субфебрильного уровня отмечалось у 48 больных, ревматоидные узлы - у 26 больных, полинейропатия - у 12 больных, анемия - у 18 больных, асептический некроз головки бедренной кости - у5 больных, дигитальный вас кул ит - у 3 больных, синдром Рейно - у 3 больных.

Сопутствующие заболевания выявлены у 54 больных (31%), в том числе: мягкая артериальная гипертензия - у 43 больных, ишемическая болезнь сердца (стенокардия напряжения 1,2 функциональный класс - у 21 больного), узелковый остеоартроз - у 12 больных.

Перед назначением базисных препаратов всем больным было проведено комплексное обследование с целью уточнения основного диагноза.

В связи с наличием клинико-лабораторной активности заболевания базисная терапия метотрексатом была назначена 49 больным, лефлюна-мидом - 37 больным, ремикейдом в комбинации с метотрексатом - 15 больным, синхронная интенсивная терапия - комбинация плазмафереза с пульс-терапией дексаметазоном и метотрексатом - 42 больным. Базисные препараты назначались в следующих дозах: метотрексат - 15мг в неделю, лефлюнамид - начальная доза 100 мгтри дня подряд, поддерживающая доза 20мг ежедневно, ремикейд из расчета Змг/кг массы тела в/в капельно через 2, 4, 8 недель, а затем каждые два месяца, синхронная интенсивная терапия в виде комбинации трех сеансов плазмафереза с интервалом в два дня, а затем трех сеансов с интервалом в неделю с пульс-терапией метипредом 250 мг внутривенно и пульс-терапией метотрексатом 20 мг внутривенно.

Оценка эффективности базисных препаратов проводилась не ранее двенадцати месяцев после начала лечения. Оценивалась динамика следующих показателей: число воспаленных суставов, число болезненных суставов, показатель DAS28, длительность утренней скованности, общее состояние здоровья пациента по ВАШ (по мнению врача и пациента), величина СОЭ, гемоглобина.

Комбинированный индекс активности PA DAS28 рассчитывали по формуле:

DAS28 = 0,56*/(tj28) + 0,28*/(sw28) + 0,70*Ln(ESR) + 0,014*VAS,

где

tj - число болезненных суставов;

sw - число воспаленных суставов;

ESR - скорость оседания эритроцитров;

VAS - визуальная аналоговая шкала;

Методы лабораторного и инструментального исследования

До и после лечения исследовали уровни интерлейкинов 1(3, 6, 10, ТЫЯ-а а также концентрацию растворимого рецептора эРаэ в сыворотке крови, синовиальной жидкости больных, полученной при пункции коленного сустава. Определяли нитрат - и нитрит - ионы в биологических жидкостях: сыворотке крови, моче, синовиальной жидкости.

Таблица 2

Методы и объекты исследования

№ Методы исследования Объект исследования (кол-во образцов)-

человека мышей

1. Общегистологический 78+7 (контроль) 22+10 (контроль)

2. Гистохимический (активность NADPH- диафоразы) 48+7 (контроль) 22+10 (контроль)

3. Иммуноцитохимический (n-NOS, i-NOS, Bel-2, р-53) 58+7 (контроль) 20+10 (контроль)

4. Определение апоптотической активности методом TUNEL 52+7 (контроль) 20+10 (контроль)

5. Электронная микроскопия 6 -

6. Иммуноферментный анализ сыворотки крови (TNF-a, IL-1P, IL-6, IL-10, sFas) 170+40 (контроль)

7. Иммуноферментный анализ синовиальной жидкости (TNF-a, IL-ip, IL-6, IL-10, sFas) 82+10 (контроль)

8. Определение N02 и N03 в сыворотке 154+40 (контроль) -

9. Определение N02 и N03b моче 154+40 (контроль) -

10. N02 и N03b синовиальной жидкости 84+10 (контроль) -

С помощью гистохимического, иммуноцитохимического и общеморфологического методов исследовали образцы синовиальной оболочки коленного сустава 70 женщин и 8 мужчин в возрасте 25 - 56 лет с диагнозом РА. Материал получали во время артроскопии и синовкапсулэктомии, проведенных согласно показаниям (непрерывно рецидивирующий синовит коленного сустава в течение не менее чем 2 месяцев). Информационное согласие было получено от всех пациентов. Работа была утверждена Комитетом по этике научных исследований Владивостокского государственного медицинского университета.

В качестве контроля использовались образцы синовиальной оболочки и хряща 7 здоровых мужчин в возрасте от 21 до 50 лет, погибших от комбинированной травмы (забор материала производился в течение не более 2

часов после наступления смерти), а также кровь и моча 40 здоровых доноров (28 женщин и 12 мужчин в возрасте от 18 до 63 лет). Забор синовиальной жидкости для контроля проведен у 10 пациентов (4 мужчины и 6 женщин в возрасте от 25 до 55 лет) во время эксплоративной артротомии коленного сустава по поводу предполагавшегося повреждения менисков. Образцы сыворотки крови и синовиальной жидкости немедленно после забора замораживались при температуре - ЗО^С.

Характеристика экспериментального материала

Экспериментальная часть исследований включала создание модели адьювантного артрита нелинейных мышах. В соответствии с поставленными задачами в качестве объекта исследования выбрана линия мышей C57Black6, для которых характерен иммунный ответ с активацией Thl субпопуляции лимфоцитов. В ходе эксперимента изучались морфологические изменения в тканях коленного сустава мышей, Проводилось определение активности NADPH-диафоразы и иммуноцитохимические исследования с целью выявления локализации конститутивной (n-NOS) и индуцибельной изоформ (¡-NOS) NOS, а так же маркеров апоптоза - Вс1-2 и р-53 (Табл. 2).

Работа выполнена на 22 взрослых самцах мышей весом по 80-110г. Животным параартикулярно (коленный сустав) вводилось по 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда. В качестве контроля использовались 10 интактных мышей этой же линии.

Полный адьювант Фрейнда представляет собой взвесь убитых термической обработкой микобактерий туберкулёза (MAFF) в минеральном масле (SIGMA) и широко используется для индукции артрита, подобного ревматоидному у экспериментальных животных [Audibert F., Chedid L., 1976; Chillingworth N.L., Donaldson L.F., 2003; Knight B. et al., 1992].

Адьювантный артрит сопровождается типичной аутоиммунной реакцией, основным звеном которой является Т-клеточный иммунитет [Синячен-ко О.В. и др., 1991; Klareskog L. et al., 1995; Oliver S.J., Brahn E., 1996].

Мыши содержались в одинаковых условиях вивария при 12 часовом дневном и 12 часовом ночном цикле в течение 30 дней. Пища и вода давались ad libitum. Животных выводили из эксперимента по две на 7 и 30 сутки после введения адьюванта. Эвтаназию животных осуществляли путём декапитации под тиопентаповым наркозом. Забор материала производился в течение 10 минут, задние лапки мышей были ампутированы и фиксированы в 3% растворе параформальдегида приготовленном на 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,4) в течение часа, затем хранились при комнатной температуре в декальцинирующем растворе, содержащем 5,5 ЭДТА, 90 мл дистиллированной воды и 10мл 10% формалина. Процесс декальцинации

занял 9 недель, при этом раствор обновлялся каждые 7 дней. После фиксации и декальцинации часть материала заливали в парафин для изучения морфологических изменений по общепринятой методике, часть образцов промывали в 30% растворе сахарозы на фосфатном буфере (рН7,4) в течение 12-24 часов при 14°С, подготавливая для иммуноцитохимических и гистохимических исследований.

Общеморфологические методы исследования

Материал для общеморфологических и иммуногистохимических исследований сразу после забора в течение 2-х часов фиксировали в 4% пара-формальдегиде, приготовленном на 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,4) при температуре 4°С, затем сутки промывали в 30% забуференном растворе сахарозы при той же температуре для криостатных срезов. Готовили серийные срезы толщиной 50 мкм (для проведения гистохимической реакции на NADPH-d) и 20 мкм (для проведения иммуногистохимической реакции) во фронтальной плоскости на криотоме. Часть материала заливали в парафин пообщепринятой методике.

Парафиновые срезы интраоперационных образцов и тканей и полученных в ходе эксперимента на мышах, окрашивали гематоксилином и эозином для интерпретации морфологических изменений.

Метод электронной микроскопии

Для ультрасгрукгурных исследований образцы фиксировали в 2,5% растворе глугарового альдегида на 0,05 M какодилатном буфере в течение 1 час.

После фиксации материал промывали в 2,5% какодилатном буфере (24 часа) и дофиксировали 1% раствором 0s04 на 0,05 M растворе того же буфера (1 час). После промывки дистиллированной водой (24 часа) материал обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации (50%, 70%, 96%, 100%, по 30 минут в каждом) и помещали в 100% изопропанол на 20 минут. Затем замещали изопропанол заливочной средой SPURR (SIGMA), выдерживая в смеси изопропанол-SPURR 1/2 и 2/1 (по 30 минут в каждой) и помещали материал в заливочную среду на 1 час, после чего, во второй порции смолы материал помещали на полимеризацию при температуре 60°С на 48 часов. Срезы изготовлялись на ультратоме Ultra-Cut, полутонкие срезы окрашивали раствором метиленового синего, а ультратонкие срезы контрастировал ись растворами уранилацетата и цитрата свинца. Ультратонкие срезы анализировали на электронном микроскопе Jeol Jem 100В.

Гистохимическое выявление активности NADPH-диафоразы

Для определения суммарной активности нитрооксидсинтазы в клетках синовиальной оболочки и хряща использовался метод V.T. Норе, S.R.Vincent

на NADPH - диафоразу, с учётом того, что этот фермент является специфическим топохимическим маркером NOS [Hope В.Т., Vincent S.R., 1989]. Метод основан на образовании нерастворимого осадка диформазана в присутствии NADPH и нитросинего тетразолия. Плотность этого преципитата считается прямо пропорциональной активности NOS в содержащих его структурах [Hope В.Т., Vincent S.R., 1989]. Получены данные, что i-NOS-им-мунореактивность и NADPH-диафоразная позитивность обнаруживается в одних и тех же зонах и типах клеток синовиальной оболочки при ревматоидном артрите [Pozza M. et al., 2000].

