Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль ангиогенного фактора VEGF, его рецепторов и антиапоптотических сигнальных белков Аkt и BCL-2 в развитии гормональной резистентности рака молочной железы

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВ Александр Михайлович

РОЛЬ АНГИОГЕННОГО ФАКТОРА УЕвЯ, ЕГО РЕЦЕПТОРОВ И АНТИАПОПТОТИЧЕСКИХ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ АКТ И ВС1.-2 В РАЗВИТИИ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор

М.И.Давыдов)

Научные руководители:

Защита состоится 2006 г. на заседании

Диссертационного совета К.001.17.01 при ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Е.С.Герштейн М.А.Красильников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Н.С.Сергеева А.Ф.Карамышева

Ведущее учреждение:

ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Росздрава

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин [Давыдов М.И. и др., 2004; Ferguson S.J. et al., 2002]. Несмотря на значительный прогресс в его лечении, достигнутый благодаря увеличению чувствительности диагностических процедур и совершенствованию хирургических и лекарственных методов, уровень смертности от РМЖ остается достаточно высоким [Давыдов М.И. и др., 2004; Куш-линский Н.Е. и др., 2005; Aaronson S.A. et al., 2000]. Одним из факторов, определяющих высокий уровень смертности больных РМЖ, является устойчивость опухоли к различным видам терапии [Кушлинский Н.Е. и др., 2005; Aaronson S.A. et al., 2000], в частности - к гормонотерапии. В этой связи не теряет актуальности изучение молекулярных механизмов развития гормональной резистентности на моделях in vitro и выявление новых клеточных маркеров, характеризующих чувствительность опухоли к лекарственным препаратам in vivo.

В настоящее время в клинической практике используется только два молекулярно-биологических маркера чувствительности опухоли к эндокринной терапии - рецепторы эстрогенов (РЭ) и рецепторы прогестерона (РП). К сожалению, данные исследования РЭ и РП не всегда точно отражают чувствительность РМЖ к гормонотерапии. Известно, что только 75% опухолей положительных по рецепторам эстрогенов и прогестерона (РЭ+/РП+) чувствительны к антиэстрогену та-моксифену [Harris J.R., 1996]. В связи с этим особую актуальность в клинической практике приобретают исследования дополнительных клеточных маркеров, характеризующих чувствительность опухолевых клеток к гормонотерапии. Среди возможных маркеров эффективности гормональной терапии особое место занимает фактор роста эндотелия сосудов (VEGF/VEGF-A/VPF). Уже не вызывает сомнения тот факт, что уровень VEGF - важная характеристика опухолевого ангио-генеза - процесса развития новых сосудов в опухоли [Ferrara N.. 2005]. Кроме того, данные исследований последних лет свидетельствуют о возможной взаимосвязи уровня VEGF как с содержанием рецепторов стероидных гормонов в опухоли [Bando Н. et al., 2005], так и с эффективностью адъювантной гормонотерапии больных РМЖ [Manders Р. et al., 2003]. В литературе, тем не менее, не существует единого мнения о роли VEGF и его рецепторов (VEGFR-1 и VEGFR-2)

-2в оценке прогноза гормональной чувствительности РМЖ [Altundag К. ef а/., 2004; Manders P. et а/., 2004]; также недостаточно изучен вопрос о взаимосвязи VEGF и его нижележащих эффекторов с классическими показателями гормонозависимости опухоли (РЭ и РП).

Разработка экспериментальных моделей развития гормональной резистентности РМЖ является перспективным направлением экспериментальной онкологии, расширяющим представления об устойчивости опухоли к антиэстрогенам. За последние годы с помощью исследований in vitro выявлено несколько ключевых механизмов, поддерживающих гормононезависимый рост опухолевых клеток: активация рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и др. [Берштейн Л.М. и др., 2002; Красильников М.А., 2004; Clarke R. etal., 2003]. Известно, что одним из возможных механизмов гормональной резистентности РМЖ является активация сигнальных путей факторов роста [Берштейн Л.М. и др., 2002]. В частности, экспериментальные данные последних лет свидетельствуют о возможном участии в поддержании роста опухолевых клеток сигнальных путей, инициируемых VEGF [Coradini D. et al., 2004; Guo P. et al., 2003; Liang Y. et al., 2005]. Интерес к этой проблеме возрос в том числе и благодаря результатам некоторых исследовательских групп, обнаруживших высокий уровень экспрессии рецепторов VEGF в клетках злокачественных опухолей [Bachelder R.E. et al., 2002; Guo P. et al., 2003; Xie B. et al., 1999]. Коэкспрессия VEGF и его рецепторов в опухолевых клетках свидетельствует о возможном участии этих белков в аутокринной регуляции роста опухоли. Однако этот механизм и его роль в поддержании гормононезависимого роста опухоли в настоящее время изучены недостаточно. Все это и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: изучение роли VEGF-зависимых сигнальных путей в развитии гормональной резистентности рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Получение и характеристика гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы человека в условиях in vitro.

2. Анализ экспрессии Bcl-2, VEGF, VEGFR-2 в клетках гормононезависимой сублинии MCF-7/T и родительской линии MCF-7.

-33. Оценка возможной роли VEGF в регуляции роста гормононеза-висимых клеток рака молочной железы.

4. Анализ экспрессии и активности Akt, одного из нижележащих эффекторов VEGF, в гормононезависимых и родительских клетках MCF-7.

5. Иммуноферментное исследование содержания VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt, Bcl-2 в первичных опухолях больных раком молочной железы и изучение взаимосвязи этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания (в том числе показателями гормоночувствительности опухоли).

Научная новизна: впервые параллельно исследовано изменение экспрессии ключевого фактора неоваскуляризации рака молочной железы VEGF, его рецепторов и антиапоптотических факторов Akt и Bcl-2 в процессе развития гормональной резистентности клеток рака молочной железы в культуре, а также оценена взаимосвязь этих показателей с клинико-морфологическими особенностями рака молочной железы на клиническом материале. Впервые показано, что развитие гормональной резистентности сопровождается увеличением экспрессии VEGF и его рецептора второго типа. Продемонстрировано, что пролиферация как родительских клеток РМЖ, так и гормононезависи-мой сублинии, находится под частичным аутокринным контролем со стороны сигнального пути VEGF. При исследовании первичных опухолей молочной железы показано, что уровень VEGF, рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и антиапоптотического белка Bcl-2 в большинстве опухолей достоверно выше, чем в окружающих гистологически неизмененных тканях. Впервые установлено также, что экспрессия VEGF и VEGFR-2 существенно увеличивается в РП-отрицательных опухолях, а в 48% опухолей обнаружено повышение активности Akt, которая имеет тенденцию к увеличению в РЭ-положительных и РП-отрицательных опухолях. В целом, впервые продемонстрировано участие сигнального пути VEGF в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста опухолей молочной железы.

Практическая значимость работы: результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что развитие гормональной резистентности РМЖ сопровождается активацией сигнальных путей VEGF. Некоторые из нижележащих эффекторов VEGF являются но-

выми перспективными маркерами гормонорезистентности рака молочной железы и возможными мишенями для действия молекулярно-направленных противоопухолевых препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту: активация сигнальных путей VEGF как механизм, поддерживающий гормононезави-симый рост клеток рака молочной железы.

Апробация работы: Диссертация апробирована на межинститутской конференции ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и ММА им. И.М.Сеченова 21 апреля 2006 г. Материалы диссертации представлены на XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006 г.), на 30-м конгрессе FEBS (Венгрия, Будапешт, 2005 г.), на XII Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2005 г.), доложены на XXXIII съезде International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Греция, Родос, 2005) и 13 International Hamburg Symposium on Tumor Markers (Германия, Гамбург, 2005 г.).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 19 научных работ.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 раздела), главы, посвященной описанию обследованных больных, клеточных культур, методов исследования и анализа данных, двух глав, описывающих полученные результаты, заключения, выводов и списка литературы, включающего 195 источников. Общий объем диссертации составляет 132 страницы машинописи. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры. Клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 [Brooks S.C. et al., 1973] были получены из коллекции клеточных культур ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 5%-ную эмбриональную сыворотку телят («Gibco») и гентамицин (50 ед/мл) («Рапесо», Россия) при 37°С в атмосфере с 5% С02. Гормононезави-симая сублиния MCF-7/T была получена в результате длительного, в течение 2 мес., культивирования клеток родительской линии MCF-7 в стандартной среде в присутствии 10"®М антиэстрогена тамоксифена. В ряде экспериментов использовали краткосрочное (в течение 3 суток)

культивирование клеток в среде DMEM без фенолового красного, содержавшей 5%-ную бесстероидную эмбриональную сыворотку [Provost P.R. et al., 2000]. В экспериментах по исследованию влияния ингибитора VEGF на рост клеток использовали растворимый фрагмент VEGFR-1/FK-1 (химера sFlt-1/Fc) (R&D, США), снижающий биологическую доступность VEGF в культуральной среде.

