Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Регуляция экспрессии лиганда для CD40 на поверхности активированных Т-лимфоцитов

На правах рукописи ЦЫЦИКОВА Алла Владимировна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ЛИГАНДА ДЛЯ СБ40 НА ПОВЕРХНОСТИ АКТИВИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ

14.00.36-аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1997

Работа выполнена в Детском Госпитале Гарвардского Университета г.Бостона, США.

На:/чные Руководители: Профессор, доктор биологических наук В.А.Алеикин Профессор, доктор медицинских наук Р.С.Геха

Официальные оппоненты: профессор, доктор медицинских

наук И.С.Гущин

профессор, доктор биологических наук Л.В.Козлов

Ведущее учереждение: Российский Государственный Медицинский Университет ш.Н.И.Пирогова

Защита состоится"^" -¿¿¿Ы 1997г. в|(^час. на заседании диссертационного совета К176.01.02 при Московском научно-исследоЕ тельском институте эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевског Минздрава РФ по адресу: 125212, Москва, ул.адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского нау*

исследовательского иститута эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Га ричевского.

Автореферат разослан"^1 ап^ЛЯ.1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат медицинских * ук Л. И. Новикова.

Актуальность темы. Как было показано, экспрессия молекулы лиганда для CD40 (CD40L) на поверхности активированных Т-лимфоцитов является ключевым событием в процессе формирования вторичного гуморального иммунного ответа, так как взаимодействие молекул CD40 и CD40L абсолютно необходимо для переключения изотипов иммуноглобулинов в В-лимфоцитах. Нарушение экспрессии CD40L является причиной Х-зависимого гипер-IgM синдрома (HIGMX-l, X-linked hyper IgM syndrome), который является первичным иммунодефицитным заболеванием и характеризуется наличием очень низкого уровня, или вообще отсутствием IgG, IgA и IgE в крови больных, наряду с нормальным или повышенным уровнем IgM. Такие пациенты подвержены аутоиммунным и лимфопролиферативным заболеваниям, а также рецидивным синусо-лёгочным инфекциям, включая пневмонию, вызываемую Pneumocystis carinii. В свою очередь, повышенная экспресия CD40L, в результате неспецифической активации Т-лимфоцитов, может приводить к формированию аутоиммунных заболеваний, а, наряду с присутствием интерлейкина-4 (ИЛ-4), - к аллергии. Более полное понимание молекулярных механизмов регуляции экспрессии CD40L позволит значительно приблизить решение проблемы лечения гуморальных иммунодефицитных заболеваний, а также подсказать более рациональные подходы к лечению аллергических заболеваний.

Научная новизна и практическая значимость исследования, В данной работе впервые было показано, что экспрессия CD40L на поверхности активированных Т-лимфоцитов строго регулируется на уровне транскрипции гена. Была показана роль транскрипционных факторов активированных Т-лимфоцитов, NF-AT (Nuclear Factor of Activated T-cells), в инициации транскрипции гена CD40L, а

также важная роль ядерных белков семейства АР-1 (Activating Protein) в формировании функционально-активного транскрипционного комплекса с белками NF-AT в промоторе гена CD40L. Данная работа - это значительный вклад в область понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции формирования тимус-зависимого гуморального иммунного ответа.

Цель панной работы:

1. Исследование регуляции экспрессии CD40 лиганда на поверхности Т-лимфоцитов, а также, участия и роли ядерных факторов NF-AT и АР-1 в регуляции транскрипции гена CD40L.

2. Исследование молекулярных механизмов влияния активирующих агентов: 4|3-форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) и иопофора кальция (иономицина, 1о), а также иммуносупрессанта циклоспорина A (CsA), на экспрессию CD40L на поверхности активированных Т~лимфоцитов.

3. Определение возможных причин нарушений экспрессии молекулы CD40L на поверхности активированных Т-лимфоцитов, приводящих к нарушениям переключения изотипов антител и, в конечном итоге, к отсутствию гуморального иммунного ответа у человека.

Публикации результатов исслепований. Материалы диссертации были представлены и доложены на 9-ом Международном Конгрессе Иммунологии (23-29 июля 1995 г., г.Сан-Франциско, США). По материалам работы опубликовано 4 печатные работы.