После фиксации и промывки срезы замороженных образцов монтировали на предметные стёкла и помещали в среду, состоящую из 50 мМ трис-буфера (рН-8,0), 1 мМ NADPH ("Sigma" USA), 0,5 мМ нитросинего тетразолия ("Sigma'USA), 0,2 тритон Х-100 ("ISN" USA). Инкубацию проводили в течение 60 минут при температуре 37°С, обезвоживали и заключали в дамарный лак.

Визуализацию изображения микропрепаратов на компьютере получали с помощью микроденситометра Vickers М-85. Цифровую обработку полученных материалов проводили с помощью компьютерных программ Adobe Photoshop 6,0 и Microsoft Excel 98. Активность фермента и оптическую плотность осадка выражали в единицах оптической плотности.

Иммуноцитохимические методы исследования

На образцах синовиальной оболочки коленного сустава человека и тканях коленного сустава экспериментальных животных изучали локализацию n-NOS, i-NOS, Bcl-2 и р-53.

Срезы толщиной 20 мкм помещали в фосфатный буфер. Иммуноцитохи-мическое окрашивание срезов включало несколько последовательных этапов: преинкубация, обработка в растворе первичных антител, обработка вторичными антителами и постановка иммунопероксидазной реакции.

Для преинкубации свободно плавающие срезы выдерживали в течение 3-4 часов при 4°С в 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 3% нормальную козью сыворотку (НКС) и 0,25% Тритон Х-100 (Serva).

Обработка первичными антителами. В работе использованы кроличьи поликлональные антисыворотки против n-NOS (1:10), i-NOS (1:10), Bel и р-53 (готовые растворы). Сыворотки растворяли в отдельных порциях 0,1 M фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 0,25% Тритона Х-100, 3% нормальной сыворотки козы (НКС). Срезы инкубировали в течение 48 часов при 4°С, после чего промывали в трех сменах фосфатного буфера по 5 мин, в каждой смене раствора.

Последующая обработка вторичными антителами и постановка иммунопероксидазной реакции осуществлялись в соответствии с требования-

ми, прилагаемыми к ImmunoCruz Staining Sistem (Santa Crus). Для этого срезы последовательнообрабатывали вторичными биотинилированными антителами козы против иммуноглобулинов кролика в течение суток при температуре 4°С. После четырёхкратной отмывки в фосфатном буфере на один час погружали в раствор стрептавидин-биотина. Хромогеном в реакции служил 0,05% раствор ДАВ (3,3'-тетрагидрохлорида диаминбензиди-на) (Sigma) на фосфатном буфере с добавлением 0,01% Н202

Затем срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, монтировали на предметные стёкла, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике. Позитивная иммуноцитохимическая реакция характеризуется отложением в цитоплазме клеток мелко - или грубозернистого преципитата коричневого цвета.

Метод изучения апоптоза

Методы выявления апоптоза достаточно разнообразны. Более доказательные подходы к оценке апоптоза основаны на выявлении формирующихся разрывов ДНК, ее деградации. В своей работе мы использовали метод, основанный на синтезе олигонуклеотидов из меченных предшественников, катализируемом дезоксирибонуклеотодилтрансферазой (TdT), и их встраивании в ДНК через ее свободные концы, формирующиеся в участках разрывов с помощью иммуноцитохимического метода TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferase-mediated dUTP nick end-labeling), основанного на выявление фрагментированных цепочек ДНК. Интраопера-ционный и полученный в ходе эксперимента материал фиксировали в течение 2 ч при 4°С в охлажденном 4% параформальдегиде, приготовленном на 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,4). Образцы промывали в течение суток в 0,1 M фосфатном буфере с 7-8 кратной сменой раствора, а затем погружали в 15% забуференный раствор сахарозы. Срезы толщиной 20 мкм изготавливали в криостате, монтировали на предметные стекла и дополнительно фиксировали в охлажденном растворе этанол -уксусной кислоты в течение 5 минут при -20°С, после чего промывали дважды по 5 минут в фосфатном буфере. На срезы наносили 75 мкл уравнивающего буфера, в котором выдерживали не менее 10 сек при комнатной температуре. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon). Срезы инкубировали в течение 1 час в растворе Fap-фрагмента вторичных антител свиньи против Ig кролика, конъюгированные с FITC (Dako). Срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, заключали в глицерин и просматривали в фильтре FITC-типа (В1450-490 нм)через микроскоп Polyvar. Часть срезов окрашивали толуидиновым синим.

Количественную оценку TUN Et-позитивных ядер проводили с помощью окуляр-морфометрической сетки на участках ткани хряща и синовии размерами 100x100 мкм. Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL- позитивных ядер {.NTUNEt) к количеству клеток, окрашенныхтолуидиновым синим и имеющих видимое непикнотизирован-ное ядро (NT) по формуле AH=(/VruN£1xl00)/ Nr Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t-критерия достоверности по Стьюденту (Р<0,05).

Определение уровня цитокинов

в сыворотке крови и синовиальной жидкости

Количественное определение цитокинов в исследуемых сыворотках крови и пробах синовиальной жидкости проводилось методом твёрдофаз-ного иммуноферментного анализа с использованием наборов BioSource Internationa! для IL-lß, IL-10, IL-6, TNF-a и набора Bender MedSystems для определения растворимого Fas-рецепторэ на базе иммунологической лаборатории Городского ревматологического центра г. Владивостока.

Перед проведением анализа приготавливались реагенты в соответствии с прилагаемыми рекомендациями.

В лунки планшета, покрытого антителами вносились исследуемые образцы и стандарты. После промывки добавлялись вторые биотинилирован-ные моноклональные антитела, которые связывались с иммобилизованными в лунках антителами, захваченными на первом этапе.

После удаления избытка вторых антител добавлялась стрептавидин-пе-роксидаза, которая связывалась с биотинилированными антителами с образованием сэндвич-комплекса из четырех реагентов.

После инкубации и промывки удалялся несвязавшийся фермент, после чего добавляли субстратный раствор ТМВ, который взаимодействовал в ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность онраски полученного раствора, прямо пропорциональна концентрации цитокина, присутствующего в пробе.

Оптическую плотность стандартов и образцов измеряли на универсальном микропланшетном ридере для иммуноферментного анализа (Humareader Single, ФРГ) при длине волны 450 нм.

Далее, используя графическую бумагу, отмечали точки считанных значений поглощения стандартов на вертикальной оси Y, а соответствующие концентрации на горизонтальной оси X. Строили калибровочную кривую и определяли концентрацию цитокинов в образцах по построенной кривой в пг/мл.

Определение метаболитов оксида азота

Определение концентрации нитрита и нитрата в пробах сыворотки крови, мочи и синовиальной жидкости выполнялось на базе Лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (заведующий лабораторией профессор П.А. Лукьянов).

Пробы мочи центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин на настольной центрифуге MPW-310 (Польша). К пробам (0,1 мл) последовательно добавляли 1%-ный раствор сульфаниламида в 5%-ной фосфорной кислоте (0,05 мл) и 0,1%-ный раствор М-(1-нафтил)этилендиамина в дистиллированной воде (0,05 мл). Оптическую плотность, полученных растворов измеряли при длине волны 570 нм на микропланшетном спектрофотометре pQuant (Biotek Instruments Inc., США). Концентрацию нитрит-ионов в пробах рассчитывали с помощью калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали раствор нитрита натрия в концентрациях от 0 до 50 мкМ.

Подготовка кадмия для восстановления нитрат- до нитрит-ионов в пробах сыворотки крови и синовиальной жидкости проводили следующим об-разомю. Кадмиевую стружкутщательно промывали водой, затем для осаждения белка 0,1 М соляной кислотой, 4 %-м раствором сульфата меди и снова водой. К пробам (0,25 мл) добавляли дистиллированную воду (0,7 мл), 30%-ный раствор сульфата цинка (0,05 мл), встряхивали и инкубировали при 20°С в течение 15 мин. Пробы центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин. К полученным супернатантам добавляли кадмиевую стружку (5 мг) и оставляли на ночь при комнатной температуре на качалке Heidolph Duomax 1030 (Германия) при 50 об/мин. Затем пробы центрифугировали, как описано выше. К надосадочной жидкости (0,1 мл) последовательно добавляли 2%-ный раствор сульфаниламида в 3 N соляной кислоте (0,05 мл) и 0,2%-ный раствор 1Ч-(1-нафтил)этилендиамина в дистиллированной воде (0,05 мл). Измеряли оптическую плотность полученных растворов и рассчитывали концентрацию суммарных нитрит-ионов по той же калибровочной кривой в мкМ/мл. Концентрацию нитрат-ионов определяли по формуЛе- ^N03 =^IM03+N02 " ^N02

Статистическая обработка цифровых данных

Статистическая обработка всех полученных цифровых данных проводилась с использованием персонального компьютера по программе «Статистика 2». Подсчитывались следующие показатели: средняя арифметическая (М), среднее квадратичное отклонение (д), средняя ошибка средней арифметической (±т), коэффициент достоверности показателя (t) и различий (t и р), коэффициент линейной корреляции (±г), ошибка и достоверность коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Резюмируя содержание настоящей работы, остановимся на нескольких ключевых вопросах:

I. Интенсивность апоптоза клеток синовиальной оболочки на разных стадиях развития РА.

II. Экспрессия про-(р53) и антиапоптотических молекул (sFas, Bcl-2) на ранней и поздней стадиях РА, а также их клиническое значение.

III. Активность индуцибельной и конститутивной форм NOS в процессе эволюции РА. Клинические аспекты оценки уровня метаболитов N0 в синовиальной жидкости.

IV. Динамика цитокинового профиля системного кровотока и синовиальной жидкости у больных РА, клинические параллели.

Результаты, полученные нами, указывают на низкую интенсивность апоптоза на ранних стадиях РА (Табл. 3). Причем эта особенность прослеживалась как у больных РА, так и в экспериментальной модели адьювантного артрита, что иллюстрируется небольшим количеством TUNEL-позитивных клеток в образцах синовиальной оболочки.