Для проведения иммуноблоттинга клетки на стадии формирования 80% монослоя снимали с чашек в 1 мл физиологического раствора. Далее из полученных образцов выделяли клеточные экстракты для нанесения на нитроцеллюлозные фильтры (Amersham BS) как описано ранее [Красильников М.А. и др., 2004]. Для иммуноблоттинга использовали антитела к РЭ (Е-1396; Sigma-Aldrich), VEGFR-2 (goat AF357; R&D Systems), ERK1, ERK2 и phospho-ERK1, ERK2 (New England Biolabs), Akt (Upstate, #05-591) и phospho-Aktl/PKBa (Ser473) (Upstate, #07-310). Для предотвращения неспецифической сорбции фильтры обрабатывали 5% раствором обезжиренного молока (Nestle), затем инкубировали с первичными антителами в течение 3 ч при комнатной температуре. Фильтры отмывали, инкубировали 1,5 ч с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (Amersham BS), и образовавшиеся комплексы проявляли хемилюминесцентным реагентом (Amersham BS).

Клиническая характеристика больных. В исследование было включено 46 женщин больных раком молочной железы I-IV стадии, проходивших лечение в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2002-2004 гг. Возраст больных составил 35-75 лет (медиана - 55 лет). Больные распределялись по стадиям заболевания следующим образом (Классификация злокачественных опухолей по системе TNM, Методические рекомендации, Москва, 1997 г.): I стадия - 2 больные, На стадия - 17 больных, lib стадия -14 больных, Illa стадия - 7 больных, 1Mb стадия -5 больных; IV стадия - 1 больная.

По гистологическому строению исследованные опухоли распределялись следующим образом: протоковый инвазивный рак (ПИР) -25, дольковый инвазивный рак (ДИР) - 6, тубулярный рак - 1, смешанный рак - 6. У остальных больных гистологическое строение опухоли определить не удалось из-за выраженного терапевтического па-томорфоза после неоадъювантного лечения.

По степени дифференцировки (G) исследованные опухоли распределялись следующим образом: высокая степень дифференцировки (G1) - 2, средняя степень дифференцировки (G2) - 13, низкая степень дифференцировки (G3) - 25.

По статусу рецепторов стероидных гормонов опухоли распределялись на следующие группы: РЭ+ - 25, РЭ- - 18; РП+ - 24, РП- - 19.

Получение и обработка тканей. Образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани молочной железы (200-300 мг) были взяты во время операции и немедленно заморожены в жидком азоте для дальнейшего хранения при -70°С. Для проведения иммунофер-ментного анализа образцы тканей лизировали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 150 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ р-глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Полученные лизаты центрифугировали в течение 30 мин при 22000 об/мин, 4°С (центрифуга OptimaTM TLX, Beckman, США).

Определение рецепторов стероидных гормонов. В клеточных линиях MCF-7 и MCF-7/T рецепторы эстрогенов определяли в целых клетках модифицированным радиолигандным методом с использованием экстракции этанолом, как описано в работе Olea-Serrano N. et al. (1985).

Во всех опухолевых образцах содержание РЭ и РП определено стандартным радиолигандным методом [Кушлинский Н.Е. и др., 1996]. Опухоли считали положительными по соответствующему виду рецепторов при их концентрации не менее 10 фмоль/мг общего белка.

Иммуноферментное определение VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2. Оценку исследуемых показателей в тканевых лизатах проводили с помощью стандартных наборов для прямого иммуно-ферментного анализа в соответствии с инструкциями производителей. Коммерческие названия и производители соответствующих наборов реактивов приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Наборы реактивов для иммуноферментного анализа, исполь-__зуемые в работе_

№ Показатель Название набора Производитель

1 VEGF «Human VEGF ELISA» BioSource Int, США

2 VEGFR-1 «Human VEGF-R1 ELISA» Bender MS, Австрия

3 VEGFR-2 «Quantikine® Human VEGF R2 Immunoassay» R&D systems

4 pAkt «PathScan™ Phospho-Akt1 Sandwich ELISA Kit» Cell Signaling technology®, США

5 Bcl-2 «Human Bcl-2 ELISA» Bender MS, Австрия

Определение содержания VEGF и Bcl-2 в клеточных экстрактах проводили с помощью наборов для иммуноферментного анализа № 1 и № 5 (табл. 1), соответственно.

Измерения показателей проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX8Q0 фирмы Bio-Tek Instruments, Inc. (США). Концентрацию показателей выражали в расчете на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури. Уровень активированной (фосфорилированной) формы белка Akt (далее pAkt) исследован в опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы 46 больных, у 39 больных параллельно оценивали содержание VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 и у 38 больных определен уровень Bcl-2.

Статистический анализ данных. При сравнении показателей использовали t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, медианный тест, критерий серий Вальда-Вольфовица. Взаимосвязь показателей оценивали с помощью корреляционного теста Пирсона (г), теста корреляции рангов Спирмена (R) и теста корреляции рангов по Кен-даллу (т). Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программных пакетов «Statistica 6.0» и «Origin 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Активация фактора роста эндотелия сосудов в гормононезави-симой сублинии клеток рака молочной железы.

Эксперименты проводили на гормонозависимых клетках рака молочной железы человека линии MCF-7 и сублинии MCF-7/T, полу-

ченной в результате культивирования клеток MCF-7 в течение 2 мес. в

присутствии Ю^М тамоксифена. <а>

ход-во клеток

MCF-7

MCF-7/T

(Ь)

450 КОЛИЧЕСТВО

400 хлегок,*/* Т

350 i

300 • ■

250 • |

200 ■

150 • ■

100 ■

50

Л

MCF-7

□ Контроль 0 Тамокснфен U Эстрлддод

MCF-7/T

МСР-7 МСР-7/Т

Рис. 1. (а) Сравнительные кривые роста клеток линий МСР-7 и МСР-7/Т в бесстероидной среде. (Ь) Влияние тамоксифена (10"6М) и 17р-эстрадиола (109 М) на рост клеток линий МСР-7 и МСР-7/Т. (с) Экспрессия рецепторов эстрогенов в клетках линий МСР-7 и МСЯ-7/Т.

Как видно на рис. 1а, сублиния MCF-7/T обладала более высокой скоростью роста в бесстероидной среде по сравнению с родительской клеточной линией MCF-7. Кроме того, клетки MCF-7/T характеризовались снижением чувствительности как к рост-стимулирующему действию 17Р-эстрадиола (Е2) (10"9М), так и к цитостатическому действию тамоксифена (Ю^М) по сравнению с родительскими клетками MCF-7 (рис.1Ь). При определении содержания РЭ методом иммуноблоттинга обнаружено незначительное снижение уровня РЭ в сублинии MCF-7/T по сравнению с родительскими клетками (рис. 1с). Проведенный параллельно анализ связывающей способности РЭ стандартным радио-лигандным методом выявил достоверное снижение (на 39%) связывания Е2 в клетках MCF-7/T по сравнению с клетками MCF-7: (3,7±0,4)*105 и (6,1±0,5)*105 мест связывания на клетку, соответственно.

MCF-7 MCF-7/T MCF-7 MCF-7/T

Рис. 2. Влияние 17р-эстрадиола и тамоксифена на уровень экспрессии VEGF (а) и Bcl-2 (b) в клетках линий MCF-7 и MCF-7/T.

В дальнейших экспериментах был проведен сравнительный анализ экспрессии двух регулируемых эстрогенами белков - VEGF и Bcl-2 в клетках MCF-7 и MCF-7/T. Как показано на рис.2а,Ь, если в клетках родительской линии MCF-7 синтез VEGF и Bcl-2 стимулировался в присутствии 173-эстрадиола и снижался под действием тамоксифена, то в клетках MCF-7/T уровень экспрессии этих белков практически не изменялся в присутствии 173-эстрадиола или тамоксифена. В целом, представленные данные свидетельствуют о значительном снижении гормональной чувствительности клеток MCF-7/T, несмотря на сохранение в этих клетках достаточно высокого уровня РЭ.

(а) 600 500 400 300 200100

<Ь)

VEGF пг/ыг белка

о mcf-7 и mcf-7/t

VEGFR-2

Актпн

Ь.

