Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс Wistar после введения липополисахарида

Перекрест, София Владимировна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс Wistar после введения липополисахарида

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Перекрест, София Владимировна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.16

Автореферат диссертации по медицине на тему Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс Wistar после введения липополисахарида

На правах рукописи

Перекрест София Владимировна

ОРЕКСИНЭРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ ГИПОТАЛАМУСА КРЫС \VISTAR ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЛНПОПОЛИСАХАРИДА

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2009

003472648

Работа выполнена в отделе Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель: Академик РАМН Корнева Елена Андреевна

Официальные оппоненты:

1. Шестакова Светлана Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры Патологической физиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.

2. Кветная Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, руководитель лаборатории Биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова.

Защита состоится «23» июня 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «22» мая 2009 г.

РАМН.

Ученый секретарь диссертационного совета

й.М.Н-

П.А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одним из перспективных научных направлений, интенсивно развивающихся в мире, является иммунофизиология, рассматривающая процессы взаимодействия нервной и иммунной системы. Особое внимание уделяется роли гипоталамуса в ней-роиммунных взаимодействиях, что обуславливается его функциональными особенностями. Как известно, гипоталамус представляет собой центр регуляции многих вегетативных функций, таких как терморегуляция, водно-солевой обмен, пищевое поведение, цикл сон/бодрствование, функций иммунной системы. К настоящему времени открыто и изучено большое количество гипоталамических нейропептидов, принимающих участие в регуляции вегетативных функций организма. Одними из этих нейропептидов являются орексины.

Орексины А и В — нейропептиды, открытые в 1998 году, синтез которых осуществляется небольшой популяцией гипоталамических нейронов от общего пептида-предшественника препроорексина. Орексин-содержащие нейроны участвуют в регуляции различных физиологических процессов (поддержания энергетического баланса, регуляции состояния сна и бодрствования, пищевого поведения, ответных реакций на стресс и восприятие боли) (Beukmann С. et al, 2002; Espana R.A. et al, 2001; Ida T. et al, 1999; Dube M.G. et al, 1999; Ida T. et al., 2000; S. Watanabe et al, 2005; Swanson L.W. et al, 2005).

Основное количество орексин-содержащих нейронов мозга локализовано в пе-рифорникальной зоне латеральной гипоталамической области (Реугоп С., 1998). Аксоны этих нейронов достигают различных отделов головного и спинного мозга. Высокая плотность распределения отростков орексин-содержащих нейронов выявлена в гипоталамических структурах (Реугоп С., 1998), вовлеченных в регуляцию функций иммунного ответа (переднее гипоталамическое ядро, заднее гипоталамическое поле, латеральная гипоталамическая область и вентро-медиальное гипоталамическое ядро) (Корнева Е.А., Хай Л.М., 1963; Лесников В.А., 1993; Shanin SN et al, 2005; Wenner M. et al, 2000). В этих же структурах локализованы нейроны, имеющие рецепторы к орексину (Hervieu G.J. et al, 2001; Trevedi P., 1998; Taheri S. et al, 1999). Рецепторы к орексину или их мРНК обнаружены и на клетках различных тканей, участвующих в реализации иммунного ответа (клетки селезенки, надпочечников, печени, стволовые клетки фенотипа CD34+) (Randeva H.S. et al, 2001; Zhang S. et al, 2005; Steidl U., 2004).

взаимодействий не вызывает сомнений, однако механизмы их до сих пор остаются не до конца раскрытыми и нуждаются в дальнейших исследованиях. Известно, что нейроны LHA участвуют в регуляции функций иммунной системы, например, электростимуляция этой области гипоталамуса, где и локализованы орексин-содержащие нейроны, усиливает цитотоксическую активность NK клеток селезенки (Wrona D., 2003; Wenner М. et al, 2000). Нейроны латеральной гипоталамической области также связаны полисинаптически с нейронами, иннервирующими селезенку (Cano G., 2001; Denes А., 2001) и красный костный мозг (Denes A. et al, 2005). Необходимо подчеркнуть, что переднее гипоталамическое ядро, заднее гипоталамическое поле и латеральная гипоталамическая область активируются в первые часы после введения антигенов различной природы, таких как липополисахарид (ЛПС) (Elmquist J.К. et al, 1996; Gaykema R.P.H. et al, 1999; Yi-Hong et al, 2000), столбнячный анатоксин (Корне-ва ЕА и др., 2001), стафилококковый энтеротоксин В (Gaykema R.P.H. et al, 1998; Goehler L.E. et al, 2001).

Хотя перечисленные факты свидетельствуют в пользу возможного участия орек-син-содержащих нейронов и самого орексина в механизмах реализации взаимодействия нервной и иммунной систем, однако прямых доказательств в современной литературе пока не существует. Изучение паттерна активации гипоталамических структур, а также исследование динамики распределения орексин-содежаших нейронов гипоталамуса в первые часы после антигенного воздействия представляется важным этапом для расшифровки этих механизмов на ранней стадии формирования иммунного ответа. Определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса позволяет проанализировать молекулярные механизмы формирования ответа орексин-содержащих нейронов, вовлекающихся в реакции ЦНС на антигенный стимул.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явилось изучение реакций орексинэргических нейронов гипоталамуса крыс на введение антигена липополисахарида в различных дозах.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать степень активации клеток и структур гипоталамуса (по выявлению c-Fos белка) через 2 часа после внутривенного введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.

2. Исследовать морфо-функциональные характеристики орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс через 2, 4 и 6 часов после внутривенного введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.

3. Исследовать уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипотала-мических структур крыс через 2, 4 и 6 часов после внутривенного введения липополисахарида в дозе 25 и 500 мкг/кг веса животного. Научная новизна работы

Впервые получены данные о степени активации гипоталамических структур в ответ на введение антигена липополисахарида в различных дозах (несептической и субсептической). Показано участие орексин-содержащих нейронов в ответных реакциях ЦНС на антигенное воздействие, а также выявлен дозозависимый характер динамики изменений их морфо-функциональных характеристик. Впервые проведен сравнительный анализ изменений уровня экспрессии гена препроорексина и выявление орексина по иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамических структур после введения антигена. Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе данные значимы для раскрытия центральных механизмов нейроиммунных взаимодействий и являются важным этапом в изучении процесса реализации реакции ЦНС на антигенное воздействие, что создает основу для поиска путей коррекции нарушений процессов взаимодействия нервной и иммунной систем.

Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о морфо-функциональных особенностях системы орексинэргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования реакций организма на антигенное воздействие, а также могут быть включены в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии. Основные положения, выносимые на защиту

1. Внутривенного введение антигена липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного приводит к активации гипоталамических структур (AHN, PVH, VMH, DMH, LHA, PH), паттерн которой различен, что проявляется индукцией синтеза c-Fos белка в клетках этих структур.

2. Орексин-содержащие нейроны вовлекаются в ответные реакции ЦНС на введение липополисахарида, что проявляется изменением иммунореактивности этих нейронов, а пространственно-временная динамика изменений их морфо-функциональных характеристик зависит от дозы вводимого антигена.

3. Внутривенное введение липополисахарида приводит к активации экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса через 2 часа после введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, из них отечественных — 13 и 214 — зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.

Апробация работы

Материалы исследования изложены в 12 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях: X Всероссийский научный форум Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 29 мая - 1 июня 2006); International Symposium Interaction of the nervous and immune systems in health and disease (Saint-Petersburg, 31 May - 2 June 2007); XX съезд физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 4-8 июня 2007); Объединенный иммунологический форум (Санкт-Петербург, 30 июня - 5 июля 2008); Международная конференция Физиология и патология иммунной системы (Москва, 14-17 сентября 2008).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные и схема эксперимента

Работа выполнена на 126 крысах, взрослых самцах породы Wistar, весом 250-300 г., адаптированных к условиям эксперимента. Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных.

В качестве тимус-независимого антигена, обладающего высокой степенью им-муногенности, использовали липополисахарид (ЛПС) (E.coli 055:В5, Sigma, L2880).

Дозы были подобраны так, чтобы в одном случае (25 мкг/кг веса животного) не вызывать синтез антител, определяемый методом пассивной гемагглютинации, а в другом случае (500 мкг/кг веса животного) приводить к достаточному для определения указанным методом синтезу антител (титр 1/64).

Все инъекции проводили в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в гипоталамусе (Taheri S. et al, 2000). Крысам внутривенно вводили 200 мкл ЛПС в дозе 25 или 500 мкг/кг веса. Контролем служили животные, которым внутривенно вводили физиологический раствор в том же объеме.