Объём и структура писсертапии. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка

литературы, включающего 95 работ. Работа изложена на 100

N

страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и 1 таблицу.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИИ СБ40 является мембранным гликопротеином типа I, который постоянно экспрессирован на зрелых В-лимфоцитах и относится к семейству белков рецептора для фактора некроза опухоли (ФНО). В свою очередь, СБ40Ь - это мембранный гликопротеин типа II, который относится к семейству белков ФНО и экспрессируется па поверхности Т-лимфоцитов вследствие их активации через Т-клеточный антигеновый рецептор, который распознает антиген в контексте с белками главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) на поверхности антиген-презентирующей клетки (Рис.1).

Активированные Т-лимфоциты, посредством контакта СБ40Ь и СВ40, передают сигнал активированным В-лимфоцитам к переключению изотипов иммуноглобулинов и формированию вторичных фолликулов в лимфатических узлах. В дальнейшем, В-лимфоциты покидают вторичные фолликулы и, благодаря последующим дифференцировке и пролиферации, превращаются или в плазматические клетки, продуцирующие антиген-специфические иммуноглобулины различных изотипов, или в клетки памяти. Активированные В-лимфоциты, которые не получили сигнал через С040, умирают в результате так называемой запрограммированной смерти, апоптоза.

Регуляция транскрипции генов является одним из наиболее важных путей регуляции их экспрессии, а транскрипционные факторы, узнающие специфические участки ДНК в промоторах генов, являются инициаторами, обеспечивающими специфичность и

Y

IqM

IГКГС f „ Л

О Антиген I В-клетка j

I Т-иепса j \

^ ^Активированная ]

CD40 CD40L

Рис.1, Роль СБ40Ь в формировании вторичного тимус-зависимого гуморального иммунного ответа. ГКГС - главный комплекс гистосовместимости, ТКР - Т-клеточный рецептор.

своевременность транскрипции. В настоящее время известно несколько различных семейств транскрипционных факторов, включая NF-кВ, NF-AT, АР-1, ETS, STAT и другие, которые принимают участие в экспрессии генов в активированных лимфоцитах. Белки одного семейства обладают значительной степенью гомологии, и, в то же время, являются продуктами различных генов или продуктами различио-сплайсированных информационных РНК. Семейство NF-AT включает в себя белки: NF-ATc, NF-ATp, NF-AT3 и NF-AT4. Из семейства АР-1 в настоящее время известны четыре Fos белка (c-Fos, FosB, Fra-1 и

Fra-2) и три Jun белка (c-Jun, JunB и JunD). В данной работе было показано, что транскрипционные факторы NF-AT связывались с элементами ДНК в регуляторной области мышиного гена CD40L и, вместе с белками семейства АР-1, формировали транскрипционно-активный комплекс.

Одним из основных методов, использованных в данной работе, был метод EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay), позволяющий выявить наличие транскрипционных факторов в ядерных экстрактах клеток, которые специфически связываются с выбранными участками ДНК. Для этого экстракты, выделяемые из клеточных ядер Т-лимфоцитов, были инкубированы с радиоактивно-мечеными химически синтезированными олигонуклеотидами (Таблица 1), соответствующими участкам ДНК из промотора CD40L, которые обладали гомологией с NF-AT-связывающими участками из промоторов генов ИЛ-2 и ИЛ-4. Вновь образовавшиеся комплексы олигонуклеотидов с белками обладали меньшей подвижностью при гель-злектрофорезе по сравнению со свободной пробой.

Анализ нуклеотидной последовательности ДНК длиной -1700 пар нуклеотидов (п.н.) непосредственно перед сайтом кэпирования гена CD40L мыши, выявил наличие четырёх участков (NM-1 -NM-4), содержащих общую консервативную последовательность -ТТТТСС-, найденную в промоторах мышиных и человеческих генов ИЛ-2 и ИЛ-4. А также были найдены две последовательности, отличающиеся от данной консервативной последовательности по одной паре оснований: -сТТТСС- и -ТТТаСС- (NLM-1 и NLM-2 соответственно).