и

о «й

(с)

MCF-7

MCF-7/T

гУ

Akt

pAkt

Актпн

fb О

Рис. 3. Содержание VEGF (а), VEGFR-2 (Ь) и Akt/pAkt (с) в клетках MCF-7/T и MCF-7.

Учитывая высокую скорость роста гормононезависимой линии MCF-7/T в бесстероидной среде, мы предположили, что в условиях отсутствия эстрогенов рост клеток поддерживается за счет повышенной активности отдельных митогенных сигнальных путей, в частности - VEGF/VEGFR.

Определение базального уровня VEGF показало, что в клетках сублинии MCF-7/T его содержание увеличено в 2 раза по сравнению с родительскими клетками (рис.За). Параллельный анализ методом иммуноблоттинга экспрессии рецептора фактора роста эндотелия сосудов второго типа (VEGFR-2/KDR) также показал повышенный уровень этого сигнального белка в клетках MCF-7/T по сравнению с линией MCF-7 (рис.ЗЬ). В то же время, определение экспрессии одного из нижележащих эффекторов VEGF - антиапоптотического белка Akt (протеинкинаэы В) не выявило существенных отличий в его содержании в клетках MCF-7/T и MCF-7 (рис.Зс).

Для оценки роли сигнального пути VEGF/VEGFR в поддержании роста клеток рака молочной железы были проведены эксперименты по культивированию клеток MCF-7 и MCF-7/T с ингибитором VEGF (растворимый фрагмент Flt-1/Fc, VEGFR-1 химера (sFlt-1/Fc)).

кол-во клеток (х1<Л

(Ь)

□ Контроль 1 sFlt-1/Fc

л

с; о а

-0 с; о а.

MCF-7

MCF-7/T

MCF-7 MCF-7/T

Рис. 4. Влияние ингибитора VEGF (sFlt-1/Fc) на рост клеток (а) и активность МАР-киназ (ERK1/2) (Ь) в клеточных линиях MCF-7/T и MCF-7.

Ингибитор VEGF вызывал достоверное (р<0,05) снижение приблизительно на 20% скорости роста как родительских, так и гормоно-резистентных клеток (рис.4а). Анализ экспрессии и активности ключевых белков, участвующих в контроле пролиферации - МАР-киназ

(mitogen-activated protein kinases - ERK1/p44 и ERK2/p42) показал, что культивирование в течение 20 мин. с ингибитором VEGF вызывает достоверное снижение активности ERK1 и ERK2 как в родительской, так и гормононезависимой линии (рис.4Ь). Взятые вместе, представленные результаты демонстрируют, что пролиферация клеток MCF-7, в том числе и гормононезависимой сублинии MCF-7/T, находится под частичным контролем со стороны сигнального пути VEGF/VEGFR.

Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов, его рецепторов первого и второго типа, активированной протеинкиназы Akt и Bcl-2 в первичных опухолях больных раком молочной железы.

Вторая часть работы была посвящена иммуноферментному исследованию содержания компонентов сигнального пути VEGF в первичных опухолях больных раком молочной железы и изучению взаимосвязи этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания, в частности - с показателями гормоно-чувствительности опухоли - РЭ и РП.

Таблица 2.

Содержание VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 и BcI-2 в опухолевой и гис-

тологически неизмененной ткани молочной железы

Исследованный материал M ± m, медиана (квартили, 25-75%)

VEGF, пг/мг белка VEGFR-1, нг/мг белка VEGFR-2, пг/мг белка Bcl-2, отн. ед/мг белка

Рак молочной железы 121 ±26 59 (25-149) 2,4 + 0,1 2,4 (2,0-2,9) 174 + 9 167(148-192) 198 ±48 91 (29-215)

Неизмененная ткань молочной железы 24 ±4* 18 (11-30) 2,0 + 0,1** 2,0(1,6-2,4) 112 ±8* 108 (79-155) 40 ± 7*** 26 (19-36)

* р<0,01 по сравнению с раком молочной железы ** р<0,05 по сравнению с раком молочной железы *** р<0,005 по сравнению с раком молочной железы

В таблице 2 представлены результаты определения \ZEGF, его рецепторов первого и второго типа и антиапоптотического белка Вс!-2

-12в опухолевой и гистологически неизмененной ткани молочной железы. Обнаружено, что содержание VEGF в опухолях молочной железы выше, чем в гистологически неизмененных тканях у 33 из 39 (85%) обследованных больных, при этом среднее и медианное значение этого показателя также достоверно возрастали в опухолевой ткани (р<0,01). Выявлено также достоверное увеличение уровня VEGFR-1 (р<0,05) и VEGFR-2 (р<0,01) в опухолевой ткани. Содержание VEGFR-1 в лиза-тах рака молочной железы было повышено у 28 из 39 обследованных больных (72%) на 4-161% по сравнению с окружающей неизмененной молочной железой, а содержание VEGFR-2 увеличено на 3-426% в опухолях 82% больных.

Определение уровня одного из нижележащих эффекторов VEGF, антиапоптотического белка Bcl-2, выявило достоверное отличие медианных значений этого показателя в опухоли и неизмененной ткани, при этом медиана уровня Bcl-2 была в 3,5 раза выше в опухолевой по сравнению с гомологичной тканью молочной железы (табл.2). У 31 из 38 (82%) больных содержание Bcl-2 в опухоли было выше, чем в гомологичной гистологически неизмененной ткани молочной железы.

У 22 из 46 обследованных больных (48%) уровень активированной (фосфорилированной) формы киназы Akt (pAkt), другого нижележащего эффектора VEGF, в опухоли был выше, чем в гомологичной гистологически неизмененной ткани.

Рис. 5. Уровень рАМ в опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы (попарное сравнение показателей для каждого больного).

Попарное сравнение уровня рАЙ в опухолевой и гистологически неизмененной ткани для каждого больного представлено на рис.5: содержание рАМ как в опухоли, так и в неизмененных тканях молочной железы значительно варьировалось; при этом уровни рАИ в опухолевой и неизмененной ткани молочной железы достоверно положительно коррелировали между собой (г=0,5; р<0,05).

VEGFR-2, пг/мг белка

Рис. 6. Взаимосвязь содержания VEGF и VEGFR-2 в опухолевой ткани молочной железы (г=0,47; р<0,05).

Обнаружена слабая, но достоверная прямая корреляция между уровнями VEGFR-1 и VEGF в опухолевой ткани (г=0,33; р<0,05); уровни VEGFR-2 и VEGF в опухоли также коррелировали между собой (рис.6; г=0,47; р<0,05). Однако взаимосвязи между содержанием двух типов рецепторов в опухолевой ткани не наблюдалось. Обнаруженное нами отсутствие взаимосвязи между показателями тканевой экспрессии двух типов рецепторов VEGF подтверждает высказанные ранее предположения о разной роли VEGFR-1 и VEGFR-2 в ангиогенезе и опухолевом росте [Жукова Л.Г. и др., 2003; Ferrara N., 2005; Prager G.W. ef al., 2004].

Дальнейший анализ включал оценку содержания VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 в ткани рака молочной железы в зависимости от основных клинико-морфологических характеристик заболевания. Уровень всех исследованных показателей не зависел от возраста, ме-нопаузного статуса больных, степени дифференцировки и гистологического типа опухоли.

-it-

Таблица 3.