Таблица 3

Апоптотический индекс клеток хряща и синовиальной оболочки коленного сустава человека при ревматоидном артрите (РА) (x±sx)

Клеточные элементы Контроль п - 7 Ранний РА Поздний РА

Хондробласты - 0,07 ± 0,05 0,4 + 0,090

Хондроцигы - - 0,01 ± 0,03

Синовиальные лимфоциты - - 0,03 ±0,01

Синовиоциты - 2,1 ±0,5 5,8 ±0,20

Примечание: 0 - достоверность различия р<0,05.

Подобные результаты были получены в единичных работах при изучении синовиальной оболочки небольшого количества больных (8 человек) с ранним РА [Catrina A.I. et al., 2002].

Распространенность апоптоза коррелирует с длительностью и выраженностью воспалительной инфильтрации синовиальной оболочки. На поздней стадии РА нами выявлена значительная активизация апоптоза. Морфологический профиль апоптотических структур смещался в сторону фибробла-стов гипертрофированной синовиальной оболочки. Обращает на себя внимание высокий апоптотический индекс хондробластов. Очевидно, что этот феномен следует расценивать как субстрат вторичного дегенеративного

процесса в хряще. Полученные нами данные соответствуют наблюдениям, в которых авторы обнаружили увеличение количества клеток, подвергшихся апоптозу в хронической фазе адьювантного артрита [TakRR, Klapwijk M.S. etal., 2000].

Следовательно, можно говорить о различной интенсивности апоптоза клеточных структур синовиальной оболочки у больных РА на ранней и поздней стадиях (Табл. 3). Есть все основания полагать, что процессы регуляции апоптоза лежат в основе прогрессии ревматоидного синовита и, на клиническом уровне, это означает различную терапевтическую стратегию в зависимости от стадии течения PA [Smith M.D., Walker J.G., 2004].

Не менее важным вопросом является идентификация механизмов при участии которых меняется интенсивность программированной клеточной смерти на разных этапах эволюции РА.

В ранней фазе адьювантного артрита нами отмечена экспрессия р53 молекулы с последовательным нарастанием интенсивности (Табл. 4). Аналогичная последовательность прослеживается в образцах синовиальной оболочки, полученной от больных РА: на ранней стадии патологического процесса незначительная экспрессия р53 с выраженной гиперэкспрессией в поздней стадии (Табл. 5).

Таблица 4

Экспрессия р53 и Вс1-2 в синовиальной оболочке коленного сустава мышей при адьювантном артрите

Клетки Доля р53-позитивных клеток, % Доля Bcl-2-позитивных клеток, %

Контроль 7-й день эксперимента 30-й день эксперимента Контроль 7-й день эксперимента 30-й день эксперимента

Лимфоциты - 4,3 ±1,2 17,4±1,1* - 34,6 ±1,30 8,6 ±2,4*0

Синовиоцигы - 2,7 ±2,2 25,2±2,2* 1,1 ±0,9 12,4 ±2,20 2,6 ±1,2*

Примечание: * - достоверность различия между группами р<0,05;

О - достоверность различия между группами р<0,01

Подобную гиперэкспрессию р53 описывают при многих хронических воспалительных процессах: воспаление в атеросклеротических бляшках [Ihlung et al., 1997], идиопатическом фиброзирующем альвеолите [Kuwano К. et al., 1996], Helicobacter pylori-ассоциированном гастрите [Hibi К. et al., 1997], язвенном колите, болезни Крона [Krishna М. et al., 1995], лимфоци-тарном тиреоидите [Okayasu I. et al., 1998]. Подтверждением участия р53 в развитии апоптоза при РА служит исследование, в котором у мышей линии DBA/1 дефицитных по р53 молекуле в модели коллаген-индуцированного артрита апоптоз клеточных элементов синовиальной оболочки отсутство-

вал [Yamanishi Y., Boyle D.L., Pinkoski M J. et al., 2002]. Более того, нейтрализация функции р53 добавлением белка Е6 в культуру человеческих синовиальных клеток ассоциировалась с резким усилением пролиферативных процессов и инвазией в хрящевую ткань у мышей линии SCID[PapT.etal., 2001].

Таблица 5

Относительное содержание и распределение р53-иммунореактивных клеток в синовиальной оболочке

на разных стадиях РА у человека (%)

Клетки Контроль п-7 Ранний РА Поздний РА

Лимфоциты воспалительных инфильтратов 2,7 ±0,5 5,1 ±0,30

Синовиоциты - 4,8 ±1,5 12,3 ±0,50

Примечание: 0 - достоверность различия р<0,05.

Надо отметить, что интенсивность апоптоза и гиперэкспрессия р53 не совпадали во времени: гиперэкспрессия р53 предшествовала активизации апоптоза. Очевидно, что определенную роль в развитии или торможении апоптоза должны играть и другие факторы.

При участии индуцибельной формы NOS возможен синтез больших количеств N0 послестимуляции цитокинами во многих типах клеток, что приводит к высокой локальной концентрации мессенджера и последующим цитотоксическим эффектом, повреждением тканей и структуры ДНК. Можно предполагать, что р53 может реагировать на эндогенные эффекты высоких концентраций N0. Действительно, на ранних стадиях РА, когда экспрессия р53 была незначительной, мы обнаружили гиперэкспрессию i-NOS в синовиальной оболочке больных РА (Табл. 9). Аналогичные результаты получены в модели адьювантного артрита (Табл. 6). Напротив, на поздних стадиях РА и адьювантного артрита при нарастающей гиперэкспрессии р53 нами выявлено существенное снижение экспрессии ¡-NOS.

Таблица 6

Локализация i-NOS и c-NOS в синовиальной оболочке коленного сустава мышей при адьювантном артрите

Клетки Доля i-NOS-позитивных клеток, % Доля n-NOS-позитивных клеток, %

Контроль 7-й день эксперимента 30-й день эксперимента Контроль 7-й день эксперимента 30-й день эксперимента

Лимфоциты - 93,3 ±1,2 36,2 ±3,2* - 97,1 ±2,2 52,3 ±3,1*

Синовиоциты - 74,6 ±2,1 23,2 ±1,1* 1,1 ±0,9 68,4 ±3,10 42,6 ±2,2*

Примечание: * - достоверность различия между группами р<0,05;

О - достоверность различия между группами р<0,01

Данные, представленные нами (со-локализация экспрессии р53 и NADPh-диафоразы в клетках синовиальной оболочки) указывают на то, что аккумуляция р53 молекулы на поздних стадиях РА может наблюдаться в ответ на стимуляцию эндогенным фактором, в частности N0. Это соответствуют предложенной в последние годы концепции о наличии отрицательной регуляторной петли между синтезом N0 и экспрессией р53 молекулы, согласно которой р53 осуществляет контроль за синтезом N0 через управление геном промоутером i-NOS [Forrester К. et al., 1996]. Репрессия гена промоутера ¡-NOS при участии р53 приводит к снижению синтеза эндогенного N0 и, соответственно, обеспечивает стабильность клеточного генома. Сообщается о том, что р53 способен репрессировать не только базальную активность i-NOS, но стимулированную цитокинами в различных человеческих клеточных опухолевых линиях различных гистологических субтипов. Подтверждением этому служит тот факт, что у подвергшейся мутации молекулы р53 подобных эффектов не наблюдалось [Forrester К. et al., 1996]. Воспроизводимое 4- и 10-кратное снижение активности гена промоутера i-NOS при участии р53 было аналогично таковому эффекту в отношении другого промоутера - Bcl-2 [Miyashita T. et al., 1994].

Таким образом, можно утверждать, что при РА существует отрицательная регуляторная связь между синтезом молекулы р53 и экспрессией i-NOS, что обеспечивает частичное управление процессом программированной клеточной смерти. Причем на ранних стадиях РА недостаточная экспрессия р53 не обеспечивает адекватной интенсивности апопотоза и клиренса иммунокомпетентных клеток, что способствует поддержанию и прогрессии воспалительного процесса в синовиальной оболочке.

Нами был выявлен совершенно противоположный паттерн экспрессии молекулы Bcl-2, известногоантиапоптотического фактора. Если ранняя стадия РА характеризовалась высокой интенсивностью экспрессии этой молекулы, то на поздней стадии ее практически не отмечалось (Табл. 7). Преимущественной локализацией молекулы Bcl-2 по нашим данным являются лимфоцитарные инфильтраты, поверхностный слой синовиальной оболочки, гладкомышечные клетки синовиальных сосудов. На поздней стадии характер локализации не изменялся, однако, интенсивность значительно снижалась. Приведем наблюдения, подтверждающие наши результаты: высокий уровень экспрессии Bcl-2 в гладкомышечных клетках сосудов синовиальной оболочки, полученной от больных РА [Perlman H. et al., 2000], более высокая концентрация иРНК Bcl-2 в синовиальной ткани больных РА в сравнении с больными остеоартрозом [184].

Таблица 7

Экспрессия Вс1-2 в структурах синовиальной оболочки человека

при РА (%)

Клетки Контроль ri - 7 Ранний РА п - 70 Поздний РА п -104

Лимфоциты воспалительных инфильтратов 7,6 ±1,1 0,8 ± ОД*

Синовиоциты 1,21+0,10 10,4 ±0,50 1,1 ± 0,2*

Примечание: * - достоверность различия между группами р<0,05;

О - достоверность различия между группами р<0,01

В противоположность результатам исследований с применением имму-ногистохимического метода изучение экспрессии Вс1-2 в клеточных культурах показало отсутствие различий между синовиальной тканью полученной от больных РА и OA. Подобный феномен известен и при изучении активности ядерного транскрипционного фактора NF-kB в синовиальной ткани и фибробластах больных РА и OA [Han Z. Etal., 1998; Marok R. et al., 1996]. Вместе эти факты позволяют предполагать, что активность Вс1-2, так же как и NF-kB, регулируется микроокружением, аточнее, цитокиновой сетью. Действительно, TNF-a [Wakisaka S. et al., 1998], IL-1 [Kawakami A et al., 1996] и другие провоспалительные цитокины индуцируют экспрессию Вс1-2 в синовиальных фибробластах. Таким образом, повышенная концентрация Bcl-2 в тканях in vivo не обязательно отражает характерные особенности клетки, но может модулироваться провоспалительными цитокинами.

