Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Роль α2-адренорецепторов и имидазолиновых I1-рецепторов в периферических эффектах моксонидина и агматина

На правах рукописи

КОЗАЕВА ЛАРИСА ПЕТРОВНА

РОЛЬ а2-ДДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ И ИМИДАЗОЛИНОВЫХ ^-РЕЦЕПТОРОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ЭФФЕКТАХ МОКСОНИДИНА И АГМАТИНА

14.00.25. - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре фармакологии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (заведующий - доктор медицинских наук, профессор О.С. Медведев).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Медведев О.С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мирзоян Р.С. доктор биологических наук, профессор Манухин Б.Н.

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт

Защита состоится (Я^О/^Л- 2005 года в часов минут на

заседании диссертационного совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу:125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

<Ц»с игЬор-Л.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Важную роль в развитии артериальной гипертензии играет активация симпатической нервной системы (Julius, 1995; Palatini and Julius, 1997a; Esler and Kaye, 1998; Esler at al., 2003, Schlaich et al., 2003; Kaye et al., 2004).

Среди терапевтических подходов, направленных на снижение симпатической активности, особый интерес представляет применение лекарственных средств, угнетающих центры симпатической нервной системы. Однако использование препаратов данной направленности действия (клонидин, И-метиддофа, гуанфацин, гуанабенз) ограничено из-за выраженности их побочных эффектов (седативный эффект, сухость во рту, феномен отмены). Ранее считали, что антигипертензивный эффект веществ центрального действия связан только со стимуляцией -адренорецепторов мозга (Timmermans et al., 1981; Van Zwieten et al., 1984a, 1984b; De Sarro et al., 1987). Однако препарат новой генерации - моксонидин (агонист имидазолиновых Il-рецепторов с относительно невысоким аффинитетом к -адренорецепторам), обладая выраженным антигипертензивным действием, в значительно меньшей степени проявляет указанные побочные эффекты (Planitz, 1987; Reid et al., 1995; Webster and Koch 1996; Stanton and Reid, 2002). В настоящее время агонисты имидазолиновых I-рецепторов являются препаратами первой линии антигипертензивной терапии (Чазова И.Е., 2002). Считают, что антигипертензивное действие этих веществ реализуется через имидазолиновые ^-рецепторы ростральной вентролатеральной зоны продолговатого мозга (RVLM) (Ernsberger et al., 1987, 1990b, 1997; Ernsberger and Haxniu, 1997; Pichard and Graham, 2000; Serban et al., 2000; Head et al., 2001; Head and Burke, 2003; Parkin, et al., 2003). Выделен и активно изучается эндогенный лиганд имидазолиновых рецепторов -агматин, представляющий собой декарбоксилированный аргинин (Li et al., 1994).

Имидазолиновые I-рецепторы и Ог-адренорецепторы широко представлены не только в ЦНС, но и в периферических органах и тканях. Поэтому моксонидин кроме центрального гипотензивного действия может вызывать и периферические эффекты. Периферическое действие моксонидина может быть связано с влиянием как на имидазолиновые, так и на -адренорецепторы. Исследования в этой области малочисленны и неоднозначны (действие моксонидина опосредуется: через адренорецепторы - Hohage et al., 1997; De Oliveira, et al., 2003;, Avellar and Marcus., 1995, Colucci et al., 1998; через I-рецепторы: Houi et al.,1987, Bhandare et al., 1991, Glavin et al., 1995, Mukaddam-Daher and Gudkovska, 2000; El-Ayoubi et al., 2003), но представляют интерес из-за перспективности использования агонистов имидазолиновых рецепторов в клинике. При этом целесообразно исследование действия моксонидина не только in vivo, но и на моделях изолированных органов. При оценке действия лекарственных веществ на изолированные органы исключаются такие факторы как распределение, превращение, депонирование, выведение веществ. Кроме того, в экспериментах на изолированных органах можно создавать строго определенную концентрацию исследуемых веществ, что позволяет проводить точную количественную оценку их влияния на рецепторы (Shild, 1957; Aliens, 1957; van Rossum, 1963). На изолированных органах можно выяснить характер взаимодействия агонистов и антагонистов, что имеет существенное значение для уточнения спектра рецепторного действия веществ.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ i

БИБЛИОТЕКА I j

Учитывая вышеизложенное, представлялось целесообразным изучение периферических эффектов моксонидина и агматина, их влияния на различные медиаторные механизмы на моделях изолированных органов и в экспериментах in vivo, a также определение рецепторного спектра действия веществ (роль ССг-адренорецепторов и имидазолиновых I-рецепторов). Такие исследования позволяют расширить возможности направленного терапевтического применения мосонидина и выявить возможные периферические эффекты эндогенного лиганда имидазолиновых рецепторов -агматина.

Целью работы являлось исследование участия имидазолиновых I-рецепторов и адренорецепторов в реализации периферических эффектов моксонидина и агматина на моделях изолированных органов с различными медиаторными механизмами и в экспериментах in vivo.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния моксонидина на сократительную активность:

- подвздошной кишки морской свинки (ПКМС) при электрической стимуляции - холинергическая медиация,

семявыносящего протока крысы (СПК) при электрической стимуляции -адренергическая медиация,

- толстой кишки мыши (ТКМ) - простагландиновые механизмы сокращений;

оценка участия имидазолиновых I-рецепторов и ОСт-адренорецепторов.

2. Исследование действия моксонидина на пропульсивную активность желудочно-кишечного тракта in vivo.

3. Исследование действия моксонидина при висцеральной боли in vivo с использованием теста "корчей".

4. Изучение некоторых эффектов агматина на моделях изолированных органов и в экспериментах in vivo.

Обоснование выбора моделей изолированных органов.

Изолированный отрезок подвздошной кишки морской свинки из-за обширного рецепторного спектра (м-холинорецепторы, серотониновые 5-НТ-рецепторы, рецепторы к субстанции Р, гистаминовые Нгрецепторы, <Х- и p-адренорецепторы) является широко используемым в фармакологических исследованиях гладкомышечным препаратом (Блаттнер и соавт., 1983; Ruffolo, 1984). Известно, что возбуждение периферических Ог-адренорецепторов вызывает ослабление сокращений тонкой кишки путем угнетения высвобождения ацетилхолина из окончаний холинергических нервов (Andrejak et al., 1980, Coupar and Liu, 1996, Doherty and Hancock, 1983; Wikberg, 1997). Было показано, что адренорецепторы, через активацию которых осуществляется ингибирование перистальтики, относятся к С^-подтипу (Liu and Coupar, 1996). Целесообразность выбора данной модели связана и с тем, что одним из побочных эффектов агонистов адренорецепторов (в частности, клонидина) является угнетение желудочно-кишечного транзита (Lu and Coupar 1997; Colucci et al., 1998; Herbert et al., 2002).

Экспериментальная модель изолированного семявыносящего протока крысы используется для изучения адренергических механизмов передачи возбуждения и

влияния на них фармакологических веществ (Блатгнер и др., 1983, Ruffolo, 1984, Avellar et al., 1996, Jurkiewicz et al., 1996, Santos et al., 2002). Действие агонистов Ог-адренорецепторов на периферические пресиналтические ai- адренорецепторы семявыносящего протока приводит к угнетению сокращений при электрической стимуляции отрезков семявыносящего протока.

Модель изолированной толстой кишки мышей используется для изучения действия агонистов адренорецепторов на простагландиновые механизмы регуляции тонуса мышц (Fontaine et al., 1984). Эта модель выбрана исходя из известных данных об участии Ого-адренорецепторов в контроле сократимости мышц кишечника (Colucci et al., 1998) и данных о возможности влияния моксонидина на синтез простагландинов на модели изолированного перфузируемого сердца крысы (Schafer et al., 2000).

В качестве препарата сравнения использовали клонидин - антигипертензивный препарат центрального действия, обладающий выраженным аффинитетом к адренорецепторам и меньшим влиянием на имидазолиновые I-рецепторы. В качестве антагонистов использовались йохимбин (антагонист (Хг-адренорецепторов с невысоким аффинитетом к I-имидазолиновым рецепторам) и эфароксан (антагонист

1-имидазолиновых рецепторов с низким аффинитетом к Иг-адренорецепторам).