Содержание \ZEGF, \ZEGFR-1, \ZEGFR-2, рАМ и Вс1-2 в ткани рака молочной железы в зависимости от клинической стадии и степени распространенности процесса

Характеристика Медианные значения (квартили, 25-75%)

п VEGF, пг/мг белка VEGFR-1, нг/мг белка VEGFR-2, пг/мг белка pAkt, ед./мг белка Вс1-2, отн. ед./мг белка

Стадия: l-lla (T,N0 и T2No) llb^N,) Illa (T2N2 и T3Ni) lllb CT4Nm) P 19 14 7 5 149 (81-343) 44(25-91) 59 (32-104) 15 (5-23)* р<0,05** 2,7 (2,3-3,1) 2,2 (2,0-2,5) 2,0(1,6-2.8) 2,3(1,6-2,8) 157(144-196) 156(150-178) 156(133-175) 159 (150-166) 0,35 (0,26-0,49) 0,56 (0,33-1,04) 0,49 (0,27-0,61) 0,37 (0,24-0,42) р<0,05**** 61 (25-341) 45(25-341) 26 (17-73) 591 (137-1043)

Размер опухоли: < 5 см > 5 см Р 38 8 87 (35-242) 29 (9-59) р<0,05*** 2,5 (2,1-3,0) 2,2(1,8-2,5) 162 (149-190) 169(147-194) 0,40 (0,31-0,59) 0,46 (0,15-0,63) 46 (24-230) 128(109-203)

Вовлеченность лимфатических узлов (N): N-N+ Р 21 25 123 (56-343) 44 (24-93) р<0,05" 2,8 (2,3-3,3) 2,3(1,9-2,5) р<0,05*** 172(145-196) 167(150-184) 0,36 (0,28-0,53) 0,46 (0,31-0,63) 85 (25-341) 50(23-214)

п - указано максимальное число больных в группе * - по сравнению с l-lla стадией (р<0,05)

** - различия между группами статистически значимы (медианный тест)

*** - различия между группами статистически значимы (критерий Манна-Уитни)

**** - l-lla стадии по сравнению с IIb

Как следует из таблицы 3, уровень VEGF достоверно возрастает на ранних стадиях заболевания, в опухолях небольших размеров и у больных без поражения лимфатических узлов. Показано также, что содержание VEGFR-1 в опухоли имеет тенденцию к увеличению на ранних стадиях РМЖ и достоверно возрастает у больных без поражения лимфатических узлов. Напротив, уровень pAkt в опухолях больных РМЖ l-lla стадии ниже, чем при более поздних клинических стадиях; при этом статистически значимы различия содержания pAkt в опухоли только между группами больных РМЖ l-lla и IIb стадии (р<0,05) (медианное значение уровня pAkt в 1,6 раза выше при IIb, чем при l-lla стадии).

Взаимосвязи уровня VEGFR-2 с клинической стадией РМЖ и степенью распространенности процесса не выявлено. У больных РМЖ lllb стадии обнаружена тенденция к значительному повышению уровня Bcl-2 в опухоли: в этой группе уровень Bcl-2 возрастал в 9 и более раз по сравнению с ранними клиническими стадиями, однако статистической значимости это различие не достигало.

Наибольший интерес, с нашей точки зрения, представляло исследование соотношения уровня VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 с показателями гормонозависимости опухоли, а именно, с содержанием рецепторов стероидных гормонов (РЭ и РП) (табл.4).

Таблица 4.

Содержание VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 в ткани рака молочной железы в зависимости от статуса рецепторов стероид-

ных гормонов

Характеристика Медианные значения (квартили, 25-75%)

п VEGF, пг/мг белка VEGFR-1, нг/мг белка VEGFR-2, пг/мг белка pAkt, ед./мг белка Bcl-2, отн. ед./мг белка

РЭ + 25 18 51 (25-125) 90 (24-271) 2,4 (1,9-3,0) 2,3 (2,0-2,5) 169(148-190) 166 (148-192) 0,49 (0,27-0,76) 0,35 (0,18-0,46) 110(32-286) 42 (15-179)

РП + 24 19 58 (24-103) 98 (31-183) 2,4 (2,0-2,9) 2,4 (1,9-3,0) 156 (144-173) 184 (152-219)* 0,34 (0,18-0,63) 0,46 (0,35-0,60) 111 (40-227) 48 (24-159)

п - указано максимальное число больных в группе

* - различия между группами статистически значимы (р<0,05)

Наблюдается тенденция к увеличению уровня \ZEGF в группе РЭ-отрицательных опухолей по сравнению с РЭ-положительными образцами, однако достоверной взаимосвязи уровней \ZEGF, \ZEGFR-1 и \ZEGFR-2 со статусом рецепторов эстрогенов не обнаружено. Выявлена также тенденция к увеличению содержания \ZEGF в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными образцами. Кроме того, при РП-отрицательном статусе отмечено более значительное повышение уровня \ZEGF в опухоли по сравнению с неизмененной тканью (увеличение на 5-778 пг/мг, медиана 50 пг/мг), чем при РП-положительном (увеличение на 3-421 пг/мг, медиана 25 пг/мг). Это различие относительного увеличения содержания \ZEGF между РГГ и РГТ группами достоверно (р<0,05). Уровень \ZEGFR-1 в опухоли не зависел от статуса РП, а содержание \ZEGFR-2 достоверно коррелировало с уровнем РП ^=-0,38; р<0,05), при этом уровень \ZEGFR-2 был достоверно увеличен в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными (табл.4).

Рис. 7. Содержание рА№ в опухолевой ткани молочной железы в зависимости от рецепторного статуса

В опухолевой ткани молочной железы уровень рАМ слабо, но достоверно коррелировал со статусом РЭ (т=0,23; р<0,05), при этом обнаружена тенденция к увеличению уровня рАМ в РЭ-положительных образцах по сравнению с РЭ-отрицательными опухолями, а также в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными (табл.4). Как видно на рис.7, частота повышения рАЙ в опухоли (по сравнению с гистологически неизмененной тканью) достоверно выше (в 2 раза) у больных с РП-отрицательными опухо-

Х00 -| частота повышения 90- рАМ,%

80 -

О- ■ +

70 ■ 60 50 • 40 • 30 ■ 20 ■ 10 ■ 0

-р<0,01

РЭ

РП

лями, чем с РП-положительными (р<0,01). Взаимосвязи частоты повышения pAkt в опухоли со статусом РЭ не выявлено.

Как следует из табл.4, наблюдается тенденция к повышению уровня Bcl-2 в РЭ-положительных опухолях по сравнению с РЭ-отрицательными образцами, а также в РП-положительных опухолях по сравнению с РП-отрицательными образцами, однако статистической значимости отличия не достигают. При этом уровень Bcl-2 в опухолевой ткани слабо, но достоверно коррелировал со статусом РЭ (т=0,23; р<0,05).

Данные, полученные в нашей работе, согласуются с последними наблюдениями Ryden L. et al. (2005), продемонстрировавших обратную корреляцию между уровнями VEGFR-2 и РП у больных раком молочной железы. VEGF-статус рассматривается этой группой авторов в качестве маркера дифференциальной чувствительности РЭ-положительных опухолей молочной железы к тамоксифену: прогноз гормонотерапии для больных с высоким содержанием VEGF в опухоли был наиболее неблагоприятный. Снижение уровня pAkt в РП-отрицательных опухолях также может косвенно свидетельствовать о взаимосвязи активации этой киназы со снижением функциональной активности РЭ. В то же время, продемонстрированная нами на клиническом материале корреляция уровня pAkt со статусом РЭ и тенденция к повышению этого показателя в РЭ-положительных опухолях согласуется с данными экспериментальных работ о взаимной регуляции Akt и РЭ [Campbell R.A. et al., 2001; Stoica G.E. ef al., 2003]. Следует отметить, что повышенный уровень pAkt рассматривается в последнее время некоторыми авторами как фактор, определяющий неблагоприятный прогноз химио- и гормонотерапии РМЖ, а также свидетельствующий о резистентности к Герцептину [Tokunaga Е. ei al., 2006].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы стало известно, что важную роль в регуляции метаболизма опухоли играют факторы роста, воздействующие на пролиферацию, выживаемость и процессы апоптоза в опухолевых клетках. Кроме того, повышенная экспрессия некоторых факторов роста и/или их рецепторов рассматривается в настоящее время как один из возможных механизмов, участвующих в формировании устойчивости рака молочной железы к действию гормональных цитостати-

ков - в частности, к тамоксифену. Фактор роста эндотелия сосудов -ключевой регулятор ангиогенеза, индуцирующий активный рост клеток эндотелия сосудов и формирование новых капилляров. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что функции VEGF не ограничиваются стимуляцией роста сосудов в опухоли, но могут также иметь большое значение в регуляции внутриклеточного защитного механизма и пролиферации опухолевых клеток [Brieger J. et al., 2005; Wang L. et al., 2005]. Однако роль сигнальных путей VEGF в поддержании роста рака молочной железы, в том числе и гормоно-независимого, до конца не ясна.

В экспериментальной части настоящей работы была охарактеризована эстроген-независимая сублиния клеток рака молочной железы, полученная из гормонозависимой линии MCF-7. Было показано, что длительное культивирование клеток MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена приводит к формированию клеточной субпопуляции (MCF-7/T), обладающей более высокой скоростью роста в бесстероидной среде по сравнению с родительской клеточной линией. Обнаружено, что клетки MCF-7/T отличаются повышенной устойчивостью как к рост-стимулирующему действию эстрогенов, так и к цито-статическому действию тамоксифена. При этом в полученной сублинии клеток было выявлено лишь незначительное снижение уровня и лиганд-связывающей способности рецепторов эстрогенов по сравнению с родительскими клетками, поэтому в целом, гормононезависи-мую сублинию MCF-7/T можно охарактеризовать как положительную по РЭ.