Экспериментальные группы:

> Группа 1. Интактные животные.

> Группа 2. Контрольные животные, которым внутривенно вводили 200 мкл физиологического раствора.

> Группа 3. Животные, которым внутривенно вводили 25 мкг/кг липополиса-харида.

> Группа 4. Животные, которым внутривенно вводили 500 мкг/кг липополи-сахарида.

Выведение животных из эксперимента проводили в 11 часов, а также через 2, 4 и 6 часов после инъекции. Иммуногистохимическое окрашивание.

Выявление c-Fos- и орексин-позитивных нейронов проводили иммуногистохи-мичеким методом на фронтальных замороженных срезах мозга (30 мкм). Для выявления c-Fos белка использовали первичные кроличьи поликлональные антитела к семейству c-Fos белков (Santa-Cruz, Biotech.Inc.) и вторичные антитела к кроличьим иммуноглобулинам (IgG), меченые пероксидазой (Sigma). Выявление орексина осуществляли авидин-биотиновым методом. В качестве первичных антител использовали кроличьи антитела к орексину A (Sigma), в качестве вторичных — моноклональ-ные антитела к кроличьим иммуноглобулинам (клон RG-16), конъюгированные с биотином (Sigma), детекцию которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки (Sigma). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили раствором диаминобензидина. Подсчет количества клеток.

Подсчет c-Fos-позитивных клеток производили, используя систему Иста-Видео-Тест. Срезы мозга исследовали при 40-кратном увеличении светового микроскопа. С помощью компьютерной программы Иста-Видео-Мастер определяли площадь клеток и среза, на которой проводили подсчет клеток и оптическую плотность окраски клеток и фона для каждого среза. При анализе количества c-Fos позитивных клеток учитывали только те клетки, оптическая плотность которых превышала окраску фона, как минимум, в 1,25 раза и выше, а площадь превышала 10 мкм2. Для сопоставления количества c-Fos позитивных клеток, данные количественных подсчетов пересчитывали на унифицированную площадь, равную 10000 мкм2. Сравнительный анализ степени активации структур гипоталамуса по экспрессии c-Fos-подобного белка проводили по оценке относительного коэффициента активации (ОКА), а также по показателю относительной оптической плотности (ООП), которые высчитывали по формулам:

ОКА= число c-Fos-позитив.клеток после введения антигена (ЛПС или БСА) число c-Fos-позитив. клеток после введения физ. раствора

ср.опт.плотность c-Fos-позитив.клеток ср.опт.плотность фона

Подсчет орексин-позитивных нейронов осуществляли при 10-кратном увеличении светового микроскопа на всей площади срезов 26-32 уровней. Количество орек-син-содержащих нейронов широко варьирует у каждого животного на различных срезах мозга, полученных с одного уровня. Для того чтобы минимизировать случайные ошибки, возникающие при изготовлении срезов, в исследовании учитывали количество орексин-содержащих нейронов на всех срезах мозга конкретного животного. Полимеразно-цепная реакция в режиме реального времени.

Для постановки полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени (RT-PCR) животных декапитировали и сразу извлекали гипоталамус.

1) Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad).

2) Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием реактивов, поставленных компанией «МедиГен».

3) Полимеразная Цепная Реакция в Реальном Времени (RT-PCR):

Для проведения реакции использовались праймеры:

— к последовательности, кодирующей препроорексин (Ох): Прямой: 5 '-TGT CGC CCA GAA GAC GTG TTC CTG-3 ' Обратный: 5'-AAG ACG GGT TCA CAC TCT GGA TC-3' Температура отжига: 61°C, длина продукта - 287 пар нуклеотидов.

— к последовательности кодирующей глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAD):

Прямой: 5'-ССА СТС AGA AGA CTG TGG AT-3' Обратный: 5'-GTC АТС ATA CTT GGC AGG TT-3' Температура отжига: 55°С, длина продукта - 224 пары нуклеотидов.

Праймеры были произведены лабораторией «СинТол».

Наблюдение за ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью компьютерной программы «Opticon Monitor 3.1».

Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и высчитывали по следующей формуле:

Ioi= EoiAC(t)oi/EcADAC(t)GAD где: I0l - относительный уровень экспрессии гена препроорексина, выраженный в долях от уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегид-рогеназы.

Е - эффективность протекания реакции в конкретной пробе. C(t) - пороговый показатель циклов (количество циклов необходимое для достижения порогового значения флюоресценции). Эти параметры были рассчитаны встроенным программным обеспечением амплификатора.

Электрофорез в агарозном геле.

Контроль специфичности полученного после ПЦР продукта осуществляли при помощи электрофореза в агарозном геле. Для постановки электрофореза амплифици-рованных фрагментов готовили 2% агарозу на lxTAE буфере. В качестве электродного буфера использовали 1 хТАЕ буфер. Электрофоретическое разделение проводили в направлении от катода к аноду при напряженности электрического поля 10 В/см геля в течение 30-40 мин. По окончанию разделения гель фотографировали при помощи установки для документации результатов ПЦР-анализа (Gel Imager) с использованием трансиллюминатора с длиной волны 260-340 нм. Статистическая обработка данных

Для статистической обработки полученных результатов были использованы программы Statistica и SPSS 11.0, а также пакет программ Microsoft Office 2003. Сравнение групп экспериментальных животных проводили при помощи t-критерия Стью-дента. Для сравнения количества орексин-содержащих нейронов на срезах мозга использовали средние взвешенные величины, а также осуществляли ранжирование срезов по количеству клеток и строили кривые распределения для каждой экспериментальной группы животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Количество c-Fos-позитивных нейронов гипоталамуса после введения липопо-лисахарида.

Активацию гипоталамических структур оценивали по наличию белка c-Fos в нейронах. Количество c-Fos-позитивных клеток определяли в латеральной гипотала-мической области (LHA), где локализовано наибольшее количество орексин-содержащих нейронов, а также в структурах с высокой плотностью рецепторов к орексину и орексин-содержащих отростков: паравентрикулярном (PVH), переднем гипоталамическом (AHN), дорзомедиальном (DMH), вентромедиальном (VMH) ядрах

и заднем гипоталамическом поле (РН) (рис. 1).

У животных, которым внутривенно вводили антиген (ЛПС) в дозе 25 мкг/кг, происходило увеличение числа активированных нейронов во всех исследуемых структурах гипоталамуса. Инъекции большей дозы ЛПС приводили к увеличению активации нейронов AHN, PVH, LHA и РН; уровень активации в VMH и DMH не отличался от уровня активации этих структур у животных после введения физиологического раствора (рис. 2). Поскольку по абсолютному количеству c-Fos-позитивных клеток нельзя сравнить между собой различные гипоталамические структуры по степени активации, сравнение проводилось по относительному коэффициенту активации (ОКА). Высокий уровень активации нейронов после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг констатирован в AHN, PVH, LHA и РН. Введение 500 мкг/кг ЛПС приводит к более выраженному ответу только в AHN, PVH и LHA (рис. 3, 4). Таким образом, можно предположить, что степень активации клеток гипотоламических структур зависит от дозы вводимого препарата. Как известно, введение ЛПС инициирует развитие комплекса системных ответов организма (активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси, лихорадку, изменение пищевого поведения), в процесс регуляции которых вовлечены указанные гипоталамические структуры. Отличие в паттерне их активации при введении различных доз ЛПС, вероятно, может быть связано с разной интенсивностью иммунных процессов, развивающихся в ответ на введение антигена в разных дозах и возможно, определяющих различную степень и паттерн активации структур ЦНС.

Для выяснения морфо-функциональных особенностей нейронов участвующих в механизмах реализации реакций мозга на антиген проведено ранжирование c-Fos-позитивных клеток, локализованных в LHA согласно их размерам. При введении малой дозы ЛПС происходит в основном активация клеток меньших размеров (10-50 мкм2; класс 1, 2), соответствующих нейронам ассоциативного типа, аксоны которых проецируются на клетки, расположенные внутри данной структуры, в то время как при введении 500 мкг/кг ЛПС наблюдается активация и более крупных клеток (>50 мкм2; класс 3 и выше), в том числе, клеток релейного типа (70-150 мкм2), образующих проекции вне LHA (рис. 5), что обуславливает возможность передачи сигнала к другим структурам мозга, и формированию системного ответа, характерного для реакции на введение ЛПС.

Рисунок 1. Схемы гипоталамуса мозга крысы на 25, 28 и 30 уровнях. AHN— переднее ядро; РУН - паравентрикулярное ядро; LH А —латеральная гипотачаиическая область; DMH — дорзомедиачьное ядро; VMH — вентромедиачьное ядро;РН — заднее ядро (Swanson, 2004).

