Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение

Шаинидзе, Кристина Зурабовна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Шаинидзе, Кристина Зурабовна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.16

Автореферат диссертации по медицине на тему Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение

На правах рукописи

Шаинидзе Кристина Зурабовна

РЕАКЦИИ ОРЕКСИН-СОДЕРЖАЩИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА КРЫС НА ОГРАНИЧЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ И ОХЛАЖДЕНИЕ.

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

, , , Г'ППО

1 0 - :.. да

Санкт-Петербург - 2009

003472653

Работа выполнена в отделе Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук и на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И. Герцена

Научные руководители: Академик РАМН Корнева Елена Андреевна Д.б.н. проф. Даринский Ю.А.

Официальные оппоненты:

1. Чернышева Марина Павловна, доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии общей физиологии человека и животных Санкт-Петербургского Государственного Университета.

2. Петрищев Николай Николаевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патофизиологии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова.

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова.

Защита состоится «23» июня 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «22» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

П.А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

На протяжении многих десятилетий главной задачей нейроиммунофизиологии являлось изучение возможных связей между нервной и иммунной системами. Применение прецизионных методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа в сочетании с иммуногистохимическими методами исследования дало возможность оценить вовлеченность различных структур мозга, а также степень участия различных биологически активных веществ, вырабатываемых нервными клетками, в механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий.

В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G. et al., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J.F. et al., 1991; Brenner G.J. and Moynihan J.A., 1997; Glaser, R. Et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., Б.А., 1987; Rybakina E.G. et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия.

Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексин-содержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (PH) ( Реугоп С., 1998).

гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi Т., 1999; Kurose Т. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al., 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества c-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого разражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха -напротив снижается (Ida Т., et al. 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose Т. et al., 2002; Zhu L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса.

Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M„ et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru М. et al., 2004; Kurose Т., et al., 2002; Jaszberenyi M„ et al., 2000; Jaszberenyi M., et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), a также увеличению количества c-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998).

внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda М, 2001; Monda М, 2003; Monda М, 2003; Monda М, 2004; Jaszberenyi М, 2002; Digby J. Е„ 2006; Székely М, 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki Т., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина A (Monda М., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi М., 2002).

Известно, что ограничение подвижности, охлаждение животных и комбинированный стресс (ограничение подвижности в сочетании с охлаждением) запускают ярко выраженную стрессорную реакцию, инициируя значительные изменения содержания в плазме крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Sheridan et al., 1991; Pacak К., 2001). Таким образом, применение адекватной экспериментальной модели стресс-индуцирующего воздействия позволит расширить представления о степени участия орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в развитии комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на стрессорное воздействие. Решение данного вопроса представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие механизмов реализации реакции нейронов гипоталамуса, синтезирующих орексин, на изменения, происходящие в центральной нервной системе на фоне стрессорного воздействия.

Целью данной работы явилось изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику экспрессии гена препроорексина по синтезу м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс во время и после ограничения подвижности, а также во время и после комбинированного воздействия - ограничения подвижности и охлаждения.

2. Определить иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах перифорникальной области

латерального гипоталамуса, при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении.

3. Установить паттерн реакций структур и зон гипоталамуса, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, характерный для проявления ответа мозга на данные виды стрессорных воздействий.

4. Проанализировать возможные механизмы развития морфо-функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении на основе результатов сочетанного исследования изменений экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе и иммуногистохимических особенностей орексин-содержащих нейронов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса возрастает в 5.5 раз через 1 час после окончания ограничения подвижности крыс и нормализуется через 1 час после охлаждения на фоне ограничения подвижности.

2. Изменения иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, после примененных стрессорных воздействий, происходят только в определенных структурах и зонах гипоталамуса крыс, представленных на срезах мозга 29-го уровня.

3. Ограничение подвижности приводит к снижению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в ЬНАс1 на срезах мозга 28-го уровня; в ЬНАгп на срезах мозга 29-го уровня; и к повышению иммунореактивности этих нейронов в ЭМНа, ЬНАэ на срезах мозга 29-го уровня, а также в РН на срезах мозга 31 уровня (согласно атласу мозга Бууапзоп Ь.\У).

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения приводит к повышению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в ЬНА]с1, Ы 1Лс1, локализованных на срезах мозга 28-го уровня и понижению иммунореактивности таких нейронов в РН на срезах мозга 31 уровня.

5. Картирование орексин-позитивных нейронов в различных структурах гипоталамуса и определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и его сочетании с охлаждением, позволило выявить функциональную дискретность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах гипоталамуса.

6. Снижение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в отдельных структурах и зонах гипоталамуса, при одновременном

повышенном уровне экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и вовлеченности данных структур в реализацию реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Научно-практическое значение. Работа является приоритетным экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.

Апробация работы. Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:

1. Второй Санкт-Петербургский Международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» 1 - 4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия

2. 4-й Объединенный Иммунологический Форум 30 июня - 3 июля, Санкт-Петербург, Россия

3. Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы» 15-17 сентября 2008 годаб Москва, Россия.

4. Межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» 13-16 апреля 2008 года.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 258 источников, из них 249 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работы была выполнена на 80 крысах-самцах, породы Wistar, весом 200-250г. Опыты начинали в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в клетках гипоталамуса. Экспериментальные животные были поделены на 2 группы. 1-ой группе животных ограничивали подвижность в течение 1 часа. II группе также ограничивали подвижность в течение часа, но после первых 20 минут они подвергались охлаждению: — 20 С. в течение 20 минут. После охлаждения животные II группы находились в контейнерах, ограничивающих подвижность оставшиеся 20 минут. Взятие материала проводили через 20, 40, 60, 90, 120 минут от начала опыта. По завершению опыта животные были наркотизированы фенобарбиталом (в/б бОмкг/кг веса животного). В качестве контроля использовали интактных животных, которых наркотизировали фенобарбиталом (в/б бОмкг/кг веса животного) одновременно с экспериментальными.

Для проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени (PCR RT) по завершению опыта у наркотизированных крыс извлекали мозг и помещали в Purezol (BioRad). Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad). Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием набора One Step RT PCR Kit (BioRad). Для проведения реакции использовались праймеры, рассчитанные по программе и произведенные лабораторией «СинТол». Регистрация длины продукта была проведена методом электрофореза в агарозном геле. Контроль над ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью ПК и программы «Opticon Monitor 3.1». Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и рассчитывали по формуле встроенным программным обеспечением амплификатора.

Для иммуногистохимического анализа животных подвергали интракардиальной перфузии с последующим приготовлением замороженных срезов мозга. Детекцию орексин-содержащих нейронов гипоталамуса осуществляли авидин-биотиновым методом с применением кроличьих антител к орексину А (1:5000) (Sigma) и моноклональных анти-кроличьих иммуноглобулинов (клон RG-16), конъюгированных с биотином (1:1000) (Sigma), выявление которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки. В качестве субстрата для пероксидазы использовали З'З диаминобензидин (DAB) (Sigma). При анализе иммуногистохимически окрашенных срезов мозга оценивали количество орексин-позитивных клеток во всех структурах, соотвтетствующих 25-32 уровням срезов гипоталамуса в соответствии с атласом мозга крыс (Swanson L.W., 1992). Окрашивание срезов мозга всех групп животных, проводили одновременно. Время окраски было строго стандартизировано. При подсчете клеток, учитывали только клетки, с четко окрашенными контурами и наполненные гранулами с орексином не меньше чем на 1/3 клетки. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стьюдента. Подсчеты данных и построение гистограмм выполнены на IBM PC при помощи программы Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Измерение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности и охлаждении.

Для определения реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на применяемые стрессорные воздействия проводили исследование динамики изменения синтеза орексина косвенно по изменению уровня экспрессии гена препроорексина (Рис.1). У интактных животных в период с 11-40 до 13-00 часов в клетках гипоталамуса крыс происходит постепенное увеличение экспрессии гена препроорексина. Относительный уровень экспрессии гена препроорексина у интактных животных в 12-00 был в 3.6 раза выше по сравнению с ее уровнем у интактных животных в 11-40. Затем в 12-30 уровень экспрессии гена препроорексина значительно снижался (в 8 раз) и снова возрастал к 13-00.

Сразу после окончания ограничения подвижности уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса уменьшается в 10 раз по сравнению с его уровнем у интактных животных (Рис 1), а через 1 час - увеличивается в 5.7 раз по сравнению с его уровнем у интактных животных.

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

#т

jljjjj

11:40

12:00

*t # ■

12:30

13:00

Рисунок I Относительный уровень экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс породы \Vistar при ограничении подвижности и охлаждении.

По оси ординат - (У) - уровень экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс: по оси абсцисс (X) - время опыта. Группы животных:

I - интактные; подвергнутые:

- ограничению подвижности.

И - ограничению подвижности и охлаждению

*р < 0.05. **р < 0.005 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у интактных животных, взятых в опыт в предыдущий срок; # р < 0.05. ## р < 0.005 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у интактных животных: ш р < 0.05 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у животных, подвергнутых ограничению подвижности.

Анализ интенсивности экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении -выявил снижение количества м-РНК препроорексина в 10 раз сразу после окончания стрессорного воздействия по сравнению с его уровнем у животных контрольной группы (животные, подвергнутые ограничению подвижности) (рис.1). Через 30 минут сохраняется значительное снижение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс, а через 1 час констатировано снижение уровня экспрессии гена препроорексина в 6 раз в клетках гипоталамуса крыс по сравнению с его уровнем у животных контрольной группы.

Сравнение данных, полученных в результате анализа экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса, крыс позволяет заключить, что наиболее значительные изменения интенсивности его экспрессии наблюдаются сразу и через час после окончания стрессорных воздействий. Поэтому в следующей серии

экспериментов явился иммуногистохимический анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и комбинированное воздействие (ограничение подвижности и охлаждение) проводили через час после их окончания.

Орексин-позитивные нейроны гипоталамуса после ограничения подвижности и

охлаждения.

Орексин-содержащие нейроны характеризуются разнообразием форм: сферическая, эллипсоидная, треугольная. У интактных животных нейроны заполнены орексиновыми гранулами, имеют четко окрашенные контуры. Показано, что орексин-содержащие нейроны локализованы, главным образом, в перифорникальной области латерального гипоталамического поля (ЬНА). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (РУЛ), дорзомедиальном (БМН) ядрах и заднем поле гипоталамуса (РН). В гипоталамусе интактных крыс орексин-содержащие нейроны расположены в структурах, представленных на срезах мозга с 25 по 32 уровни. Максимальное количество орексин-позитивных клеток располагается в структурах, локализованных на срезах мозга 28-го, 29-го, 30-го уровней.

У животных после ограничения подвижности происходит снижение степени иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на 28 уровне среза мозга крыс, что проявляется в снижении степени визуализации орексин-позитивных нейронов, локализованных в этой области и соответственно уменьшении количества определяемых орексин-позитивных нейронов. То есть значительная часть орексин-позитивных клеток на срезах мозга у животных экспериментальной группы содержит меньше орексина в сравнении с его содержанием в орексин-позитивных клетках гипоталамуса интактных животных, что на срезах проявлялось снижением общего количества нейронов, в которых иммуногистохимически выявляли орексин. При анализе общего количества иммунореактивных орексин-содержащих нейронов у экспериментальных животных после ограничения подвижности определено изменение степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов (Таблица 2). Как видно из таблицы, в структурах гипоталамуса, локализованных на срезах, относящихся к 28 уровню мозга крыс, иммунореактивность орексин-содержащих нейронов снижена на 17%. В противоположность этому на срезах мозга 31 уровня, выявлено увеличение количества орексин-позитивных нейронов на 19% (Рис 2). При комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении - у экспериментальных

животных на 31 % повышается количество орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на срезах мозга 28-го уровня (Рис. 2). В структурах гипоталамуса, локализованных на 31 уровне среза мозга крыс, наблюдается тенденция к снижению степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов (13 %). Изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на 29, 30 и 32 уровнях срезов, не выявлено.