При сравнительном анализе экспрессии двух регулируемых эстрогенами белков - VEGF и Вс1-2 было установлено, что в клетках MCF-7ГГ их синтез практически не изменяется при действии эстрадиола или тамоксифена, что свидетельствует о высокой степени гормональной независимости полученной сублинии клеток.

Учитывая высокую скорость роста гормононезависимой линии MCF-7/T в бесстероидной среде, мы предположили, что в условиях отсутствия эстрогенов рост клеток поддерживается за счет повышенной активности отдельных митогенных сигнальных путей, в частности - VEGF-ассоциированных белков. Действительно, было выявлено значительное увеличение содержания VEGF и VEGFR-2 в гормононезависимой линии MCF-7/T по сравнению с родительскими клетками.

При этом мы не обнаружили существенных отличий в активности Akt (одного из эффекторов VEGF) в клетках MCF-7 и MCF-7/T, что косвенно свидетельствует о возможном нарушении передачи сигнала от VEGF к Akt в сублинии MCF-7/T".

Для исследования возможной роли VEGF в аутокринной регуляции роста клеток РМЖ была проведена серия экспериментов с использованием ингибитора VEGF - растворимого фрагмента рецептора VEGF первого типа, снижающего биологическую доступность VEGF в среде. Как в родительской линии, так и в гормононезависимой сублинии MCF-7/T ингибитор VEGF вызывал достоверное снижение скорости роста клеток, которое сопровождалось подавлением активности МАР-киназ - ключевых белков, участвующих в контроле пролиферации. Взятые вместе, представленные результаты показывают, что пролиферация клеток MCF-7, в том числе и гормононезависимой сублинии MCF-7/T, находится под частичным аутокринным контролем со стороны сигнального пути VEGF. Конститутивная активация VEGF и VEGFR-2, обнаруженная в гормононезависимых клетках MCF-7/T, свидетельствует о важной роли сигнального пути VEGF/VEGFR-2 в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста РМЖ.

Следует отметить, что активация сигнального пути VEGF может рассматриваться лишь как один из возможных механизмов, участвующих в преодолении опухолевой клеткой цитостатического действия антиэстрогенов. Данные современной литературы свидетельствуют о том, что изменения метаболизма, происходящие в опухоли при возникновении гормонорезистентности, охватывают широкий спектр молекулярных путей: активация некоторых рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, изменения активности цитоплазматических белков семейства Hsp, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и других транскрипционных факторов и др. Все это определяет целесообразность дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на оценку роли различных внутриклеточных путей в возникновении гормонорезистентности, с другой - на разработку новых методов лекарственной терапии гормононезависимых форм РМЖ с использованием ингибиторов сигнальных молекул.

-20В клинико-лабораторной части исследования мы продемонстрировали, что уровень \ZEGF, его рецепторов и антиапоптотического белка Вс1-2 достоверно повышен в 73-85% опухолей по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями молочной железы, при этом увеличение уровня рА№, одного из эффекторов \ZEGF, выявлено лишь в половине исследованных опухолей. Уже на ранних стадиях заболевания обнаружена способность опухоли к повышенной продукции \ZEGF, а также тенденция к увеличению уровня \ZEGFR-1 в ткани РМЖ. Напротив, тенденция к увеличению как рАМ, так и Вс1-2 проявляется на более поздних клинических стадиях и взаимосвязана со значительной распространенностью процесса. Продемонстрированная достоверная корреляция показателей содержания \ZEGF в опухолевой ткани с уровнями \ZEGFR-1 и \ZEGFR-2 может указывать на возможную коэкспрессию некоторых компонентов сигнального пути \ZEGF в клетках рака молочной железы и их аутокринную роль. В целом, результаты нашего исследования косвенно подтверждают продемонстрированную в экспериментальной части работы координированную активацию некоторых \/ЕСР-зависимых механизмов в опухоли.

Обнаружена взаимосвязь компонентов сигнального пути \ZEGF с показателями гормонозависимости: уровни \ZEGF и \ZEGFR-2 были повышены в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными, хотя наблюдалась также и тенденция к увеличению содержания \ZEGF в РЭ-отрицательных образцах. Уровни как рАМ, так и Вс1-2 достоверно положительно коррелировали со статусом РЭ. Для РП, напротив, проявлялась тенденция к увеличению содержания рА№ в рецепторотрицаительных опухолях, а частота повышения рАМ: в опухолях больных этой группы была вдвое выше, чем у больных с РП-положительным РМЖ. Таким образом, некоторые компоненты сигнального пути \ZEGF являются достаточно перспективными биомаркерами рака молочной железы не только в качестве показателей неоан-гиогенеза, но и в качестве возможных факторов неблагоприятного прогноза гормонотерапии. По-видимому, утрата опухолью гормональной зависимости может быть ассоциирована в некоторых случаях с повышенной продукции ангиогенных факторов, их рецепторов, а также с изменениями в балансе между белками, регулирующими апоптоз и выживаемость клеток.

-21В целом, полученные в настоящей работе экспериментальные и клинико-лабораторные данные демонстрируют важную роль сигнального пути VEGF/VEGFR в аутокринной регуляции и поддержании гор-мононезависимого роста опухолей молочной железы, что может послужить основой для использования VEGF и его рецепторов в качестве дополнительных маркеров чувствительности опухолей молочной железы к эндокринной терапии и иметь значение для разработки подходов к преодолению исходной и/или приобретенной гормонорези-стентности.

ВЫВОДЫ

1. Получена новая клеточная субпопуляция, MCF-7/T, характеризующаяся устойчивым гормононезависимым ростом, низкой чувствительностью к цитостатическому действию тамоксифена и незначительным, на 25-30%, снижением содержания и связывающей способности рецепторов эстрогенов по сравнению с клетками MCF-7.

2. Продукция эстроген-зависимых белков VEGF и Bcl-2 в клетках MCF-7/T практически полностью теряет зависимость от эстра-диола.

3. Обнаружено достоверное повышение базального уровня экспрессии VEGF и рецептора второго типа VEGFR-2 в клетках MCF-7/T по сравнению с родительской клеточной линией, при этом пролиферация как родительских, так и гормонорезистент-ных клеток, находится под частичным аутокринным контролем со стороны VEGF-сигнального пути.

4. Существенных отличий в экспрессии и активности Akt, одного из нижележащих эффекторов VEGF, в сублинии MCF-7/T по сравнению с клетками MCF-7 не выявлено.

5. При исследовании первичных опухолей молочной железы показано, что уровень VEGF, рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и анти-апоптотического белка Bcl-2 достоверно выше в 73-85% опухолей по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями.

6. Установлено, что экспрессия VEGF и VEGFR-2 существенно увеличивается в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными.

Тенденция к повышенной продукции VEGF проявляется уже на ранних стадиях рака молочной железы и не сопровождается увеличением активности Akt, которая повышена лишь в 48% опухолей и имеет тенденцию к увеличению на поздних стадиях заболевания, а также в РЭ-положительных и РП-отрицательных опухолях.

В целом, полученные данные демонстрируют важную роль VEGF-сигнального пути в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста опухолей молочной железы, что может послужить основой для использования VEGF и его рецепторов в качестве дополнительных маркеров чувствительности опухолей молочной железы к гормонотерапии и мишеней для преодоления гормонорезистентности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. E.S.Gershtein, A.M.Scherbakov, O.A.Anurova, M.A.Krasil'nikov, N.E.Kushlinsky. Phosphorylated Akt1 in human breast cancer measured by direct sandwich enzyme-linked immunosorbent assay: correlation with clinico-pathologic features and tumour VEGF-signalling system components levels. Int J Biol Markers, 2006, v.21, p.12-19.

2. А.М.Щербаков, Ю.С.Лобанова, В.А.Шатская, О.В.Онопченко, А.В.Гаспарьян, Е.С.Герштейн, М.А.Красильников. Сенсибилизация клеток рака молочной железы MCF-7 к апоптотическому действию эстрадиола. Бюлл. эксп. биол. мед., 2006, т. 141, №3, с.334-337.

3. А.М.Щербаков, Е.С.Герштейн, О.А.Анурова, Н.Е.Кушлинский. Активированная протеинкиназа В при раке молочной железы. Бюлл. эксп. биол. мед., 2005, т. 139, №5, с.570-572.