Научная новизна исследования

Впервые в комплексном исследовании на моделях изолированных органов и на целом организме проведено изучение периферических эффектов моксонидина. Показано, что моксонидин на моделях ПКМС И СПК угнетает выделение медиаторов (ацетилхолина и норадреналина), вызываемое электрической стимуляцией. Действие моксонидина на подвздошную кишку морской свинки реализуется через

02-адренорецепторы и имидазолиновые I-рецепторы, тогда как на семявыносящем протоке крысы моксонидин взаимодействует преимущественно с адренорецепторами. На модели толстой кишки мыши моксонидин стимулирует синтез простагландинов, действуя на (Х2-адренорецепторы. Обнаружено, что моксонидин оказывает антиноцицептивное действие при висцеральной боли и угнетает моторику желудочно-кишечного тракта у мышей. Агматин в высоких концентрациях угнетает сокращения подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока крысы, но не действует на толстую кишку мышей. Агматин на моделях изолированных органов не модулирует эффекты клонидина, моксонидина, даларгина, серотонина и гистамина; не оказывает антиноцицептивного действия у мышей in vivo, но стимулирует у них моторику желудочно-кишечного тракта.

Научно-практическое значение

Полученные данные дополняют и уточняют механизмы действия моксонидина и позволяют предположить связь его побочных эффектов с влиянием на периферические рецепторы, что может быть учтено для рекомендаций к применению препарата в клинике. В перспективе исследования подобного рода могут способствовать расширению показаний к применению препарата. Экспериментальная модель изолированной подвздошной кишки морской свинки может быть рекомендована для фармакологического тестирования агонистов имидазолиновых рецепторов. Кроме того, данные настоящей работы дополняют сведения об особенностях адренорецепторов и

имидазолиновых рецепторов различных органов, что в конечном счете открывает возможность направленного воздействия на эти органы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003; 15-ой Европейской конференции студентов и молодых ученых, Берлин, 2004; на заседаниях кафедры фармакологии факультета фундаментальной медицины МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (включает 331 отечественных и иностранных публикаций). Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 28 рисунков.

Автор глубоко признательна доценту кафедры фармакологии, кандидату медицинских наук, Николаю Васильевичу Коробову, чья неоценимая помощь позволила состояться данной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы следующие фармакологические препараты: клонидина гидрохлорид («Sigma», США), моксонидина гидрохлорид (НПО «Фармзащита», Россия), йохимбина гидрохлорид («Sigma-Aldrich Chemie», Германия), эфароксана гидрохлорид (RBI, США), ацетилхолина гидрохлорид («Sigma», США), атропина сульфат («Sigma», США), налоксона гидрохлорид («Sigma», США), диклофенак натрий (AGIO, Индия), даларгин (ВКНПК РФ) агматина сульфат («Fluka», Германия).

Эксперименты проведены на гладкошерстных морских свинках, крысах линии Вистар, нелинейных белых мышах. Животные были получены из вивария биологического факультета МГУ и питомника ИМБП РАН, содержались в контролируемых условиях: 12-часовой световой режим с автоматическим отключением освещения в 20:00, комнатная температура - 20°±2°С, влажность 50-60%, корм и вода ad libitum.

1. Методика работы на изолированных органах

За 24 часа до эксперимента для освобождения кишечника от содержимого животное лишали корма, оставляя воду ad libitum. Перед выделением тканей животное наркотизировали диэтиловым эфиром и обескровливали перерезкой сонных артерий. Затем при помощи ножниц вскрывалась брюшная полость от лонного сочленения до грудины и препарировались соответствующие органы. Отрезки органов длиной 1 см очищали от соединительной и жировой ткани, затем помещали в отдельные термостатируемые ванночки для органов установки «Hugo Sachs Elektronik KG» (Германия) объемом 10 мл с аэрируемым раствором Кребса-Ханселейта, следующего

состава- NaCl - 118,0, КС1 - 4,7, CaCI2 - 2,5, KH2PO4 - 1,2, MgSO4 -1,2, NaHCO3 - 25,0, глюкоза - 11,5 ммоль/л, при температуре 34°-35°С . Нижний конец препарата крепили за крючок на держателе между двумя платиновыми эчектродами, верхний конец при помощи лигатуры с крючком присоединяли к датчику регистрирующего устройства. Плавным подъемом держателя датчика сегменты растягивали, создавая нагрузку в 1 г. Препараты уравновешивали в течение 60 мин до начала опыта. В период преинкубации раствор в ванночке заменяли на свежий каждые 15 мин.

При тестировании агонистов и антагонистов адренорецепторов- и имидазолиновых ^-рецепторов для препаратов ПКМС и СПК применяли электрическую стимуляцию отрезков. Стимуляцию начинали не менее, чем за 30 мин до начала исследования, используя следующие параметры: частота 0,1 Гц, длительность импульса 1 мс, сила тока - 200-250 мА. Регистрацию сокращений осуществляли с помощью датчика К30 («Hugo Sachs Elektronik KG» Германия) на четырехканальном самописце «Rikadenki» («Hugo Sachs Elektronik KG» Германия).

В экспериментах на ПКМС и СПК исследуемые агонисты адренорецепторов и имидазолиновых Ii-рецепторов клонидин и моксонидин растворяли в дистиллированной воде и вводили в раствор, омывающий органы, в объеме 5 и 15 мкл, кумулятивно, в возрастающих молярных концентрациях с разницей в 0,5 лог. до достижения максимального эффекта, начиная с концентрации 1x109 М (1x109, 3x10-9, 1x10-8... -1x105 М). Интервал между введениями каждой последующей концентрации равнялся 23 минутам (в предварительных экспериментах было установлено, что за это время эффект агониста полностью проявляется). После достижения максимальной реакции на агонист (почти полное прекращение сокращений, вызванных электрическим током) изолированный препарат тщательно отмывался (45-60 мин), после чего опыт повторяли еще два раза. В каждом опыте на одном препарате исследовали действие одного агониста.

Изучаемые антагонисты ССг-адренорецепторов и имидазолиновых ^-рецепторов йохимбин и эфароксан вводили за 10 мин до введения агонистов (клонидин и моксонидин). Антагонисты вводились в трех концентрациях (3x109, 1х108, 3х10-8 М). На фоне каждой концентрации добавляли агонисты кумулятивно, в возрастающих концентрациях, для определения зависимости «концентрация-эффект» в присутствии различных доз антагонистов. В каждом эксперименте на одном из каналов исследовалось действие только агониста без присутствия антагониста, чтобы скорректировать изменения, зависимые от длительности инкубации (контроль).

Рис.

1.

Угнетение ПКМС

сокращений

клонидином в возрастающих

клонидин

отмывка

клонидин

Jfk концентрациях (Зх10-9-3х10-7М) в отсутствии и присутствии йохимбина

(1х108М)

g

В экспериментах с агматином в одной серии экспериментов исследовали его способность модулировать сокращения ПКМС и СПК, вызываемые электрическим током. Агматин вводили кумулятивно, в концентрациях 1 х 10-6 — 1 х 10-3 М, так как по литературным данным (Avellar et al., 1996, Jurkiewicz et al, 1996, Santos et al., 2002) только в этих концентрациях он вызывает эффект. Исследовали также способность агматина модулировать эффекты моксонидина, клонидина и даларгина (синтетический опиоид) в данных моделях (агматин вводили за 10 мин до препаратов, в концентрации 1x10-5 М). В другой серии экспериментов изучали действие агматина на сократительную активность ПКМС без электрической стимуляции и его модулирующее действие на эффект серотонина и гистамина. Серотонин и гистамин использовали в концентрации равной ЕС50 этих препаратов (1x10-7 М и 3x10-7 М, соответственно) на фоне агматина (1x10-5 М). Концентрации серотонина и гистамина были подобраны, исходя из кривых едоза-эффект», в предварительных экспериментах.

В экспериментах на ТКМ в начале каждого исследования в ванночки с препаратами добавляли ацетилхолин (10-6М) для оценки чувствительности препаратов и зависимости изменения реакции от времени инкубации. После этого препараты отмывали в течение 10 мин и начинали исследование Исследуемые агонисты Иг-адренорецепторов и имидазолиновых I-рецепторов клонидин и моксонидин растворяли в дистиллированной воде и вводили в раствор, омывающий органы в объеме 5 и 15 мкл, некумулятивно, в возрастающих молярных концентрациях с разницей в 0,5 лог. до достижения максимального эффекта (1х109, 3х10-', 1х108... - lx105 M). Время воздействия каждой концентрации агониста на препарат составляло 2-3 мин до достижения пика сокращения. Введение каждой последующей концентрации клонидина или моксонидина производили после 4-5-кратного отмывания отрезков ТКМ в течение 12-15 мин. После завершения одного тестирования препараты отмывали в течение 30 мин при использовании моксонидина и в течение 50 мин при использовании клонидина. Антагонисты вводили за 5 мин до введения агониста. Зависимость «концентрация-эффект» для клонидина и моксонидина была построена в присутствии 3-х концентраций йохимбина и эфароксана (1x10', 3х10-9, 1x108 М). В каждом эксперименте на одном из каналов исследовалось действие только агониста без присутствия антагониста, чтобы скорректировать изменения, зависимые от длительности инкубации (контроль).