Таблица 1 Общее количество орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс, локализованных на срезе мозга определенного уровня, при ограничении подвижности и сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения.

Животные (п=6) Средние значения количества орексин-позитивных нейроно! в структурах, представленных на срезе мозга конкретного уровня

28 29 30 31 32

Интактные 116,1*5,3 106,5±5,6 76,1 ±4,7 49,5±3,6 18,7±2,8

Подвергнутые ограничению подвижности 95,9±6,2* 108,0±7,6 85,1±6,3 58,9*2,8* 19,3±2,6

Подвергнутые ограничению подвижности и охлаждению 126,1±5,1## 114,7±14,3 81,5±4,9 51,6±6,5 24,2±3,7

Уровни срезов мозга указаны в соответствии с атласом мозга крыс 5и>ал50и'5. 1992.* — Р<0,05; степень достоверности различий между средним количеством орексин-позитивных нейронов, расположенных на определенном срезе, в гипоталамусе интактных и подвергнутых воздействию животных: ## — Р<0.005 степень достоверности различий между количеством орексин-позитивных нейронов, расположенных на определенном срезе в гипоталамусе животных, подвергнутых ограничению подвижности и ограничению подвижности и охлаждению.

28 29 30 31 32

Рисунок 2 Количество орексин-позитивных нейронов в перифорникальной зоне латерального гипоталамуса крыс через I час после окончания ограничения подвижности и охлаждения. По оси ординат - (Y) - абсолютное количество орексин-позитивных нейронов на срезе; по оси абсцисс (X) -уровни срезов мозга крыс по атласу Swanson L. W.

Группы животных: ■

шш - интактные; подвергнутые:

- ограничению подвижности, В - ограничению подвижности и охлаждению

*р < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; ##р < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности.

Распределение орексин-содержащих нейронов в различных структурах гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения.

Как уже было отмечено выше, орексин-содержащие нейроны в основном расположены в LHA, DMH. РН. Для оценки особенностей распределения орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе был произведен подсчет орексин-позитивных нейронов, локализованных в разных структурах (Рис 3).

Дифференцированное определение количества орексин-позитивных клеток в исследуемых структурах гипоталамуса позволило установить, что после ограничения подвижности животных иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHA на срезах мозга 28-го уровня (Рис 3) снизилась на 17 % по сравнению с их количеством у интактных животных. После применения комбинированного воздействия количество орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHA на срезах мозга 28-го уровня, повысилось на 29 % по сравнению с их количеством у животных после ограничения подвижности (Рис 3).

Рисунок 3. Количество орексин-позитивных нейронов, локализованных в латеральном гипоталамическом поле (ЬНА), дорзомедиальном ядре гипоталамуса (ОМН), заднем гипоталамическом поле (РН) крыс через 1 час после ограничения подвижности и

охлаждения.

По оси ординат - (У) - количество орексин-позитивных нейронов в конкретных структурах, расположенных срезе мозга определенного уровня; по оси абсцисс (X) -уровни срезов мозга крыс по атласу Зч/апьоп Ь. IV. Группы животных:

И - интактные: подвергнутые:

- ограничению подвижности. I - ограничению подвижности и охлаждению

*р < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных: #р < 0.05. ##р < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности.

В области ЭМН на срезах мозга 29-го уровня количество орексин-позитивных нейронов после ограничения подвижности животных повысилось на 39% по сравнению с их количеством у интактных животных (Рис. 3). В ОМН на срезах 31 уровня количество орексин-позитивных нейронов в этих условиях повышается на 138% по сравнению с их количеством орексин-позитивных нейронов у животных контрольной группы. После применения комбинированного воздействия количество визуализированных орексин-содержащих нейронов, локализованных в ОМН на срезах мозга 28-го уровня, увеличилось на 65% (Рис. 3).

Распределение орексин-позитивных нейронов, локализованных в

различных зонах исследуемых структур гипоталамуса, при ограничении подвижности и комбинированном воздействии-ограничении подвижности и

охлаждении.

Анализ количества орексин-позитивных клеток в различных зонах определенных структур гипоталамуса (ЬНА, ОМН, РН, РУН) позволил установить, что их количество изменяется по-разному в различных зонах одних и тех же структур после стрессорных воздействий.

Анализ количества орексин-содержащих клеток, локализованных в определенных зонах структур гипоталамуса, расположенных срезов мозга 28-го уровня крыс, позволил выявить снижение иммунореактивности нейронов только в ЬНАс! на 31% через 1 час после окончания ограничения подвижности (Рис. 4). Применение комбинированного воздействия привело к повышению степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных на срезах мозга 28-го уровня, которое наблюдается в зонах ЬНАё (59%), ОМН (65%), Ы1Л]с1 (41%) (Рис. 4). В тех же структурах мозга, локализованных на срезах мозга крыс 29-го уровня, количество орексин-позитивных нейронов гипоталамуса после ограничения подвижности животных оставалось без изменений.

Однако, при анализе изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в различных зонах тех же структур после данного воздействия, выявлены различия. В ЬНА на срезах мозга 28-го уровня количество иммунореактивных орексин-содержащих нейронов увеличивалось на 76% в области ЬНАб, тогда как в области ЬНАт происходило снижение числа орексин-позитивных клеток на 63% (Рис. 4).

30 20 10 0

30 25 20 15 10 5 0

40 30 20 10 0

** ##

I и

■■ 1

■

ЦНАс)

"Т" .....I

РМН

(.Н/Цс!

LHДs

ЬНАш

РМН

** . I # . Л™.

«шйшш 1 1 И

РН

ОМН

Рисунок 4 Изменение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в зонах определенных структур гипоталамуса крыс.

По оси ординат - (У) - количество орексин-позитивных нейронов в структурах, расположенных на срезе; по оси абсцисс (X) -зоны и структуры гипоталамуса, согласно по атласу Зм>ап50п Ь. IV. Группы животных:

И- интактные, подвергнутые:

- ограничению подвижности, В - ограничению подвижности и охлаждению

*р < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; #р < 0.05, ##р < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности.

В структурах гипоталамуса крыс, локализованных на срезах мозга 29-го уровня, после применения комбинированного воздействия изменения отмечаются в области ЬНАт, в которой количество иммунореактивных орексин-содержащих нейронов увеличивается на 135% (Рис 4). Количество орексин-позитивных клеток, представленных в структурах гипоталамуса на срезах мозга 31-го уровня, после ограничения подвижности повысилось на 19 %, главным образом, за счет увеличения степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в дорзальной части РН на 41% (Рис 4).

В дорзальной части РН степень иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, расположенных на срезах мозга 31-го уровня крыс, понизилась на 39 %. Однако, в области ОМН количество орексин-позитивных нейронов повысилось на 138%. Таким образом, можно заключить, что изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс, как при ограничении подвижности, так и при сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения, происходит преимущественно в структурах дорзальной части перифорникальной области гипоталамуса (Рис 5). Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, локализованных в структурах под сводом головного мозга, не изменяется.

Детальный анализ гипоталамуса крыс на срезах мозга, соответствующих 29 уровню, после примененных стрессорных воздействий позволил установить наличие изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов только в отдельных структурах и зонах гипоталамуса без изменений общего количества орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах данного уровня. В структурах гипоталамуса, локализованных на срезах мозга 29-го уровня, происходит увеличение количества орексин-позитивных нейронов на 76% в ЬНАб, а в ЬНАш - напротив, снижение на 63%. Таким образом, применение картирования орексин-содержащих нейронов по структурам и зонам гипоталамуса после примененных воздействий впервые позволило установить наличие функциональной дискретности популяции этих нейронов, не выявляемое при простом подсчете среднего количества орексин-позитивных нейронов, локализованных на одном срезе конкретного уровня и даже в одной структуре.

Сопоставление данных, полученных в результате изучения экспрессии гена препроорексина, с данными иммуногистохимического анализа иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса позволяет заключить, что наблюдаемое после ограничения подвижности увеличение уровня м-РНК препроорексина в структурах гипоталамуса ассоциируется с увеличением количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в структурах РН, ОМНа, и верхней части ЬНА. Однако, несмотря на повышенный синтез м-РНК препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности, иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в ЬНАэ и ЬНАс1, значительно снижается.

Рисунок 5 Изменение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в структурах и зонах гипоталамуса крыс, на срезах, соответствующих 28-31

уровням.

1-4 -после ограничения подвижности; 5-8 - после ограничения подвижности и охлаждения. Черным цветом обозначены структуры и зоны гипоталамуса крыс (по атласу Зм>ап$оп Ь.Ж), в которых наблюдается увеличение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов, темно-серым - ее уменьшение.

Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс повышается в ЬНАс1, ЬНА]ё, ОМНа, ЬНАт при комбинированном применении ограничения подвижности и охлаждения. В ЬНАс1, на срезах, соответствующих 28 уровню, а также в ЬНАт и РН на срезах соответствующих 29 и 31 уровню соответственно, при сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения наблюдается восстановление количества орексин-позитивных нейронов до его уровня, характерного для интактных животных. В ЭМНа, ЬНА]с1, на срезах,

соответствующих 28 уровню, в LHAs и DMHa, на срезах, соответствующих 29 уровню, а также в DMHa, на срезах, соответствующих 31 уровню, количество орексин-позитивных нейронов при ограничении подвижности и охлаждении крыс повышено.

Синтез м-РНК препроорексина при комбинированном воздействии снижается по сравнению с его уровнем у животных после ограничения подвижности, и соответствует показателям, характерным для интенсивности синтеза м-РНК препроорексина у интактных животных. Таким образом, при комбинированном воздействии (ограничение подвижности и охлаждение) наблюдается нивелирование, наблюдаемых после ограничения подвижности изменений, уровня экспрессии гена препроорексина в структурах гипоталамуса.

Анализ полученных данных позволяет полагать, что выявленные через 1 час после примененных стрессорных воздействий изменения, обусловлены как изменением интенсивности синтеза м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс, так и по-видимому изменением скорости процесса утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах. Изменение соотношения интенсивности синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах гипоталамуса проявляется снижением или повышением степени их иммунореактивности через 1 час после примененных экспериментальных воздействий. Установлено, что при данных видах воздействий происходит избирательное изменение степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, что свидетельствует о функциональной неоднородности популяции орексин-содержащих нейронов, расположенных в туберальной области гипоталамуса.

Дискретность изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, как при ограничении подвижности, так и при комбинированном воздействии, может свидетельствовать о существовании функционально разнородных популяций орексин-содержащих клеток, дающих, по-видимому, проекции в разные области мозга.

Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, расположенных в DMH, РН, и некоторых зонах LHA существенно изменяется при ограничении подвижности и охлаждении. Известно, что дорзомедиальное ядро (DMH), латеральная гипоталамическая область (LHA), и заднее (РН) поле гипоталамуса причастны к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura К, et al 1984 Amir, 1990, Zaretskaia, 2002,

Cao, 2004, Tanaka et al 2001). Изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, расположенных в областях, вовлеченных в систему регуляции теплопродукции, дают основание предположить возможность участия орексин-содержащих нейронов в процессах терморегуляции.