В литературе упоминается способность i-NOS стабилизировать мембрану митохондрий, предотвращая расщепление молекулы Вс1-2 и, тем самым, не допускать развитие апоптоза [Kim Y.M. et al., 1999]. Обнаруженная нами высокая экспрессия i-NOS на ранней стадии РА (Табл. 9) способствовала стабильности молекулы Вс1-2 и это подтверждается обнаруженной нами солокализацией этих ферментов в одних и тех же типах клеток синовиальной оболочки. В поздней стадии РА активность i-NOS снижалась на фоне резкой регрессии Вс1-2.

Подавление экспрессии Вс1-2 в фибробластах, независимо от источника и состояния культуры клеток, сопровождалось выраженным апоптозом, что свидетельствует об отсутствии повышенной активности проапоптотических молекул [Perlman H. et al., 2000]. Наши данные убедительно подтверждают этот факт, поскольку на фоне гиперэкспрессии Вс1-2 мы не обнаружили гиперэкспрессии р53 и, наоборот, выявили повышенную концентрацию sFas.

Таким образом, мы обнаружили закономерный стереотип экспрессии Вс1-2 в синовиальной ткани в зависимости от стадии РА: от гиперэкспрес-

сии на ранней стадии до гипоэкспрессии на поздней стадии, причем гиперэкспрессия не сопровождалась повышением активности проапоптотичес-ких молекул.

Поскольку основной мишенью Вс1-2 семейства является митохондрия, то можно предполагать заинтересованность преимущественно митохондри-ального пути апоптоза при РА (второй вариант Fas-опосредованного апоп-тоза). В митохондриальном апоптозе молекула р53 играет важную роль в изменении стабильности мембраны митохондрий и, непосредственно, запуске программированной клеточной смерти [Rich Т. et al., 2000; Vousden К.Н., 2000]. В мембране митохондрий был обнаружен белок (р53А1Р1), опосредующий р53-зависимый путь апоптоза [Matsuda К. et at., 2002].

Действительно, если рассмотреть взаимоотношения р53 и Вс!-2, то складывается весьма логичная картина их взаимоотношений. Согласно нашим данным при интенсивной экспрессии Вс1-2 на ранней стадии РА и в острой фазе адьювантного артрита отмечается низкая экспрессия проапоптоти-ческой молекулы р53 и, соответственно, низкий апоптотический индекс (Табл. 8). Напротив, на поздней стадии РА и в хронической фазе адьювантного артрита резко возрастала экспрессия р53 и критически снижалась экспрессия Bcl-2, что сопровождалось интенсивным апоптозом клеточных элементов суставной среды. Некоторые авторы ранее высказывались в пользу способности р53 репрессировать ген-промоугер Bcl-2 [Miyashita Т. etal., 1994], и способности Bcl-2, в свою очередь, супрессировать проапоп-тотическую функцию р53 [Smith M.D., Walker J.G., 2004].

Следовательно, в процессе эволюции РА и его экспериментальной модели в виде адьювантного артрита «работает» молекулярный реостат Bcl-2/р53, который в значительной мере определяет апоптотическую активность клеток синовиальной среды сустава.

Экспрессия Bcl-2 молекулы исследовалась при многих заболеваниях, но практически ничего не известно о клиническом значении этой молекулы при РА. Высокий уровень экспрессии Bcl-2 ассоциировался с плохим прогнозом при карциноме мочевого пузыря [Atug F. et al., 1998], болезни Ходжкина [Smolewski Р. et al., 1998], раке предстательной железы [Moul J.W., 1999]. Кроме того, коэффициент Bcl-2/Bax показал хорошие прогностические характеристики при химиотерапии острого миелолейкоза [Bincoletto С. et al., 1999], рака желудка [Nakata В. et al., 1998].

Согласно нашим данным повышенная экспрессия Bcl-2 молекулы коррелировала с ЧВС (г=0,67, р<0,05) и функциональным классом больных РА (г=0,71, р<0,05). Это позволяет говорить о прогностической ценности антиапоптотического маркера и, одновременно, о новой мишени терапевтических воздействий.

Стереотип изменения концентрации эРаз, антиапоптотического фактора, полностью соответствовал направленности изменений экспрессии р53, Вс1-2 молекул и интенсивности апоптоза (Табл. 8). С увеличением индекса апоптоза на поздней стадии РА снижался уровень вРаэ в синовиальной жидкости. Максимальное снижение синтеза эРаэ на фоне лечения происходило у больных «очень ранним» РА. При отмеченных связях эРав со степенью активности РА (г=0,62, р<0.05) и функциональным классом больных РА (г=0,83,р<0,05), а также апоптотическим индексом (г= - 0,74, р<0,05) все вышесказанное позволяет использовать зРав как интегративный показатель напряженности и характера происходящих в синовиальной оболочке процессов программированной клеточной смерти. А большая доступность его использования в клинической практике в сравнении с р53 и Вс1-2 молекулами позволяет рекомендовать мониторинг эРаэ у больных РА с целью контроля за эффективностью проводимой терапии и определения прогноза.

Таблица 8

Апоптотические маркеры в группе «раннего» и «позднего» РА

Показатели Контроль Ранний РА Поздний РА

п-7 п-70 п-104

AI - 2,12 ±0,51 5,83 ±0,220

Bcl-2 1,21 ± 0,10 10,45 ± 0,5* 1,12 ±0,240

р53 - 4,86 ±1,53 12,34 ±0,510

Fas-ser (п-40) 333,25 ± 23,50 1618,76 ± 308,52* 3698,83 ± 387,45*0

Fas-sin (п-10) 210,42 ± 55,90 2665,21 ± 262,27* 1381,00 ± 216,52*0

Примечание: п - число больных в каждой группе;

*- достоверность различия с контрольной группой р<0,05; О - достоверность различия между группами р<0,05.

Полученные нами данные о меняющемся паттерне апоптоза в зависимости от стадии РА, подтвержденные в экспериментальной модели, подчеркивают необходимость уточнения роли нитрооксидсинтаз в этом процессе. Особенный интерес представляет выяснение функции каждой из NO-синтаз в развитии воспаления синовиальной оболочки, поскольку прежние представления об исключительно провоспалительной роли ¡-NOS утратили свое значение [Fletcher D.S. et al., 1998; Kubes P., 2000; Veihelmann A et al., 2001].

Представляется особенно важным подчеркнуть, что РА является примером хронического воспалительного процесса, который проходит различные стадии с различной скоростью прогрессии (от медленного до агрессивного течения) и сменой патогенетических стереотипов, что может определять патогенетическую роль каждой из NO-синтаз.

Результаты наших исследований показали, что уровень метаболитов N0 в крови повышался на ранней стадии РА, что подтверждает данные других авторов о вовлечении N0 в патологический процесс [Beri A. et at., 2004; Farrel AJ. et al., 1992; Onur 0. et al., 2001].

Отрицательные корреляционные связи между метаболитами N0 в сыворотке крови и индексами активности РА (длительность утренней скованности: г= -0,70 при р<0,05; СОЭ: г= -0,64 при р<0,05; DAS28: г= -0,72 при р<0,05), характеризуют возможную протективную роль i-NOS на ранней стадии РА. Снижение уровня метаболитов N0 к поздней стадии РА в этом случае должно совпадать со снижением экспрессии i-NOS в этой группе больных и характеризовать системный характер эффектов активации этого фермента у больных РА. В этой связи изучение характера экспрессии NO-синтаз дает более глубокое представление о роли нитрооксидергичес-кого механизма в развитии воспаления в синовиальной оболочке при РА и адьювантном артрите.

Нами выявлена достоверная иммунореактивность к i-NOS в гиперпластической синовиальной ткани больных с ранним РА и мышей с адьювант-ным артритом в острой фазе (Табл. 6 и Табл. 9). Преимущественно экспрессия фермента отмечалась в поверхностном слое синовиальной оболочке и, в меньшей степени, хондроцитах. Параллельное изучение экспрессии i-NOS и n-NOS показало наличие i-NOS в синовиальной оболочке при РА и экспериментальном артрите, чего не было в контрольных образцах. Что касается экспрессии n-NOS, то предварительные исследования подтвердили ее присутствие в костных структурах [Ralston S.H., 1997], но не в синовиальной ткани. Согласно нашим данным n-NOS идентифицировалась в клетках синовиальной оболочки (Табл. 10).

Таблица 9

Количественная характеристика i-NOS в синовиальной оболочке

человека при РА (в %от клеток, окрашенных гематоксилином и эозином)

Клетки Контроль п - 7 Ранний РА п - 70 Поздний РА п -104

Лимфоциты воспалительных инфильтратов _ 24,3 ± 3,1 5,5 ±2,1*

Синовиоциты - 36,3 ± 1,1 8,7 ± 1,8*

Примечание: * - достоверность различия между группами р<0,01.

Наши данные соответствуют данным других авторов, выявивших наличие i-NOS и n-NOS с помощью Western blot анализа в модели SCW-индуци-рованного артрита [McCartney-Francis N., 2001]. Авторы выявили экспрес-

сию ¡-N05 в мононуклеарных и полинуклеарных клетках воспалительного инфильтрата, ¡-N05, п^ОЭ в мононуклеарах периферической крови и пе-ритонеальных макрофагах.

Таблица 10

Доля п-МОБ-иммунореактивных клеток в синовиальной оболочке

человека при РА (в % от клеток, окрашенных гематоксилином и эозином)

Показатели Контроль п-7 Ранний РА п-70 Поздний РА п-104

Лимфоциты - 78,5 ± 3,3 43,6 ± 2,8*

Синовиоциты 3,2 ± 1,5 56,4 ±2,10 27,3 ± 2,3*0

Примечание: * - достоверность различия между группами р<0,01; О - достоверность различия с контролем р<0,05.