Синтетические олигонуклеотиды длиной 18 п.н. (NM-1 - NM-4) (Таблица 1), соответствующие четырем последовательностям в

Таблица 1.

Положение и нуклеотидная последовательность №-АТ-связывающих участков в промоторах мышиных генов: С040Ь, ИЛ-2 и ИЛ-4.

Ген Название Расстояние от точки инициации транскрипции Нуклеотидная последовательность

С040Ь Ш-1 -74 - 57 -ААССАСАТТТТССАССАА-

ЫМ-2 -283 266 -ССАСГАТТТТТССТАТТб-

Ш-З -935 - 916 -АААСТСТТТТТССТТАвС-

Ш-4 -1016 - 999 -АААТаАвТЧТТССАААТв-

МШ-1 -327 - 310 _ТТТСТСДсТТТССТТСДД_

-1169 - 1152 -ААв СААТТТТаССАСТТТ-

ИЛ-2 №-АТ1 -290 - 273 -АААСАААТТТТССТСТТТ-

ИЛ-4 Р1 -81 - 64 -ААТААААТТТТССААТ ОТ -

промоторе гена С040Ь, специфически связывали два комплекса из ядерных экстрактов Т-клеточной линии ЕЬ-4. Комплексо-образование значительно увеличивалось после стимуляции клеток ФМА и иономицином. Более того, комплексы, полученные с каждым из четырёх ИМ олигонуклеотидов, ингибировались любым немеченым ИМ олигонуклеотидом, добавленным в избытке (Рис.2А). Поэтому NN1-1 олигопуклеотид, как наиболее близко расположенный к точке инициации транскрипции, был выбран для дальнейших экспериментов.

Предположение, что транскрипционный фактор ОТ-АТ принимает участие в образовании N14-1 комплексов, определило серию наших дальнейших экспериментов. ИР-АТ1 и Р1 олигонуклеотиды из промоторов мышиных генов ИЛ-2 и ИЛ-4 (Таблица 1) связывали комплексы, по миграционным характеристикам идентичные НМ-1 комплексам. Немеченые 1\Т-АТ1 и Р1 олигонуклеотиды, добавленные в избытке, ингибировали оба ИМ комплекса. Как оказалось, последовательность -ТПТСС-является критической для связывания ИР-АТ, потому что мутированный ИМ-1 олигонуклеотид, в котором последовательность -ТТТТСС- была заменена на -ТТССАТ- (3'-мутант), не образовывал специфических комплексов, и избыток этого олигонуклеотида не ингибировал образование комплексов ИМ-1 (Рис.2В). Два других олигонуклеотида 1\ТМ-1 и №ЬМ-2, соответствующие двум последовательностям в промоторе СБ40Ь, в которых -ТТТТСС- последовательность отличается только по одной паре нуклеотидов (-сТТТСС- и-ТТТаСС~), также не были способны связывать белки из ядерных экстрактов Т-лимфоцитов или ипгибировать образование ИМ-1 комплексов (Рис.2А).

Недавно были клонированы четыре различных белка из семейства транскрипционных факторов КР-АТ. К двум из них были получены специфические антитела: кроличьи поликлопальные для ОТ-АТр и мышиные моноклональные антитела 7Аб для №~АТс. Мы исследовали комплексы, полученные с олигонуклеотидами №Л-1, МР-АТ1 и Р1 (каждый 18 п.н. длиной), и ядерными экстрактами из Т-лимфоцитов (Рис.3). Апти-№-АТр антитела вызывали замедление миграция нижней полосы на геле, потому что, по-видимому, происходило формирование крупных агрегатов молекул, в результате чего образовавшийся комплекс даже не входил в гель.

А.

я 2

Ингибиторы

а § I V

» - . . <? ^ 3

| в 5 2 2 3 3

Й с г Ж 2 2 2

и Ьг , I I I 1

X <

2 ?