"к***, эфароксана (1 х 10-8 М).

Рис. 2. Сократительные ответы ТКМ на возрастающие концентрации моксонидина

отсутствии и присутствии

(1х10-7 - 1x10-5 M) в

МОКСОЮЮИН 1*10' 1X10- 3*10* IMU*

Для исследования механизма действия агонистов в качественных экспериментах использовались даларгин (1х10-7 М), ацетилхолин (1х10-6 М), налоксон (1х10-6 М), атропин (1х10-6 М) и индометацин (1х10-5 М) Исследовали действие агматина

(lx10-6 - 1x10-3 М) на сократительную активность ТКМ, а также его модулирующее влияние на эффекты моксонидина, клонидина и даларгина.

2. Метод оценки пропульсивной активности кишечника

Пассаж активированного древесного угля через желудочно-кишечный тракт используется как параметр кишечной подвижности для изучения эффектов веществ, влияющих на моторику кишечника (Macht and Barba-Gose, 1931; Miller et al., 1981; Ward and Takemori, 1982). Метод основан на сравнении расстояния, на которое прошла пища с углем от пилорического отдела желудка у животных с тестируемым веществом и у интактных животных. Длина тонкой кишки, на которую продвинулась пища с углем, берется как процент от всей длины тонкой кишки от пилорического отдела желудка до слепой кишки.

Протокол исследования

Эксперименты были проведены на 48 самцах нелинейных белых мышей массой 20-25 г. За 18 часов до эксперимента животные были оставлены без корма, вода давалась ad libitum. Животные были разделены случайным образом на четыре группы по 12 мышей в каждой группе. Первой группе вводили клонидин в физиологическом растворе, объемом 0,25 мл из расчета 1 мг/кг внутрибрюшинно, второй - моксонидин 1 мг/кг, третьей агматин - 10 мг/кг, четвертой группе вводили физиологический раствор, объемом 0,25 мл (контроль). Через 15 мин после введения препаратов всем животным через зонд вводили по 0,25 мл 4% суспензии активированного угля в 2%-ном р-ре крахмала. Через 40 мин после введения угля животных умерщвляли высокой дозой диэтилового эфира, извлекали тонкий кишечник от пилорического отдела желудка до слецой кишки. Измеряли всю длину тонкой кишки и расстояние, которое прошла пища с углем от пилорического отдела желудка.

3. Метод оценки антиноцицептивной активности по тесту корчей

Метод корчей (Koster et al., 1959) основан на подсчете количества корчей животного (специфическая поведенческая болевая реакция - сокращения абдоминальных мышц) в ответ на внутрибрюшинное введение слабого 0,6% - ного раствора уксусной кислоты из расчета 1 мл на 100 г веса тела животного. При "этом происходит активация многочисленных терминалей ноцицепторов, обширно иннервирующих органы брюшной полости, что сопровождается развитием специфической поведенческой реакции - корчей. После введения вещества, когда развивается стабильная поведенческая реакция корчей, начинают подсчет количества корчей, который производят в течение 10 минут.

Протокол исследования

Эксперименты проводились на 60 самцах нелинейных белых мышей, весом 25-30 г. Животные были случайным образом разделены на 5 групп, по 12 животных в каждой группе.

1-ой группе (контроль) вводили физ. раствор, объемом 0,25 мл, п/к

2-ой группе вводили клонидин, из расчета 1 мг/кг п/к в объеме 0,25 мл

3-ей группе вводили моксонидин из расчета 1 мг/кг п/к в объеме 0,25 мл

4-ой группе вводили агматин из расчета 1 мг/кг п/к в объеме 0,25 мл

5-ой группе вводили агматин из расчета 10 мг/кг п/к в объеме 0,25 мл

Через 10 мин всем животным был введен 0,6%-ный раствор уксусной кислоты по 0,25 мл внутрибрюшинно. После инъекции кислоты начинали подсчет количества корчей, который осуществляли в течение 10 мин.

4. Расчеты и статистическая обработка результатов

В опытах на изолированных органах для расчета показателя pD2 брали результаты 2-го и 3-го тестирования. По этим результатам строили кривые зависимости «концентрация-эффект». Для этого по оси абсцисс откладывали отрицательный логарифм молярной концентрации агониста, а по оси ординат - величину реакции тест-объекта на данный препарат в процентах от максимального эффекта. В опытах на семявыносящем протоке крысы и на подвздошной кишке морской свинки, где применялась электрическая стимуляция, за максимальный эффект считали полное угнетение сокращений, вызванных электрическим током, а в опытах на толстой кишке мыши за максимальный эффект считали максимальный по амплитуде сократительный ответ. По полученным графикам определяли показатели активности EC50 и pD2 (соответственно молярная концентрация и логарифм молярной концентрации соединения, в которой оно вызывает полумаксимальную функциональную реакцию изучаемого объекта). Статистическую обработку данных проводили на основании данных 6 и более экспериментов по методу Стьюдента.

Анализ результатов экспериментов с антагонистами проводили с помощью метода О. Arunlakshana и Н. Shild (1959), предназначенного для графического определения по серии кривых «концентрация-эффект» агониста, полученных до и в присутствии возрастающих концентраций антагониста, константы сродства конкурентного антагониста к специфическим рецепторам (рА^). Предложенный Shild способ графического анализа позволяет также оценить характер антагонизма исследуемого вещества с агонистом. График по методу Shild строили, используя уравнение: Л'/Л=1+В/КВ (Caddum, 1957), где

- Л'/Л - отношение равноэффективных концентраций агониста в присутствии (Л') и отсутствии (Л) антагониста.

- В - молярная концентрация антагониста

- Кв - константа диссоциации антагониста

При Л'/Л=2, отношение В/Кв=1, или, переводя в логарифмы:

logB-logKB=0; так как рЛ^определяется как отрицательный логарифм от [В], следовательно:

pA2=-logB=logKB=log (1/logKB) log(A'/A-l)=logB-logKB

При использовании разных концентраций антагонистов отношение Л7Л считают для каждой концентрации. В случае параллельного сдвига кривых зависимости «концентрация-эффект» агониста в присутствии разных концентраций антагониста отношение Л'/Л определяли на уровне EC50. При непараллельном сдвиге кривых в расчетах использовали показатели Л'/Л на уровне ЕС20. Далее строили график по методу Schild, в котором по оси абсцисс откладывали значения -log10[B], а по оси ординат -значения log(A'/A-l). Прямая, соединяющая нанесенные в этой системе координат

точки, пересекала ось абсцисс под углом ОС. Если тангенс этого угла не отличался от 1, то взаимодействие антагониста с агонистом расценивалось как конкурентное. Точка пересечения линии регрессии с осью абсцисс на этом графике показывает величину -logKB, численно равную показателю рА2 для данного антагониста. Оба эти показателя в случае конкурентного антагонизма характеризуют сродство антагониста к специфическим рецепторам. При неконкурентном характере антагонизма (угол наклона меньше или больше единицы) эти показатели могут служить мерой активности неконкурентного антагониста. Средние значения показателей рА2 и slope рассчитывали по методу Стьюдента на основании 6 и более экспериментов. Влияние препаратов на пропульсивную активность кишечника анализировали при помощи непарного t-критерия Стьюдента. Для оценки различий в разных группах в тесте корчей использовали критерий Манна-Уитни.