4. А.М.Щербаков, Е.С.Герштейн, ОААнурова, Н.Е.Кушлинский. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы первого и второго типа при раке молочной железы. Вопросы онкологии, 2005, Т.51, №3, с.317-321.

5. Е.С.Герштейн, А.М.Щербаков, С.К.Алиева, О.А.Анурова, К.П.Лактионов, Н.Е.Кушлинский. Фактор роста эндотелия сосудов в опухолях и сыворотке крови больных раком молочной железы: связь с клинико-морфологическими факторами. Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 2005, №1-2, с.26-30.

6. О.В.Павличенко, В.А.Шатская, Е.ВЛузай, А.М.Щербаков, Е.С.Герштейн, М.А.Красильников. Молекулярный механизм

адаптации злокачественных опухолей к гормональным препаратам: роль фосфатидилинозит-3-киназы и фосфоинозитид-зависимых белков. Вестник РАМН, 2004, №12, с.20-25.

7. Е.С.Герштейн, А.М. Щербаков, СХАлиева, О.А.Анурова, К.П.Лактионов, Н.Е.Кушлинский. Фактор роста эндотелия сосудов в опухолях и сыворотке крови больных раком молочной железы. Бюлл. эксп. биол. мед., 2003, т.135, №1, с.99-102.

8. А.М.Щербаков, Ю.С.Лобанова, Е.С.Герштейн, М.А.Красильников. Сенсибилизация к апоптотическому действию эстрадиола и активация митогенных путей в тамоксифен-резистентных клетках рака молочной железы. XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ло-моносов-2006». 12-15 апреля 2006 г., Москва. Тезисы докладов, секция биология, с.258-259.

9. E.S.Gershtein, A.M.Scherbakov, V.A.Shatskaya, N.E.Kushllnsky M.A.Krasil'nikov. Phospatidyliriositol 3-kinase/AKT signalling pathway components in human breast cancer: clinico-pathological correlations. Abstracts of the 13th International Hamburg Symposium on Tumor Markers. 27-29 November, 2005, Hamburg, Germany. Anticancer Research, 2005, v. 25, N6D, p.4784.

10. A.M.Scherbakov, M.A.Krasil'nikov, E.S.Gershtein. Activation of VEGF signaling pathways in tamoxifen-resistant breast cancer cells. 30th FEBS Congress, 2-7 July 2005; Budapest, Hungary. The FEBS Journal, Vol. 272, s. 1, p.445-446.

11. A.Scherbakov, E.S.Gershtein, J.Lobanova, A.Shishkin, M.A.Krasil'nikov. VEGF signaling pathways in tamoxifen-resistant breast cancer cells. ISOBM 2005, The XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 24-28 September 2005, Rhodes, Greece. Abstracts. P-15, p.59.

12. E.S.Gershtein, A.M.Scherbakov, O.A.Anurova, N.E.Kushlinsky. Relationship between Akt1 phosphorylation and VEGF, its receptors and Bcl-2 protein levels in human breast cancer. ISOBM 2005, The XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 24-28 September 2005, Rhodes, Greece. Abstracts. О-47, p.27.

13. А.М.Щербаков, М.А.Красильников, Е.С.Герштейн. Роль фактора роста эндотелия сосудов в развитии резистентности рака молочной железы к тамоксифену. XII Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство". 18-22 апреля 2005 г. Москва. Тезисы докладов, с.605.

-2414. А.М.Щербаков, Е.С.Герштейн, О.А.Анурова, Н.Е.Кушлинский. Роль фактора роста эндотелия сосудов и его рецепторов первого и второго типа при раке молочной железы. Межрегиональная конференция «Актуальные проблемы клинической онкологии», 2005, Якутск. Материалы конференции, с.89-90.

15. М.А.Красильников, В.А.Шатская, Е.В.Лузай, О.В.Павличенко, А.М.Щербаков, Ю.С.Лобанова. Механизм регуляции гормон-независимого роста злокачественных опухолей: роль фосфати-дилинозитольной сигнальной системы. Российская конференция по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, 15 апреля 2005 г. Тезисы докладов, с. 12-13.

16. А.М.Щербаков, В.А.Шатская, Е.С.Герштейн, М.А.Красильников. Механизм аутокринной регуляции роста гормон-независимых опухолей молочной железы: роль фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A). VIII Российский онкологический конгресс. 23-25 ноября 2004 г. Москва. Материалы конференции, с.207.

17. A.M.Scherbakov, O.V.Onopchenko, E.S.Gershtein, М.А. Krasii'nikov. Coordinate activation of Akt/PKB and VEGF signaling pathways in tamoxifen-resistant breast cancer cells. Fifteenth International Congress on Anti-cancer Chemotherapy. Paris, France, February 9th-12th, 2004, p.223.

18. А.М.Щербаков, О.В.Онопченко, Е.С.Герштейн, М.А. Красильни-ков. Координированная регуляция VEGF- и Р13К-сигнальных путей в клетках рака молочной железы MCF-7. Ill съезд онкологов и радиологов СНГ. 25-28 мая 2004 г. Минск. Материалы съезда. Часть I, с.293-294.

19. E.S.Gershtein, A.M.Scherbakov, N.E.Kushlinsky. Tissue and serum VEGF levels in breast cancer patients: relationship and association with clinico-pathologic features. Tumor Markers, Tumor Targeting and Translational Cancer Research. The XXXI Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM 2003. August 30 - September 4, 2003, Edinburgh, United Kingdom. Tumor Biology, 2003, v. 24, Suppl. 1, P-46, p.65.

Подписано в печать 14.06.06 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 298 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин [6, 69, 88]. Несмотря на значительный прогресс в его лечении, достигнутый благодаря увеличению чувствительности диагностических процедур и совершенствованию хирургических и лекарственных методов, уровень смертности от РМЖ остается достаточно высоким [6, 13, 20, 88]. Одним из факторов, определяющих высокий уровень смертности больных РМЖ, является существование резистентности опухоли к различным видам терапии [8, 13, 20]. В этой связи не теряет актуальности изучение молекулярных механизмов развития резистентности на моделях in vitro и выявление новых клеточных маркеров, характеризующих чувствительность опухоли к лекарственным препаратам in vivo.

Более 30 лет антиэстроген тамоксифен (Nolvadex, ICI 46474) успешно применяется для лечения больных гормонозависимым РМЖ [4, 13, 20, 54, 61, 83]. Тамоксифен выбран в качестве основного препарата, применяемого в эндокринной терапии первой линии больных РМЖ в постменопаузе, благодаря относительно слабым побочным эффектам и низкой общей стоимости лечения [20]. Данные ретроспективных клинических исследований свидетельствуют о том, что использование тамоксифена на ранних стадиях РМЖ значительно увеличивает общую выживаемость и способствует торможению опухолевого роста [20, 88]. Однако применение тамоксифена осложнено существованием форм РМЖ, резистентных к антиэстрогенам de novo или приобретающих гормональную резистентность в процессе терапии [2, 83].

В настоящее время в клинической практике используется только два молекулярно-биологических маркера чувствительности опухоли к эндокринной терапии - рецепторы эстрогенов (РЭ) и рецепторы прогестерона

РП). По некоторым данным, существует достоверная прямая корреляция между уровнем рецепторов стероидных гормонов в опухолевой ткани и чувствительностью больного к терапии тамоксифеном [20]. К сожалению, данные исследования РЭ и РП не всегда точно отражают чувствительность РМЖ к гормонотерапии. Известно, что только 75% опухолей положительных по рецепторам эстрогенов и прогестерона (РЭ+/РП+) чувствительны к тамоксифену [88].

В связи с этим особую актуальность в клинической практике приобретают исследования дополнительных клеточных маркеров, характеризующих чувствительность опухолевых клеток к гормонотерапии. Среди возможных маркеров эффективности гормональной терапии особое место занимает фактор роста эндотелия сосудов (VEGF/VEGF-A). Уже не вызывает сомнения тот факт, что уровень VEGF - важная характеристика опухолевого ангиогенеза - процесса развития новых сосудов в опухоли [70]. Кроме того, данные исследований последних лет свидетельствуют о возможной взаимосвязи уровня VEGF как с содержанием рецепторов стероидных гормонов в опухоли [32], так и с эффективностью адъювантной гормонотерапии больных РМЖ [121]. В литературе, тем не менее, не существует единого мнения о роли VEGF и его рецепторов (VEGFR-1 и VEGFR-2) в оценке прогноза гормональной чувствительности РМЖ [25, 120, 121]; также недостаточно изучен вопрос о взаимосвязи VEGF и его нижележащих эффекторов с классическими показателями гормонозависимости опухоли (РЭ и РП).