I 3

нЫ

б

Ингибиторы Й Ё -£ £ £

нУ Ц ы

ААССАСАТТТТССАССАА и ААССАСАТГССАТАОСАА З'-муташ

ААОТСТАГПТССАССАА 5'-мутак

Рис.2. Характеристика ядерных комплексов ЫМ-1. Результаты ЕМБА с использованием ядерных экстрактов из Т-клеточной линии ЕЬ-4 и радиоактивно-меченым олигонуклеотидом ИМ-1. А. йнгибирование меченого ИМ-'! холодными ИМ и N1,14 олигонуклеотидами из промотора СВ40Ь, а также холодным 1Ь2-кВ из промотора ИЛ-2. В. Йнгибирование образования комплексов холодными мутантными олигонуклеотидами, добавленными в 100-кратном молярном избытке, было проведено с целью определения пар нуклеотидов, необходимых для связывания белка.

Рис.3. Анализ NN1-1 комплексов методом ЕМКА с использованием ядерных экстрактов из мышиных тимоцитов и Т-лимфоцитов селезёнки (неактивированных и активированных ФМА+1о). Специфические антитела против №-АТр и ЬТ-ЛТс белков или неспецифическая кроличья сыворотка (НКС) и изотип контроль были добавлены к ядерным экстрактам за 30 минут до радиоактивной пробы.

Неспецифическая кроличья сыворотка (негативный контроль антител) никакого действия на NN1-1 комплексы не оказывала. В свою очередь, моиоклональные антитела к №~АТс смещали верхнюю полосу, в то время, как ^в! мыши (изотип контроль)

никакого эффекта не оказывал. Таким образом, нижний ИМ-1 комплекс содержал транскрипционный фактор МР-АТр, а верхний -транскрипционный фактор Г-Ш-АТс. Оба фактора являлись членами семейства ИР-АТ и связывались с последовательностью ДНК -ТТТТСС-.

Для проверки транскрипционных комплексов на функциональную активность мы использовали систему временной экспрессии гена при трансфекции клеток. Были приготовлены несколько конструкций ДНК на основе вектора рОЬ-2-Промотор, содержащего ген фермента люциферазы под контролем минимального 5У-40 промотора. Конструкции, где непосредственно перед минимальным Б У-40 промотором были вставлены пентамеры олигонуклеотидов NN1-1 или КР-АТ1 18 п.н. длиной, были трансфецированы в ЕЬ-4 или 68-41 Т-клеточные линии с помощью электрошока (метод электропорации) или методом с использованием ДЕАЕ-декстрана. Через 4 часа после трансфекции клетки были стимулированы ФМА и иономиципом. Через 20 часов клетки были лизированы и измерен уровень экспрессии гена люциферазы, используя субстрат люциферин. Активность гена люциферазы в клетках, трансфецированных конструкциями рвЬ-2-Промотор с пентамерами олигонуклеотидов NN1-1 или ОТ~АТ1 (18 п.н.), не возрастала после стимуляции клеток с ФМА И иопомицином по сравнению с клетками, трансфецированными вектором рСЬ-2-Промотор без пентамера. Таким образом, не смотря на то, что олигоиуклеотиды 18 п.н. длиной связывали транскрипционные факторы №-АТ в ЕМБА экспериментах, было очевидно, что данные олигоиуклеотиды не были способны инициировать траикрипцшо после стимуляции клеток.

В качестве положительного контроля в данном эксперименте мы использовали вектор рСЬ-2-Контроль, который содержал ген люциферазы, 5У-40 минимальный промотор и 5У-40 энхансер. Уровень экспрессии гена люциферазы в клетках был постояпио высоким после трансфекции этим вектором и не зависел от активации клеток.