Различия считались достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05. Все результаты представлены в виде (среднее стандартная ошибка среднего).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Модели изолированных органов

1.1. Влияние на изолированную подвздошную кишку морской свинки

В проведенных исследованиях клонидин и моксонидин дозозависимо угнетали сокращения гладких мышц ПКМС, вызываемые электрической стимуляцией (рис. 1). Предварительное введение антагонистов - йохимбина и эфароксана - вызывало уменьшение действия агонистов. Для достижения равнозначного эффекта требовалось увеличить концентрации агонистов. На основании серии экспериментов строили кривые зависимости «концентрация-эффект» агонистов в отсутствии и присутствии антагонистов в возрастающих концентрациях (3x10-9 - 1x10-7 М). При добавлении антагонистов кривые «концентрация-эффект» смещались вправо (рис. 3). Используя кривые зависимости эффекта от концентрации, рассчитывали активность агонистов (таб.1)

Таблица 1. Активность агонистов в отсутствии и присутствии возрастающих

концентраций антагонистов (ПКМС)

Клонидин Моксонидин

ЕС50(М) pD,(-logEC,0) ес50(М) p D 2 (-log EC50)

Контроль 1,04х10-7 6,98 + 0,14 2,09х10-7 6,67 ±0,09

Йохимбин 3х 10-9 1,07x10-6 5,97 ±0,12 1,02x10-6 5,99 ±0,08

Йохимбин 1х10-8 2.,72х10-6 5,56 ±0,13 1,80x10-6 5,74 ±0,10

Йохимбин 3х10-8 1,26х10-5 4,90 ±0,15 3,43х10-6 5,46 ±0,12

Йохимбин 1x10-7 2,83х10-5 4,56 ±0,10 1,10х10-5 4,96 ±0,09

Эфароксан 3х10-' 9,34х10-7 6,03 ±0,10 8,75x10-6 5,06 ±0,12

Эфароксан 1х10-8 3,94x10-6 5,40 ±0,13 1,50x10-5 4,82 ±0,11

Эфароксан 3х10-8 1,90х10-5 4,72 ±0,15 2,60х10-5 4,58 ±0,09

Данные представлены как М ± m (mean ± SEM), n=6

Клонидин был примерно в 2 раза активнее на данной модели, чем моксонидин (таб. 1). При относительно низких концентрациях йохимбина клонидин и моксонидин не отличались по активности. В противоположность этому, эфароксан в концентрациях 3х10-9 М и 1x10^ M ослаблял действие моксонидина в 9,37 и 3,8 раза, соответственно, в большей степени, чем действие клонидина. В концентрации 3х10-8 М вызываемое эфароксаном угнетение эффекта было одинаковым для обоих препаратов.

Рис.3. Кривые зависимости «концентрация-эффект» для клонидина и моксонидина в отсутствии ( ) и присутствии йохимбина и эфароксана

Концентрации антагонистов: ♦ - 3х10-9М, А- 1х10-8М, • - 3х10-8М

Йохимбин и эфароксан в одинаковой степени ослабляли действие клонидина, тогда как по отношению к моксонидину эфароксан как антагонист был в 8 раз активнее по сравнению с йохимбином, причем эта разница сохранялась во всех использованных концентрациях (рис. 4).

Рис.4. Сравнительная активность клонидина (А) и моксонидина (Б) в отсутствии (светлые столбики) и присутствии антагонистов - йохимбина (заштрихованные столбики) и эфароксана (темные столбики) - в возрастающих концентрациях (1 - 3x10-9 М, 2 - 1x10^ М, 3 - 3х10-8М), на модели ПКМС. Активность выражена показателем pD2, вертикальные линии отражают величину стандартной ошибки среднего при П>6, * - р<0,001. При сравнении всех групп с контролем р<0,001.

На основании данных кривых «концентрация - эффект» с антагонистами, используя концентрации агонистов на уровне 20% эффекта (на этом уровне параллельность сдвига хорошо выражена, при более высоких концентрациях она нарушается из-за трудностей с отмыванием агонистов), были построены графики по методу Schild для антагонистов (рис. 5А и 5Б). На графиках приведены значения углов наклона a (slope) линий регрессии, характеризующие характер антагонизма йохимбина и эфароксана по отношению к клонидину и моксонидину.

йоям5ин-4ов[М] эффоссан-1од[М]

Рис.5. Графики, построенные по методу Schild для антагонистов - йохимбина (А) и эфароксана (Б) - по отношению к клонидину (1) и моксонидину (2) со значениями наклона (slope), модель ПКМС, n=6.

В - активность йохимбина (светлые столбики) и эфароксана (темные столбики) по антагонизму к клонидину и моксонидину, выраженная показателем рА2 (отрицательный логарифм константы диссоциации антагониста) на модели ПКМС. Вертикальные линии отражают величину стандартной ошибки среднего, n=6, * - р<0,001.

Значения slope линий регрессии клонидина и моксонидина в присутствии йохимбина практически одинаковы и почти равны 1, что указывает на конкурентный антагонизм йохимбина по отношению к клонидину и моксонидину на данной модели. Slope для клонидина и моксонидина в присутствии эфароксана достаточно значимо отличаются от единицы. Значения рА2, характеризующие сродство антагонистов к рецепторам, для йохимбина и эфароксана одинаковы в опытах с клонидином, тогда как рА2 для эфароксана больше, чем рА2 для йохимбина на 1,8 логарифмические единицы в экспериментах с моксонидином. (таб. 2, рис. 5В).

Таблица 2. Значения рА2 и slope для йохимбина и эфароксана по отношению к

клонидину и моксонидину (ПКМС)

Антагонист Агонис т р А 2 slope

Йохимбин клонидин 9,28 ±0,05 0,97 ±0,03

моксонидин 8,73 ±0,06 0,96 + 0,06

Эфароксан клонидин 9,17 ±0,13 1,42 ±0,08

моксонидин 10,56 ±0, 16 0,77 ±0,08

Значения представлены как М ± m, n=6

1.2. Влияние на изолированный семявыносящий проток крысы

Клонидин и моксонидин дозозависимо вызывали сокращения сегментов семявыносящего протока крысы (СПК). Клонидин на данной модели был в 5 раз активнее, чем моксонидин (таб. 3).

Таблица 3. Активность агонистов в отсутствии и присутствии возрастающих

концентраций антагонистов (СПК)

Клонидин Моксонидин

ЕС50(М) pD„(-logEC„) ЕС» (М) pD, (-log EC5O)

Контроль 5,24х10-' 6,98 ±0,14 2,65x10-7 6,67 ±0,09

Йохимбин 3x10-9 1,07x10-6 5,97 ±0,12 8,62x10-7 6,06 ±0,08

Йохимбин 1x10-8 2,72x10-6 5,56 ±0,13 1.72x10-6 5,76 ±0,10

Йохимбин 3х10-8 1,26х10-5 4,90 ±0,15 3,43x10-6 5,46 ±0,12

Йохимбин 1x10-7 2,83x10-5 4,56 ±0,10 9,46x10-6 5,02 ±0,09

Эфароксан 3х10-' 9,34х10-7 6,03 ±0,10 1,05x10-6 5,98 ±0,12

Эфароксан 1x10'" 3.94x10-6 5,40 ±0,13 2,77x10-6 5,56 ±0,11

Эфароксан 3х10-8 1,90x10-5 4,72 ±0,15 1,20x10-5 4,92 ±0,09

Данные представлены как М ± т, п=6

Активность клонидина в присутствии высоких концентраций йохимбина (3х10-8М и 1х10-7М) была ниже, чем активность моксонидина (в 3,66 и 2,98 раза соответственно). При относительно низких концентрациях йохимбина различий в активности не было. Эфароксан одинаково ослаблял действие обоих тестируемых препаратов. Йохимбин и эфароксан в равной степени угнетали действие клонидина и моксонидина. Значения

slope линий регрессии для клонидина и моксонидина в присутствии йохимбина практически одинаковы и почти равны 1. Значение slope для линии регрессии моксонидина в присутствии эфароксана тоже близко к единице, тогда как для клонидина эта величина значимо отличается от единицы (таб. 4).

Таблица 4. Значения рА2 и slope для йохимбина и эфароксана по отношению к

клонидину и моксонидину (СПК)

Антагонист Агонист рА, slope

Иохимбин клонидин 9,49 ± 0,05 0,96 ±0,03

моксонидин 8,71 ±0,06 0,94 + 0,06

Эфароксан клонидин 9,31 ±0,13 1,43 ±0,08

моксонидин 9,16 ±0,16 1,11 ±0,08

Значения представлены как М ± m, n=6

Для йохимбина рА2 по отношению к клонидину больше, чем по отношению к моксонидину на 0,8 лог единицы. Значение рА2 для эфароксана больше, чем рА2 для йохимбина на 0,5 логарифмические единицы в экспериментах с моксонидином.