Рисунок 2. Количество с-Гох позитивных клеток в гипотачамаческих структурах мозга крыс после

введения МПС. По оси абсцисс — структуры гипоталамуса.

По оси ординат — количество с-¡^-позитивных клеток на ¡0000 мк.м2 среза мозга Группы животных: СИ — интактные посче введения: Ш —физиологического раствора 0 —25мкг кг липополисахарида Ш —500 мкг кг липополисахарида

* — Р<0,01; ** — Р' 0,05 по отношению к их количеству у животных после введения физиологического раствора;

* — Р<0,01; ** — Р<0,05 по отношению к их количеству у животных после введения 25 мкг/кг ЛПС;

* — Р<0,05 по отношению к их количеству у интактных животных.

Рисунок 5. Относительные коэффициенты активации гипоталамических структур мозга крыс после введения

ЛПС (25 мкг/кг).

По оси абсцисс — структуры гипоталамуса.

По оси ординат — относительный коэффициент активации гипоталамических структур по количеству с-1-т-позитив!1ЫХ клеток на ЮОООмкм2.

* - Р--0.01: ** — Р<0,05 по отношению к значению ОКА ШН и ПМН;

* — Р-" 0,05 — Р- 0,05 по отношению к значению ОКА РУН

Рисунок 4. Относительные коэффициенты активации гипотачамических структур мозга крыс поае введения

ЛПС (ЗООмкг кг).

По оси абсцисс — структуры гипоталамуса.

По оси ординат — относительный коэффициент активации гипоталамических структур по количеству с-Ром-позитипных меток на ЮОООмкм2.

* — Р<0,01 по отношению к значению ОКА ОМН, ШН, ША, РН;

" — Р<0,05 по отношению к значению ОКА ОМН, 1ЫН, РН

Рисунок 5. Распределение с-Роз позитивных клеток ША, ранжированных согласно их площади,

после введения ЛПС.

По оси абс1{исс — классы с-Роз позитивных клеток:

Класс 5 — 91-110 мкм' Класс 6— 111-НОмкм' Класс 7— 131-150 мкм~ Класс 8— 151-170 мкм2

Класс 1 — 10-30 мкм Класс 2 — 31-50 мкм Класс 3 — 51-70 мкм Класс 4 — 71-90 мкм

По оси ординат — % с-Роз-позитивных клеток определенного класса.

Животные после введения: С] — физиологического раствора ЕЭ — ЛПС (25 мкг/кг) Ш — ЛПС (500мкг/кг)

Орексин-позитивные нейроны гипоталамуса после введения ЛПС.

Количество орексин-позитивных нейронов определяли на срезах мозга с 24 по 34 уровень (рис. 6). Так как в литературе имеются данные об изменении количества мРНК препроорексина в орексин-содержащих нейронах гипоталамуса в течение суток (ТаЬеп 8. е1 а1, 2000), то предварительно было проведено определение распределения орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе интактных крыс в различное время дня (11, 13, 15 и 17 часов), но изменений количества орексин-позитивных нейронов мы не выявили. Для дальнейшего анализа были выбраны срезы 28, 29 и 30 уровней (по атласу БууапБоп'з), так как на этих уровнях локализовано наибольшее количество клеток, содержащих орексин.

Введение малой дозы ЛПС (25 мкг/кг) привело к изменению количества орексин-позитивных нейронов. Через 2 и 4 часа после введения ЛПС наблюдалось увеличение количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга 29 уровня, а через 6 часов

— снижение их числа на срезах мозга 28 уровня (рис. 7). После введения ЛПС в дозе 500 мкг/кг на срезах мозга 29 уровня через 2 часа наблюдалась только тенденция к увеличению количества орексин-позитивных нейронов, и лишь через 6 часов после введения данной дозы антигена было выявлено уменьшение их числа на всех анализируемых уровнях (рис. 7).

Выявленную закономерность подтвердило и сравнение усредненных кривых распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга у животных всех групп (рис 8, 9).

Через 2 и 4 часа после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг кривые распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга 29 уровня сдвигаются в сторону больших величин по сравнению с кривыми их распределения у животных после введения физиологического раствора, что обусловлено преобладанием срезов мозга с большим количеством орексин-позитивных нейронов у животных после введения данной дозы ЛПС (рис 8). После введения ЛПС в дозе 500 мкг/кг также выявлено смещение кривых распределения в сторону больших значений по сравнению с кривыми их распределения у животных после введения физиологического раствора, хотя при сравнивании этих групп животных по средним величинам была выявлена только слабая тенденция (Р=0,09) к увеличению количества орексин-позитивных нейронов.

Через шесть часов после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг кривые распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга только 28 уровня, а при введении ЛПС в дозе 500 мкг/кг - 28, 29 и 30 уровней, сдвигаются в сторону меньших величин по сравнению с кривыми их распределения после введения физиологического раствора, что определяется превалированием срезов мозга с меньшим количеством орексин-позитивных нейронов у животных данных экспериментальных групп (рис 9).

Изменения количества орексин-позитивных нейронов отражают различия в содержании орексина в этих клетках, достаточное или недостаточное для иммуногисто-химического выявления орексин-содержащих нейронов в гипоталамических структурах на срезах мозга. Изменения содержания орексина в нейронах могут быть обусловлены смещением баланса процессов его синтеза и потребления. Повышение содержания орексина в нейронах может быть следствием как возросшего синтеза этого нейропептида, так и снижением его утилизации. Соответственно уменьшение содержания орексина в нейронах может объясняться либо его сниженным синтезом, либо усилившимся потреблением. Определение уровня экспрессии гена препроорексина дает возможность достаточно определенно судить, какой из указанных механизмов лежит в основе выявленных изменений.

27 а Г " г> \ р

г ] к чУ \ Л •V. —Ж ••... С-«- > > ! Ч' : ♦ л . * • • . * » , ■ * • * *» / \

ж « л »V * • V ♦ *•** _ .. .л_____ ■ > 1 ^ 1 31 1 . . ••• /г ^ V „ / 32 • ** 1

к к: 0 I 34 V ;

Рисунок 6. Распределение орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе крыс Жмйг. Представлены схемы срезов 24-34 уровней мозга. (8ч>агаоп '¡.2004).

Точками указаны орексин-содержащие нейроны, цифры на схемах соответствуют уровням срезов.

количество орексин-позитивных нейронов.» _> СО СП СО К} СП со э о о о о о о

X Л

11 13 15 17 время суток

150

** **

к'*"

__ЯГ

15 17 ! время суток

15 17 I

время суток.

150 -120 -

ш о

8. 90 -

а)

Х 60 -30 -о -

13 15 17

время суток;

15 17

время суток I

Рисунок 7. Динамика изменения количества орексин-позитивных нейронов в гипоталамических структурах на срезах мозга через 2, 4 и б часов после введения ЛПС. Введение физиологического раствора и ЛПС проводили в 11.00. __ — — после введения физиологического раствора

.........— после введения ЛПС (25 мкг/кг).

_— после введения ЛПС (500 мкг/кг)

Уровни мозга: А. В — 28; С, О — 29; £,/="— 30. * — Р<0,01; ** — Р<0,05;" — Р=0,09

\ ММ! ;

/ !..........

' Я' V4

П 'X 271 2'Л т

Е И

Рисунок 8. Усредненные кривые распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах

мозга после введения ЛПС. Уровни срезов мозга: А. В — 28й; С. О — 29й; Е, Е— ЗОй. Время после введения: А, С, Е — через 2 часа: В, Д Р— через 4 часа. По оси абсцисс — количество орексин-позитивных нейронов в срезе По оси ординат — % срезов с определенным количеством орексин-позитивных нейронов

Животные после введения: ......— физиологического раствора

--25 мкг/кг ЛПС

--500 мкг/кг ЛПС

Рисунок 9. Усредненные кривые распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах

мозга через 6 часов после введения липополисахарида. Уровни срезов мозга: А — 28й; В — 29й; С — ЗОй. По оси абсцисс — количество орексин-позитивных нейронов в срезе По оси ординат — % срезов с определенным количеством орексин-позитивных нейронов

Животные после введения: ...... — физиологического раствора

- — 25 мкг/кг липополисахарида

— — 500 мкг/кг липополисахарида

Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс после введения ЛПС.

Для того чтобы определить причину изменения содержания орексина в нейронах, выявляемых иммуногистохимическим методом в гипоталамических структурах на срезах мозга, исследовали динамику изменения уровня экспрессии гена препроорексина, которую определяли методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. Специфичность полученных продуктов была подтверждена данными электрофореза, а также кривыми его плавления.