Разработка экспериментальных моделей развития гормональной резистентности РМЖ является перспективным направлением экспериментальной онкологии, расширяющим представления об устойчивости опухоли к антиэстрогенам. За последние годы с помощью исследований in vitro выявлено несколько ключевых механизмов, поддерживающих гормононезависимый рост опухолевых клеток: активация рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и др. [8, 54, 89, 148]. Известно, что одним из возможных механизмов гормональной резистентности РМЖ является активация сигнальных путей факторов роста. В частности, экспериментальные данные последних лет свидетельствуют о возможном участии в поддержании роста опухолевых клеток сигнальных путей ключевого ангиогенного белка - VEGF [56, 84, 113, 186]. Интерес к этой проблеме обострился в последнее время в связи с данными некоторых исследовательских групп об экспрессии в опухолевых клетках рецепторов VEGF [30, 84, 188]. Коэкспрессия VEGF и его рецепторов в опухолевых клетках может свидетельствовать об участии этих белков в аутокринной регуляции роста опухоли, однако механизм подобной регуляции и его роль в поддержании гормононезависимого роста опухоли в настоящее время изучены недостаточно. Все это и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: изучение роли VEGF-зависимых сигнальных путей в развитии гормональной резистентности рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Получение и характеристика гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы человека в условиях in vitro.

2. Анализ экспрессии Bcl-2, VEGF, VEGFR-2 в гормононезависимых и родительских клетках MCF-7.

3. Оценка возможной роли VEGF в регуляции роста гормононезависимых клеток рака молочной железы.

4. Анализ экспрессии и активности Akt, одного из нижележащих эффекторов VEGF, в гормононезависимых и родительских клетках MCF-7.

5. Иммуноферментное исследование содержания VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt, Bcl-2 в первичных опухолях больных раком молочной железы и изучение взаимосвязи этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания (в том числе показателями гормоночувствительности опухоли).

Научная новизна: впервые параллельно исследовано изменение экспрессии ключевого фактора неоваскуляризации рака молочной железы VEGF, его рецепторов и антиапоптотических факторов Akt и Вс1-2 в процессе развития гормональной резистентности клеток рака молочной железы в культуре, а также оценена взаимосвязь этих показателей с клинико-морфологическими особенностями рака молочной железы на клиническом материале. Впервые показано, что развитие гормональной резистентности сопровождается увеличением экспрессии VEGF и его рецептора второго типа. Продемонстрировано, что пролиферация как родительских клеток РМЖ, так и гормононезависимой сублинии, находится под частичным аутокринным контролем со стороны сигнального пути VEGF. При исследовании первичных опухолей молочной железы показано, что уровень VEGF, рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и антиапоптотического белка Вс1-2 достоверно выше в опухоли по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями. Впервые установлено, что экспрессия VEGF и VEGFR-2 существенно увеличивается в РП-отрицательных опухолях. В 48% опухолей обнаружено повышение активности Akt, которая имеет тенденцию к увеличению в РЭ-положительных и РП-отрицательных опухолях. В целом, впервые продемонстрировано участие сигнального пути VEGF в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста опухолей молочной железы.

Практическая значимость работы: результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что развитие гормональной резистентности РМЖ сопровождается активацией УЕвР-зависимых сигнальных путей. Некоторые из нижележащих эффекторов УЕвР являются новыми перспективными маркерами гормонорезистентности рака молочной железы и возможными мишенями для ее преодоления.

Основные положения, выносимые на защиту: активация сигнальных путей УБвР как механизм, поддерживающий гормононезависимый рост клеток рака молочной железы.

выводы

1. Получена новая клеточная субпопуляция, MCF-7/T, характеризующаяся устойчивым гормононезависимым ростом, низкой чувствительностью к цитостатическому действию тамоксифена и незначительным, на 25-30%, снижением содержания и связывающей способности рецепторов эстрогенов по сравнению с клетками MCF-7.

2. Продукция эстроген-зависимых белков VEGF и Вс1-2 в клетках MCF-7/T практически полностью теряет зависимость от эстрадиола.

3. Обнаружено достоверное повышение базалыюго уровня экспрессии VEGF и рецептора второго типа VEGFR-2 в клетках MCF-7/T по сравнению с родительской клеточной линией, при этом пролиферация как родительских, так и гормонорезистентных клеток, находится под частичным аутокринным контролем со стороны VEGF-сигнального пути.

4. Существенных отличий в экспрессии и активности Akt, одного из нижележащих эффекторов VEGF, в сублинии MCF-7/T по сравнению с клетками MCF-7 не выявлено.

5. При исследовании первичных опухолей молочной железы показано, что уровень VEGF, рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и антиапоптотического белка Вс1-2 достоверно выше в 73-85% опухолей по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями.

6. Установлено, что экспрессия VEGF и VEGFR-2 существенно увеличивается в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными.

-1117. Тенденция к повышенной продукции VEGF проявляется уже на ранних стадиях рака молочной железы и не сопровождается увеличением активности Akt, которая повышена лишь в 48% опухолей и имеет тенденцию к увеличению на поздних стадиях заболевания, а также в РЭ-положительных и РП-отрицательных опухолях. 8. В целом, полученные данные демонстрируют важную роль VEGF-сигнального пути в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста опухолей молочной железы, что может послужить основой для использования VEGF и его рецепторов в качестве дополнительных маркеров чувствительности опухолей молочной железы к гормонотерапии и мишеней для преодоления гормонорезистентности.

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы стало известно, что большое значение в регуляции метаболизма опухоли имеют факторы роста, воздействующие на пролиферацию, выживаемость и процессы апоптоза в опухолевых клетках. Кроме того, повышенная экспрессия некоторых факторов роста и/или их рецепторов рассматривается в настоящее время как один из возможных механизмов, участвующих в формировании устойчивости рака молочной железы к действию гормональных цитостатиков - в частности, к тамоксифену. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) - ключевой регулятор ангиогенеза, белок, индуцирующий активный рост клеток эндотелия сосудов и формирование новых капилляров. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что функции VEGF не ограничиваются стимуляцией роста сосудов в опухоли, но могут также иметь большое значение в регуляции внутриклеточного защитного механизма и пролиферации опухолевых клеток. Однако роль сигнальных путей VEGF в поддержании роста рака молочной железы, в том числе и гормононезависимого, до конца не ясна.

В экспериментальной части настоящей работы была охарактеризована эстроген-независимая сублиния клеток рака молочной железы, полученная из гормонозависимой линии MCF-7. Было показано, что длительное культивирование клеток MCF-7 в присутствии тамоксифена приводит к формированию клеточной субпопуляции, устойчивой как к рост-стимулирующему действию эстрогенов, так и к цитостатическому действию тамоксифена. В полученной сублинии клеток выявлено лишь незначительное снижение уровня рецепторов эстрогенов по сравнению с родительскими клетками. Обнаружено также, что в гормононезависимых клетках снижается лиганд-связывающая способность РЭ по сравнению с родительской линией, но

-104в целом, полученную гормононезависимую сублинию можно охарактеризовать как положительную по РЭ.

Учитывая тот факт, что под контролем эстрогенов в РМЖ находится экспрессия большого количества белков, отвечающих за передачу митогенного и антиапоптотического сигнала - в частности, по данным литературы, эстрогены принимают участие в регуляции экспрессии \TEGF и белка Вс1-2, был проведен анализ влияния 17Р-эстрадиола и тамоксифена на уровень Вс1-2 и УЕОБ в родительских и гормононезависимых клетках. Продемонстрировано, что экспрессия УЕвР и Вс1-2 в родительской линии клеток РМЖ значительно увеличивается в присутствии 17(5-эстрадиола и снижается при добавлении тамоксифена. Напротив, в гормононезависимых клетках культивирование с 17р-эстрадиолом не приводило к значительному увеличению экспрессии УЕСР и Вс1-2, а в присутствии тамоксифена уровень этих белков в гормононезависимых клетках практически не снижался. В целом, отсутствие значимых изменений базального уровня УЕСБ и Вс1-2 в сублинии МСР-7/Т в присутствии 17р-эстрадиола или тамоксифена свидетельствует о значительном снижении ответа этих клеток на эстрогены/антиэстрогены по сравнению с родительской линией МСР-7.