1.3. Влияние на изолированную толстую кишку мыши

Клонидин и моксонидин дозозависимо вызывали сокращения толстой кишки мышей (рис. 3). Дозозависимые ответы вызывали ацетилхолин и даларгин (синтетический опиоидый пептид). Действие клонидина, моксонидина и даларгина, но не ацетилхолина предупреждалось ингибитором циклоксигеназы диклофенаком (1х10"5 М). На действие клонидина и моксонидина не оказывали влияние атропин и налоксон (1х10-7 М). Атропин предупреждал действие ацетилхолина, а налоксон - даларгина. Клонидин на данной модели был в 2 раза активнее, чем моксонидин, тогда как по эффективности моксонидин превосходил клонидин. Предварительное введение антагонистов - йохимбина и эфароксана - ослабляло действие клонидина и моксонидина. Кривые зависимости «концентрация-эффект» агонистов в присутствии антагонистов в возрастающих концентрациях (3х10-9 - 3х10-8 М) смещались вправо. Сравнительная активность исследуемых препаратов на фоне различных концентраций йохимбина и эфароксана представлена в таб. 5.

Таблица 5. Активность агонистов в отсутствии и присутствии различных концентраций

антагонистов (ТКМ)

Клонидин Моксонидин

ЕС50(М) pD,(-logEC5o) ЕС50(М) pD2(-logEC50)

Контроль 1,22x10-8 7,91 ±0,10 6,67x10-' 7,18 ±0,08

Йохимбин 3x10-' 1.71х10-7 6,77 ±0,12 1.90х10-6 5,72 ± 0,12

Йохимбин 1 х 1 0- 8 2,0 1x10-6 5,70 + 0,15 5.33х10-6 5,27 ±0,13

Йохимбин 3x 1 0- 8 6.77х10-6 5,17 ±0,13 3 ,20х10-5 4,50 ±0,11

Эфароксан 3x 1 0-9 3,81х10-8 6,03 ±0,10 1,56x10-6 5,80 ±0,11

Эфароксан 1 x 1 0- 8 1,28х10-7 5,40 ±0,13 1,04х10-5 4,98 ±0,12

Эфароксан 3x1 0-' 7,78x10-7 4,72 ±0,15 2,24х10-5 4,65 ± 0,20

Данные представлены как М ± m, при n=6

Йохимбин и эфароксан выраженнее угнетали действие моксонидина, чем клонидина во всех трех использованных концентрациях, причем ингибирующий эффект эфароксана на моконидин был в несколько десятков раз больше, чем в отношении клонидина во всех трех использованных концентрациях (в 41; 81 и 29 раза соответственно). Для йохимбина эти соотношения в отношении агонистов были ниже (в 11; 2,6 и 4,7 раза). При сравнении действия антагонистов на эффект моксонидина эфароксан только в одной концентрации (1x10-8 М) был активнее йохимбина. На эффект клонидина йохимбин оказывал более выраженное влияние, чем эфароксан во всех концентрациях (в 4,5; 15,6; 8,7 раза соответственно).

В отношении моксонидина на данной модели антагонисты проявляют свойства конкурентного ингибирования, в отношении клонидина конкурентный антагонизм выражен меньше (значения углов наклона отклоняются от 1, таб. 6).

Таблица 6. Значения рА2 и slope для йохимбина и эфароксана по отношению к

клонидину и моксонидину (ТКМ)

Антагонист Агонист рА2 slope

Йохимбин клонидин 9,13 ±0,05 1,54 ±0,03

моксонидин 9,58 ±0,06 1,19 ±0,06

Эфароксан клонидин 8,79 ±0,13 1,56 ±0,08

моксонидин ,10,20 ±0,16 1,01 ±0,08

Значения представлены как М ± m, n=6

Значения рА2, характеризующие сродство антагонистов к рецепторам, на которые действуют исследуемые агонисты, для эфароксана по отношению к моксонидину больше, чем по отношению к клонидину на 1,4 лог единицы.

2. Эксперименты in vivo

2.1. Влияние веществ на пропульсивную активность кишечника

Влияние клонидина и моксонидина на кишечный транзит пищи с активированным углем в сравнении с контролем представлены на рис. 6А. Согласно полученным результатам предварительное внутрибрюшинное введение мышам клонидина (препарат сравнения, 1 мг/кг) достоверно (р<0,001) уменьшало расстояние, на которое продвигалась по кишечнику пища с углем ( по отношению ко всей длине кишечника) с 63,7 ± 6,0% (контроль) до 13,0 ± 5,0%. Клонидин оказывал выраженное угнетающее действие на спонтанную двигательную активность мышей. Моксонидин (I мг/кг) уменьшал продвижение пищи до 36,5 ± 4,7%. На спонтанную двигательную активность животных моксонидин не влиял.

2.2. Антиноцицептивная активность веществ по тесту корчей

В данном тесте с висцеральной болью клонидин (препарат сравнения) и моксонидин в дозе 1 мг/кг оказывали достоверное антиноцицептивное действие. Сравнивали среднее количество корчей у мышей контрольной группы, которым предварительно (за 10 мин) вводили физиологический раствор (этот показатель

принимали за 100%), со средним количеством корчей у мышей с предварительной инъекцией клонидина и моксонидина (рис. 6В). Согласно результатам наших экспериментов клонидин полностью предотвращал возникновение корчей в ответ на внутрибрюшинное введение 0,6%-ного раствора уксусной кислоты (на рис. 6В отсутствуют столбики с клонидином). Двигательная активность этих мышей была резко снижена. Достоверно уменьшалось количество корчей у мышей с предварительно введенным моксонидином и составляло 54,9% ± 5,6% по отношению к среднему количеству корчей в контрольной группе. Двигательная активность мышей данной группы не изменялась.

Рис. 6. Влияние моксонидина (А - заштрихованный столбик), клонидина (А -серый столбик) и агматина (Б) на прохождение пищи по желудочно-кишечному тракту мышей. По оси ординат - расстояние в процентах по отношению ко всей длине тонкого кишечника, по оси абсцисс - дозы веществ.

В: изменение количества корчей у мышей при действии моксонидина (заштрихованный столбик) и клонидина в процентах по отношению к контролю;

Вертикальные линии отражают величину стандартной ошибки среднего (М±т); * - р<0,05; ** - р<0,01, *** - р<0,001

3. Исследования с использованием агматина

Агматин в высоких концентрациях 3х10"5 М - 1х10-3 М вызывал некоторое угнетение сокращений сегментов ПКМС и СПК, вызываемых электрической

стимуляцией. ЕС50 агматина в экспериментах с ПКМС было равно 1х10-4М, а в экспериментах с СПК - 5х10-4 М. Максимальное угнетение сокращений, вызываемое

агматином, было практически одинаково на обеих моделях (36,12+2,31% и 38,23+3,5%

соответственно). Йохимбин и эфароксан в низкой концентрации (3 х 10'9 М) полностью

предупреждали действие агматина, поэтому не удалось построить кривые «доза-эффект» в присутствии антагонистов и рассчитать показатели рА2. Агматин не оказывал влияние на сократительную активность отрезков изолированной толстой кишки мыши.

Для определения модулирующего влияния агматин вводили в раствор с препаратами изолированных органов в концентрации 1 10-5 М за 10 мин до

исследуемых веществ. Агматин достоверно не влиял не угнетающее действие клонидина (3х 10" М) и моксонидина (3х10-7 М). Введение клонидина и моксонидина вызывало угнетение сокращений ПКМС на 55,41±6,54% и 63,83± 11,12%, соответственно; на фоне агматина клонидин и моксонидин вызывали угнетение сокращений на 52,43±7,21% и 69,52±13,11%, соответственно (р>0,05, п=10). Достоверно не изменялась также амплитуда угнетения сокращений на модели СПК. Даларгин (3x10-7 М) вызывал угнетение сокращений ПКМС на 55,47114,02%, а на фоне агматина - на 57,56±17,47% (р>0,05, n=16). Агматин достоверно не влиял на угнетающее действие даларгина и в модели СПК.

Гистамин и серотонин вызывали сокращения изолированных сегментов ПКМС. Амплитуда сокращений ПКМС, вызываемых гистамином и серотонином в концентрации 3x10-7 М составляла 11,15±3,37 и 13,28±6,16 мм соответственно; на фоне агматина -11,25+2,98 и 13,56±5,29 мм (р>0,05, n=16).

In vivo исследовалось влияние агматина на пропульсивную активность кишечника и его антиноцицептивное действие по тесту корчей.

Влияние агматина (в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно) на кишечный транзит пищи с активированным углем в сравнении с контролем представлено на рис. 6Б. Предварительное внутрибрюшинное введение агматина увеличивало расстояние продвижения пищи по тонкому кишечнику с 63,7 ± 6,0% до 79,2 ± 7,8% (р<0,05).