Показано, что через 2 часа после введения ЛПС в дозах как 25 мкг/кг, так и 500 мкг/кг веса животного, в клетках гипоталамуса происходит увеличение экспрессии гена препроорексина, что отражает увеличение количества его мРНК и может быть косвенным свидетельством возрастания синтеза орексина в нейронах (рис. 10). Через 4 и 6 часов изменений выявлено не было.

Сопоставляя результаты иммуногистохимического анализа с данными ПЦР, можно заключить, что реакции орексинэргических нейронов в ответ на введение ЛПС направлены на повышение уровня синтеза и потребления орексина в нейронах, причем соотношение интенсивности этих процессов может зависеть от дозы вводимого антигена. Заключение.

Таким образом, комплекс полученных результатов свидетельствует в пользу участия орексинэргических нейронов гипоталамуса в механизмах реализации реакций мозга на антигенный стимул. Выявлены конкретные структуры, активирующиеся при введении ЛПС, определен характер и степень участия орексин-содержащих нейронов в реакциях ЦНС на введение антигена, показаны различия паттернов их активации при введении различных доз ЛПС, а также проведен сравнительный анализ изменения экспрессии гена препроорексина и содержания орексина в клетках гипоталамуса, что важно для расшифровки механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем в индуцибельную фазу иммунного ответа.

Рисунок 10. Экспрессия гена препроорексина через 2 часа после введения липополисахарида.

После введения:

СИ —физиологического раствора

0 —25 мкг/кг липополисахарида

^ —500 мкг/кг липополисахарида

* — Р<0,01; ** — Р<0.05 по отношению к уровню экспрессии гена препроорексина у животных после введения физиологического раствора

ВЫВОДЫ

1. Внутривенное введение липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг приводит к увеличению количества c-Fos-позитивных клеток во всех исследованных структурах гипоталамуса (AHN, PVH, DMH, VMH, LHA, PH) через 2 часа после инъекции, что свидетельствует об их активации.

2. Введение ЛПС в дозе 500 мкг/кг веса животного инициирует более выраженную активацию гипоталамических структур — AHN, PVH и LHA (ОКА=4,98±0,53, 4,03±0,33, 2,66±0,33 соответственно), а введение ЛПС в дозе 25 мкг/кг веса животного — AHN, PVH, LHA и PH (ОКА=4,23±1,05, 3,87±0,46, 4,85±0,54, 4,21±1,03 соответственно).

3. Количество выявленных орексин-позитивных нейронов в гипоталамических структурах, локализованных на срезах мозга 29 уровня возрастает через 2 и 4 часа после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг (141,07±8,31 и 143,71±6,36 клеток соответственно), что свидетельствует об увеличении содержания орексина в этих нейронах.

4. Снижение количества орексин-позитивных нейронов в гипоталамических структурах, представленных на срезах мозга, соответствующих 28 уровню, происходит через 6 часов после введения 25 мкг/кг ЛПС (108,39±7,00 клеток), а после введения ЛПС в дозе 500 мкг/кг — в гипоталамических структурах, выявляемых на срезах мозга, соответствующих 28, 29 и 30 уровням (99,40±6,05, 110,79±6,73 и 62,12±6,18 клеток соответственно), что говорит об уменьшении содержания в них орексина.

5. Изменение степени активации гипоталамических структур после введения различных доз ЛПС сочетается с изменением содержания орексина в нейронах.

6. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса возрастает через 2 часа после инъекции ЛПС в обеих дозах (25 мкг/кг и 500 мкг/кг: 1ох=0,311±0,091 и 0,416±0,102 соответственно).

7. Изменения интенсивности экспрессии гена препроорексина в нейронах гипоталамуса после введения ЛПС в различных дозах соответствует изменениям количества нейронов гипоталамических структур, выявляемых на срезах мозга 28, 29 и 30 уровней, зависящего от содержания орексина в клетке.

8. Орексинэргические нейроны вовлекаются в процесс реализации реакций мозга на введение антигена (ЛПС), а паттерн их реакций зависит от его дозы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Гаврилов Ю.В., Перекрест С.В., Новикова Н.С. LPS-индуцированная экспрессия c-Fos белка в структурах гипоталамуса при электроболевом раздражении // Медицинская иммунология. — 2006. — Т. 8, №2-3. — С. 128.

2. Гаврилов Ю.В., Перекрест С.В., Новикова Н.С., Корнева Е.А. Стрессиндуцированные изменения реакций клеток гипоталамических структур на введение антигена (липополиса-харида) (по экспрессии c-Fos белка) // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова — Т.92, № 11. — 2006. — С.1296-1304.

3. Перекрест С.В., Гаврилов Ю.В., Абрамова Т.В., Новикова Н.С., Корнева ЕА. Активация клеток гипоталамических структур при введении антигенов различной природы (по экспрессии c-fos гена) // Медицинская иммунология. — 2006. — Т.В, №5-6. — С.631-636.

4. Перекрест С.В., Гаврилов Ю.В., Новикова Н.С., Корнева Е.А. Экспрессия белка c-Fos в клетках гипоталамических структур при введении антигенов различной природы // Медицинская иммунология. — 2006. — Т. 8, №2-3. — С. 166-167.

5. Gavrilov Y., Perekrest S., Novikova N. Antigen-induced expression of c-Fos-like protein in the cells of hypothalamic structures after electrical painful stimulation. // Abstracts of International Symposium Interaction of the nervous and immune systems in health and disease. 31 May -2 June, 2007 in Saint-Petersburg, — C. 26.

6. Novikova N.S., Abramova T.V., Perekrest S.V., Rogers V. Comparative analysis of the activation pattern of hypothalamic structures resulting from stress-induced changes of the nervous and immune systems // Abstracts of International Symposium Interaction of the nervous and immune systems in health and disease. 31 May -2 June, 2007 in Saint-Petersburg, — C.59.

7. Perekrest S.V., Novikova N.S., Abramova T.V., Loskutov U.V., Rogers V., Korneva E.A. Reaction of orexin-containing neurons to LPS injection // Abstracts of International Symposium Interaction of the nervous and immune systems in health and disease. 31 May -2 June, 2007 in Saint-Petersburg. — C.67.

8. Абрамова T.B., Перекрест C.B., Новикова H.C., Лоскутов Ю.В., Роджерс В., Корнева Е.А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крысы при введении липополисахарида (ЛПС), сочетанном с электромагнитным облучением кожи волнами крайне высокой частоты (КВЧ) // Российский иммунологический журнал. — 2008. — Т. 2 (11), №2-3. — С.152.

9. Перекрест С.В. Влияние введения различных доз липополисахарида на активацию орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крысы. // Аллергология и иммунология. — 2008. — Т. 9, №3. — С.270.

10. Перекрест С.В., Новикова Н.С., Абрамова Т.В., Лоскутов Ю.В., Роджерс В Дж., Корнева Е.А. Паттерн активации структур гипоталамуса при введении липополисахарида в низких и высоких дозах // Российский иммунологический журнал. — 2008. — Т.2(11), №2-3. — С.156.

11. Gavrilov Y.V., Perekrest S.V., Novikova N.S. Intracellular expression of c-Fos protein in various structures of the hypothalamus in electrical pain stimulation and administration of antigens //Neurosci Behav Physiol. — 2008. — Vol.38, №1. — P.87-92.

12. Perekrest S.V., Abramova T.V., Novikova N.S., Loskutov Yu.V., Rogers V.J., Komeva E.A. Changes in immunoreactivity of Orexin-A-Positive Neurons after an Intravenous Lipopolysac-charide injection//Medical Science Monitoring. — 2008. — V. 14, №7, BR127-133.

Сдано в набор 20.05.2009. Подписано в печать 20.05.2009. усл. печат. листов 1.0 Уст. тираж 100 экз. Заказ 15-5/АРООЗ.

Издано в Центре стратегического анализа общественных процессов 193036, СПб, Литовский пр. дом 29.

Оглавление диссертации Перекрест, София Владимировна :: 2009 :: Санкт-Петербург

Перечень условных обозначений.

Введение.

Обзор литературы.

Взаимодействие нервной и иммунной систем.

Изучение влияния нейроэндокринной системы на функции иммунной системы.

Изучение влияния медиаторов иммунной системы на активацию клеток струкур ЦНС.

Орексин и орексин-содержащие нейроны.

Структура орексинов А и В.

Характеристика орексин-содержащих нейронов.

Рецепторы к орексинам.

Участие орексин-содержащих нейронов в регуляции вегетативных функций.