В дальнейших экспериментах по исследованию роли сигнальных путей УЕСБ в поддержании роста РМЖ была использована методика краткосрочного культивирования клеток в среде с бесстероидной сывороткой, что позволило исключить влияние стероидных гормонов, содержащихся в стандартной коммерческой сыворотке, на базальный уровень экспрессии генов-мишеней эстрогенов (в частности, УЕСБ). Было отмечено, что гормононезависимая сублиния клеток обладает более высокой скоростью роста при культивировании в бесстероидной среде по сравнению с родительской клеточной линией. Учитывая высокую скорость роста гормононезависимой линии МСР-7/Т в бесстероидной среде, мы предположили, что в условиях отсутствия эстрогенов рост клеток поддерживается за счет повышенной активности отдельных митогенных сигнальных путей, в частности - УЕвР-ассоциированных молекул. Иммуноферментный анализ выявил значительное увеличение содержания УЕвР в гормононезависимой линии МСР-7/Т по сравнению с родительскими клетками в этих условиях культивирования, в гормононезависимой линии МСР-7/Т была обнаружена также повышенная экспрессия рецептора УЕвР второго типа. Таким образом, в гормононезависимых клетках РМЖ наблюдается повышенная продукция УЕвБ с параллельным увеличением экспрессии УЕОРЯ-2. Полученные нами результаты, свидетельствующие об экспрессии УЕвР и УЕОРЯ-2 в клетках МСР-7 и МСР-7/Т, позволяют рассматривать активацию УЕОР/УЕСР11-2-сигнального пути как один из возможных аутокринных механизмов, поддерживающих рост клеток рака молочной железы и играющих, в частности, важную роль в регуляции гормононезависимого роста РМЖ.

Для подтверждения этой гипотезы мы использовали ингибитор УЕвР -растворимый фрагмент его рецептора первого типа, снижающий биологическую доступность УЕвР в среде. Как в родительской, так и в гормононезависимой сублинии МСР-7/Т ингибитор УЕвР вызывал достоверное снижение скорости роста клеток. Кроме того, продемонстрировано, что культивирование клеток с ингибитором УЕвР приводит к снижению активности МАР-киназ (ключевых белков, участвующих в контроле пролиферации) как в родительской, так и в гормононезависимой сублинии МСР-7/Т.

Взятые вместе, представленные результаты показывают, что пролиферация клеток МСР-7, в том числе и гормононезависимой сублинии МСР-7/Т, находится под частичным аутокринным контролем со стороны сигналыгого пути VEGF. Конститутивная активация VEGF и VEGFR-2, обнаруженная в гормононезависимых клетках MCF-7/T, свидетельствует о важной роли сигнального пути VEGF/VEGFR-2 в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста РМЖ.

Также в родительских и гормононезависимых клетках оценена также активность антиапоптотического сигнального белка Akt - одного из нижележащих эффекторов VEGF [145]. Учитывая повышенную продукцию VEGF в гормононезависимой сублинии по сравнению с родительскими клетками, можно было ожидать, что в этих клетках повышается содержание активированной (фосфорилированной) формы Akt. Однако отличий в активности и экспрессии Akt в родительских и гормононезависимых клетках не выявлено. Отсутствие отличий в активности Akt в клетках MCF-7 и MCF-7/Т (при значительной разнице в продукции VEGF и VEGFR-2 в этих линиях) косвенно свидетельствует о возможном нарушении передачи сигнала от VEGF к Akt в полученной гормононезависимой линии РМЖ.

Следует подчеркнуть, что активация сигнального пути VEGF может рассматриваться лишь как один из возможных механизмов, участвующих в преодолении опухолевой клеткой цитостатического действия антиэстрогенов. Данные современной литературы свидетельствуют о том, что изменения метаболизма, происходящие в опухоли при возникновении гормонорезистентности, охватывают широкий спектр молекулярных путей: активацию некоторых рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, изменения активности цитоплазматических белков семейства Hsp, активацию митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и других транскрипционных факторов и др. [2, 3, 8, 13, 39, 49, 53, 54, 56, 68, 85, 148, 156]. Все это определяет целесообразность дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на оценку роли различных внутриклеточных путей в возникновении гормонорезистентности, с другой - на разработку новых методов лекарственной терапии гормононезависимых форм РМЖ с использованием ингибиторов сигнальных молекул.

В клинико-лабораторной части настоящего исследования нам удалось продемонстрировать увеличение уровня VEGF и его рецепторов VEGFR-1 и VEGFR-2 в первичных опухолях больных раком молочной железы по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями. Продемонстрированная достоверная корреляция показателей содержания VEGF в опухолевой ткани с уровнями VEGFR-1 и VEGFR-2 указывает на возможную коэкспрессию некоторых компонентов VEGF-сигнального пути в клетках рака молочной железы. В целом, эти результаты свидетельствуют об активации некоторых VEGF-зависимых механизмов в опухоли и косвенно подтверждает аутокринную роль VEGF при РМЖ, продемонстрированную в экспериментальной части нашей работы.

Проведенная параллельно оценка содержания в опухолевой и неизмененной ткани молочной железы нижележащих эффекторов сигнального пути VEGF - белка Вс1-2 и активированной формы антиапоптотического белка Akt (pAkt) - показала, что увеличение уровня pAkt относительно окружающей неизмененной ткани молочной железы происходит лишь в половине исследованных опухолей, а уровень другого антиапоптотического белка, Вс1-2, достоверно возрастает в опухолях 82% обследованных больных.

Сопоставление с основными клинико-морфологическими факторами прогноза свидетельствует о том, что уже на ранних стадиях заболевания проявляется способность опухоли к повышенной продукции VEGF, а также тенденция к увеличению уровня VEGFR-1 в ткани РМЖ. Повышенная экспрессия VEGF отмечена в опухолях небольших размеров и у больных без поражений лимфатических узлов. Уровень VEGFR-2 не зависит от клинической стадии заболевания, размера опухоли и вовлеченности лимфатических узлов. С другой стороны, уровень нижележащего эффектора VEGF - pAkt - наиболее низок на ранних стадиях заболевания, и его содержание не связано с размером опухоли и вовлеченностью лимфатических узлов, а уровень антиапоптотического белка Вс1-2 не был взаимосвязан ни с одним из показателей распространенности РМЖ.

Различия во взаимосвязи клинико-морфологических характеристик РМЖ с уровнями VEGF и его рецепторов с одной стороны, и с уровнями нижележащих эффекторов этого сигнального пути, с другой, указывают на отсутствие согласованных изменений экспрессии различных сигнальных молекул при прогрессировании рака молочной железы. В пользу этого предположения свидетельствует и отсутствие корреляционных зависимостей между уровнями VEGF/VEGFR и эффекторных антиапоптотических белков.

Одной из важнейших задач работы была оценка возможной взаимосвязи экспрессии компонентов сигнального пути VEGF с классическим показателем гормоночувствительности рака молочной железы, используемым в клинической практике, - статусом рецепторов стероидных гормонов в опухоли. Оказалось, что уровни VEGF и VEGFR-2 были повышены в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными, наблюдалась также и тенденция к увеличению содержания VEGF в РЭ-отрицательных образцах. В то же время, уровни как pAkt, так и Вс1-2 достоверно положительно коррелировали со статусом РЭ. Для РП, напротив, проявлялась противоположная тенденция: содержание pAkt в опухоли и частота его повышения по сравнению с неизмененной тканыо при рецепторотрицательных опухолях была достоверно выше, чем при РП-положителыюм РМЖ.

Полученные данные о связи pAkt с показателями гормоночувствительности свидетельствуют о возможной роли этого белка в прогнозе эндокринной терапии РМЖ. В настоящее время Akt рассматривается многими авторами [47, 91, 160] как перспективная мишень для направленной противоопухолевой терапии, так как воздействие на этот фермент возможно использовать для преодоления лекарственной, гормональной и радиорезистентности опухолей.

Таким образом, некоторые компоненты сигнального пути УЕвР являются достаточно перспективными биомаркерами рака молочной железы не только в качестве показателей неоангиогенеза, но и в качестве возможных факторов неблагоприятного прогноза гормонотерапии. По-видимому, утрата опухолью гормональной зависимости может быть ассоциирована в некоторых случаях с повышенной продукцией ангиогенных факторов, их рецепторов, а также с изменениями в балансе между белками, регулирующими апоптоз и выживаемость клеток.

В целом, полученные в настоящей работе данные демонстрируют важную роль сигнального пути УЕОР/УЕОРЯ в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста опухолей молочной железы, что может послужить основой для использования УЕвР, его рецепторов и некоторых нижележащих эффекторных белков в качестве дополнительных маркеров чувствительности опухолей молочной железы к эндокринной терапии и иметь значение для разработки подходов к преодолению исходной и/или приобретенной гормонорезистентности.