В тесте с висцеральной болью агматин (10 мг/кг) не вызывал антиноцицептивого эффекта. Напротив, при предварительном введении мышам агматина в дозе 1 мг/кг наблюдалась тенденция к повышению болевой чувствительности.. Среднее количество корчей у мышей, получивших агматин (1 мг/кг) увеличилось до 124,7 ± 9,1% по отношению к среднему количеству корчей в контрольной группе, принятому за 100%. Однако, эти различия были недостаточно достоверны (р=0,071).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Модели изолированных органов

1.1. Влияние моксонидина на подвздошную кишку морской свинки

Результаты проведенной работы показали следующее:

1) действие моксонидина на сокращения изолированной подвздошной кишки морской свинки более выражено угнетается эфароксаном (I/ö2 - антагонист, обладающий примерно в 37 раз большей селективностью к Ij-рецепторам, чем к Cij-адренорецепторам (Emsberger et al., 1990.1992; Haxhiu et al., 1994)), чем йохимбином (селективный антагонист (Хг-адренорецепторов с очень низким аффинитетом к 1г связывающим сайтам (отношение аффинитетов Ii/ot2<0,01, см таб.1, Ernsberger et al., 1987, 1992; Hamilton et al., 1988, Senard et al., 1990, Goldberg and Robertsson, 1983)). Эти данные подтверждают результаты, полученные в разных лабораториях в экспериментах с центральным введением (микроинъекции в RVLM, введение в желудочки мозга) антагонистов, где идазоксан (смешанный - антагонист с низким аффинитетом к а2-адренорецепторам) и эфароксан были более эффективны, чем йохимбин по антагонизму к клонидину, рилменидину и моксонидину (Emsberger et al., 1990; Feldman et al., 1990;

Gomez et al., 1991; Tibirica et al., 1991a; Mayorov et al., 1993; Haxhiu et al., 1994; Tolentino-Silvaetal. ,2000).

2) Эфароксан был более эффективен как антагонист по отношению к моксонидину, по сравнению с клонидином в низких концентрациях, причем в самой низкой концентрации эта разница была больше (9 раз). Наши данные согласуются с данными, полученными О.Н.Хохловой и соавт. (2001а) в экспериментах с центральным введением (в RVLM) моксонидина и антагонистов. В этом исследовании эфароксан, в отличие от йохимбина, в низкой концентрации (4 нмоль) проявлял свойства антагониста (незначительно повышал АД), тогда как в дозе 8 нмоль он действовал так же, как и йохимбин (немного снижал АД). Считается, что антагонисты в низких концентрациях действуют более избирательно, чем в высоких. В высоких концентрациях они способны блокировать и другие рецепторы, селективность к которым у них гораздо меньше, или могут оказывать токсическое действие (Caddum et al., 1957; Shild, 1957; Блаттнер и соавт 1983; Ruffolo, 1984). Учитывая, что в высоких концентрациях (3х10-8 М) эфароксан был одинаково эффективен как антагонист по отношению к клонидину и моксонидину, вероятно, можно считать концентрацию (3х10-9 М) как блокирующую селективно Ij-рецепторы. Это предположение подтверждается еще и тем, что, хотя клонидин и обладает достаточно выраженным аффинитетом к имидазолиновым Ir рецепторам, отношение аффинитетов у моксонидина равно примерно 34, тогда как для клонидина эта цифра гораздо ниже -4 (Ernsberger et al., 1992).

3) Йохимбин был эффективнее в отношении клонидина, чем в отношении моксонидина, возможно, из-за гораздо большего аффинитета клонидина к адренорецепторам по сравнению с моксонидином (по данным разных лабораторий в 201000 раз больше, чем у моксонидина (Ernsberger et al., 1992; Bricca et al., 1994; Jasper et al., 1998; Zhu ct al., 1999; Uhlen et al., 1995)).

4) Показатели рА для йохимбина и эфароксана одинаковы в опытах с клонидином, тогда как в экспериментах с моксонидином между ними значительная разница: рА для эфароксана больше, чем рА2 для йохимбина на 1,8 лог единицы. Это значит, что эфароксан по сравнению с йохимбином проявляет почти в 65 раз большее сродство к рецепторам, на которые действует моксонидин. Учитывая вышеизложенное и принимая во внимание, что рА является показателем, который характеризует сродство антагониста к рецепторам, на которые действует тестируемый агонист и не зависит от активности агониста, можно предположить, что в случае с клонидином оба антагониста действуют на одни и те же рецепторы, тогда как в случае с моксонидином эфароксан, вероятно, действует еще и на другие рецепторы, предположительно - имидазолиновые.

На основании результатов нашей работы можно сделать заключение, что в реализации эффектов моксонидина на модели подвздошной кишки морской свинки участвуют как Ог-адренорецепторы, так и имидазолиновые Ij-рецепторы.

1.2. Влияние моксонидина на семявыносящий проток крысы Результаты экспериментов показали, что:

1) йохимбин и эфароксан практически в одинаковой степени ослабляют действие моксонидина. Оба антагониста также показали одинаковую эффективность в отношении клонидина на данной модели;

2) йохимбин был эффективнее как антагонист клонидина, чем моксонидина, возможно из-за гораздо большего аффинитета клонидина к Сф-адренорецепторам по сравнению с моксонидином (по данным разных лабораторий в 20-1000 раз больше, чем у моксонидина (Emsberger et al., 1992; Bricca et al., 1994; Jasper et al., 1998; Zhu et al., 1999; UMen et al., 1995)); это подтверждается тем, что активность клонидина на данной модели была в 5 раз больше;

3) йохимбин и эфароксан проявляют одинаковое сродство к рецепторам, на которые действует клонидин. Показатели рА2 антагонистов в экспериментах с моксонидином различаются незначительно - на 0,5 лог единицы. Это означает, что сродство эфароксана к рецепторам моксонидина примерно в 3 раза выше, чем у йохимбина. Эта разница незначительная, если учесть, что эфароксан проявляет в =600 раз большую селективность к имидазолиновым Ij-рецепторам, чем йохимбин (Emsberger et al., 1987, Piletz et el., 1996).

Таким образом, на основании приведенных данных можно предположить, что на использованной модели действие моксонидина, так же как и клонидина реализуется преимущественно через Иг-адренорецепторы. Эти данные подтверждают результаты, полученные в экспериментах на СПК, проведенных Avellar and Markus (1996) с использованием норадреналина, клонидина, рилменидина, идазоксана и йохимбина. Было показано, что все три агониста действуют на одни и те же рецепторы -(Хг-адренорецепторы. Показатель pD2 клонидина (7,2±0,19) рассчитанный в этих исследованиях, совпадает с нашими данными (см. таб. 3). Значение рА2 йохимбина по антагонизму к клонидину авторы не приводят. Сходные результаты, подтверждающие преимущественную роль адренорецепторов в действии клонидиноподобных веществ на изолированный семявыносящий проток крысы, описаны и в работах других авторов (Jurkiewicz et al., 1995; Santos et al., 2003).

1.3. Влияние моксонидина на толстую кишку мышей

Проведенные нами эксперименты показали следующее: диклофенак был эффективен как антагонист клонидина, моксонидина и даларгина, тогда как на эффект ацетилхолина он не влиял; атропин угнетал только действие ацетилхолина. Эти данные предполагают отсутствие холинергического механизма в действии клонидина, моксонидина и даларгина. Налоксон ослаблял действие только даларгина, что подтверждает отсутствие действия моксонидина и клонидина на опиоидные рецепторы. Наши данные согласуются с результатами исследования на изолированной толстой кишке мышей с использованием агонистов СС-адренорецепторов (Fontaine et al., 1984).

Анализ полученных данных дает основание предположить, что клонидин и моксонидин вызывают сократительные ответы ТКМ посредством ингибирования нехолинергического неадренергического механизма путем активации адренорецепторов и, возможно, имидазолиновых Ij-рецепторов. Ранее было показано, что угнетение этого нехолинергического неадренергического механизма растормаживает другой, противоположно действующий механизм регуляции мышечного тонуса ТКМ -синтеза простагландинов (Fontaine et al., 1984). В проведенных экспериментах это положение подтверждается способностью диклофенака предупреждать действие препаратов. В последнее время были получены данные о возможности влияния

моксонидина на синтез простагландинов на модели изолированного перфузируемого сердца крысы (Schafer et al., 2000).