Пищевое поведение.

Цикл сон/бодрствование.

Влияние орексина на гемодинамику и водно-солевой обмен.

Участие орексина в эндокринной регуляции.

Орексины и стресс.

Эффекты липополисахарида.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Перекрест, София Владимировна, автореферат

Актуальность проблемы

Одним из перспективных научных направлений, интенсивно развивающихся в мире, является иммунофизиология, рассматривающая процессы взаимодействия нервной и иммунной системы. Особое внимание уделяется роли гипоталамуса в нейроиммунных взаимодействиях, что обуславливается его функциональными особенностями. Как известно, гипоталамус представляет собой центр регуляции многих вегетативных функций, таких как терморегуляция, водно-солевой обмен, пищевое поведение, цикл сон/бодрствование, функции иммунной системы. К настоящему времени открыто и изучено большое количество гипоталамических нейропептидов, принимающих участие в регуляции вегетативных функций организма. Одними из этих нейропептидов являются орексины.

Орексины А и В — нейропептиды, открытые в 1998 году, синтез которых осуществляется небольшой популяцией гипоталамических нейронов от общего пептида-предшественника препроорексина. Орексин-содержащие нейроны участвуют в регуляции различных физиологических процессов (поддержания энергетического баланса, регуляции состояния сна и бодрствования, пищевого поведения, ответных реакций на стресс и восприятие боли) (Beukmann С. et al, 2002; España R.A. et al, 2001; Ida T. et al, 1999; Dube M.G. et al, 1999; Ida T. et al., 2000; S. Watanabe et al, 2005; Swanson L.W. et al, 2005).

Основное количество орексин-содержащих нейронов мозга локализовано в перифорникальной зоне латеральной гипоталамической области (Реугоп С., 1998). Аксоны этих нейронов достигают различных отделов головного и спинного мозга. Высокая плотность распределения отростков орексин-содержащих нейронов выявлена в гипоталамических структурах (Реугоп С., 1998), вовлеченных в регуляцию функций иммунного ответа (переднее гипоталамическое ядро, заднее гипоталамическое поле, латеральная гипоталамическая область и вентро-медиальное гипоталамическое ядро) (Корнева Е.А., Хай JI.M., 1963; Лесников В.А., 1993; Shanin SN et al, 2005; Wenner M. et al, 2000). В этих же структурах локализованы нейроны, имеющие рецепторы к орексину (Hervieu G.J. et al, 2001; Trevedi P., 1998; Taheri S. et al, 1999). Рецепторы к орексину или их мРНК обнаружены и на клетках различных тканей, участвующих в реализации иммунного ответа (клетки селезенки, надпочечников, печени, стволовые клетки фенотипа CD34+) (Randeva H.S. et al, 2001; Zhang S. et al, 2005; Steidl U., 2004).

Установленные к настоящему времени многочисленные факты могут свидетельствовать в пользу возможного участия системы орексин-содержащих нейронов и самого орексина в регуляции функций иммунной системы. Наличие нейро-иммунных взаимодействий не вызывает сомнений, однако механизмы их до сих пор остаются не до конца раскрытыми и нуждаются в дальнейших исследованиях. Известно, что нейроны LHA участвуют в регуляции функций иммунной системы, например, электростимуляция этой области гипоталамуса, где и локализованы орексин-содержащие нейроны, усиливает цитотоксическую активность NK клеток селезенки (Wrona D., 2003; Wenner М. et al, 2000). Нейроны латеральной гипоталамической области также связаны полисинаптически с нейронами, иннервирующими селезенку (Cano G., 2001; Denes А., 2001) и красный костный мозг (Denes A. et al, 2005). Необходимо подчеркнуть, что переднее гипоталамическое ядро, заднее гипоталамическое поле и латеральная гипоталамическая область активируются в первые часы после введения антигенов различной природы, таких как липополисахарид (ЛПС) (Elmquist J.K. et al, 1996; Gaykema R.P.H. et al, 1999; Yi-Hong et al, 2000), столбнячный анатоксин (Корнева EA и др., 2001), стафилококковый энтеротоксин В (Gaykema R.P.H. et al, 1998; Goehler L.E. et al, 2001).

Хотя перечисленные факты свидетельствуют в пользу возможного участия орексин-содержащих нейронов и самого орексина в механизмах реализации взаимодействия нервной и иммунной систем, однако прямых доказательств в современной литературе пока не существует. Изучение паттерна активации гипоталамических структур, а также исследование динамики распределения орексин-содежащих нейронов гипоталамуса в первые часы после антигенного воздействия представляется важным этапом для расшифровки этих механизмов на ранней стадии формирования иммунного ответа. Определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса позволяет проанализировать молекулярные механизмы формирования ответа орексин-содержащих нейронов, вовлекающихся в реакции ЦНС на антигенный стимул.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явилось изучение реакций орексинэрги-ческих нейронов гипоталамуса крыс на введение антигена липополисаха-рида в различных дозах.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать степень активации клеток и структур гипоталамуса (по выявлению с-Боз белка) через 2 часа после внутривенного введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.

3. Исследовать уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамических структур крыс через 2, 4 и 6 часов после внутривенного введения липополисахарида в дозе 25 и 500 мкг/кг веса животного.

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

1. Внутривенного введение антигена липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного приводит к активации гипоталамических структур (АНИ, РУН, УМН, БМН, ЬНА, РН), паттерн которой различен, что проявляется индукцией синтеза с-Боз белка в клетках этих структур.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, из них отечественных — 13 и214 — зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.

Заключение диссертационного исследования на тему "Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс Wistar после введения липополисахарида"

ВЫВОДЫ

3. Количество выявленных орексин-позитивных нейронов в гипоталамических структурах, локализованных на срезах мозга 29 уровня возрастает через 2 и 4 часа после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг (141,07±8,31 и 143,71 ±6,36 клеток соответственно), что свидетельствует об увеличении содержания орексина в этих нейронах.

6. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса возрастает через 2 часа после инъекции ЛПС в обеих дозах (25 мкг/кг и 500 мкг/кг: 1Ох=0,311±0,091 и 0,416±0,102 соответственно).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Перекрест, София Владимировна

1. Броун Г.Р., Могутов С.С., Кан Г.С. Роль некоторых структур гипоталамуса в регуляции иммунобиологических процессов при иммунизации организма вакциной БЦЖ. // Бюл. эксперим. Биол. и мед. 1970. - Т. 70, №7. с. 74-78.

2. Корнева Е.А. Основные этапы становления Иммунофизиологии.// Ней-роиммунология, 2005. - ТЗ, №1, С4-10.

3. Корнева Е.А., Казакова Т.Б., Носов М.А. Экспрессия c-fos мРНК и с-Fos-подобных белков в клетках гипоталамических структур при введении антигена. // Аллергология и иммунология 2001. - №1. - С. 37-44.

4. Корнева Е.А, Клименко В.М., Шхинек Э.К. Нейрогормональное обеспечение иммунного гомеостаза. Л.:«Наука», 1978. - 248с.

5. Корнева Е.А., Хай Л.М. Влияние разрушения участков гипоталамиче-ской области на процесс иммуногенеза. // Физиол. ж. 1963. - Т.49, №1. - С.42-48.

6. Лесников В.А. Нейрогуморальные механизмы регуляции функций красного костного мозга, как источника стволовых гемопоэтических клеток. Иммунофизиология / под ред. Корнева Е.А., СПб. Наука. - 1993. -С.294-315

7. Лесников В.А., Аджиева С.Б., Исаева E.H. Гипоталамическая модуляция гемопоэтической функции костного мозга // Сб. I Всесоюз. Иммунол. Съезда. Тез.-Т. 1. -М.,1989, С. 331.

8. Лондон Е.С. О влиянии удаления различных частей мозга на иммунитет сибирской язвы // Арх. Биол. Наук. 1899. - Т. 7. - С. 177-187.

9. Петровский И.П. Вопросы нервной регуляции реакций иммунитета // Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1961. -Т.32, №7. - С.103-108.

10. Савченко И.Г. К вопросу о невосприимчивости к сибирской язве // Врач. -1891, №5.-С. 132-134.

11. Флоров Е.П. Нейрогуморальные механизмы регуляции иммунологических процессов. М., 1974. - 264с.

12. Цыпин А.Б., Мальцев B.JI. Влияние раздражения гипоталамуса на содержание нормальных антител в сыворотке крови // Патол. Физиол. И эксперим. Терапия. 1967. - №5. - С.83-84.

13. Шаинидзе К.З., Новикова Н.С., Корнева Е.А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности у крыс. // Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 11 Медицина. 2008. - Вып.З. - С.140-148.