Неспособность пентамеров олигонуклеотидов 18 п.н. длиной инициировать транскрипцию гена люциферазы определила серию наших дальнейших экспериментов. Мы синтезировали более длинный ИМ-1 олигонуклеОтид (30 п.н.), последовательность которого показана на рисунке 4. Методом ЕМБА, используя радиоактивный олигонуклеотид ЫМ-1 (30 п.н.) и ядерные экстракты из ЕЬ-4 или 68-41 клеток, мы обнаружили образование трёх ядерных комплексов: доминирующий комплекс Ь; немного медленнее мигрирующий, слабый комплекс а; и быстро мигрирующий, слабый комплекс с. Все три комплекса ингибировались 100-кратным избытком длинного немеченого олигонуклеотида и частично ингибировались коротким ЫМ-1 (18 п.н.) олигонуклеотидом, но не ЬТ-кВ-связывающим олигонуклеотидом из ИЛ-2 промотора. Образование медленно мигрирующих комплексов, а и Ь, ингибировалось избытком немеченого АР-1 олигонуклеотида, а также эти комплексы смещались при добавлении антител к ОТ~АТр и с-1ип, ингибировались антителами к с-Л« и, в меньшей степени, антителами к КР-АТс, подтверждая, что комплексы а иЬ содержали белки из семейств №-АТ и АР-1. Нижний комплекс (комплекс с) по миграционным характеристикам совпадал с нижним комплексом, полученным с коротким (18 п.н.) ММ-1 олигонуклеотидом. Антитела к ИР- АТр при добавлении смещали комплекс с, в то время как анти-с-Ро$ и анти-с-./ил антитела

Ш-1(18п.н.) ААССАСАТГТГССАСОАА

Ш-1 (30 п.к.) САСАОААйАСТАССААССАСАТТТТССАСС

Рис.4. Зависимость образования комплексов от длины олиго-нуклеотидов и наличие белков АР-1 (с-^б, с-^п) в комплексе, образованном длинным ИМ-1 (30 п.н.). В эксперименте были использованы радиоактивно-меченые ЫМ-1 олигонуклеотиды длиной 18 и 30 п.н. и ядерные экстракты из Т-клеточной линии ЕЬ-4, не стимулированной и стимулированной ФМА+1о.

его не смещали, показывая, что комплекс с содержал только М7-АТ, но не АР-1. Таким образом, длинный (30 п.н.) олигонуклеотид N1*4-1 связывал транскрипционные факторы из обоих семейств, семейства ОТ-АТ и семейства АР-1, в отличие от короткого (18 п.н.) №4-1 олигонуклеотида, который связывал транскрипционные факторы только из семейства ИР-АТ.

В промоторе гена ИЛ-2 ОТ-АТ-зависимый транскрипционный комплекс содержал белки из семейства АР-1 и формировался благодаря тому, что участки ДНК, связывающие №-АТ и АР-1, расположены в непосредственной близости друг от друга. Таким образом, транскрипционные факторы связывались с ДНК и одновременно между собой, образуя транскрипционно-активный комплекс. В отличие от промотора гена ИЛ-2, в промоторе гена СБ40Ь участки, обладающие гомологией с АР-1-связывающей последовательностью, не были найдены в непосредственной близости с №-АТ-связывающими последовательностями. Более того, мутации в №-АТ-связывающей последовательности, -ТТТТСС-, парушали образование всех трёх NN1-1 комплексов (а, Ь, с). Это даёт возможность предположить, что связывание белков АР-1 с длинным NN1-1 олигонуклеотидом полностью зависело от связывания белков МР-АТ за ДНК.

Конструкции на основе вектора рОЬ-2-Промотор, содержащие пентамеры длинных олигонуклеотидов NN1-1 или N7-АТ1 (30 п.н.), были трансфецированы в Т-клеточные линии ЕЬ-4 и 68-41. После активации трапсфецированных клеток активность люциферазы возрастала в несколько десятков раз (Рис.5). Таким образом, пентамер длинного NN1-1 олигонуклеотида (30 п.н.) был способен индуцировать транскрипцию гена люциферазы. В свою очередь, пентамер мутантного олигонуклеотида NN1-1, в котором последовательность -ТТТТСС- изменили на -ТТССАТ-, не увеличивал уровень транскрипции гена люциферазы. Обобщая результаты наших экспериментов, можно утверждать, что наряду со связыванием белков №-АТ за ДНК, было необходимо дополнительное связывание транскрипционных факторов семейства АР-1 для формирования фунционально- активного комплекса.

I

2000

1500

1000-

500

-CsA

pGL2-Промогор

pGL2-Промотор 5x(NF-ATl)

ФМА+Io

0 +CsA

pGL2-IIpoMorop 5x(NM-l)

ОЙ

ФМА+Io -

ФМА Io ФМА+Io

.ssa.