Взаимодействие клонидина и моксонидина с антагонистами носит, скорее всего, конкурентный характер, хотя из-за трудности отмывания высоких концентраций исследуемых препаратов (клонидина в большей степени) не удалось получить полных графиков зависимости «доза-эффект». Значения углов наклона (таб. 6) характеризующие конкурентный антагонизм в опытах с клонидином больше отклоняются от единицы, по сравнению с моксонидином, что, возможно, происходит из-за десенситизации рецепторов высокими концентрациями клонидина (Schild, 1957). Значения рА йохимбина для клонидина и моксонидина отличаются незначительно, тогда как сравнивая значения рА2 эфароксана для обоих веществ можно предположить, что, по-видимому, доля участия имидазолиновых Ij-рецепторов в реализации эффектов моксонидина несколько больше, чем клонидина. Однако, учитывая, что аффинитет эфароксана к имидазолиновым Ij-рецепторам гораздо выше, чем йохимбина (К; 0,15 и 5000 нмоль соответственно), тогда как аффинность к адренорецепторам у них сопоставима (К; 5,6 и 5,8 нмоль соответственно) (Ernsberger et al., 1997), полученные результаты позволяют предположить, что влияние и клонидина и моксонидина на ТКМ обусловлено преимущественно взаимодействием с адренорецепторами. В то же время, некоторое превосходство моксонидина над клонидином по вызываемому эффекту (максимальная сила сокращений) в этой модели, возможно, обусловлено влиянием и на имидазолиновые рецепторы.

2. Эксперименты in vivo

2.1. Влияние моксонидина на пропульсивную активность кишечника

Согласно результатам наших исследований моксонидин подобно клонидину оказывал угнетающее действие на пропульсивную активность кишечника, однако действие моксоиидина было гораздо менее выражение по сравнению с влиянием клонидина. В исследованиях по действию клонидина на моторику кишечника in vivo показано, что клонидин оказывал выраженый противодиарейный эффект, действуя на периферические 02-адренорецепторы (Thollander et al., 1989). При сравнении действия агонистов гнетам иновых Нз-рецепторов и клонидина на желудочно-кишечный транзит in vivo и in vitro у мышей, установлено, что действие клонидина реализуется через периферические Ог-адренорецепторы окончаний холинергических нейронов, тогда как Нз-агонисты гистаминовых рецепторов оказывают влияние только в экспериментах in vivo, т.е. через рецепторы, которые находятся вне кишечного сплетения (Pozzoli et al., 2002). На основании экспериментов на крысах in vivo и in vitro Umesava с соавт. (2003) сделали вывод, что ингибирующее действие клонидина на моторику кишечника реализуется путем активации центральных Ог-адренорецепторов. Учитывая вышеизложенное и принимая во внимание более высокий аффинитет клонидина к адренорецепторам, можно предположить, что действие моксонидина реализуется через те же механизмы, что и клонидина - адренорецепторы. Косвенным подтверждением данному предположению является то, что агматин в экспериментах in vivo на мышах не оказывал влияния на угнетающее действие морфина на моторику желудочно-кишечного

тракта (Kolesnikov et al., 1996), а по результатам наших исследований агматин в дозировке 10 мг/кг даже стимулировал моторику кишечника.

2.2. Действие моксонидина при висцеральной боли

Моксонидин оказывал выраженное антиноцицептивное действие при висцеральной боли: снижал количество корчей, вызываемых раздражением брюшины раствором уксусной кислоты почти вдвое. Действие клонидина было более выраженным, однако, клонидин, в отличие от моксонидина, оказывал также выраженное седативное действие, вероятно, обусловленное влиянием на центральные а.ги? адренорецепторы. Через какие рецепторы опосредуется антиноцицептивное действие клонидиноподобных веществ пока недостаточно ясно. В исследованиях по спинальной анальгезии на нокаутных мышах с отсутствием адренорецепторов было показано, что анальгезирующее действие клонидина обусловлено влиянием именно на подтип адренорецепторов, тогда как в реализацию антиноцицептивного эффекта моксонидина вовлечены и другие подтипы, в частности агс-адренорецепторы (Stone et al., 2003; Fairbanks et al., 2002). Monroe и соавт. (1995) в экспериментах со спинальной анальгезией у крыс приводят данные, не подтверждающие участие имидазолиновых рецепторов в антиноцицептивном действии клонидина. Напротив, Shannon и соавт. (2000), предположили, что анальгезирующее действие моксонидина (формалиновый тест на крысах) реализуется через адренорецепторы (причем и подтипы в этот эффект не вовлечены), а клонидин действует через механизм, нечувствительный к йохимбину. В одной из последних работ по анальгезии у мышей (Roerig, 2003), при исследовании действия агматина (эндогенный лиганд имидазолиновых рецепторов, взаимодействующий также и с адренорецепторами), было показано, что агматин потенцирует анальгезию, вызываемую морфином и угнетает развитие толерантности к морфину. Это действие агматина реализуется через Ог-адрено и имидазолиновые I1-рецепторы при центральном введении, а при спинальной анальгезии - только через имидазолиновые ^-рецепторы. Эти данные, а также отсутствие у моксонидина седативного эффекта позволяют предположить возможность участия имидазолиновых ^-рецепторов в антиноцицептивном действии моксонидина. Кроме того, некоторыми исследователями (Boronat et al., 1999; Sanchez-Blazquez et al., 2000) выдвинуто предположение, что имидазолиновые Ij-рецепторы могут модулировать эффекты опиоидных рецепторов. Это влияние реализуется через GrG0 белки.

3. Исследование некоторых фармакологических свойств агматина

Агматин в диапазоне стандартных концентраций (1х10-'9 - 3x10-6 М), которые обычно используются в исследованиях на изолированных органах, не проявлял активности на моделях ПКМС, СПК и ТКМ. Действие этого амина на моделях ПКМС и СПК проявлялось только при использовании в высоких концентрациях (1x10-6 - 1x10-3 М), которые обычно не применяются в исследованиях подобного рода (Блаттнер и соавт., 1983), так как могут оказывать токсический эффект на ткани. Однако по данным литературы в опытах с агматином часто используются высокие концентрации агматина (300 мкмоль - Pinthong et al., 1995; 100 мкмоль - Szabo et al., 1995; 1-10 мкмоль -Molderings and Gothert, 1995,1-10ммоль - Jurkiewicz et al., 1996; Santos et al., 2003). Это обосновано тем, что по данным Raasch с соавт. (1995) концентрация агматина в тканях в

физиологических условиях тоже высока и составляет 0,45 пг/мг - 71пг/мг (в семявыносящих протоках крысы около 9,5 пг/мг) ткани, поэтому такие высокие концентрации, используемые в опытах in vitro, тоже, вероятно, физиологичны. Кроме того, по данным некоторых радиолигандных исследований (Piletz et al., 1995; Pinthong et al., 1995; Li et al., 1994) агматин связывается с двумя различными сайтами: с имидазолиновыми ¡¡-рецепторами - аффинитет к которым тоже различался в зависимости от ткани (K, high=33 - 127 нмоль и К, low~280 нмоль) - и 02-адренорецепторами (к, =26-164 мкмоль). Учитывая эти данные и эффективность агматина только в высоких дозах, можно предположить, что в наших исследованиях агматин, вероятно, связывался с имидазолиновыми ¡¡-рецепторами с низкими значениями аффинитета (К, low) и с Иг-адренорецепторами. Это предположение подтверждается тем, что йохимбин и эфароксан в низких концентрациях одинаково эффективно блокировали действие агматина. Однако для более точного определения рецепторного спектра действия агматина, нужно, вероятно, использовать более чувствительные к действию агматина модели, чем ПКМС и СПК. На модели ТКМ агматин оказался неэффективным. Вероятно, из-за низкой чувствительности данных органов, агматин не влиял на действие клонидина и моксонидина.

Согласно литературным данным агматин повышает секрецию хлористоводородной кислоты в желудке крыс, взаимодействуя с адренорецепторами (Daly, 1984) и с имидазолиновыми ¡/^-рецепторами (Molderings et al., 1998; 1999с). Предполагают, что агматин увеличивает выделение гистамина из энтерохромаффиноподобных клеток желудка (Molderings et al., 1999a), что ведет к повышению секреции кислоты путем активации Н2-гистаминовых рецепторов. Эти исследования и данные о том, что полиамины могут регулировать выделение гистамина (Purcell et al., 1994), позволили нам предположить, что, возможно, агматин может оказывать влияние на эффекты гистамина и серотонина при их взаимодействии с соответствующими рецепторами на модели изолированной подвздошной кишки морской свинки. Однако агматин в условиях наших опытов не оказывал модулирующего влияния на эффекты гистамина и серотонина. В экспериментах in vivo при исследовании влияния на пропульсивную активность агматин, в отличие от клонидина и моксонидина, в дозе 10 мг/кг ускорял желудочно-кишечный транзит. Механизм подобного действия агматина остается неясным.