Таким образом, с помощью иммуногистохимического метода мы доказали присутствие всех изоформ NOS в синовиальной оболочке больных РА и мышей с адьювантным артритом на ранних стадиях развития патологического процесса с соответствующей топографией ферментов.

Поздняя стадия РА и хроническая фаза адьювантного артрита отличались изменением паттерна экспрессии NOS. Нами обнаружено снижение экспрессии i-NOS при сохраняющемся уровне экспрессии n-NOS и неизменной топографии ферментов.

Подобные изменения экспрессии NOS позволяют по-новому подойти к вопросам патогенетической роли каждой из синтаз в развитии воспаления в синовиальной оболочке. Снижение активности индуцибельной изоформы фермента в поздней стадии РА и хронической фазе экспериментального артрита дают основания поставить вопрос о содержании функции ¡-NOS.

Оценивая динамику интенсивности апоптоза и сопоставляя ее с динамикой экспрессии ¡-NOS и р53 молекулы, а также наличие признаков соло-кализации этих молекул в наших исследованиях можно сделать вывод о наличии мощной протекгивной компоненты у i-NOS. Сущность протектив-ного эффекта состоит в сенсибилизации клеточных структур синовиальной оболочки к апоптозу с последующей его реализацией через р53 опосредованный механизм на поздней стадии эволюции РА. Некоторые авторы указывают, что р53 опосредованный апоптоз является маркером i-NOS индуцированного процесса [Kim Y.M. et al., 1999; Messmer U.K. et al., 1994]. Продемонстрировано полное совпадение локализации i-NOS и участков апоптоза в синовиальной оболочке больных РА [Van Hof RJ. et al., 2000].

Втоже время солокализация экспрессии NADPh-диафоразы и Вс1-2 молекулы говорит и об антиапоптотическом эффекте i-NOS, но проявляется

он на ранней стадии развития РА. Такой дуализм функции i-NOS в развитии ревматоидного синовита не позволяет расценивать ее как мишень для терапевтических вмешательств.

Наш вывод подтверждают данные, полученные на различных моделях экспериментального артрита. Авторам удалось показать, что применение селективных ингибиторов ¡-NOS приводило к ухудшению течения эрозивного артрита [McCartney-Francis N., 2001; Veihelmann A. eta!., 2002]. Деле-ция гена i-NOS в мутантных линиях мышей повышала чувствительность к развитию адьювантного [Gilkeson G.S. eta!., 1997], септического [Mclnnes LB. eta!., 1998] артрита.

В тоже время, согласно нашим результатам, монотонная экспрессия конститутивной формы NOS (n-NOS) на всех стадиях развития патологического процесса (Табл.10), как при РА, так и при экспериментальном артрите (Табл.6), определенно указывает на их участие в патогенезе РА. Повышение содержания метаболитов N0 в синовиальной жидкости происходило параллельно с нарастающей гиперэкспрессией конститутивной формы n-NOS. Очевидно, что в условиях снижения экспрессии i-NOS, сохраняющаяся экспрессия конститутивной формы является основным источником метаболитов N0 в синовиальной жидкости, а, следовательно, и свидетельством ихактивногоучастия в поддержании воспалительного процесса в синовиальной оболочке.

Регрессия воспаления в синовиальной оболочке при лечении неселективными блокаторами N0S, при неэффективной селективной блокаде i-NOS, иллюстрирует патологическую роль конститутивных форм NOS [Veihelmann A. et al., 2002]. Это подтверждается применением селективного блонатора нейрональной NOS 7-нитроиндазола, сопровождавшееся значительной регрессией признаков адьювантного артрита [Pozza М. et al., 1998].

Следовательно, обнаруженная нами экспрессия конститутивной формы NOS в синовиальной оболочке больных РА обеспечивает персистиро-вание воспаления на всех этапах развития воспалительного процесса.

Выявленная нами многочисленность и устойчивость связей уровня метаболитов N0 в синовиальной жидкости с ЧБС (г=0,99 в группе «раннего» РА при р<0,05), ЧВС (г=0,80, р<0,05 в общей группе больных), DAS28 (г=0,67 в общей группе больных возрастал до 0,92 в группе «позднего» РА при р<0,05) в разных группах больных позволяет расценивать уровень метаболитов N0 в синовиальной жидкости как надежный показатель активности, тяжести РА и эффективности проводимой терапии. Максимальное падение количества метаболитов N0 в синовиальной жидкости на фоне лечения в группе «раннего» РА (Табл. 11) и отсутствие подобной динамики в группе «позднего» РА (Табл. 12) подтверждает оптимальность, рекомендуемых в последнее время, сроков начала базисной терапии.

Таблица 11

Метаболиты N0 на фоне лечения в группе 'раннего» РА

Показатели Контроль n-40 До лечения n-70 После лечения n-70

N02-ser 1,30 ± 0,11 3,29 ± 0,76 3,9910,73

N03-ser 1,17 1 0,08 1,6910,66 2,3710,84

NO-ser 2,47 ± 0,10 4,9811,17 6,3811,29

N02-m 1,1210,31 9,1111,05* 19,1111,25*0

N03-m 0,58 ±0,09 16,1014,63* 26,10 ± 3,23*

NO-m 1,71 ±0,12 25,20 14,83* 45,20 1 2,82*0

N02-sin 1,0810,07 8,60 1 0,93* 1,2310,320

N03-sin 0,5810,04 1,6711,31 0,08 1 0,03*

NO-sin 1,6610,11 10,2011,21* 2,3110,13*0

Примечание: п - число больных в каждой группе;

*- достоверность различия с контрольной группой р<0,05; О- достоверность различия между группами р<0,05.

По-видимому, именно низкие концентрации N0 на поздней стадии РА, обеспечиваемые идентифицированной нами экспрессией конститутивной формы NOS, осуществляют поддержку Thl типа иммунного ответа в синовиальной оболочке. Убедительные доказательства такого эффекта низких количеств N0 были приведены в литературе ранее [Niedbala W. et al., 2002]. Авторы указывают, что за модуляцию пролиферативного Thl сигнала N0 несут ответственность цитокины.

Таблица 12

Метаболиты N0 на фоне лечения в группе «позднего» РА

Показатели Контроль n-40 До лечения n-104 После лечения n-104

N02-ser 1,3010,11 2,0710,33 2,8010,59

N03-ser 1,17 10,08 0,87 10,17 1,8510,79

NO-ser 2,47 10,10 2,8610,43 4,6611,14

N02-171 1,1210,31 9,2812,41* 29,35 1 2,37*

N03-m 0,5810,09 13,9413,97* 32,4312,63*

NO-m 1,7110,12 23,22 1 3,90* 61,1913,23*0

N02-sin 1,0810,07 10,10 12,34* 3,2011,35

N03-sin 0,5810,04 15,6815,54* 0,4610,06

NO-sin 1,6610,11 25,781 7,48* 3,6611,02

Примечание: п - число больных в каждой группе;

*- достоверность различия с контрольной группой р<0,05; О- достоверность различия между группами р<0,05.

Наши исследования цитокинового профиля сыворотки крови и синовиальной жидкости у больных РА показали более яркие изменения последнего в синовиальной жидкости {Табл. 13). Подобные данные были получены другими авторами. Так Hata Н., и соавторы сообщают, что методом ELISA им удалось определить содержание IL-6 только у 20% животных в эксперименте [Hata Н. et а!., 2004]. Matsuno Н. с соавторами указывают, что уровень интерлейкинов в сыворотке крови становится доступным для определения только после различного типа стимуляции (введение реком-бинантныхформ интерлейкинов, трансплантация синовиальной оболочки больных PA) [Matsuno Н. et а!., 2002]. Приведенные факты имеют теоретическое обоснование. Общим свойством цитокинов является то, что они не депонируются в клетках в виде молекул-предшественников. Их синтез стимулируется импульсно, по сигналу и начинается с транскрипции иРНК цитокинов с соответствующего гена. По мнению Игнатьевой Г.А., в системной циркуляции можно выявить только 4 цитокина, а именно TNF, IL-1, IL-6 и G-CSF, но не в норме, а при тяжелых септических процессах [Актуальные проблемы патофизиологии. М., 2001].

Напротив, синовиальная жидкость больных РА по нашим данным содержала повышенные количества TNF-a, IL-lß, IL-6, что не противоречит аналогичным исследованиям других авторов [Arend W.P., 2001; Feldmann М. et al„ 1996; Harris E.D., 1997]. TNF-a, IL-lß, IL-6 синергично опосредуют синовит и деструкцию хряща и кости. Считают, что TNF-a, IL-lß стимулируют секрецию клетками IL-6 [Feldmann М. et а!., 1996; Harris E.D., 1997].

Таблица 13

Цитокиновый профиль в группах «раннего» и «позднего» РА

Показатели Контроль Ранний РА Поздний РА

п-40 п-70 П-104

IL-1-ser 1,65 ± 0,03 0,67 ± 0,30 1,03 ±0,20

IL-6-ser 2,47 ±0,03 35,20 ± 19,33 83,32 ± 41,20

IL-10-ser 0,21 ± 0,02 0,40 ± 0,23 0,60 ±0,39

TNF-ser 2,17 ±0,07 4,35 ± 1,93 3,09 ± 1,46

IL-1-sin 1,95 ± 0,91 11,95 ± 2,60* 1,02 ± 0,40 0

IL-6-sin 3,48 ±1,12 1335,30 ± 182,04* 1552,37 ± 101,39*

IL-10-sin 1,11 ± 1,02 2,65 ± 0,87 12,61 ± 1,64*0

TNF-sin 4,12 ± 2,03 117,86 ± 14,24* 192,42 ± 28,05*

Примечание: п - число больных в каждой группе;

*- достоверность различия с контрольной группой р<0,05; О- достоверность различия между группами р<0,05.

Обращает на себя внимание обнаруженная нами особенно высокая концентрация IL-lp в синовиальной жидкости в сравнении с остальными цитокинами на ранних стадиях РА (Табл.13). При этом IL-lp обнаружил положительную корреляционную связь с ЧВС (г=0,74 при р<0,05).