Изменения уровня экспрессии гена препроорексина и содержания орексина в клетках разных структур гипоталамуса позволяет заключить, что орексин-содержащие нейроны гипоталамуса избирательно вовлекаются в развитие комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на ограничение подвижности и сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения. Таким образом, применение подробного картирования орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных зонах структур гипоталамуса, впервые позволило установить функциональные различия популяции орексин-содержащих нейронов, не выявляемые при простой количественной оценке орексин-позитивных нейронов, расположенных на срезах мозга конкретного уровня.

Комплекс полученных результатов свидетельствует об участии орексинэргических нейронов гипоталамуса в механизмах реализации реакций мозга на ограничение подвижности и сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения. Выявлены конкретные структуры, активирующиеся при этих воздействиях, определен характер и степень участия орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций мозга при такого рода стрессорных воздействиях. Показаны различия паттернов их активации при ограничении подвижности и комбинированном применении ограничения подвижности и охлаждения, что важно для понимания механизмов реализации реакций мозга в этих условиях.

ВЫВОДЫ.

1. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс снижается (с

0,283±0,034 до 0,027±0,010, р<0.005) сразу после окончания ограничения подвижности, а через 1 час - возрастает (с 0,165±0,038 до 0,945±0,247, р<0.05).

2. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс сразу после окончания

ограничения подвижности, сочетанного с охлаждением, уменьшается (с 0,027±0,010 до 0,003±0,002, р<0.05) и нормализуется через 1 час после его окончания.

3.Через 1 час после окончания ограничения подвижности иммунореактивность орексин-содержащих нейронов изменяется: в ЬНАс! количество орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах мозга 28-го уровня, снижается на 31%, на срезах мозга 29-го уровня - в ЬНАб и ОМНа увеличивается на 76% и 75% соответственно, а в ЬНАш снижается на 63%; на срезах мозга 31 -го уровня - возрастает на 41 %в дорзальной части РН.

4.Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения через 1 час после окончания воздействия приводит к восстановлению снижающегося при ограничении подвижности количества орексин-позитивных нейронов до показателей, характерных для количества этих нейронов у интактных животных в ШАс1, на срезах мозга 28-го уровня, а также в ЬНАт и РН на срезах мозга 29-го и 31-го уровней соответственно. В ОМНа, ЬНА]с1 на срезах мозга 28-го уровня, в ЬНАэ и ОМНа, на срезах мозга 29-го уровня, а также в ОМНа, на срезах мозга 31-го уровня количество орексин-позитивных нейронов остается повышенным.

5.Картирование орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса и их зонах, при ограничении подвижности и ограничении подвижности на фоне охлаждения демонстрирует дискретность функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, участвующих в процессе реализации ответа на данные виды стрессорных воздействий.

6. Повышение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса при

одновременном снижении количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах и зонах гипоталамуса, в условиях ограничения подвижности и его сочетанного применения с охлаждением, свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и их вовлеченности в процессы реализации реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Шаинидзе К.З., Новикова Н.С., Алешина Г.М., Даринский Ю.А., Сынчикова А.П., Корнева Е.А. Изменение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности и охлаждении. // Медицинский Академический журнал №2.- 2009.- С. 31-36.

2. Шаинидзе К. 3., Новикова Н. С., Корнева Е. А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности у крыс // Вестник. Санкт-Петербургского университета.-Серия. 11 Медицина,- 2008.- № 3.-С. 145-153.

3. Шаинидзе К. 3., Новикова Н. С., Даринский Ю.А., Корнева Е. А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при иммобилизационном и холодовом стрессах.//Материалы Второго Санкт-Петербургского Международного экологического форума «Окружающая среда и здоровье человека» 1 - 4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия, // Вестник Военно-Медицинской Академии 2008 Прил. 2 часть 2,- № 3(23).- 2008,- С. 374.

4. Шаинидзе К. 3., Новикова Н. С., Корнева Е. А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и холодовом воздействии. // Материалы 4-й Объединенного Иммунологического Форума 30 июня - 3 июля, Санкт-Петербург, Россия, Российский иммунологический журнал.-Т.2 (11).-№2-3.- 2008.-С 157.

5. Шаинидзе К. 3. Изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс при различных моделях стрессорных воздействий. // Материалы Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» 15-17 сентября 2008 г. Москва, Россия, Аллергология и иммунология Том 9.- № 3.- 2008.-С. 270.

6. Шаинидзе К.З., Новикова Н.С., Даринский Ю.А., Корнева Е.А. Изменение степени визуализации орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности и холодовом воздействии. // Материалы межвузовской конференции молодых ученых 13-16 апреля 2008 г. Санкт-Петербург, Россия, Герценовские чтения Выпуск 8.-2008,- С.136.

Сдано в набор 20.05.2009. Подписано в печать 20.05.2009. усл. печат. листов 1.0 Уст. тираж 100 экз. Заказ 15-5/АР002.

Издано в Центре стратегического анализа общественных процессов 193036, СПб, Литовский пр. дом 29.

Оглавление диссертации Шаинидзе, Кристина Зурабовна :: 2009 :: Санкт-Петербург

14.00.16 - ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ 03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Академик РАМН, профессор Е.А.Корнева доктор б. н., профессор Ю.А. Даринский

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009 Г.

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Нейропептид орексин.

2.2 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в регуляции различных физиологических процессов.

2.2.1 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в регуляции пищевого поведения.

2.2.2 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в регуляции цикла сон-бодрствование.

2.2.3 Участие системы орексин-содержащих нейронов в регуляции функций автономной и эндокринной систем.

2.2.4 Участие системы орексин-содержащих нейронов в регуляции пищеварения и энергетического обмена.

2.2.5 Участие системы орексин-содержащих нейронов в регуляции функций репродуктивной системы.

2.2.6 Участие системы орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в терморегуляции.

2.2.7 Орексин-содержащие нейроны и регуляция функций иммунной системы.

2.3 Система орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций на стрессорные воздействия.

2.4 Центральные механизмы реализации реакций на стрессорные воздействия.

2.4.1 Центральные механизмы реализации реакций на иммобилизационный стресс.

2.4.2 Центральные механизмы реализации реакций на холодовой стресс.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Шаинидзе, Кристина Зурабовна, автореферат

Актуальность работы.

В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J. et al., 1991; Sheridan J. et al., 1998; Glaser R. et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., 1987; Rybakina et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия.

Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексин-содержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), 7 дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (РН) (Реугоп С., 1998).

С помощью иммунногистохимического метода выявления c-Fos белка и орексина А в клетках мозга установлена избирательность реакции орексин-содержащих нейронов при различных стресс-индуцирующих воздействиях. Показано, что данные воздействия приводят к активации доли орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi Т., 1999; Kurose Т. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al., 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества с-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого раздражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха - напротив снижается (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose T. et al. 2002; Zhu, L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса.

Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M. et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru М. et al., 2004; Kurose Т. et al., 2002; Jaszberenyi M. et al., 2000; Jaszberenyi M. et al., 2001; Hagan J.J. et al., 1999; Al-Barazanji K.A. et al., 2001; Russell S.H. et al., 2001; Mullett M.A. et al., 2000), а также увеличению количества c-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998).

Появившиеся в последнее время данные свидетельствуют о том, что орексин-содержащие нейроны помимо участия в ответе на стрессорные воздействия, вовлечены в процесс терморегуляции и теплопродукции (Monda М, 2001; Monda М, 2003; Monda М, 2003; Monda М, 2004; Jaszberenyi М, 2002; Digby J. Е., 2006; Székely М., 2002). Однако, данные работ, в которых показана причастность орексин-содержащих нейронов к процессу терморегуляции, неоднозначны. Известно, что дорзомедиальное (DMH) и паравентрикулярное (PVH) ядра, а также латеральное и заднее (РН) гипоталамические поля, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, имеют причастность к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura К, et al 1984; Amir, 1990, Zaretskaia, 2002; Cao, 2004; Tanaka et al., 2001). При разных условиях внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda М., 2001; Monda М., 2003; Monda М., 2003; Monda М., 2004; Jaszberenyi М., 2002; Digby J. Е., 2006; Székely М., 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki Т., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина A (Monda М., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi М., 2002).

Цель данной работы.

Изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику экспрессии гена препроорексина по синтезу м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс во время и после ограничения подвижности, а также во время и после комбинированного воздействия -ограничения подвижности и охлаждения.

2. Определить иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах перифорникальной области латерального гипоталамуса, при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении.

4. Проанализировать возможные механизмы развития морфофункциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении на основе результатов сочетанного исследования изменений экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе и иммуногистохимических особенностей орексин-содержащих нейронов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса возрастает в

5.5 раз через 1 час после окончания ограничения подвижности крыс и нормализуется через 1 час после охлаждения на фоне ограничения подвижности.

3. Ограничение подвижности приводит к снижению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в ЬНАё на срезах мозга 28-го уровня; в ЬНАт на срезах мозга 29-го уровня; и к повышению иммунореактивности этих нейронов в ЭМНа, ЬНАб на срезах мозга 29-го уровня, а также в РН на срезах мозга 31 уровня (согласно атласу мозга БшапБоп Ь.\У).

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения приводит к повышению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в ЬНА]с1, ЬНАё, локализованных на срезах мозга 28-го уровня и понижению иммунореактивности таких нейронов в РН на срезах мозга 31 уровня.

6. Снижение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в отдельных структурах и зонах гипоталамуса, при одновременном повышенном уровне экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и вовлеченности данных структур в реализацию реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Научно-практическое значение и новизна работы.

Работа является приоритетным экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.

Апробация работы.

Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:

2. 4-й Объединенный Иммунологический Форум 30 июня - 3 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертационного исследования на тему "Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение"

6 выводы.

1. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс снижается (с 0,283±0,034 до 0,027±0,010, р<0.005) сразу после окончания ограничения подвижности, а через 1 час - возрастает (с 0,165±0,038 до 0,945±0,247, р<0.05).

2. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс сразу после окончания ограничения подвижности, сочетанного с охлаждением, уменьшается (с 0,027±0,010 до 0,003±0,002, р<0.05) и нормализуется через 1 час после его окончания.

3. Через 1 час после окончания ограничения подвижности иммунореактивность орексин-содержащих нейронов изменяется: в ЬНАсІ количество орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах мозга

28-го уровня, снижается на 31%, на срезах мозга 29-го уровня - в ЬНАв и ОМНа увеличивается на 76% и 75% соответственно, а в ЬНАт снижается на 63%; на срезах мозга 31-го уровня - возрастает на 41%в дорзальной части РН.

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения через 1 час после окончания воздействия приводит к восстановлению снижающегося при ограничении подвижности количества орексин-позитивных нейронов до показателей, характерных для количества этих нейронов у интактных животных в ЬНАсі, на срезах мозга 28-го уровня, а также в ЬНАт и РН на срезах мозга 29-го и 31 -го уровней соответственно. В ЭМНа, ЦНА]с1 на срезах мозга 28-го уровня, в ЬНАб и БМНа, на срезах мозга

29-го уровня, а также в БМНа, на срезах мозга 31-го уровня количество орексин-позитивных нейронов остается повышенным.

5. Картирование орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса и их зонах, при ограничении подвижности и ограничении подвижности на фоне охлаждения демонстрирует дискретность функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, участвующих в процессе реализации ответа на данные виды стрессорных воздействий.