Агматин при внутрибрюшинном введении дозозависимо потенцировал антиноцицептивное действие морфина у мышей (тест отдергивания хвоста), предположительно за счет влияния на Ог-адренорецепторы (Yesilurt and Uzbay 2001; см раздел I). У агматина выявлена способность препятствовать развитию толерантности к морфину в остром и хроническом экспериментах, а также ослаблять проявления абстинентного синдрома, вызванного введением налоксона крысам, получавшим морфин (Aricioglu-Kertal and Uzbay,1997; Kolesnikov et al., 1996). Исходя из этих данных, мы предположили, что, возможно, агматин может модулировать действие даларгина -агониста опиоидных рецепторов, угнетающего сокращения ПКМС (подобным образом действует и морфин). Однако в наших экспериментах агматин не влиял на действие даларгина. А в экспериментах с висцеральной болью агматин не только не вызывал анальгезию, но даже наблюдалась некоторая тенденция к повышению болевой чувствительности при использовании низкой дозы агматина - 1 мг/кг. Агматин не

оказывал анальгезирующего действия и в модели спинальной анальгезии (Kolesnikov et al., 1996, Bradly and Headley. 1997; Horvath et al., 1999). Предполагается, что потенцирующее действие агматина опосредуется через 5-опиоидные рецепторы. Однако еще неясно, с какими рецепторами непосредственно взаимодействует агматин. Некоторые исследователи (Boronat et al., 1998) предполагают, что это могут быть имидазолиновые ^-рецепторы, на которые агматин действует как антагонист. Данное предположение мотивируется тем, что идазоксан - смешанный антагонист имидазолиновых и адренорецепторов с высоким аффинитетом к имидазолиновым рецепторам, тоже снижает развитие толерантноси к морфину. Согласно результатам другого исследования, действие агматина при спинальной анальгезии может реализовываться через имидазолиновые Ij-рецепторы, причем агматин в данном случае выступает как агонист (Roerig, 2003).

Таким образом, агматин, не оказывает антиноцицептивного действия в экспериментах in vivo, он также не влияет на опиоидные рецепторы in vitro. Вопрос о спектре рецепторного действия при потенцировании анальгезирующего действия опиоидных препаратов остается открытым.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашей работы показали, что действие моксонидина на изолированную подвздошную кишку морской свинки реализуется как через адренорецепторы, так и Ij-имидазолиновые рецепторы. Это положение согласуется с данными о влиянии моксонидина на рецепторы в центральной нервной системе (Emsberger et al., 1990; Feldman et al., 1990; Gomez et al., 1991; Tibirica et al., 1991a; Mayorov et al., 1993; Haxhiu et al., 1994; Tolentino-Silva et al., 2000; O.H. Хохлова и соавт., 2001а) и не противоречит предположению Head с соавт. (1998b., 1999) о том, что активация имидазолиновых Ir рецепторов является следствием стимуляции адренорецепторов. Результаты исследования на изолированной подвздошной кишке морской свинки позволяют рекомендовать данную экспериментальную модель для фармакологического тестирования агонистов имидазолиновых рецепторов. В отличие от модели ПКМС действие моксонидина на препарат изолированного семявыносящего протока крысы и толстой кишки мышей реализуется преимущественно через адренорецепторы. Это подтверждается практически одинаковыми эффектами клонидина и моксонидина и данными литературы по действию клонидина на эти тест-объекты. Однако механизмы эффектов моксонидина на этих препаратах разные: на модели СПК моксонидин опосредованно через адренорецепторы вызывает угнетение высвобождения норадреналина (высвобождение медиатора вызывалось электрической стимуляцией), а на модели ТКМ моксонидин опосредованно через адренорецепторы стимулирует синтез простагландинов, возможно, повышая активность фосфолипазы и высвобождая арахидоновую кислоту из мембран (Griffiths and Moore, 1982). В экспериментах in vivo моксонидин, как и клонидин, оказывал угнетающее действие на пропульсивную активность кишечника у мышей. Моксонидин также оказывал выраженное антиноцицептивное действие при висцеральной боли у мышей. Участие в этих эффектах имидазолиновых рецепторов остается неясным.

Агматин в опытах на изолированных органах был эффективен только в высоких концентрациях на моделях ПКМС и СПК, однако спектр рецепторного действия агматина остается неопределенным из-за низкой чувствительности рецепторов данных тест-объектов к влиянию лиганда. На модели ТКМ агматин оказался неэффективным. Агматин не оказывал модулирующего действия на действие клонидина, моксонидина, даларгина, гистамина и серотонина. В опытах in vivo агматин в дозе 10 мг/кг оказывал некоторое стимулирующее действие на пропульсивную активность кишечника мышей. Антиноцицептивного действия у агматина на модели висцеральной боли у мышей не выявлено.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах на изолированной подвздошной кишке морской свинки моксонидин вызывает угнетение выделения ацетилхолина, обусловленное воздействием на имидазолиновые 11-рецепторы и Аг-адренорецепторы.

2. Моксонидин вызывает угнетение высвобождения норадреналина на модели изолированного семявыносящего протока крысы, которое реализуется через адренорецепторы.

3. Моксонидин вызывает сокращения изолированной толстой кишки мышей, стимулируя синтез простагландинов. Действие моксонидина реализуется преимущественно через адренорецепторы.

4. На модели висцеральной боли у мышей моксонидин при подкожном введении оказывает антиноцицептивное действие. Эффект моксонидина реализуется, по-видимому, через адренорецепторы. Агматин на этой модели не вызывает антиноцицептивного эффекта.

5. Моксонидин при внутрибрюшинном введении вызывает у мышей угнетение пропульсивной активности желудочно-кишечного тракта, обусловленное действием преимущественно на 02-адренорецепторы. Агматин на этой модели (в дозе 10 мг/кг) стимулирует пропульсивную активность желудочно-кишечного тракта.

6. На моделях изолированных органов не выявлено модулирующего влияния агматина на периферические эффекты гистамина, серотонина, клонидина моксонидина и даларгина.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козаева Л.П., Коробов Н.В., Медведев О.С. Исследование влияния агматина на эффекты гистамина, серотонина и даларгина в моделях изолированных органов. // Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 7-11 апреля, 2003, стр.723

2. Козаева Л.П., Коробов Н.В., Медведев О.С. Исследование периферических эффектов агматина на моделях изолированных органов. // Сборник тезисов 2-го Съезда российского научного общества фармакологов, 21-25 апреля, Москва, 2003,стр. 250

3. Козаева Л.П., Коробов Н.В. Медведев О.С. Агматин - эндогенный лиганд имидазолиновых рецепторов. // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2003, Т. 66, №5, С. 69-73

4. Козаева Л.П., Коробов Н.В., Медведев О.С. Различия рецепторного спектра клонидина и моксонидина на модели изолированной подвздошной кишки морской свинки. // Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 19-23 апреля, 2004, стр.723

5. Kozaeva L.P. Involvement of (¡^-adrenoceptors or imidazoline Ij-receptors in the effects of moxonidine on contractility of the isolated colon of the mouse. // Abstractbook of the 11-th International Congress ofMedical Sciences, Groningen, 9-12 June, 2004, P. 167

6. Козаева Л.П., Коробов Н.В., Медведев О.С. Влияние моксонидина на сократительную активность изолированной толстой кишки мышей: значение 02-адренорецепторов и имидазолиновых Ij-рецепторов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Т. 137, №3, С.284-287

7. Kozaeva L.P., Korobov N.V., Medvedev O.S. // Effects of clonidine and moxonidine on contractility of the isolated mouse colon: involvement of adrenoceptors or imidazoline I1-receptors. // Abstractbook of the 15-th European Conference for future doctors and young scientists, Berlin, 19-23 October, 2004, P. 411

8. Козаева Л.П., Коробов Н.В., Медведев О.С. Роль -адрено- и I1 -имидазолиновых рецепторов в действии клонидина и моксонидина на изолированную толстую кишку мышей. // Экспериментальная и клиническая фармакология. В печати.

Подписано в печать 19.01.2005 Объем 1.75усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 10 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Р- 14 47>