Синхронная гиперэкспрессия Вс1-2, высокие значения IL-ip и низкая интенсивность апоптоза на ранней стадии РА свидетельствуют об антиапоп-тотической активности IL-ip. Подобный эффект цитокина в отношении хон-дроцитов был успешно показан в работе [Kuhn К. et al., 2000]. Антиапопто-тическое действие IL-ip не связано с N0, поскольку блокада синтеза оксида азота не влияет на этот эффект [Blanco B.C. et al., 1995].

Основными клеточными элементами синовиальной среды, продуцирующими IL-lp являются макрофаги и синовиальные фибробласты [Ulfgren А.К. et al., 2000]. Не исключено, что более высокая концентрация IL-ip может быть объяснением успешной анти-TNF-a терапии толькоу 30-40 %боль-ных РА [Feldmann M., Maint R.N., 2001]. Последнее обстоятельство дает возможность объективизировать показания и прогнозировать успех при назначении лечения моноклональными антителами к TNF-a.

Таким образом, ранняя стадия РА характеризуется повышенным содержанием IL-lp в синовиальной жидкости суставов, оказывающим антиапоп-тотический эффект.

Как было показано ранее, хронизация воспалительного процесса происходит при активном участии IL-6 [Rose-John S., 2003]. По нашим данным развитие РА характеризуется стойким повышением концентрации IL-6 в системном кровотоке и в синовиальной жидкости, особенно в группе «позднего» РА, что, позволяет характеризовать IL-6 как маркер хронического течения воспалительного процесса. Это подтверждается и наличием корреляций между IL-6 и содержанием метаболитов N0 в синовиальной жидкости и моче как на ранней, так и на поздней стадии РА (соответственно г=0,99 и г=0,97 при р<0,05). IL-6 участвует в развитии резистентности Т-клеток к программированной клеточной смерти, тем самым, поддерживая персистенцию патологического процесса.

Увеличение концентрации IL-10 способствует снижению продукции TNF-a и IL-6 макрофагами, синовиоцитами, Т-клетками, как было показано в ряде экспериментальных работ [Katsikis P.D. et al., 1994; Persson S. et al., 1996; Walmsley M. et al., 1996]. В нашем исследовании уровень IL-10 в синовиальной жидкости и крови был повышен на ранней стадии РА и еще более повышался на фоне успешной терапии (Табл.14), что позволяет расценивать IL-10 как показатель эффективности лечения и развития компенсаторных реакций при наличии корреляций с рентгенологической стадией РА (г=0,58 в общей группе при колебаниях от 0,61 в группе «раннего» РА до

0,74 в группе «позднего раннего» РА, р<0,05) и уровнем экскреции метаболитов N0 с мочой (г= -0,93, р<0,05).

Увеличение содержания 1Ы0 в системном кровотоке в группе «раннего» артрита на фоне лечения при отсутствие подобного эффекта на более поздних этапах эволюции РА, а также возрастание в этот же период уровня 1Ь1р, подтверждает выдвинутый тезис о наличии у больных РА оптимального «терапевтического окна» в дебюте заболевания (Табл.14).

Таблица 14

Цитокиновый профиль на фоне лечения в группе «очень раннего» РА

Показатели Контроль п-40 До лечения п-33 После лечения п-33

IL-1-ser 1,65 ± 0,03 0,64 ±0,43 0,37 ±0,28*

IL-6-ser 2,47 ± 0,03 18,74 ±14,77 8,85 ± 1,58*

IL-10-ser 0,21 ± 0,02 0,28± 0,19 0,70 ± 0,48

TNF-ser 2,17 ± 0,07 5,41 ± 2,69 32,10 ± 24,81

IL-1-sin 1,95 ± 0,91 17,38 ± 1,68* 3,18 ±1.180

IL-6-sin 3,48 ± 1,12 1366,33 ± 209,46* 1666,43 ± 109,72*

IL-10-sin 1,11 ± 1,02 2,02 ±0,57 22,42 ±0,84*0

TNF-sin 4,12 ± 2,03 123,35 ± 21,77* 23,75 ± 1,77*0

Примечание: п - число больных в каждой группе;

♦-достоверность различия с контрольной группой р<0,05; О- достоверность различия между группами р<0,05.

В общем, цитокиновый профиль синовиальной жидкости на разных стадиях РА отличается гетерогенностью. На ранней стадии РА доминирует ан-тиапоптотическое влияние И-1Р, на поздней - противовоспалительное влияние II.-10 и, стабилизирующее персистенцию воспаления, влияние 11.-6.

Итак, нам удалось вывить новые патогенетические звенья развития воспаления в синовиальной оболочке пораженных суставов при РА, отличающиеся специфическими особенностями на ранней и поздней стадии патологического процесса, подтвержденные в экспериментальной модели адьювантного артрита у линейных мышей С57В1аск6.

Ранняя стадия РА отличается низкой активностью апоптоза синовиальных клеток и, содержащихся в синовиальной оболочке лимфоцитарных инфильтратов. Низкая апоптотическая активность обусловлена несколькими факторами. Прежде всего, это гиперэкспрессия молекулы Вс1-2, стабилизирующая мембраны митохондрий и препятствующая реализации ми-тохондриального пути апоптоза. Помимо этого низкая экспрессия проапоп-тотической молекулы р53, обусловленная двумя основными причинами: супрессирующим влиянием Вс1-2 и высокой концентрацией растворимого

рецептора Fas, связывающим лиганды Fas и, таким образом, отменяющим Fas-зависимый путь развития апоптоза и активации экспрессии р53. Помимо этого, повышенная секреция IL-ip оказывает мощный антиапопто-тический эффект, реализуемый через повышенную экспрессию молекулы Вс1-2, стабилизируемой экспрессией NOS.

Таким образом, на ранней стадии РА оказывается отмененным второй тип Fas-опосредованного апоптоза (митохондриальный), что обеспечивает неконтролируемую пролиферацию синовиальной оболочки.

Вместе с тем, уже на ранней стадии РА закладываются основы для индукции массивного апоптоза синовиальных клеток. Этот процесс связан с гиперэкспрессией ¡-NOS при участии которой генерируются большие количества локального N0, оказывающего генотоксическое воздействие и стимулирующего экспрессию р53 молекулы. Известно, что одной из основных функций р53 является контроль постоянства генетического аппарата клеток.

Поздняя стадия РА отличается значительным снижением экспрессии Bcl-2 и нарастающей гиперэкспрессией р53, предвестником активного апоптоза. По принципу отрицательной регуляторной петли р53 репрессирует синтез i-NOS, что в своюочередь вносит вклад в дестабилизацию митохон-дриальной мембраны, которая и без того утратила защитный потенциал Bcl-2. Это приводит к полной активации второго типа Fas-зависимого апоптоза и реализации его эффектов на морфологическом уровне, что мы наблюдали на этой стадии РА.

Кроме того, активизация синтеза IL-10 оказывает противовоспалительное действие, снижая активность воспалительной компоненты в синовиальной оболочке и отменяя стимулированную экспрессию ¡-NOS клеточными элементами синовиальной оболочки. Вместе стем, перманентная экспрессия конститутивной формы нитрооксидсинтазы поддерживаетThl пролиферацию и хроническую персистенцию умеренного воспаления на фоне постоянного синтеза IL-6, способствующего хронизации воспаления.

Таким образом, в процессе эволюции РА мы наблюдаем работу своего рода «молекулярного реостата» Вс1-2/р53, модулируемого воздействием интерлейкинов, нитрооксидсинтаз и определяющего неодинаковую интенсивность апоптоза на разных стадиях заболевания, что является причиной неконтролируемой пролиферации клеточных элементовсиновиальной оболочки с соответствующими клиническими последствиями.

Сопоставление собственных результатов с литературными данными позволило создать принципиальную схему межклеточных коммуникаций в синовиальной оболочке человека при реализации механизмов апоптоти-ческой гибели на разных стадиях развития РА.

РАННИИ РА

ПОЗДНИМ РА

(|)

1Ь-1Ь

, , М-6 (,)

1ь-ю

Рисунок 28. Принципиальная схема регуляции интенсивности

апоптоза клеток синовиальной оболочки на ранней и поздней

стадиях РА

Примечание: Стрелки серого цвета - усиление эффекта

Стрелки черного цвета - ослабление эффекта

Выводы:

1. Патогенетическая значимость различной интенсивности апоптоза клеток синовиальной оболочки доказана на модели адъювантного артрита и при различных стадиях ревматоидного синовита поданным имму-номорфологических исследований операционных биоптатов больных РА.

2. Интенсивность апоптоза клеток синовиальной оболочки в эксперименте и у больных РАзависит от длительности и стадии синовита, уровня экспрессии ГМО-синтаз и баланса молекул, имеющих анти-апопто-тическую (Вс1-2) или про-апоптоптическую (р53) активность.

3. Низкий апоггготический индекс синовиоцитов на ранней стадии адь-ювантного артрита и РА определяется гиперэкспрессией Вс1-2 и низким уровнем экспрессии р53.

4. Максимальный апоптотический индекс синовиоцитов характерен для поздней стадии РА. Он обусловлен противоположным ранней стадии РА паттерном распределения р53 и Вс1-2 молекул: гиперэкспрессией р53 и низким уровнем экспрессии Вс1-2.

5. Изменение уровня sFas достоверно коррелирует с апоптотическим индексом (г=-0,75), экспрессией р53 (г=-0,99), степенью активности (г=0,62) и функциональным классом (г=0,83) больных РА, что позволяет использовать его как интегративный показатель напряженности происходящих в синовиальной оболочке процессов программированной клеточной смерти.

6. Ранняя стадия адьювантного артрита и РА характеризуется высокой активностью NADPH-диафоразы (NADPH-d), конститутивной NOS(cNOS) и индуцибельной NOS (¡NOS) в макрофагальных и фибробластических синовиоцитах. На поздней стадии РА количество iNOS-позитивных клеток достоверно снижается в 4 раза, синтез N0 поддерживается за счет активности cNOS.