14. Alam M.N., Gong H., Alam Т., Jaganath R., McGinty D., Szymusiak R. Sleep-waking discharge patterns of neurons recorded in the rat perifornical lateral hypothalamic area // J. Physiol. 2002. - Vol.538. - P.619-631.

15. Ammoun S., Holmqvist Т., Shariatmadari R., Oonk H.B. Detheux M., Parmentier M., Akerman K.E.O., Kukkonen J.P.Distinct recognition of OX1 and OX2 receptors by orexin peptides // J Pharmacol Exp Ther. 2003. -№305. - P.507-514.

16. Anderson J., Nagy S., Bjork L., Abrams J., Holin S., Anderson U. Bacterial toxin-inducedcytokine production studied at the single-cell level // Immunol Rev. 1992.-Vol.127.-P.69-76.

17. Antunes V.R., Brailoiu G.C., Kwok E.H., Scruggs P., and. Dun N.J.Orexins/hypocretins excite rat sympathetic preganglionic neurons in vivo and in vitro // Am. J. Physiol. Regul. Integr. ComP.Physiol. 2001. - Vol. 281, P.R1801-R1807.

18. Baatout S. Interleukin-6 and megakaryocytopoiesis and update // Ann Hematol. 1996. - Vol.73. - P. 157-162.

19. Bateman A., Singh A., Krai Т., Solomon S. The immunehypothalamic-pituitary-adrenal axis // Endocr Rev. 1989. - Vol. 10. - P.92-111.

20. Bazil V., Horejsi V., Bandys M., Kristofova H., Strominger J.L., Kostka W., Hilgert I. Biochemical characterization of a soluble form of the 53-kDamonocyte surface antigen // Eur J Immunol. 1986. - Vol.16. - P. 15831589.

21. Becskei C., Riediger H., Hernadfalvy D., Arsenijevic, Lutz T.A., Langhans W. Inhibitory effects of lipopolysaccharide on hypothalamic nuclei implicated in the control of food intake.// Brain. Behav. Immun. 2008. -Vol. 22, № 1. - P.56-64.

22. Berczi I., Nagy E. Effects of hypophysectomy on immune function // Psychoneuroimmunology. Ed. 2. / Eds. Ader, D. Felten, N. Cohen. New-York: Acad, press inc. - 1991. - P.339-375.

23. Bernardis L.L., Bellinger L.L. The lateral hypothalamic area revisited: ingestive behavior // Neurosci Biobehav Rev. 1996. - Vol.20, №2. -P. 189-287.

24. Besedovsky H.O. Sorkin E., Felix D., Haas H. Hypothalamic changes during the immune response // Eur. J. immunol. 1977. - Vol.7. - P.323-325.

25. Beuckmann C.T., Yanagisawa M. Orexin: from neuropeptides to energy homeostasis and sleep/wake regulation // J. Mol. Med. 2004. - Vol.80 -P.329-342.

26. Beuckmann C.T., Yanagisawa M.Orexins: from neuropeptides to energy homeostasis and sleep/ wake regulation // J. Mol. Med. 2002. - №80. -P.329-342.

27. Beutler B. TLR4: Central component of the sole mammalian LPS sensor // Curr. Opin. Immunol. 2000. - №12. - P.20-26.

28. Blanco M., Lopez M., Garcia-Caballero T., Gallego R., Vazquez-Boquete A. Morel G., Senaris R., Casanueva F., Dieguez C., Beiras A. Cellularlocalization of orexin receptots in human pituitary // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. - №86. - P. 1616-1619.

29. Bluthe R.M., Walter P., Parnet C.R., Laye S., Lestage J., Verrier D., Poole S., Stenning B.E., Kelley K.W., Dantzer R. Lipopolysaccharide induces sickness behavior in rats by a vagal mediated mechanism. // Acad. Sci. III. 1994. -Vol.317.-P.499-503.

30. Bourgin P.Huitron-Resendiz S., Spier A. Fabre V., Morte B., Criado J.R., Sutcliffe J.G, Henriksen S.J., de Lecea L. Hypocretin- 1 modulates rapid eye movement sleep through activation of locus coereleus neurons // J. Neurosci. 2000. - №20. P.7760-7765.

31. Brown, R.E., Sergeeva O., Eriksson K.S., Haas H.L. Orexin A excites serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus of the rat // Neuropharmacology. 2001 -Vol. 40. - P.457^159.

32. Cadenas S., Cadenas A.M. Fighting the stranger-antioxidant protection against endotoxin toxicity // Toxicology. 2002. - №180. - P.45-63.

33. Cai X.J., Widdowson P.S, Harrold J., Wilson S., Buckingham R.E., Arch J.R., Tadayyon M., Clapham J.C., Wilding J., and Williams G. Hypothalamic orexin expression: modulation by blood glucose and feeding // Diabetes -1999. Vol.48. - P.2132-2137.

34. Cake M.N., Litwak G. The glucocorticoid receptops // Biochemical actions of hormones. / Ed.G. Litwak. New-York: Acad. Press, 1975. - Vol.3. -P.317-390.

35. Campbell R.E., Smith M.S., Summer E.A., Bernadette E.G., Jarlath M.H. Mullen F.F., Grove K.L. Orexin Neurons Express a Functional Pancreatic Polypeptide Y4 Receptor // J. Neurosci. 2003. - Vol.23. - P. 1487.

36. Cano G., Sved A.F., Rina-man L. Characterization of the central nervous system innervation of the rat spleen using viral transneuronal tracing. // J. of comP.neurol. -2001. Vol. 439. - P. 1-18.

37. Chang S.L., Ren T., Zadina J.E. Interleukin-1 activation of FOS proto-oncogene protein in the rat hypothalamus // Brain Res. 1993. - Vol.617. -P.123-130.

38. Chang Y., Albright S., Lee F. Cytokines in the central nervous system: expression of macrophage colony stimulating factor and its receptor during development // J. neuroimmunol. 1994. - Vol.52. - P.9-17.

39. Chemelli R.M., Willie J.T., Sinton C.M. Narcolepsy in orexin knockout mice: moleculat genetics of sleep regulation // Cell. 1999. - №98. - P.437-451.

40. Chen C.T., Dun S.L., Kwok E.H., Dun N.J., Chang J.K. Orexin A-like immunoreactivity in the rat brain // Neurosci. Lett. 1999 - Vol. 260. -P.161-164.

41. Chen, CT, Hwang LL, Chang JK, and Dun NJ. Pressor effects of orexins injected intracisternally and to rostral ventrolateral medulla of anesthetized rats // Am J. Physiol. Regul. Integr. ComP.Physiol. 2000. - Vol. 278. -P.R692-R697.

42. Chuluyan H.E., Saphier D., Rohn W.M., Dunn A.J. Noradrenergic innervation of the hypothalamus participates in adrenocortical responses to interleukin-1 // Neuroendocrinol. 1992. - Vol.56. - P. 106-111.

43. Cunningham J.R., Wada E., Carter D.B. In situ histochemical localization of type I interleukin-1 receptor messenger RNA in the central nervous system, pituitary, and adrenal gland of tye mouse // J. neurosci. 1992. - Vol.12. -P.l 101-1114.

44. Darker J.G., Porter R.A., Eggleston D.S., Smart D., Brough S.J., Sabido-David C., and Jerman J.C. Structure-activity analysis of truncated orexin-A analogues at the orexin-1 receptor // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. -Vol.11.-P.737-740.

45. Date Y., Mondal M.S., Matsukura S., Ueta Y., Yamashita H., Kaiya H., Kangawa K., and Nakazato M. Distribution of orexin/hypocretin in the rat median eminence and pituitary // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 2000. -Vol.76.-P. 1-6.

46. Day H.E., Akil H. Differential pattern of c-fos mRNA in rat brain following central and systemic administration of interleukin-l-beta: implications for mechanism of action // Neuroendocrinology. 1996. - Vol.63, №3. - P.207-218.

47. De Lecea L., Sutcliffe J.G. The hypocretins/orexins: Novel hypothalamic neuropeptides involved in different physiological systems // Cell Mol. Life Sci. 1999. Vol. 56. - P.473^180.

48. Denes A. Boldogkoi Z., Uhereczy G. Characterization of the central nervous system innervations of the rat spleen using viral transneuronal tracing // J. Comp Neurol. 2001. - Vol. 439. - P. 1-18.

49. Denes A., Boldogkoi Z., Uhereczky G. Central automatic control of the bone marrow: multisynaptic tract trasing by recombinant pseudorabies virus // Neurosci. 2005. - Vol. 134, №3 - P.947-963.