6. Повышение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса при одновременном снижении количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах и зонах гипоталамуса, в условиях ограничения подвижности и его сочетанного применения с охлаждением, свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и их вовлеченности в процессы реализации реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

2.5 Заключение

Анализ современной литературы не позволяет сделать определенные выводы об участии орексин-содержащих нейронов, расположенных в различных структурах гипоталамуса, в центральных механизмах формирования ответной реакции организма на стрессорные воздействия. Также не ясным остается вопрос об особенностях функционирования орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в условиях стресса. Однако, очевидно, что применение адекватной модели стресса позволит дифференцировать локализацию и морфофункциональные изменения орексин-содержащих нейронов в различных структурах гипоталамуса в этих условиях. Анализ литературы по данному вопросу свидетельствует о том, что ограничение подвижности в сочетании с охлаждением животных, является универсальной моделью для установления характера реакции орексин-содержащих нейронов структур гипоталамуса на стрессорное воздействие (Kuru М. et al., 2004; Kurose Т., et al., 2002; Jaszberenyi M., et al., 2000; Jaszberenyi M., et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), а также дает возможность выяснить, вовлекаются ли орексин-содержащие нейроны в процесс терморегуляции, так как известно, что часть этих нейронов локализована в областях гипоталамуса, участвующих в этом процессе. Для изучения структурно-функциональных характеристик орексин-содержащих нейронов гипоталамуса целесообразно использовать иммуногистохимический метод, позволяющий определить количество клеток, содержащих орексин, и локализацию этих нейронов в различных структурах гипоталамуса, а также метод ПЦР, позволяющий оценить уровень экспрессии орексина в ответ на примененные воздействия. Данная работа позволит выявить характер ответа определенных групп орексин-содержащих нейронов на примененные стрессорные воздействия, а также, исследуя степень иммунореактивности этих нейронов в совокупности с интенсивностью экспрессии гена препроорексина, судить об изменениях синтеза и потребления данного нейромедиатора в нейронах гипоталамуса. Учитывая иммуносупрессирующее действие используемого варианта стрессороного воздействия, результаты этой работы позволят обозначить и возможность участия орексина в модуляции функций иммунной системы.

3 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Экспериментальная модель.

Работы была выполнена на 80 крысах-самцах, породы ЭДЫаг, весом

200-250г. Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище. Опыты начинали в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в клетках гипоталамуса. Экспериментальные животные были поделены на 2 группы. I-ой группе животных ограничивали подвижность в течение 1 часа. II группе также ограничивали подвижность в течение часа, но после первых 20 минут они подвергались охлаждению: - 20 С. в течение 20 минут. После охлаждения животные II группы находились в контейнерах, ограничивающих подвижность оставшиеся 20 минут. Взятие материала проводили через 20, 40, 60, 90, 120 минут от начала опыта. По завершению опыта животные были наркотизированы фенобарбиталом (в/б бОмкг/кг веса животного). В качестве контроля использовали интактных животных, которых наркотизировали фенобарбиталом (в/б бОмкг/кг веса животного) одновременно с экспериментальными.

Необходимо отметить, что используемая нами модель ограничения подвижности была выбрана с учетом следующих требований:

1. Воздействие на экспериментальных животных должно проводиться в момент, когда естественные колебания в уровне орексинов А и Б минимальны (ТаЬеп 8. е1 а1., 2000).

2. Учитывая, что орексин-содержащие нейроны гипоталамуса участвуют в регуляции таких процессов как обезболивание (7\т Ь. е1 а1., 2002), пищевое поведение (Мог^исЫ Т., 1999), а также регуляция цикла сон-бодрствование (М1§по1 Е. а1., 2002), наиболее адекватно использовать модель, минимально влияющую на эти процессы, что и обусловило использование модели ограничения подвижности в пластиковых контейнерах в течение 1 часа без фиксации конечностей.

Для проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени (PCR RT), по завершению опыта у наркотизированных крыс извлекали мозг и помещали в Purezol (BioRad). Для иммуногистохимического анализа животных подвергали интракардиальной перфузии для последующего приготовления замороженных срезов мозга.

3.2 Измерение динамики уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс.

1) Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad).

2) Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием One Step RT PCR Kit (BioRad).

Полимеразная Цепная Реакция в Реальном Времени (RT-PCR):

Для проведения реакции использовались праймеры:

- к последовательности кодирующей препроорексин (Ох): Прямой: 5'-TGT CGC CCA GAA GAC GTG TTC CTG-3' Обратный: 5'-AAG ACG GGT TCA С AC TCT GGA TC-3' Температура отжига: 61°С, длина продукта - 287 пар нуклеотидов.

- к последовательности кодирующей глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (G3PDH/GAD):

Прямой: 5 '-ССА СТС AGA AGA CTG TGG AT-3 '

Обратный: 5'-GTC АТС ATA CTT GGC AGG TT-3'

Температура отжига: 55°С, длина продукта - 224 пары нуклеотидов.

Праймеры были произведены лабораторией «СинТол».

Регистрация длины продукта была проведена методом электрофореза в агарозном геле.

Реакционная смесь для одной пробы м-РНК содержала: - One step SYBR Green Reaction Mix 10 мкл, Taq-полимераза - 0.4 мкл («МедиГен»); праймеры прямой и обратный (20 пмоль/мкл) по 0.5 мкл каждого для препроорексина и по 1 мкл для глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы; Н20 - для пробы с праймерами к препроорексину - 8,1 мкл, с праймерами к глицеральдегид-3 -фосфат дегидрогеназе - 7,1 мкл.

После приготовления реакционной смеси с праймерами Ох или GAD, в реакционную смесь добавляли пробу м-РНК (0,5 мкл), перемешивали и осаждали. Пробы помещали в амплификатор («MiniOpticon System» BioRad). Из-за разности в температурах отжига праймеров реакции проводили отдельно.

Контроль за ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью ПК и программы «Opticon Monitor 3.1».

Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. И высчитывали по следующей формуле:

Iox= EoxAC(t)ox/ EGADAC(t)G/VD,

Где: Iox - относительный уровень экспрессии гена препроорексина, выраженный в долях от уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы.

Е - эффективность протекания реакции в конкретной пробе.

C(t) - пороговый показатель циклов (количество циклов необходимое для достижения порогового значения флюоресценции).

Эти параметры рассчитаны встроенным программным обеспечением амплификатора.

3.3 Электрофорез в агарозном геле.

Используемые реагенты:

- 50 х ТАЕ буфер: 5М трис-ацетат рН 8.2; 0.125 М ЭДТА

- Агароза

- Раствор бромистого этидия 10%

- Раствор для нанесения проб: 20% Ficoll 400; 1% ДСН; 9% Ма2ЭДТА; ксилен цианол (в следовых количествах)

- Бромфеноловый синий

- Маркер молекулярного веса ДНК

Постановка электрофореза:

Для постановки электрофореза амплифицированных фрагментов готовили 2% агароза на ІхТАЕ буфере. В качестве электродного буфера использовали ІхТАЕ буфер.

Пробы, полученные в ходе RT-PCR, смешивали с раствором для нанесения в соотношении 9:1 по объему. На гель наносили амплифицированные фрагменты кДНК, контроли, ДНК-маркеры, а так же бромфеноловый синий в качестве краски-лидера.

Электрофоретическое разделение проводили в направлении от катода к аноду при напряженности электрического поля 10 В/см геля в течении 30-40 мин. По окончанию разделения гель фотографировали при помощи установки для документации результатов ПЦР-анализа (Gel Imager) с использованием трансиллюминатора с длиной волны 260-340 нм.

3.4 Иммуногистохимическое выявление орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс.

Наркотизированных животных подвергали интракардиальной перфузии, которую проводили теплым физиологическим раствором, содержащим гепарин (10ед/мл.), а затем охлажденным фиксирующим раствором (100мл 4% параформальдегида на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и 0,2% пикриновой кислоты, рН 7,4). Через 1 час после перфузии мозг извлекали и погружали в свежий фиксирующий раствор, не содержащий пикриновую кислоту, на 12 часов при температуре +4°С с последующим приготовлением замороженных фронтальных срезов. Анализировали фронтальные срезы мозга (толщина — 30 мкм) с 26 по 32 уровень, с использованием максимально возможного количества срезов каждого уровня мозга.

Детекцию орексин-содержащих нейронов гипоталамуса осуществляли авидин-биотиновым методом. В качестве первых антител использовали кроличьи антитела к орексину А (1:5000) (Sigma), а в качестве вторых — моноклональные анти-кроличьи иммуноглобулины (клон RG-16), конъюгированные с биотином (1:1000) (Sigma), выявление которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки. В качестве субстрата для пероксидазы использовали З'З диаминобензидин (DAB) (Sigma). Затем срезы монтировали на предметные стекла и заключали в канадский бальзам (Sigma). При анализе иммуногистохимически окрашенных срезов мозга оценивали количество орексин-позитивных клеток во всех структурах гипоталамуса. Меченые нейроны имели темно-коричневую окраску. При подсчете клеток, учитывали только клетки, с четко окрашенными контурами и наполненные гранулами с орексином не меньше чем на 1/3 клетки.

Для минимизации случайных ошибок, возникающих при изготовлении срезов, в исследовании учитывали количество орексин-содержащих нейронов на всех срезах мозга с 26 по 32 уровень срезов в соответствии с

51 атласом мозга крыс [31]. Окрашивание срезов мозга всех групп животных, проводили одновременно. Время окраски было строго стандартизировано. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стьюдента. Подсчеты данных и построение гистограммы выполнены на IBM PC при помощи программы Excel.

3.5 Статистический анализ данных.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов описательной статистики, а так же с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (программа STATISTIKA, version 8.0). Для построения диаграмм использовали пакет Microsoft Office 2007.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Шаинидзе, Кристина Зурабовна

1. Анохин П.К. и Судаков К.В. Нейрофизиологическая теория голода, аппетита и насыщения.//Усп. физиол Наук. 1971,- Т.2.-№ 1.-С. 3.

2. Корнева Е.А., Хай Л.М. Влияние разрушения участков гипоталамической области на процесс иммуногенеза. //Физиологический журнал СССР. -1963.-Т.49.- №1.- С.42-48.

3. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л., 1988. 251 с.

4. Лакомкин А.И., Мягков И.Ф. Голод и жажда. М.: Медицина, 1975.

5. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т., Каткова Л.С. Адаптация организма к стрессорным ситуациям и предупреждение стрессорных повреждений // Вестн. АМН СССР.-1984.- № 4.- С. 45-51.

6. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т. Стрессорные нарушения в системе противоопухолевого иммунитета и их ограничение стресс-лимитирующими факторами // Вестник АМН СССР. -1985.- № 8.- С. 2329.

7. Фролов Е.П. Нейрогуморальные механизмы регуляции иммунологических процессов. М.- 1974.- 264 с.

8. Фролов Б.А. Стрессорные нарушения функций иммунной системы и их предупреждение: Автореферат диссертации доктора мед.наук.-Л., -1987.49 с.

9. Abrahamson, ЕЕ, Leak RK, and Moore RY. The suprachiasmatic nucleus projects to posterior hypothalamic arousal systems.//Neuroreport.-2001.-12: 435-440.

10. Amir S. Stimulation of the paraventricular nucleus with glutamate activates interscapular brown adipose tissue thermogenesis in rats.//Brain Res.-1990.-V.-508.-P.152-155.

11. Amir S. Intra-ventromedial hypothalamic injection of glutamate stimulates brown adipose tissue thermogenesis in the rat.//Brain Res.-1990.-V.511.-P.341-344.

12. Amir S. Activation of brown adipose tissue thermogenesis by chemical stimulation of the posterior hypothalamus.//Brain Res. 1990.-V.534.-P. 303308.