7. Вс!-2 и р53 частично со-локализованы с NADPH-d, что указывает на наличие NO-зависимого апоптоза. На ранней стадии РА N0 действует как антиапоптотический фактор, который работает в функциональном тандеме с Вс1-2. Уровень экспрессии Вс1-2 достоверно коррелирует с ЧВС (r=0,67) и функциональным классом больных РА(г=0,71) и может быть использован в оценке прогноза течения РА.

8. Уровень метаболитов N0 в синовиальной жидкости является надежным показателем активности, тяжести РА и эффективности проводимой терапии поскольку имеет многочисленные устойчивые связи сЧБС, ЧВС, DAS28 индексом.

9. Уровень IL-lp в синовиальной жидкости достоверно коррелируете ЧВС (r=0,74), а концентрация IL-6 в системном кровотоке и синовиальной жидкости - с содержанием метаболитов оксида азота в синовиальной жидкости, моче (г=0,99; г=0,97), СОЭ (г=0,62), тогда как содержание IL-10 в синовиальной жидкости связано с выраженностью эрозивного артрита (r=0,58; р<0,05), а его динамика - с развитием эффекта по критериям EULAR.

10. Изученные пути реализации механизмов апоптотической гибели на разных стадиях заболевания позволяют предложить схему межклеточных коммуникаций в синовиальной оболочке суставов и обосновать необходимость раннего начала базисной терапии больных РА.

Практические рекомендации:

1. Определение метаболитов оксида азота в синовиальной жидкости у больных РА рекомендуется использовать для оценки активности РА и эффективности проводимой терапии. За границы нормы при определении содержания в синовиальной жидкости метаболитов оксида азота следует считать (в мкМ/мл): N02 -1,08 ± 0,07; N03 - 0,58 ± 0,04; суммарный N0 -1,66 ± 0,11. Особенно высокое их содержание отмечается при эрозивном РА (суммарный N0 - 25,73 ± 3,78 мкМ/мл). Снижение уровня метаболитов коррелирует с улучшением клинического состояния больного.

2. Рекомендуется использовать определение концентрации 1L-6 как прогностический маркер эволюции РА: стойкое сохранение высокого уровня IL-6 в системном кровотоке характерно для хронического прогрессивного течения РА.

3. Определение уровня IL IO в системном кровотоке может служить критерием степени тяжести течения РА, а содержание IL-10 в синовиальной жидкости пораженных суставов нафоне лечения - критерием эффективности проводимой терапии.

4. Доступность определения sFas в клин ической практике в сравнении с р53 и Вс1-2 молекулами позволяет рекомендовать мониторинг sFas у больных РА с целью контроля за эффективностью проводимой терапии и определения прогноза.

5. Базисную терапию у больных РА рекомендуется назначать в дебюте заболевания, что является патогенетически обоснованным подходом.

Публикации:

Монография

1. Дубиков А.И. Ревматоидный артрит, апоптоз, оксид азота: новые аспекты патогенеза. - Владивосток: Издательство Дальневост. ун-та, 2004. - 132 с.

Статьи

2. Дубиков А.И. Роль оксида азота в деградации хрящевого матрикса у больных остеоартрозом // Научно-практическая ревматология. -2003. - № 2 (Приложение: Тезисы Конгресса ревматологов России, Саратов. 2003.). - С. 31.

3. Дубиков А.И., Череповский A.B., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э., Никулин C.B. Роль оксида азота в патологии опорно-двигательного аппарата (Часть I) // Научно-практическая ревматология. - 2004. - № 3. -С. 78-82.

4. Дубиков А.И.,Череповский A.B., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э., Никулин C.B. Роль оксида азота в патологии опорно-двигательного аппарата (Часть II) // Научно-практическая ревматология. - 2004. - № 4. -С. 53-56.

5. Дубиков А.И., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э. Апоптоз как механизм развития аутоиммунного воспаления в коленном суставе человека // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - Т. 137. -№ 12. - С. 641-644.

6. Дубиков А.И., Шуматова Т.А., Белоголовых Л.А., Медведь Е.А. Оксид азота как медиатор апоптоза при патологии опорно двигательного аппарата // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - № 3 (Т. 19). -С. 118-121.

7. Череповский A.B., Никулин C.B., Дубиков А.И., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э. Современные представления о патогенезе остеоартроза: роль оксида азота // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - № 3 (Т. 19). - С. 121-125.

8. Дубиков А.И. Нитрооксидергические механизмы индукции апоптоза при патологии опорно-двигательного аппарата. - Владивосток, 2004. - 17 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 867-В2004.

9. Дубиков А.И., Череповский A.B., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э., Никулин C.B. Нитрооксидергические механизмы патологии опорно-двигательного аппарата. Ч. 1. - Владивосток, 2004. - 17 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 865-В2004.

10. Дубиков А.И., Череповский A.B., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э., Никулин C.B. Нитрооксидергические механизмы патологии опорно-двигательного аппарата. Ч. 2. - Владивосток, 2004. - 24 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 866-В2004.

11. Дубиков А.И., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э., Череповский A.B., Никулин C.B. Апоптотические механизмы патологии суставов. - Владивосток, 2004. - 25 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 868-В2004.

12. Дубиков А.И., Шуматова Т.А., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э. Топохи-мия NADPH-диафоразы в структурах коленного сустава человека и крыс и ее изменения при экспериментальном артрите // Морфология. -2004. - № 5. - С. 69.

13. Дубиков А.И., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э., Шуматова Т.А., Череповский A.B., Никулин C.B. Влияние селективных и неселективных ингибиторов цикпооксигеназ на нитрооксинтазную активность хряща и синовии при аутоиммунном артрите // Человек и лекарство. XI Российский национальный конгресс. Тез. докладов. - Москва, 2004. -С. 783.

14. Дубиков А.И., Медведь Е.Э., Белоголовых Л.А., Шуматова Т.А., Никулин С.В., Череповский А.В. Влияние инфликсимаба на продукцию оксида азота клетками хряща и синовиальной оболочки суставов при адью-вантном артрите // Человек и лекарство. XI Российский национальный конгресс. Тез. докладов. - Москва, 2004. - С. 783-784.

15. Череповский А.В., Дубиков А.И., Никулин С.В., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э. Активность нитрооксидсинтазы синовиальной оболочки в условиях индуцированного остеоартроза // International Journal of Immunorehabilitation. - 2004. - Vol. 6., № 1 (IX Междунар. конгресс по клинической патологии. Бангкок, Таиланд. 15 - 23 февраля 2004.). -С. 78-79.

16. Череповский А.В., Дубиков А.И., Никулин С.В., Белоголовых Л.А., Медведь Е.Э. Активность нитрооксидсинтазы и дисметаболия хряща й эксперименте // International Journal of Immunorehabilitation. - 2004. -Vol. 6., № 1: IX Международный конгресс по клинической патологии. Бангкок, Таиланд. 15 - 23 февраля 2004. - С. 79.

17. Dubikov A.I., Cherepovsky A.V., Belogolovyh L.A., Medvedev E.E., Nikulin S.V. Effects of the Anti-TNF-antibody Infliximab on Nitric Oxide (NO) Synthesis by Synovial Membrane and Cartiladge in Adjuvant Arthritis // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2004. ~ July. - Vol. 63, Supplement 1. - P. 163.

18. Cherepovskii A.V., Dubikov A.I., Nikulin S.V., Belogolovykh L.A., Medved E.E. Nitroxide Synthase Activity as a Marker of Early Stages of Experimental Cartilage Dysmetabolism // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.

- 2004. - May. - Vol. 137, № 5. - P. 517 - 520.

19. Cherepovsky A.V., Dubikov A.I., Nikulin S.V., Belogolovyh L.A., Medved E.E. Chronic Posttraumatic Knee Synovitis: Nitric Oxide Synthase Activity and Apoptosis // 9th World Congress of the Osteoarthritis Research Society International. - In: Osteoarthritis and Cartilage. - 2004. - Vol. 12, № 1002.

- P. 38.

Дубиков Александр Иванович

Роль апоптоза и оксида азота в патогенезе ревматоидного артрита

Автореферат

Подписано в печать 9.03.2005 г. Формат 60x841/16. Усл. п.л. 2,32, уч-изд. л. 2,18. Тираж 100 экз. Заказ 34

Издательство Дальневосточного университета 690950, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27.

Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического комплекса ДВГУ 690950, г. Владивосток, ул. Алеутская, 56.

f

л

*

I

РНБ Русский фонд

2005-4 47736

i

12 MAP * i У '

Актуальность проблемы.

Ревматические заболевания (РЗ) в последние годы привлекают все большее внимание ученых в силу своей высокой распространенности и социальной значимости. Поражая преимущественно лиц трудоспособного возраста, они приводят к ранней инвалидизации, имеют тенденцию к прогрессиро-ванию, значительно укорачивают продолжительность жизни. Среди РЗ особое теоретическое и медико-социальное значение имеет ревматоидный артрит (РА), классический пример хронических воспалительных заболеваний человека [29]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется около 300 тысяч больных РА, а болезненность по этому заболеванию по данным статистики составляет 2,75 на 1000 лиц 18 лет и старше [34; 36; 46].

Высокая социально-экономическая значимость РА связана с тем, что на лечение больных расходуются огромные средства, существенно превышающие бюджет других хронических заболеваний [17]. Распространенность РА в мире составляет 0,5 - 1% [35; 47; 127; 283]. Прямые медицинские затраты на лечение больных РА в США оцениваются, согласно различным источникам, от 3,7 до 8,6 млрд. долларов в год [65]. При этом пациенты, страдающие РА, используют ресурсы здравоохранения в значительно большей степени, чем страдающие другими заболеваниями внутренних органов. Так, в Швеции стоимость медицинского обеспечения больных РА в 2,5 раза выше, чем прямые затраты на обслуживание пациентов, не страдающих РА [151]. Показано также, что средняя продолжительность жизни при РА достоверно на 10 — 15 лет короче ожидаемой возрастных уровней, а 5-летняя выживаемость у больных с системными вариантами не превышает 50% [33]. Прогноз заболевания при РА со значительной деструкцией суставов сравним с таковым у больных атеросклеротическим поражением трех коронарных сосудов и у больных с IV стадией ходжкинской лимфомы [30].