+ <

2

•e

I

c-2

хЧ

и

r e

3$

M

i ©

Рис.5. Уровень экспрессии гена люциферазы в неактивированных и активированных Т-клеточных линиях, трансфецированных векторами, содержащими пентамеры олигонуклеотидов NM-1 и NF-AT1. ОЕЛ - относительная единица люминесценции.

После активации Т-лимфоцита через Т-клеточный рецептор, сигнал в цитоплазме передаётся двумя различными путями: первый, кальций-зависимый путь, - через появление свободных ионов [Са2+]; второй путь - через активацию протеин-киназы С (Рис.б). Эти два пути могут быть имитированы в результате обработки клеток с помощью химических реагентов: иономицина, который является ионофором и способствует проникновению ионов кальция внутрь клетки; и ФМА, который связывается с протеин-киназой С и тем самым активирует её. Поэтому оптимальная индукция экспрессии многих генов, свойственных Т-лимфоцитам в активированном состоянии, требует обработки клеток обоими ста-

Т-клеточный рецептор

Рис.б. Схема молекулярного механизма действия циклоспорина А на активацию №-АТ и последующую экспрессию С040Ь на поверхности активированных Т-лимфоцитов.

муляторами одновременно, иономицином и ФМА, предполагая тем самым, что необходимы оба пути, кальций-зависимый и протеин-киназа С-зависимый.

Оба данных пути, проводящие сигнал, были необходимы и для формирования функционального ИМ-1 комплекса и последующей экспрессии С040Ь на Т-лимфоцитах. Активация протеин-киназы С и последующих внутриклеточных событий с помощью 'ФМА

приводит к активации белков семейства АР-1. Высвобождение ионов кальция приводит к серии внутриклеточных событий, одним из которых является активация кальцинурина. Кальцинурин - это кальций- и кальмодулин-зависимая фосфатаза, состоящая из двух субъединиц. Регуляторная субъединица содержит кальций-связывающий и активирующий домены. Каталитическая субъединица кальцинурина, несущая фосфатазную активность, содержит кальмодулин-связывающий и аутоингибирующий домены. Активированный кальцинурин дефосфорилирует ЫР-АТ, который присутствует в цитоплазме в неактивированном фссфорилироваяном состоянии, и после дефосфорилирования переносится в ядро, где принимает участие в связывании ДНК и инициации транскрипции.

На следующем этапе нашей работы мы проверяли действие иммуносупрессанта, циклоспорина А, на транскрипцию гена С040Ь в активированных Т-лимфоцитах (Рис.7). Циклоспорин А полностью ингибировал образование комплексов коротких (18 п.н.) ИМ-1 и ОТ-АТ! олигонуклеотидов с транскрипционными факторами из семейства №-АТ. Как и предполагалось, АР-1 комплекс чувствительности к действию циклоспорина А не проявлял.

В экспериментах с пептамером длинного КМ-1 олигопуклеотида экспрессия люциферазы была максимальной в результате стимуляции клеток ФМА и иономицином, хотя она была достаточно высокой и при стимуляции одним иономицином без ФМА (Рис.5). Обработка клеток циклоспорином А за несколько минут до стимуляции клеток почти полностью ингибировала экспрессию гена люциферазы (Рис.5) и образование ЫМ-1 комплекса (Рис.7). Непосредственной мишенью для циклоспорина А является кальцинурин. Циклоспорин А формирует комплексы с

NN1-1* ОТ-АТ!* АР-1*

< (Л

и

< и

а &

с

<л

и

I а

к я а к я

и

У

5 К

8. э

К Й й »3

' 1Г V '' 1

у Ы1 'Ы кн)Ы-

Рис.7. Чувствительность различных комплексов к циклоспорину А (СзА). Результаты ЕМБА с использованием ядерных экстрактов из тимомы ЕЬ-4 (неактивированной или активированной иономицином) и радиоактивно-мечеными олигонуклеотидами КМ1 (С040Ь), МБ-АТ1 и АР-1 (ИЛ-2).