50. Dube M.G., Kalra S.P., Kalra P.S. Food intake elicited by central administration of orexins/hypocretins: identification of hypothalamic sites of action // Brain Research. 1999. - Vol. 842. - P.473-477.

51. Ek M., Kurosawa M., Lundeberg T., Ericsson A. Activation of vagal afferents after intravenous injection of interleukin-lp: role of endogenous prostaglandins // J. neurosci. 1998. - Vol.18. - P.9471-9479.

52. Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P.The sympathetic nerve-an intergrative interface between two supersystems: the brainand the immune system // Pharmacol. Rev. 2000. - Vol. 52, №4. - P.595-638.

53. Elias C.F., Aschkenasi C., Lee C., Kelly J., Ahima R.S., Bjorbaek C., Flier J.S., Saper C.B., Elmquist J.K. Leptin differentially regulates NPY and POMC neurons projecting to the lateral hypothalamic area // Neuron. 1999. - Vol.23, №4. - P.775-786.

54. Elmquist J.K., Ackermann M.R., Register K.B., Rimler R.B., Ross L.R., Jacobson C.D. Induction of Fos-like immunoreactivity in the rat brain following Pasteurella multocida endotoxin administration // Endocrinology. -1993.-Vol.133.-P.3054-3057.

55. Elmquist J.K., Elias C.F., Saper C.B. From lesions to leptin: hypothalamic control of food intake and body weight // Neuron. 1999. - Vol.22, №2. -P.221-232.

56. Elmquist J.K., Saper C.B. Activation of neurons projecting to the paraventricular hypothalamic nucleus by intravenous lipopolysaccharide // J. of comP.neurol. 1996. - Vol.374, №3. P.315-331.

57. Elmquist J.K., Scammell T.E., Jacobson C.D., Saper C.B. Distrubution of Fos-like immunoreactivity in the rat brain following intravenous lipopolysaccharide administration // J. of ComP.Neurol. 1996. - Vol. 371, №1. - P.85-103.

58. Ericsson A., Kovacs K.J., Sawchenko P.E. A functional anatomical analysis of central pathways subserving the effects of interleukin- 1 on stress-related neuroendocrine neurons // J Neurosci 1994 - Vol.14. - P.897-913.

59. Espana R.A., Baldo B.A., Kelley A.E, Berridge C.W. Wake-promoting and sleep-supressing actions of hypocretin (orexin): basal forebrain sites of action // Neuroscience 2001. - Vol. 106(4). - P.699-715.

60. Estabrooke I.V., McCarthy M.T., Ko E., Chou T.C., Chemelli R.M., Yanagisawa M., Saper C.B., and Scammell T.E. Fos expression in orexin neurons varies with behavioral state // J. Neurosci. 2001. - Vol.21. -P.1656-1662.

61. Fabry Z., Rain C.S., Hart M.N. Nervous tissue as an immune compartment: the dialect of the immune response in the CNS // Immunol. Today. 1994. -Vol.15.-P.218-224.

62. Felten S.Y. and Olschowka J.J. Noradrenergic sympathetic innervation of the spleen: II. Tyrosine hydroxylase (TH)-positive nerve terminals form synaptic-like contacts on lymphocytes in the splenic white pulp // Neurosci. Res. 1987.-Vol.18-P.37-48.

63. Ferguson A.V., Samson W.K. The orexin/hypocretin system: A critical regulator of neuroendocrine and autonomic function // Frontiers in Neuroendocrinology. 2002. - Vol.24. - P. 141-150.

64. Fleshner M., Goehler L.E., Hermann J., Relton J.K., Maier S.F., Watkins L.R. Interleukin-1 beta induced corticosterone elevation and hypothalamic NE depletion is vagally mediated // Brain Res Bull. 1995. - Vol.37, №6. -P.605-610.

65. Fleshner M., Slibert L., Deaket T. TNF-alpha-induced corti costerone elevation but not serum protein or corticosteroid bind ng globulin reduction is vagally mediated // Brain res. bull. 1997. - Vol.44. - P.701-706.

66. Florin-Lechner S.M., Druhan J.P., Aston-Jones G., and Valentino R.J. Enhanced norepinephrine release in prefrontal cortex with burst stimulation of the locus coeruleus // Brain Res. 1996. - Vol.742, №1-2. - P.89-97.

67. Gadient R.A. and Otten U. Differential expression of interleukin-6(IL-6) and interleukin-6 receptor (IL-6R) mRNAs in rat hypothalamus // Neurosci. lett. 1993 V.153. - P.13-16.

68. Gaykema R.P., Balachandran M.K., Godbout J.P., Johnson R.W., Goehler L.E. Enhanced neuronal activation in central autonomic network nuclei in aged mice following acute peripheral immune challenge // Auton Neurosci. -2007. Vol.131, №1-2. - P.137-142.

69. Gaykema R.P.A., Goehler L.E., Bol F.J.H., McGorry M.M., Maier S.F., Watkins L.R. Bacterial endotoxin induces Fos immunoreactivity in primary afferent neurons of the vagus nerve // Neuroimmunomodulation 1998. -Vol.5.-P.234-240.

70. Gaykema RPA Goehler LE, Armstrong CB, Khorsand J, Maier SF, Watkins LR. Differential FOS expression rat brain induced by lipopolisaccharide and staphylococcal enterotoxin B // Neuroimmunomodulation 1999. - Vol. 6 -P.220.

71. Goehler L.E. Gaykema P.R.A., Hansen K. Staphylococcal enterotoxin B induces fever, brain c-Fos expression, and serum corticosterone in rats // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative ComP.Physiol. 2001. - Vol.280. -P.R1434-R439.

72. Goehler L.E. Gaykema R.P.A., Khorsand J., Kleiner J. Staphylococcal enterotoxin B induces c-Fos immunoreactivity in rat nervous system // Soc. neurosci. abstr. 1998b. - Vol.24. - P. 1611.

73. Goehler L.E. Gaykema R.P.H, Maier S.E., Watkins L.R. Vagal afferents innervate deep cervical and iliac lymph nodes in the rat // Soc. neurosci. abstr. 2000. - Vol.26. - P. 1184.

74. Goehler L.E., Gaykema P.R.A., Hammach S.E., Maier, Watkins L.R. Interleukin-1 induces c-Fos immunoreactivity inprimary afferent neurons of the vagus nerve // Soc. neurosci. abstr. 1998. - Vol.804. - P.306-310.

75. Griffond B., Risold P.Y., Jacquemard C., Colard C. and Fellmann D. Insulin-induced hypoglycemia increases preprohypocretin (orexin) mRNA in the rat lateral hypothalamic area // Neurosci. Lett. 1999. - Vol.262. - P.77-80.

76. Hakansson M., de Lecea L., Sutcliffe J.G., Yanagisawa M., and Meister B. Leptin receptor- and STAT3-immunoreactivities in hypocretin/orexin neurones of the lateral hypothalamus // J. Neuroendocrinol. 1999. - Vol.11. -P.653-663.

77. Hasum E. K.J. Chang, P.Cuatrecasas. Specific nonopiat receptors for beta endorphins. -//Nature. 1979. - Vol.205. - P.1033-1035.

78. Haynes A.C., Jackson B., Overend P., Buckingham R.E., Wilson S., Tadayyon M., and Arch J.R. Effects of single and chronic intracerebroventricular administration of the orexins on feeding in the rat // Peptides. 1999 - Vol.20. - P. 1099-1105.

79. Helderman J.H. and Strom T. Strannegard O.J. Specific insulin binding site on T and B lymphocytes as a marker of cell activation // Nature. 1978. -Vol.274.-P.62-63.

80. Hellstrand K., Hermodsson S. Evidence for a beta-adrenoreceptor-mediated regulation of human natural killer cells // Immunol. 1985. - Vol. 134. -P.4095-4099.

81. Hermann G.E., Emch G.S., Tovar C.A., Rogers R.C. C-Fos generation in the dorsal vagal complex after systematic endotoxin is not dependent on the vagus nerve // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative ComP.Physiol. -2001.-. Vol.280. -P.R289-R299.

82. Hervieu G.J., Cludery J.E., Harrison D.C., Roberts J.C., Leslie R.A. Gene expression and protein distribution of the orexin-1 receptor in the rat brain and spinal cord // Nueroscience. 2001. - Vol. 103. - P.'777-797.

83. Hopkins SJ, Rothwell NJ. Cytokines and the nervous system I: expression and regulation // Trends Neurosci. 1995. - Vol. 18. - P.83-88.