13. Antunes V.R., Brailoiu G.C., Kwok E.H., Scruggs P., and Dun N.J. Orexins/hypocretins excite rat sympathetic preganglionic neurons in vivo and in vitro.//Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.- 2001-V.281.- P.1801-1807

14. Arihara Z., Takahashi K., Murakami O., Totsune K., Sone M., Satoh F., Ito S., Hayashi Y., Sasano H., and Mouri T. Orexin-A in the human brain and tumor tissues of ganglioneuroblastoma and neuroblastoma.//Peptides.- 2000.-V.21-P.565-570.

15. Armario A., Marti O., Gavalda A., Giralt M., Jolin T Effects of chronic immobilization stress on GH and TSH secretion in the rat: response to hypothalamic regulatory factors.//Psychoneuroendocrinology.-1993-. V.-18-P.405-413.

16. Aston-Jones G. A neural circuit for circadian regulation of arousal. G. Aston-Jones, S. Chen, Y. Zhu, M.L. Oshinsky. // Nat. Neurosci. 2001. - №4. - P. 732-738.

17. Bailey T.W., and DiMicco J.A. Chemical Stimulation of the Dorsomedial Hypothalamus Elevates Plasma ACTH in Conscious Rats. Am J Physiol.-2001 .-V.280.- P.8-15.

18. Balasko M., Szelenyi Z., and Szekely M. Central thermoregulatory effects of neuropeptide Y and orexin A in rats.//Acta Physiol Hung.- 1999.-.V.86.- P.219-222.

19. Bamshad M., Song C.K., and Bartness T.J. CNS origins of the sympathetic nervous system outflow to brown adipose tissue.//Am J Physiol. 1999- 276.-:R1569-R1578.

20. Bartanusz V., Jezova D., Bertini L.T., Tilders F.J., Aubry J.M., Kiss J.Z. Stress-induced increase in vasopressin and corticotropinreleasing factor expression in hypophysiotrophic paraventricular neurons. Endocrinology.-1993 .-132:895902.

21. Beck B, Richy S. Hypothalamic hypocretin/orexin and neuropeptide Y: divergent interaction with energy depletion and leptin.//Biochem Biophys Res Commun.- 1999.- V.258(l).-P.-119-22.

22. Becskei C., N. Hernadfalvy D. Arsenijevic T.A. Lutza W. Langhans and T. Riedige. Inhibitory effects of LPS on hypothalamic nuclei involved in the control of food intake//Elsevier Ltd.-2007.-V.125.-P.222-228.

23. Beuckmann C.T., Yanagisawa. M. Orexins: from neuropeptides to energy homeostasis and sleep/ wake regulation. // J Mol Med. 2002. - №80. - P. 329342.

24. Bingham S., Davey P.T., Babbs A.J., Irving E.A., Sammons M.J., Wyles M., Jeffrey P., Cutler L., Riba I., Johns A., Porter R.A., Upton N., Hunter A.J., and107

25. Parsons A.A. Orexin-A, an hypothalamic peptide with analgesic properties.//Pain.-2001 .-V.92.-P. 81 -90.

26. Blanco M., M. Lopez, T. Garcia-Caballero, R. Gallego, A. Vazquez-Boquete, G. Morel, R. Senaris, F. Casanueva, C. Dieguez, A. Beiras.Cellular localization of orexin receptots in human pituitary. // J Clin Endocrinol Metab-2001 -№86.-P. 1616-1619.

27. Bligh J. The thermosensitivity of the hypothalamus and thermoregulation in mammals. Biol Rev.-1966.-V.41.-P.317-367.

28. Boulant J.A., Bignall K.E. Hypothalamic neuronal responses to peripheral and deep-body temperatures. // Am J Physiol.-1973.-V.225.-P.1371-1374

29. Boulant J.A., Demieville H.N. Responses of thermosensitiv preoptic and septal neurons to hippocampal and brain stem stimulation.//! Neurophysiol.-1977.-V.40.-P.1356-1368

30. Boulant J.A. Hypothalamic control of thermoregulation. In: Morgane PJ, Panksepp J, eds.//Handbook of the hypothalamus, vol. 2.- New York.- 1980.-Marcell Decker.-p.82

31. Boulant J.A., Dean J.B. Temperature receptors in the central nervous system. //Annu Rev Physiol.-1986.- V.48.-P.639-654.

32. Boulant J.A. Properties of hypothalamic temperature sensitive and insensitive neurones.//Physiol Res.- 1992.- V.41.- P.83-84

33. Boulant J.A. Cellular mechanisms of temperature sensitivity in hypothalamic neurons.//Prog Brain Res.- 1998.- V.l 15.-P.3-8

34. Briski K.P., and Sylvester P.W. Hypothalamic orexin-A-immunopositive neurons express Fos in response to central glucopenia.//Neuroreport.- 2001.-V.12.- P.531-534

35. Bourgin P, Huitron-Resendiz S, Spier A.D, Fabre V, Morte B, Criado J.R, Sutcliffe J.G, Henriksen S.J, and de Lecea L. Hypocretin-1 modulates rapid eye movement sleep through activation of locus coeruleus neurons.//J Neurosci.-2000.-20.-V.7760.-P.7765.

36. Burlet S, Tyler C.J, and Leonard C.S. Direct and indirect excitation of laterodorsal tegmental neurons by Hypocretin/Orexin peptides: implications for wakefulness and narcolepsy.//J Neurosci.-2002.-V.22.-P.2862-2872.

37. Cai X.J, Widdowson P.S, Harrold J, Wilson S, Buckingham R.E, Arch J.R, Tadayyon M, Clapham J.C, Wilding J, and Williams G. Hypothalamic orexin expression: modulation by blood glucose and feeding.//Diabetes.-1999.-V.48.-P.2132-2137.

38. Cano G, A.F. Sved, Characterization of the central nervous system innervation of the rat spleen using viral transneuronal tracing. // J. of comp. neurol. 2001. -V.-439.-P. 1-18.

39. Cano G, Passerin A.M., Schiltz J.C, Card J.P, Morrison S.F, and Sved A.F. Anatomical substrates for the central control of sympathetic outflow to interscapular adipose tissue during cold exposure.//J Comp Neurol.- 2003.-V.460.- P.303-326.

40. Cao W.H, Fan W, and Morrison S.F. Medullary pathways mediating specific sympathetic responses to activation of dorsomedial hypothalamus.//Neuroscience.-2004.-V. 126.- P.229-240.

41. Ceccatelli S, Orazzo C. Effect of different types of stressors on peptide messanger ribonucleic acids in the hypothalamic paraventricular nucleus. Acta Endocrinol (Copenh).-1993.-V.128.-P.485-492.109

42. Chen C.T., Dun S.L., Kwok E.H., Dun N.J, and Chang J.K. Orexin A-like immunoreactivity in the rat brain.//Neurosci Lett.-1999.-V.260.-P.161-164.

43. Chen C.T., Hwang L.L., Chang J.K., and Dun N.J. Pressor effects of orexins injected intracisternally and to rostral ventrolateral medulla of anesthetized rats.//Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.-2000.-V.278.-P.692-697.

44. Chou T.C., T.E. Scammell, J.J. Gooley, S.E. Gaus, C.B. Saper, Jun Lu.Critical Role of Dorsomedial Hypothalamic Nucleus in a Wide Range of Behavioral Circadian Rhythms. // The Journal of Neuroscience V. 23 (33). - P. 1069110702-2003.

45. Chrousos G.P., Gold P.W. The concepts of stress and stress system disorders.// JAMA.-1992.-V.267.-P. 1244-1252

46. Clark G., Magoun H.W., Ranson S.W. Hypothalamic regulation of body temperature.//J Neurophysiol.-1939.-V.2.-P.61-80.

47. Cluderay J.E., Harrison D.C., and Hervieu G.J. Protein distribution of the orexin-2 receptor in the rat central nervous system.//Regul Pept.-2002.-V.104.-P.131-144

48. Coppinge T.R., Minton J. E., Reddy P. G. Repeated restraint and isolation stress in lambs increases pituitary-adrenal secretions and reduces cell-mediated immunity Kansas State University, Manhattan 66506-0201 //J. Anim. Sci.-1991.-V.69.-P.2808-2814.

49. Cullinan W.E, Herman J.P., Battaglia D.F., Akil H., Watson S.J. Pattern and time course of immediate early gene expression in rat brain following acute stress.//Neuroscience.-1995.-V.64.-P.477-505.

50. Cutler D.J., Morris R., Sheridhar V., Wattam T.A., Holmes S., Patel S., Arch J.R., Wilson S., Buckingham R.E., Evans M.L., Leslie R.A., and Williams G.

51. Differential distribution of orexin-A and orexin-B immunoreactivity in the rat brain and spinal cord.//Peptides.-1999.-V.20.-P.1455-1470.58.

52. Dalal M.A., Schuld A., Haack M., Uhr M., Geisler P., Eisensehr I., Noachtar S., and Pollmacher T. Normal plasma levels of orexin A (hypocretin-1) in narcoleptic patients.//Neurology.-2001 .-V.56.-P. 1749-1751.

53. Date Y., Mondal M.S., Matsukura S., and Nakazato M. Distribution of orexin-A and orexin-B (hypocretins) in the rat spinal cord. //Neurosci Lett.-2000.-V.288.-P.87-90.

54. Date Y. Mondal M.S., Matsukura S., Ueta Y., Yamashita H., Kaiya H., Kangawa K., and Nakazato M. Distribution of orexin/hypocretin in the rat median eminence and pituitary .//Brain Res Mol Brain Res.-2000.-V.76.-P.l-6.

55. Denes A., Boldogkoi Z., Uhereczy G. Characterization of the central nervous system innervations of the rat spleen using viral transneuronal tracing.//J Comp Neurol.-2001.-V. 439.-P. 1-18.

56. Dering M.A., Santer R.M. and Watson A.H.D. Age related changes in the morphology of preganglionaric neurons projecting to the rat hypogastric ganglion. // J. Neurocytol.-1996.-V.25.-P.555-563.

57. Digby J.E., Chen J., Tang J.Y., Lehnert H., Matthews R.N., and Randeva H.S., Orexin receptor expression in human adipose tissue: effects of orexin-A and orexin-B //Journal of Endocrinology.-2006.-191.-129-136.

58. Dube M.G., Kalra S.P., and Kalra P.S. Food intake elicited by central administration of orexins/hypocretins: identification of hypothalamic sites of action.//Brain Res.-1999.-V.842.-P.473-477.

59. Elmquist J.K., Scammell T.E., and Saper C.B. Mechanisms of CNS response to systemic immune challenge: the febrile response.//Trends Neurosci.-1997.-V.20.-P.565-570.

60. Eriksson K.S., Sergeeva O., Brown R.E., and Haas H.L. Orexin/hypocretin excites the histaminergic neurons of the tuberomammillary nucleus.//J Neurosci.-2001 .-V.21 .-P.9273-9279.

61. Espana R.A., Baldo B.A., Kelley A.E., and Berridge C.W. Wake-promoting and sleep-suppressing actions of hypocretin (orexin): basal forebrain sites of action.//Neuroscience.-2001 .-V. 106.-P.699-715.

62. Estabrooke I.V., McCarthy M.T., Ko E., Chou T.C, Chemelli R.M., Yanagisawa M., Saper C.B., and Scammell T.E. Fos expression in orexin neurons varies with behavioral state.//J Neurosci.-2001.-V.21.-P.1656-1662.