внутриклеточными белками - иммунофилинами. которые затем способны связываться с кальцинурином, ингибируя его ферментативную активность и, тем самым, предотвращая транслокацию цитоплазматического компонента ОТ-АТ в ядро, при этом не оказывая никакого действия на ядерный компонент АР-1. В результате, функционально-активный транскрипционный комплекс

в промоторе гена СБ40Ь не формируется, что, в свою очередь, приводит к отсутствию экспрессии гена СЭ40Ь.

Этот результат был подтверждён следующим экспериментом. Клеточная линия 68-41 была трансфецирована одновременно конструкцией на основе вектора рОЬ-2-Промотор, содержащей пентамер длинного олигонуклеотида ИМ-1, и вектором рВ15-€N11111128.19, экспрессирующим постоянно активную каталитическую субъединицу кальцинурина. Трансфецированяые нестимулированные клетки имели повышенный уровень экспрессии гена люциферазы, а при обработке ФМА - уровень экспрессии достигал оптимального уровня (Рис.5).

Функциональность пептамера ИМ-1 (30 п.н.) говорит о формировании транскрипционно-активного комплекса в промо-торной части гена СБ40Ь в ответ на активацию Т-лимфоцитов. Это подтверждает, что экспрессия СБ40Ь на поверхности активированных Т-лимфоцитов зависит от транскрипционных факторов №-АТ и АР-1, которые, в свою очередь, зависят от многоступенчатых процессов, приводящих к их активации. Нарушение процесса передачи сигнала с поверхности клетки в ядро (от Т-клеточного рецептора до промотора гена С040Ь), с помощью обработки циклоспорином А, приводит к нарушению экспрессии С040Ь на поверхности активированных Т-лимфоцитов, и в последующем к нарушению взаимодействия между Т- и В-лимфоцитами через СБ40Ь - С040, что, в свою • очередь, отрицательно сказывается на процессе формирования вторичного гуморального иммунного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Получены доказательства критической роли транскрипционного фактора ОТ-АТ для оптимальной экспрессии молекулы СБ40Ь, абсолютно необходимой для формирования вторичного гуморального иммунного ответа в результате переключения изотипов иммувоглобулинов.

2. Получена последовательность ДНК промотора зена СБ40Ь мыши, и найдены участки, которые связывают ядерный фактор №-АТ и играют критическую роль в транскрипции данного гена в активированных Т-лимфоцитах. Доказано, что необходимо связывание ядерного фактора АР-1 с комплексом Ш^-АТ/ДИК для инициации транскрипции гена СБ40Ь в ответ на активацию Т-лимфоцитов.

3.Разработан метод трансфекции Т-клеточных линий вектором, содержащим ген люциферазы под контролем различных участков промотора гена СБ40Ь, с целью определения транскрипционной активности данных участков.

4. Показан я охарактеризован молекулярный механизм ингибирования циклоспорином А ядерной транслокации ОТ-АТ и последующей экспрессии гена С040Ь.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Alia V. Tsytsykova, Erdyni N.Tsitsikov, and Raif S. Geha. 1996. THE CD40L PROMOTER CONTAINS NUCLEAR FACTOR 01 ACTIVATED T CELLS-BINDING MOTIES WHICH REQUIRE AP-BINDING FOR ACTIVATION OF TRANSCRIPTION. The Journal о Biological Chemistry, v.271 (No. 7, February 16): p.3763-3770.

2. Castigli E., Fuleihan R., Ramesh N., Tsitsikov E., Tsytsykova A, Geha R.S. 1995. CD40 LIGAND/CD40 DEFICIENCY. [Review|. International Archives of Allergy & Immunology, v.107 (1-3): p.37-39.

3. A.V.Tsytsykova, E.N.T,sitsikov, and R.S.Geha. DNA ELEMENTS IT THE CD40 LIGAND GENE BIND NF-AT AND TRANSCRIPTIONAL! ACTIVE. 9th International Congress of Immunology. 23-29 July 1995, Sai Francisco, CA.

4. Цыцикова A.B. Лунев H.A., Геха P.C., Алешкин В.А. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ЛИГАНДА ДШ CD40 НА ПОВЕРХНОСТИ АКТИВИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ. Бюллетень по экспериментальной биологии и медицины. 1997 (в печати)