Существенными звеньями или составляющими элементами борьбы с РЗ являются их своевременная диагностика, выяснение этиологии и патогенеза заболеваний, их профилактика и лечение. Многие аспекты этих вопросов при РА остаются неясными и, как следствие этого, сохраняется и по сей день запоздалая диагностика, хронизация течения, отсутствие надежной этиопато-генетической терапии, позволяющей в ранние сроки прервать прогрессиро-вание патологического процесса и, тем более, привести к регрессу наступивших патологических органических изменений. Исследования в этом направлении не потеряли актуальности.

Проведенный анализ литературы показал, что развитие научно-обоснованной концепции патогенеза РА за последние годы достигло заметных успехов. Они связаны, главным образом, с выяснением ряда важных патогенетических звеньев аутоиммунного процесса, свойственного этому заболеванию, и возможностью их нейтрализации с помощью специфических антител. В то же время, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, удовлетворительной общей концепции патогенеза РА не существует, что иллюстрируется недостаточной клинической эффективностью используемых терапевтических подходов [41].

Раскрытие механизмов гиперплазии синовиальной оболочки, сопровождающейся появлением пренеопластических характеристик у синовиальных макрофагов и фибробластов в виде экспрессии протоонкогенов и особой ин-вазивности [290] невозможно без уточнения следующих проблем:

- роль апоптоза в развитии РА на ранней и поздней стадиях патологического процесса;

- роль ЫО-синтазной компоненты на разных этапах развития РА;

- взаимосвязь продукции оксида азота и апоптоза в процессе эволюции РА;

- взаимоотношения цитокиновой сети с феноменом апоптоза и продукцией оксида азота при РА.

Изучение этих механизмов даст новое, более целостное, концептуальное представление о патогенезе РА, особенно ранних стадий, что позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторинга и лечения этого тяжелого заболевания.

Цель работы: определить значение апоптоза и оксида азота в механизмах развития ревматоидного артрита и оценить возможность прогнозирования течения, эффективности проводимой терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние и динамику NO-синтазной функции у больных РА.

2. Определить роль про- (Fas, р53) и антиапоптотических (Вс1-2) механизмов в развитии РА.

3. Установить характер изменения нитрооксидпродуцирующей функции клеток синовиальной оболочки в условиях экспериментального адъю-вантного артрита.

4. Выяснить роль апоптоза (Fas, р53, Вс1-2 опосредованные звенья) в развитии экспериментального адъювантного артрита.

5. Оценить взаимосвязь между нитрооксидпродуцирующей функцией, феноменом апоптоза и цитокиновым профилем у больных РА.

6. Установить соотношения между продукцией оксида азота, апоптозом, синтезом цитокинов и клинико-лабораторными характеристиками РА.

7. Установить влияние различных терапевтических программ на нитроок-сидпродуцирующую функцию, апоптоз, цитокины у больных РА.

Научная новизна работы.

В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота и апоптоза у больных РА.

Впервые выявлены специфические особенности экспрессии про- и анти-апоптотических маркеров на ранней и поздней стадиях патологического процесса, что проясняет роль апоптоза в эволюции РА.

Впервые установлена протективная роль индуцибельной нитрооксид-синтазы в развитии аутоиммунного воспаления суставов.

Представлены в динамике взаимоотношения между продукцией оксида азота, апоптозом и цитокиновым профилем, что позволило выяснить новые звенья патогенеза РА.

Продемонстрирована возможность прогнозирования степени тяжести и течения РА путем мониторинга маркеров апоптоза (Вс1-2, Брав).

Оценена динамика нитроксидсинтетической функции, апоптоза и цито-кинового профиля в зависимости от проводимой терапии. Показана возможность использования гистохимических и иммуноцитологических показателей для объективизации контроля за эффективностью проводимой терапии.

Практическая ценность.

Проведенные исследования показали, что установленная закономерность экспрессии Вс1-2, р53 и зРаз молекул апоптоза на ранних и поздних стадиях РА позволяет прогнозировать течение патологического процесса и, соответственно, подбирать адекватные терапевтические программы.

Доказанная протективная роль индуцибельной нитрооксидсинтазы на ранних стадиях аутоиммунного воспаления суставов определяет нецелесообразность использования в лечебных схемах селективных блокаторов последней и определяет необходимость синтеза противовоспалительных препаратов доноров оксида азота.

Продемонстрирована способность некоторых базисных препаратов инициировать апоптоз синовиальных клеток и положительно влиять на цитоки-новый профиль у больных РА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интенсивность апоптоза клеточных элементов синовиальной оболочки значительно различается на ранней и поздней стадиях развития РА.

2. Основным механизмом, определяющим активность апоптоза на разных стадиях эволюции РА является различный уровень экспрессии молекул р53, Вс1-2 и sFas.

3. Активная фаза РА сопровождается присутствием в синовиальной оболочке всех трех изоформ NOS с различным паттерном экспрессии в зависимости от длительности течения заболевания.

4. Цитокиновый профиль синовиальной жидкости на разных стадиях РА отличается гетерогенностью и наличием связей с нитрооксидпродуци-рующей функцией синовиальной оболочки, а также клиническими индексами активности заболевания.

5. Определение активности про- и антиапоптотических молекул, метаболитов оксида азота, цитокинов синовиальной жидкости у больных РА позволяет прогнозировать течение заболевания и эффективность проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Патогенетическая значимость различной интенсивности апоптоза клеток синовиальной оболочки доказана на модели адъювантного артрита и при различных стадиях ревматоидного синовита по данным иммуноморфологических исследований операционных биоптатов больных РА.

2. Интенсивность апоптоза клеток синовиальной оболочки в эксперименте и у больных РА зависит от длительности и стадии синовита, уровня экспрессии NO-синтаз и баланса молекул, имеющих анти-апоптотическую (Вс1-2) или про-апоптоптическую (р53) активность.

3. Низкий апоптотический индекс синовиоцитов на ранней стадии адьювантного артрита и РА определяется гиперэкспрессией Вс1-2 и низким уровнем экспрессии р53.

4. Максимальный апоптотический индекс синовиоцитов характерен для поздней стадии РА. Он обусловлен противоположным ранней стадии РА паттерном распределения р53 и Вс1-2 молекул: гиперэкспрессией р53 и низким уровнем экспрессии Вс1-2.

5. Изменение уровня sFas достоверно коррелирует с апоптотическим индексом (г=-0,75), экспрессией р53 (г=-0,99), степенью активности (г=0,62) и функциональным классом (г=0,83) больных РА, что позволяет использовать его как интегральный показатель напряженности происходящих в синовиальной оболочке процессов программированной клеточной смерти.

6. Ранняя стадия адьювантного артрита и РА характеризуется высокой активностью NADPH-диафоразы (NADPH-d), конститутивной NOS (п-NOS) и индуцибельной NOS (i-NOS) в макрофагальных и фибробластических синовиоцитах. На поздней стадии РА количество i

ИОЗ-позитивных клеток достоверно снижается в 4 раза, синтез N0 поддерживается за счет активности п-1Ч08.

7. Вс1-2 и р53 частично со-локализованы с NADPH-d, что указывает на наличие >Ю-зависимого апоптоза. На ранней стадии РА N0 действует как антиапоптотический фактор, который работает в функциональном тандеме с Вс1-2. Уровень экспрессии Вс1-2 достоверно коррелирует с ЧВС (г=0,67) и функциональным классом больных РА (г=0,71) и может быть использован в оценке прогноза течения РА.

8. Уровень метаболитов N0 в синовиальной жидкости является надежным показателем активности, тяжести РА и эффективности проводимой терапии, поскольку имеет многочисленные устойчивые связи с ЧБС, ЧВС, ОА828 индексом.

9. Уровень 1Ь-1р в синовиальной жидкости достоверно коррелирует с ЧВС (г=0,74), а концентрация 1Ь-6 в системном кровотоке и синовиальной жидкости - с содержанием метаболитов оксида азота в синовиальной жидкости, моче (г=0,99; г=0,97), СОЭ (г=0,62), тогда как содержание 1Ь-10 в синовиальной жидкости связано с выраженностью эрозивного артрита (г=0,58; р<0,05).

10.Изученные пути реализации механизмов апоптотической гибели на разных стадиях заболевания позволяют предложить схему межклеточных коммуникаций в синовиальной оболочке суставов и обосновать необходимость раннего начала базисной терапии больных РА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение метаболитов оксида азота в синовиальной жидкости у больных РА рекомендуется использовать для оценки активности РА и эффективности проводимой терапии. За границы нормы при определении содержания в синовиальной жидкости метаболитов оксида азота следует считать (в мкМ/мл): N02 - 1,08 ± 0,07; N03 - 0,58 ± 0,04; суммарный N0 - 1,66 ±0,11. Особенно высокое их содержание отмечается при эрозивном РА (суммарный N0 - 25,73 ± 3,78 мкМ/мл). Снижение уровня метаболитов коррелирует с улучшением клинического состояния больного.

2. Рекомендуется использовать определение концентрации 1Ь-6 как прогностический маркер эволюции РА: стойкое сохранение высокого уровня ТЬ-6 в системном кровотоке характерно для хронического прогрессивного течения РА.

3. Определение уровня 1Ь-10 в системном кровотоке может служить критерием степени тяжести течения РА, а содержание 1Ь-10 в синовиальной жидкости пораженных суставов на фоне лечения - критерием эффективности проводимой терапии.

4. Доступность определения вРаэ в клинической практике в сравнении с р53 и Вс1-2 молекулами позволяет рекомендовать мониторинг эРав у больных РА с целью контроля за эффективностью проводимой терапии и определения прогноза.

5. Базисную терапию у больных РА рекомендуется назначать в дебюте заболевания, что является патогенетически обоснованным подходом.