63. Fodor M., Palkovits M. Neuropeptide Y-containing neuronal pathway from the spinal trigeminal nucleus to the pontine peribrachial region in the rat.//Neurosci Lett.-l 991.-V. 133.-P. 195-198.

64. Ford Gemma K., Kamal A. Al-Barazanji, Shelagh Wilson, Declan N.C. Jones, Michael S. Harbuz, and David S. Jessop. Orexin expression and function: Glucocorticoid manipulation, stress and feeding studies.//Endocrinology.-2005.-10.1210/en. -0496.

65. Frank S.M., Raja S.N., Bulcao C.F., Goldstein D.S. Relative contribution of core and cutaneous temperatures to thermal comfort and autonomic responses in humans. // J Appl Physiol.-1999.-V.86.-P. 1588-1593.

66. Fujiki N., Yoshida Y., Ripley B., Honda K., Mignot E., and Nishino S. Changes in CSF hypocretin-1 (orexin A) levels in rats across 24 hours and in response to food deprivation. //Neuroreport.-2001.-V.12.-P.993-997.

67. Fukuhara K., Kvetnansky R., Weise V.K., Ohara H., Yoneda R., Goldstein D.S., Kopin I.J. Effects of continuous and intermittent cold (SART) stress on sympathoadrenal system activity in rats. // J Neuroendocrinol.-1996.-V.8.-P.65-72.

68. Glaser R., Kennedy S., Lafuse W/P/ et al. Phsychological stress-induced modulation of interleukin-2 production in periferal blood leukocytes.//Arch.Gen.Psychiatry. -1990. -V.47. -P.707-712.

69. Griffond B., Risold P.Y., Jacquemard C., Colard C., and Fellmann D. Insulin-induced hypoglycemia increases preprohypocretin (orexin) mRNA in the rat lateral hypothalamic area. //Neurosci Lett.-1999.-V.262.-P.77-80.

70. Hakansson M.L., Brown H., Ghilardi N., Skoda R.C., and Meister B. Leptin receptor immunoreactivity in chemically defined target neurons of the hypothalamus. // J Neurosci.-1998.-V.18.-P.559-572.

71. Harbuz M.S., Chalmers J., De Souza L., Lightman S.L. Stressinduced activation of CRF and c-fos mRNAs in the paraventricular nucleus are not affected by serotonin depletion. // Brain Res.-1993.-V.609.-P. 167-173.

72. Harbuz M.S., Lightman S.L. Responses of hypothalamic and pituitary mRNA to physical and psychological stress in the rat. // J Endocrinol.-1989.-V. 122.-P.705-711.

73. Harbuz M.S., Chowdrey H.S., Jessop D.S., Biswas S., Lightman S.L. Role of catecholamines in mediating messenger RNA and hormonal responses to stress. // Brain Res.-1991 .-V.551 .-P.52-57.

74. Harrison T.A., Chen C.T., Dun N.J., and Chang J.K. Hypothalamic orexin A-immunoreactive neurons project to the rat dorsal medulla.// Neurosci Lett.-1999.- V.273.-P. 17-20.

75. Hauger R.L., Milan M.A., Lorang M., Harwood J.P., Aguilera G. Corticotropin-releasing factor receptors and pituitary adrenal responses during immobilization stress.//Endocrinology.-1988.-V. 123 .-P.396^105.

76. Hauger R.L., Lorang M., Irwin M., Aguilera G. CRF receptor regulation and sensitization of ACTH responses to acute ether stress during chronic immobilization stress.//Brain Res.-1990.-V.532.-P.34-40.

77. Haynes A.C., Jackson B., Chapman H., Tadayyon M., Johns A., Porter R.A., and Arch J.R. A selective orexin-1 receptor antagonist reduces food consumption in male and female rats.//Regul Pept.-2000.-V.96.-P.45-51.

78. Hellstrand K. Evidence for a beta-adrenoreceptor-mediated regulation of human natural killer cells. / K. Hellstrand, S. Hermodsson, O.J. Strannegard. // Immunol. 1985. - V. 134. - P. 4095 - 4099.

79. Hilairet S. Hypersensitization of the Orexin 1 Receptor by the CB1 Receptor. / S. Hilairet, M. Bouaboula, D. Carrie're, G. Le Fur, P. Casellas. // The Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278, №26. - P. 23731-23737.

80. Hill J.J., and Peralta E.G. Inhibition of a Gi-activated potassium channel (GIRK1/4) by the Gq-coupled ml muscarinic acetylcholine receptor. // J Biol Chem.- 2001.-V. 276.-P.5505-5510.

81. Hinckel P., Schroder-Rosenstock K. Responses of pontine units to skin-temperature changes in the guinea-pig. // J Physiol (Lond).-1981.-V.314.-P. 189-194.

82. Hervieu G.J., Cluderay J.E., Harrison D.C., Gene expression and protein distribution of the orexin-1 receptor in the rat brain and spinal cord. // Neuroscience.-2001 .-V. 103 .-P.777-797.

83. Hori T., Nakayama T. Effects of biogenic amines on central thermoresponsive neurons in the rabbit. // J Physiol.-1973.-V.232.-P.71-85.

84. Horvath T.L., Peyron C., Diano S., Ivanov A., Aston-Jones G., Kilduff T.S., and van Den Pol AN. Hypocretin (orexin) activation and synaptic innervation of the locus coeruleus noradrenergic system. // J Comp Neurol.-1999.-V.415.-P.145-159.

85. Horvath T.L., Warden C.H., Hajos M., Lombardi A., Goglia F., and Diano S. Brain uncoupling protein 2: uncoupled neuronal mitochondria predict115thermal synapses in homeostatic centers. // J Neurosci.-1999.-V.19.-P.10417-10427.

86. Huang Z.L, Qu W.M, Li W.D, Mochizuki T, Eguchi N, Watanabe T, Urade Y, and Hayaishi O. Arousal effect of orexin A depends on activation of the histaminergic system. // Proc Natl Acad Sci.-USA.-2001.-V.98.-P. 99659970.

87. Ida T, Nakahara K, Murakami T. Possible involvement of orexin in the stress reaction in rats. // Biochem. Byophys. Res. Commun.-2000.-V.270.-P.318-323.

88. Imai-Matsumura K, Matsumura K, and Nakayama T. Involvement of ventromedial hypothalamus in brown adipose tissue thermogenesis induced by preoptic cooling in rats. // Jpn J Physiol.-1984.-V.34.-P.939-943.

89. Isenschmid R, Krehl L. Uber den Einfluss des Gehirns auf die Warmeregulation. // Arch exp Path Pharmacol.- 1912.-V.70.-P.149-182.

90. Isenschmid R, Schnitzler W. Beitrage zur Lokalisation des der Warmeregulation vorstehenden Zentralapparates im Zwischenhirn. // Arch exp Path Pharmacol.-1914.-V.76.-P.202-233.

91. Ishikawa K, Kakegawa T, Suzuki M. Role of hypothalamic paraventricular nucleus in the secretion of thyrotropin under adrenergic and cold-stimulated conditions in the rat. // Endocrinology.-1984.-V.114.- P.352-358.

92. Jain M.R, Horvath T.L, Kalra P.S, and Kalra S.P. Evidence that NPY Y1 receptors are involved in stimulation of feeding by orexins (hypocretins) in sated rats. // Regul Pept.-2000.-V.87.-P. 19-24.

93. Jaszberenyi M, Bujdoso E, Pataki I., and Telegdy G. Effects of orexins on the hypothalamic-pituitary-adrenal system. // J Neuroendocrinol.-2000.-V.12.-P.1174-1178.

94. Jaszberenyi M., Bujdoso E., Kiss E., Pataki I., Telegdy G. The role ofNPY in the mediation of orexin-induced hypothermia. // Regul. Pept.-2002.-V.104.-P.55-59.

95. Jaszberenyi M., Bujdoso E., and Telegdy G. The role of neuropeptide Y in orexin-induced hypothalamic-pituitary-adrenal activation. // J Neuroendocrinol.-2001 .-V. 13.-P. 438-441.

96. Johren O., Neidert S.J., Kummer ML, Dendorfer A., and Dominiak P. Prepro-orexin and orexin receptor mRNAs are differentially expressed in peripheral tissues of male and female rats. //Endocrinology.- 2001.-V.142.-P. 3324-3331.

97. Johren O., Bruggemann N., Dendorfer A. Gonadal steroids differentially regulate the messenger ribonucleic acid expression of pituitary orexin type 1 receptors and orexin type 2 receptors. // Endocrinology.-2003.-V.144.-P.1219-1225.

98. Kalin N.H., Takahashi L.K., Chen F.L. Restraint stress increases corticotropin-releasing hormone mRNA content in the amygdale and paraventricular nucleus. // Brain Res.-1994.-V.656.-P. 182-186.

99. Karteris E., Randeva H.S., Grammatopoulos D.K., Jaffe R.B., and Hillhouse E.W. Expression and coupling characteristics of the crh and orexin type 2 receptors in human fetal adrenals. // J Clin Endocrinol Metab.-2001.-V.86.-P.4512-4519

100. Kastin A.J., and Akerstrom V. Orexin A but not orexin B rapidly enters brain from blood by simple diffusion. // J Pharmacol Exp Ther.-1999.-V.289.-P. 219-223.

101. Kayaba Y., Nakamura, A., Kasuya, Y., et al. Attenuated defense response and low basal blood pressure in orexin knockout mice. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.-2003.-V.285.- P581-593.117

102. Keller A.D., Hare W.K. The hypothalamus and heat regulation. // Proc Soc Exp Biol Med.-1932.- V.29.-P. 1069-1070.

103. Kirchgessner A.L., and Liu M. Orexin synthesis and response in the gut. // Neuron.-1999.-V.24.-P.941-951.

104. Konarska M., Stewart R.E., McCarty R. Predictability of chronic intermittent stress: effects on sympathetic-adrenal medullary responses of laboratory rats. // Behav Neural Biol.-1990.- V.53.-P.231-243.

105. Konarska M., Stewart R.E., McCarty R. Sensitization of sympathetic-adrenal medullary responses to a novel stressor in chronically stressed laboratory rats. // Physiol Behav.-1989.-V46.-P.129-135.

106. Kukkonen J.P., Akerman K.E.O. Orexin receptors couple to Ca2+ channels different from store-operated Ca2+ channels. // Neuroreport.- 2001.-V. 12.-P.2017-2020.

107. Kunii K., Yamanaka A., Nambu T., Matsuzaki I., Goto K., and Sakurai T. Orexins/hypocretins regulate drinking behaviour. // Brain Res.- 1999.-V842.-P. 256-261.

108. Kuru M., Ueta Y., Serino, R. Centrally administered orexin/hypocretin activates HP A axis in rats. // Neuroreport.-.2004.-V.l 1.-P. 1977-1980.

109. Kuwahara M., Huh M.D., Hirose H., Sugano S. Alteration of the intrinsic heart rate and autonomic nervous tone during the growing process of rats and pig. // Jpn.J.Vet.Sci.-l986.-V.48.-P.703-709.

110. Kvetnansky R., Palkovits M., Mitro A., Torda T., Mikulaj L. Catecholamines in individual hypothalamic nuclei of acutely and repeatedly stressed rats. // Neuroendocrinology.-1977.-23.-P.257-267

111. Lee J.H., Bang E., Chae K.J., Kim J.Y., Lee D.W., and Lee W. Solution structure of a new hypothalamic neuropeptide, human hypocretin-2/orexin-B.// Eur J Biochem.- 1999.-V.266.- P.831-839.

112. Li Y. Gao X.B., Sakurai T., van den Pol A.N. Hypocretin/orexin excites hypocretin neurons via a local glutamate neuron-A potential mechanism for orchestrating the hypothalamic arousal system. // Neuron. 2002. - V. 36. - P. 1169-1181.

113. Lin M.T, Wang PS, Chuang J, Fan LJ, Won SJ Cold stress or a pyrogenic substance elevates thyrotropin-releasing hormone levels in the rat hypothalamus and induces thermogenic reactions. //Neuroendocrinology.-1989.-V.50.-P. 177181.

114. Lipton J.M. Thermal stimulation of the medulla alters behavioral temperature regulation. //Brain Res.-1971.-V.26.-P.439-442.

115. Lipton J.M. Thermosensitivity of medulla oblongata in control of body temperature. //Am J Physiol.-1973.-V.224.-P.890-897.

116. Lipton J.M, Dwyer P, Fossler DE Effects of brainstem lesions on temperature regulation in hot and cold environments. //Am J Physiol.-1974.-V. 226.-P.1356-1365.

117. Lipton J.M, ClarkWG Neurotransmitters in temperature control. //Annu Rev Physiol.-1986.-V.48.-P.613-623.

118. Lopez M, Seoane L, Garcia MC, Lago F, Casanueva FF, Senaris R, and Dieguez C. Leptin regulation of prepro-orexin and orexin receptor mRNA levels in the hypothalamus.//Biochem Biophys Res Commun.-2000.-V.269.-P.41-45.

119. Lubkin M, and Stricker-Krongrad A. Independent feeding and metabolic actions of orexins in mice.// Biochem Biophys Res Commun.-1998.-V.253.-P.241-245.

120. Luo X, Kiss A, Makara GB, Lolait S, Aguilera G Stressspecific regulation of corticotropin releasing hormone receptor expression in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus in the rat.//J Neuroendocrinol.-1994.-V.6.-P.689-696.

121. McCarty Richard. Sympathetic-adrenal medullary and cardiovascular responses to acute cold stress in adult and aged rats. // Auton. Nerv. Syst.-1985.-V.12.-P.115-122.

122. Malendowicz, L.K, Hochol A, Ziolkowska A, Nowak M, Gottardo L, and Nussdorfer GG. Prolonged orexin administration stimulates steroid-hormone secretion, acting directly on the rat adrenal gland.//Int J Mol Med.-2001.-V.7.-P.401-404.

123. Martins P.J.F., D'Almeida, V., Pedrazzoli, M., Lin, L., Mignot, E. and Tufik, S. Increased hypocretin-1 (Orexin-A) levels in cerebrospinal fluid of rats after short-term forced activity. //Regul. Pept.- 2004.-V.117.-P.155-158.

124. Marcus J.N., Aschkenasi C.J., Lee CE, Chemelli RM, Saper CB, Yanagisawa M, and Elmquist JK. Differential expression of orexin receptors 1 and 2 in the rat brain. //J Comp Neurol.-2001 .-V.435.-P.6-25.

125. Marino F, Sockler JM, Fry JM. Thermoregulatory, metabolic and sympathoadrenal responses to repeated brief exposure to cold. // Scand J Clin Lab Invest.-1998.-58.-P.537-545.

126. Mark M.D., and Herlitze S. G-protein mediated gating of inward-rectifier K+ channels. Eur J Biochem.-2000.-V.267.-P.5830-5836.

127. Mason J.W. A re-evaluation of the concept of "non-specificity" in stress theory. //J Psych Res.-1971 .-V.8.-P.323-333.

128. Matsumura K., Tsuchihashi T., and Abe I. Central orexin-A augments sympathoadrenal outflow in conscious rabbits.//Hypertension.-2001.-V.37.-P. 1382-1387.

129. Matsuzaki I., Sakurai T., Kunii K., Nakamura T., Yanagisawa M., and Goto K. Involvement of the serotonergic system in orexin-induced behavioral alterations in rats.//Regul Pept.-2002.-104.-P.l 19-123.

130. Melia K.R., Ryabinin A.E., Schoroeder R., Bloom F.F., Wilson M.C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.// J.of Neuroscience.-1994.-V.14. N.10. P.5929-5938.

131. Methippara M.M., Alam M.N., Szymusiak R., and McGinty D. Effects of lateral preoptic area application of orexin-A on sleep-wakefulness. //Neuroreport.-2000.-V. 11 .-P.3423-3426.

132. Mignot E., Taheri S., Nishino S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. // Nature Neuroscience.-2002.-V.5.-P.1071-1075.

133. Mintz E.M., van den Pol A.N., Casano A.A., and Albers H.E. Distribution of hypocretin-(orexin) immunoreactivity in the central nervous system of Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). //J Chem Neuroanat.-2001.- V.21.-P.225-238.

134. Mitsuma T., Hirooka Y., Mori Y., Kayama M., Adachi K., Rhue N., Ping J., and Nogimori T. Effects of orexin A on thyrotropin-releasing hormone and thyrotropin secretion in rats. //Horm Metab Res.-1999.-V.31.-P.606-609.

135. Mochizuki Takatoshi, Elizabeth B. Klerman, Takeshi Sakurai and Thomas E. Scammell. Elevated body temperature during sleep in orexin knockout mice.// Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol.-2006.-V.291,-P.533-540.

136. Mochizuki Takatoshi, Amanda Crocker, Sarah McCormack, Masashi Yanagisawa, Takeshi Sakurai, and Thomas E. Scammell. Behavioral State Instability in Orexin Knock-Out Mice. // The Journal of Neuroscience.-2004.-V.24(28) .-P.6291-6300.

137. Monda M., Viggiano A., Mondola P., De Luca V: A paradoxical effect of orexin A: the hypophagia induced by hyperthermia. // Brain Res.-2003.-V.961.-P.220-228.

138. Monda M., Viggiano A., Mondola P., De Luca V: Haloperidol reduces the sympathetic and thermogenic activation induced by orexin A.//Neurosci Res 2003.-V.45.-P. 17-23.

139. Monda M., Viggiano A., Mondola P., Fuccio F., De Luca V: Cortical spreading depression blocks the hyperthermic reaction induced by orexin A. //Neuroscience.-2004.-V. 123 .-P.567-574.

140. Monda M., Viggiano A., Mondola P., De Luca V: Inhibition of prostaglandin synthesis reduces hyperthermic reactions induced by hypocretin-1/orexin A. // Brain Res.-2001.-V.909.-P.68-74.

141. Monda M., Viggiano A., Mondola P., Fuccio F., De Luca V: Clozapine blocks the hyperthermia induced by orexin A in the rat. // Physiol Res.-2004.-V.53.-P.507-513.

142. Mondal M.S., Nakazato M., Date Y., Murakami N., Yanagisawa M., and Matsukura S. Widespread distribution of orexin in rat brain and its regulation upon fasting.// Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.256.-P.495-499.

143. Moriguchi T., Sakurai T., Nambu T., Yanagisawa M., and Goto K. Neurons containing orexin in the lateral hypothalamic area of the adult rat brain are activated by insulin-induced acute hypoglycemia. //Neurosci Lett.-1999,-V.264.-P.101-104.

144. Mosso J.A., Kruger L. Spinal trigeminal neurons excited by noxious and thermal stimuli. //Brain Res.-1972.-V.38.-P.206-210.

145. Mullett M.A., Billington C.J., Levine A.S., and Kotz C.M. Hypocretin I in the lateral hypothalamus activates key feeding-regulatory brain sites. //Neuroreport.-2000.-V. 11 .-P.: 103-108.

146. Muroya S., Uramura K., Sakurai T., Takigawa M., and Yada T. Lowering glucose concentrations increases cytosolic Ca2+ in orexin neurons of the rat lateral hypothalamus. // Neurosci Lett.-2001.-V.309.-P.165-168.

147. Muschamp J.W. A Role for Hypocretin (Orexin) in Male Sexual Behavior. / J.W. Muschamp, J.M. Dominguez, S.M. Sato, S. Roh-Yu, E.M. Hull. // The Journal of Neuroscience. 2007. - V. 27, №11. - P. 2837-2845.

148. Nakamura T., Uramura K., Nambu T., Yada T., Goto K., Yanagisawa M, and Sakurai T. Orexin-induced hyperlocomotion and stereotypy are mediated by the dopaminergic system.// Brain Res.-2000.-V.873.-P.181-187.

149. Nambu T., Sakurai T., Mizukami K., Hosoya Y., Yanagisawa M., and Goto K. Distribution of orexin neurons in the adult rat brain. // Brain Res.-1999.-V.827.-P.243-260.

150. Nanmoku T., Isobe K., Sakurai T., Yamanaka A., Takekoshi K, Kawakami Y, Goto K., and Nakai T. Effects of orexin on cultured porcine adrenal medullary and cortex cells. // Regul Pept.-2002.-V.104.-P.125-130.

151. Naslund E., Ehrstrom M., Ma J., Hellstrom P.M., and Kirchgessner A.L. Localization and effects of orexin on fasting motility in the rat duodenum. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.-2002.-V.282.-P.470-479.

152. Nishino S., Fujiki N., Ripley B., Sakurai E., Kato M., Watanabe T., Mignot E., and Yanai K. Decreased brain histamine content in hypocretin/orexin receptor-2 mutated narcoleptic dogs. //Neurosci Lett.-2001.-V.313.-P.125-128.

153. Nowak K.W., Mackowiak P., Switonska M.M., Fabis M., and Malendowicz L.K. Acute orexin effects on insulin secretion in the rat: in vivo and in vitro studies.// Life Sci.-2000.-V.66.-P.449-454.

154. Osaka T, Matsumura H. Noradrenaline inhibits preoptic sleep-active neurons through alpha 2-receptors in the rat. // Neurosci Res.- 1995.-V.21.-P.323-330.

155. Pacak K., Palkovits M., Yadid G., Kvetnansky R., Kopin I.J., Goldstein D.S. Heterogeneous neurochemical responses to different stressors: a test of Selye's doctrine of nonspecificity. // Am J Physiol.-1998.-V. 275.-P.1247-1255.

156. Pacak K., Palkovits M., Makino S., Kopin I.J., Goldstein D.S. Brainstem hemisection decreases corticotropin-releasing hormone mRNA in the paraventricular nucleus but not in the central amygdaloid nucleus.//J Neuroendocrinol .-1996.- V.8.-P.543-551.

157. Pacak Karel and Palkovits Miklos. Stressor Specificity of Central Neuroendocrine Responses: Implications for Stress-Related Disorders. // Endocrine Reviews.- 2001.-V. 22(4) .-P.502-548.

158. Pace-Schott E.F. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. / E.F. Pace-Schott, J.A. Hobson. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. - V. 3. - P. 591-605.

159. Pachomov N. The effects of posterior and anterior hypothalamic lesions on the maintenance of body temperature in the rat. // J Neuropathol Exp Neurol.-1962.-V.21.-P.45(M60.

160. Palkovits M., Baffi J.S., Dvori S. Neuronal organization of stress response. Pain-induced c-fos expression in brain stem catecholaminergic cell groups. // Ann NY Acad Sci.-1995.-V.771 .-P.313-326.

161. Palkovits M., Baffi J.S., Pacak K. Stress-induced Fos-like immunoreactivity in the pons and the medulla oblongata of rats. // Stress.-1997.-V.l.-P. 155-168.

162. Peyron, C, Tighe DK, van den Pol AN, de Lecea L, Heller HC, Sutcliffe JG, and Kilduff TS. Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems. // J Neurosci.-1998.-V.18.-P.9996-10015. ■:

163. Pharmacology in exercise and sports. Satu M. // Somani. CRC Press.-1996.-359 p.

164. Piper D.C., Upton N., Smith M.I., and Hunter A.J. The novel brain neuropeptide, orexin-A, modulates the sleep-wake cycle of rats. // Eur J Neurosci.-2000.-V. 12.-P.726-730.

165. Richard F, Faucon-Biguet N, Labutu R, Rollet D, Mallet J, Buda M. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. // J Neurosci Res.-1988.-V.20.-P.32-37.

166. Rodgers R.J, Halford J.C, Nunes de Souza R.L, Canto de Souza A.L, Piper D.C, Arch J.R, and Blundell J.E. Dose-response effects of orexin-A on food intake and the behavioural satiety sequence in rats. // Regul Pept.-2000.-V.96.-P.71-84.

167. Rondeel J.M.M, de Greef W.J, Hop W.C.J, Rowland D.L, Visser T.J. Effect of cold exposure on the hypothalamic release of thyrotropin- releasing hormone and catecholamines. //Neuroendocrinology.-1991.-54.-P.477-481.

168. Rybakina E.G., Shanin S.n, Kozinets I.A, Fomicheva E.E, Korneva E.A. Cellular mechanisms of cold stress-related immunosupression and the action of interleukin 1 // INTJ.TISS.REAC. XIX.-1997.- V.3/4.-P.135-140.

169. Sakurai T., Moriguchi T., Furuya K, Kajiwara N, Nakamura T, Yanagisawa M, and Goto K. Structure and function of human prepro-orexin gene. // J Biol Chem .-1999.-V.274.-P. 17771 -17776.

170. Samson W.K., Gosnell B., Chang J.K., Resch Z.T., and Murphy T.C. Cardiovascular regulatory actions of the hypocretins in brain. // Brain Res.-1999.-V.831 .-P.248-253.

171. Samson W.K., Taylor M.M., Follwell M., and Ferguson A.V. Orexin actions in hypothalamic paraventricular nucleus: physiological consequences and cellular correlates. // Regul Pept.-2002.-V.104.-P.97-103.

172. Satinoff E., Rutstein J. Behavioral thermoregulation in rats with anterior hypothalamic lesions. // J Comp Physiol Psychol.-1970.-V.71.-P.77-82.

173. Satinoff E., Shan S.Y. Loss of behavioral thermoregulation after lateral hypothalamic lesions in rats.// J Comp Physiol Psychol.-1971.-V.77.-P.302-312.

174. Satinoff E. Neural organization and evolution of thermal regulation in mammals. // Science.-1978.-V.201.-P. 16-22.

175. Scammell T.E., Estabrooke I.V., McCarthy M.T., Chemelli R.M., Yanagisawa M., Miller M.S., and Saper C.B. Hypothalamic arousal regions are activated during modafinil-induced wakefulness. // J Neurosci.-2000.-V.20.-P.8620-8628.

176. Scammel T.E. // Current Biology.-2001.-V.I 1.-P.R769—R771.

177. Selye H. Thymus and adrenals in the response of the organism to injuries and intoxications. // Br J Exp Pathol.- 1936.-V.17.-P.234-248.

178. Senba E., Ueyama T. Stress-induced expression of immediate early genes in the brain and peripheral organs of the rat. // Neurosci Res.-1997.-V.29.-P. 183207.

179. Shanin S.N. Natural killer cell cytotoxic activity and c-Fos protein synthesis in rat hypothalamic cells after painful electric stimulation of the hind limbs and EHF irradiation of the skin. // Med Sci Monit. 2005. - V. 11(9) - P. BR309-315.

180. Sheridan J., Feng N., Bonneau R. et al. // J. Neuroimmunol.-1991.-V.31.-№ 2.-P. 245-255.

181. Sherin J.E., Elmquist J.K., Torrealba F., Saper C.B. Interaction of histaminergic tuberomammillary neurons by GABAergic and galaninergic neurons in the ventrolateral preoptic nucleus of the rat. // J Neurosci.-1998.-V.18.-P.4705-4721.

182. Shibahara M., Sakurai T., Nambu T., Takenouchi T., Iwaasa H., Egashira S.I., Ihara M., and Goto K. Structure, tissue distribution, and pharmacological characterization of Xenopus orexins. // Peptides.-1999.-V.20.-P. 1169-1176.

183. Shiraishi T., Oomura Y., Sasaki K., and Wayner M.J. Effects of leptin and orexin-A on food intake and feeding related hypothalamic neurons. // Physiol Behav.-2000.-V.71 .-P.251 -261.

184. Shirasaka T., Nakazato M., Matsukura S., Takasaki M., and Kannan H. Sympathetic and cardiovascular actions of orexins in conscious rats. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.-1999.-V.277.-P. 1780-1785.

185. Simpkins J.W., Hodson C.A., Meites J. Differential effects of stress on release of thyroid-stimulating hormone in young and old male rats. // Proc Soc Exp Biol Med.-1978.-V.157.-P. 144-147.

186. Slugg R.M., Light A.R. Spinal cord and trigeminal projections to the pontine parabrachial region in the rat as demonstrated with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. //J Comp Neurol.-1994.-V.339.-P.49-61.

187. Stress and immunity. PlotnikoffN. P., Murgo A.//CRC Press.-1991.-558 p.

188. Suemaru S., Hashimoto K., Ota Z . Brain corticotropin-releasing factor (CRF) and catecholamine responses in acutely stressed rats. // Endocrinol Jpn.1985.-V.32.-P.709-718.

189. Swanson L.W.// Brain Maps: Computer Graphics Files. Elsevier Science, Amsterdam. 1992.

190. Sweet D.C., Levine A.S., Billington C.J., and Kotz C.M. Feeding response to central orexins. //BrainRes.-1999.-V821.-P.535-538.

191. Switonska M.M., Kaczmarek P., Malendowicz L.K., and Nowak K.W. Orexins and adipoinsular axis function in the rat. // Regul Pept.- 2002.-V. 104.-P.69-73.

192. Szekely M., Petervari E., Balasko M., Hernadi I., Uzsoki B. Effects of orexins on energy balance and thermoregulation. // Regul Pept.-2002.-V. 104(1-3) .-P.47-53.

193. Taheri S., Sunter D., Dakin C., Moyes S., Seal L., Gardiner J., Rossi M., Ghatei M., and Bloom S. Diurnal variation in orexin A immunoreactivity and prepro-orexin mRNA in the rat central nervous system. // Neurosci Lett.-2000.-V.279.-P. 109-112.

194. Takahashi N., Okumura T., Yamada H., and Kohgo Y. Stimulation of gastric acid secretion by centrally administered orexin-A in conscious rats. // Biochem Biophys Res Commun.-l999.-V.254.-P.623-627.

195. Takayama H., Ota Z., Ogawa N. Effect of immobilization stress on neurupeptides and their receptors in rat central nervous system. // Regul Pept.1986.-V.15.-P.239-248.

196. Tanaka M., Tonouchi M., Hosono T., Nagashima K., Yanase-Fujiwara M., and Kanosue K. Hypothalamic region facilitating shivering in rats. // Jpn J Physiol.-2001.-V.51.-P.625-629.

197. Tanaka M., Nishikawa T., Kohno Y., Nagasaki N., Noda Y., Inanaga K. Hypothermia and gastric lesions in rats exposed to immobilization stress.// Kurume Med J.-1981.-V.28.-P.247-253.

198. Teague R.S., Ranson S.W. The role of the anterior hypothalamus in temperature regulation. // Am J Physiol.-1936.-V. 117.-P.562-570.

199. Thoenen H. Induction of tyrosine hydroxylase in peripheral and central adrenergic neurones by cold-exposure of rats. // Nature.-1970.-V.228.-P.861-862.

200. Trivedi P., Yu H., MacNeil D.J., Van der Ploeg L.H., and Guan X.M. Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain. // FEBS Lett.-1998.-V.438.-P.71-75.

201. Van den Pol A.N., Gao X.B., Obrietan K., Kilduff T.S., and Belousov A.B. Presynaptic and postsynaptic actions and modulation of neuroendocrine neurons by a new hypothalamic peptide, hypocretin/orexin. // J Neurosci.-1998.-V. 18.-P.7962-7971.

202. Van den Pol A.N. Hypothalamic hypocretin (orexin): robust innervation of the spinal cord. // J Neurosci.-1999.-V. 19.-P.3171 -3182.

203. Weiner H. Behavioral biology of stress and psychosomatic medicine. In: Brown M.R, Koob G.F, Rivier C, eds. Stress. // Neurobiology and neuroendocrinology. New York: Marcel Dekker.-1991.-P.23-51.

204. Wenner M. Reward linked to increased natural killer cell activity in rats. / M. Wenner, N. Kawamura, T. Ishikawa. // Neuroimmuno Modulation. 2000. -V. 7.-P. 1-5.

205. Williams G., Harrold J.A., and Cutler D.J. The hypothalamus and the regulation of energy homeostasis: lifting the lid on a black box. // Proc Nutr Soc.-2000.-V.59.-P.385-396.

206. Willie J.T. To eat or to sleep? Orexin in the regulation of feeding and wakefulness. / J.T. Willie, R.M. Chemelli, C.M. Sinton, M. Yanagisawa. // Annu Rev Neurosci. 2001. - V. 24. - P. 429-458.

207. Wickman, K, and Clapham DE. Ion channel regulation by G proteins. // Physiol Rev.-1995.-V.75.-P.865-885.

208. Wrona D. Chronic electrical stimulation of the lateral hypothalamus increases natural Killer cell cytotoxicity in rats / D. Wrona, W. Trojniar. // J. of Neuroscience. -2000. V. 20(17).-P. 6578-6586.

209. Yamada H., Okumura T., Motomura W., Kobayashi Y., and Kohgo Y. Inhibition of food intake by central injection of anti-orexin antibody in fasted rats. // Biochem Biophys Res Commun.-2000.-V.267.-P.527-531.

210. Yamanaka A., Tsujino N., Funahashi H., Honda K., Guan J.L., Wang Q.P., Tominaga M., Goto K., Shioda S., and Sakurai T. Orexins activate histaminergic neurons via the orexin 2 receptor. // Biochem Biophys Res Commun.-2002.-V.290.-P. 1237-1245.

211. Yang Y.L. and Lu K.T. Effects of orexin-A on rat thermoregulation: the roles of prostaglandin E2// Proceedings of the Australian Physiological and Pharmacological Society 2008.

212. Yoshimatsu H., Egawa M., and Bray G.A. Sympathetic nerve activity after discrete hypothalamic injections of L-glutamate. // Brain Res.-1993.-V.601.-P.121-128.

213. Yoshimichi Go, Hironobu Yoshimatsu, Takayuki Masaki and Toshiie Sakata. Orexin-A Regulates Body Temperature in Coordination with Arousal // StatusExperimental Biology and Medicine.-2001.-V.226.-P.468-476.

214. Zaretskaia M.V., Zaretsky D.V., Shekhar A., and DiMicco J.A. Chemical Stimulation of the dorsomedial hypothalamus evokes non-shivering thermogenesis in anesthetized rats. // Brain Res.-2002.-V.928.-P. 113-125.

215. Zhang S. Expression of orexin receptors in the brain and peripheral tissues of the male sheep. / S. Zhang, D. Blache, P.E. Vercoe, C.L. Adam, M.A. Blackberry, P.A. Findlay, K.A. Eidne, G.B. Martin. // Regul Pept. 2005. - V. 124.-P. 81-87.

216. Zhu L., Onaka T., Sakurai T., Yada T. Activation of orexin neurons after noxious but not conditioned fear stimuli in rat. // Neuroendocrinol.-2002.-V.13 (10).-P. 1351-1353.