84. Horvath T.L., Peyron C., Diano S, Ivanov A, Aston-Jones G, Kilduff TS, and van Den Pol AN. Hypocretin (orexin) activation and synaptic innervation of the locus coeruleus noradrenergic system // J. ComP.Neurol. 1999. -Vol.415.-P.145-159.

85. Ida T., Nakahara K., Murakami T., Hanada R., Nakazato M., Murakami N. Possible involvement of orexin in the stress reaction in rats // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000. - Vol. 270. - P.318-323.

86. Jaszberenyi M., Bujdoso E., Pataki I., and Telegdy G. Effects of orexins on the hypothalamic-pituitary-adrenal system // J. Neuroendocrinol 2000 -Vol.12.-P.l 174-1178.

87. Kapcala L.P. He J.R,. Gao Y Subdiaphragmatic vagotomy inhibits intraabdominal in terleukin-lb stimulation of adrenocorticotropin secretion // Brain res. 1996. - Vol.728. - P.247-254.

88. Kastin A.J., Akerstrom V. Orexin A but not orexin B rapidly enters brain from blood bysimple diffusion // J. Pharmacol ExP.Ther. 1999. - Vol. 289. -P.219-223.

89. Kazakova T.B., Barabanova S.V., Novikova N.S., Nosov M.A., Rogers V., Korneva E.A. Induction of c-fos and interleukin-2 genes expression in thecentral nervous system following stressor stimuli // Pathophysiology. 2000. -Vol.7, №1.-P.53-61.

90. Kim H.Y., Hong E., Kim J.I., Lee W. Solution structure of human orexin-A: regulator of appetite and wakefulness // J Biochem Mol Biol. 2004. -Vol.37, №5.-P.565-573.

91. Kinouchi K., Braun C., Pasternak G., Donner D.B. Identificaton and characterization of receptors for tumor necrosis factoralpha in the brain // Biochem. Biophys. Res. commun. 1991. - Vol.18. - P. 1532-1538.

92. Kirchgessner A.L., Liu M-L: Orexin synthesis and response in the gut // Neuron. 1999. - Vol.21, №4 -P.941-951.

93. Kisanuki Y.Y., Chemelli R.M., Sinton C.M., Williams S.C., Richardson J.A. The role of orexin receptor type-1 (OX1R) in the regulation of sleep // SleeP- Vol.23.-P. A91.

94. Kodama T., Usui S., Honda Y., Kimura M. High Fos expression during the active phase in orexin neurons of a diurnal rodent, Tamias sibiricus barberi // Peptides. 2005. - Vol.26, №4. - P.631-638.

95. Kohm A.P.and Sanders V.M. Norepinephrine and p2-adrenergic receptor stimulation regulate CD4+ T and B lymphocyte function in vitro and in vivo // Pharmacol.rev. 2001 - Vol.53, №4. - P.487-525.

96. Konsman J.P., Kelley K., Dantzer R. Temporal and spatial relationships between lipopolisaccharide-induced expression of fos, interleukin-1 beta and inducible nitric oxide synthase in the rat brain // Neuroscience. 1999. -Vol.89, №2.-P.535-548.

97. Kopf M., LeGros G., Coyle A.J., Kosco-Vilbois M., Brombacher F. Immune responses of IL-4, IL-5, IL-6 deficient mice // Immunol Rev. 1995. -Vol.148. - P.45-69.

98. Koyama Y., Takahashi K., Kodama T., Kayama Y. State-dependent activity of neurons in the perifornical hypothalamic area during sleep and waking // Neuroscience. -2003. Vol.119, №4. - P. 1209-1219.

99. Kukkonen J.P., and Akerman KEO Orexin receptors couple to Ca2+ channels different from store-operated Ca2+ channels // Neuroreport 2001. - Vol.12. -P.2017-2020.

100. Kummer M., Neidert S.J., Johren O, and Dominiak P.Orexin (hypocretin) gene expression in rat ependymal cells // Neuroreport. 2001. - Vol.12. -P.2117-2120.

101. Kunii K., Yamanaka A., Nambu T., Matsuzaki I., Goto K., and Sakurai T. Orexins/hypocretins regulate drinking behaviour // Brain Res. 1999. -Vol.842.-P.256-261.

102. Kuru M., Ueta Y., Serino R., Nakazato M., Yamamoto Y., Shibuya I., Yamashita H. Centrally administered orexin/hypocretin activates HPA axis in rats // Neuroreport. 2000. - Vol. 11. - P. 1977-1980.

103. Lacroix S., Rivest S. Functional circuitry in the brain of immune-challenged rats: Partial involvement of prostaglandins // J Comp Neurol. 1997. -Vol.387.-P.307-324.

104. Laflamme N., Rivest S. Toll-like receptor 4: The missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components // FASEB J. 2001. - Vol. 15. - P.155-163.

105. Lapchak P.A., Araujo D.M., Quiron R., Beaudet A. Immunoautoradiographiic localization of interleukin 2—like immunoreactivity and interleukin 2 receptors (Tac antigen-like immunoreactivity) in the rat brain //Neurosci. 1991. - Vol.44. - P. 173-184.

106. Layé S., Bluthe R.M., Kent S., Combe C., Medina C., Parnet P., Kelley K., Dantzer R. Subdiaphragmatic vagotomy blocks induction of IL-1 beta mRNA in mice brain in response to peripheral LPS //. Am. J. physiol. 1995.- Vol.268. P.R1327-R1331.

107. Layé S., Gheusi G., Cremona S., Combe Ch., Kelley K., Dantzer R., Parnet P.Endogeneus brain IL-1 mediates LPS-iduced anorexia and hypothalamic cytokine expression // Am. J. reg. integr. ComP.physiol. 2000 - Vol.279. -P.R93-R98.

108. Lee J.H., Bang E., Chae K.J., Kim J.Y., Lee D.W., Lee W. Solution structure of a newhypothalamic neuropeptide, human hypocretin- 2/orexin- B // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 266. - P.831-839.

109. Li Y., Gao X.B., Sakurai T., van den Pol A.N.Hypocretin/orexin excites hypocretin neurons via a local glutamate neuron-A potential mechanism for orchestrating the hypothalamic arousal system // Neuron. 2002. - Vol. 36. -P.1169-1181.

110. Lu X.Y. Bagnol D., Burke S., Akil H., Watson SJ. Differential distribution and regulation of OX1 and OX2 orexin/hypocretin receptor messenger RNA in the brain upon fasting // Horm. Behav. 2000. - Vol. 37. - P.335-344.

111. Ma X.C., Oliver J., Horvath E., Phelps C.P.Cytokine and adrenal axis responses to endotoxin // Brain Res. 2000. - Vol. 861. - P.135-142.

112. Marcus J.N., Aschkenasi C.J., Lee C.E., Chemelli R.M., Saper C.B., Yanagisawa M., Elmquist J.K. Differential expression of orexin receptors 1 and 2 in the rat brain // J Comp Neurol. 2001. - Vol. 435. - P.6-25.

113. Martich G.D., Danner R.L., Coska M., Suffredini A.F. Detection of interleukin-8 and tumor necrosis factor in normal humans after intravenous endotoxin: The effects of anti-inflammatory agents // J Exp Med. 1991. -Vol.173.-P.1021-1024.

114. Matta S, Sineh 1, Newton R., Sharo B.M. The adrenocorticotropin respo&e to interleukin-1 bela instilled into the rat median eminence depends on the local release of catecholamines // Endocrinol. 1990. - Vol.127 - P.2175-2182.

115. Methippara, MM, Alam MN, Szymusiak R, and McGinty D. Effects of lateral preoptic area application of orexin A on sleep-wakefulness // Neuroreport. - 2000. - Vol.11. - P.3423-3426.

116. Mitsuma T., Hirooka Y., Mori Y., Kayama M., Adachi K., Rhue N., Ping J., and Nogimori T. Effects of orexin A on thyrotropin-releasing hormone and thyrotropin secretion in rats // Horm. Metab. Res. 1999. - Vol.31. - P.606-609.

117. Mochizuki T., Crocker A., McCormack S., Yanagisawa M., Sakurai T., Scammell Th.E. Behavioral State Instability in Orexin Knock-Out Mice // J. Neurosci. 2004. - Vol.24. - P.6291-6300.

118. Moriguchi T. Sakurai T., Nambu T., Yanagisawa M., Goto K. Neurons containing orexin in the lateral hypothalamic area of the adult rat brain are activated by insulin-induced acute hypoglycemia // Neurosci. Lett. 1999. -Vol. 264. - P.101-104.

119. Munck A. and Guyre P.M. Glucocorticoids and immune function // Psychoneuroimmunology. / Eds.R. Ader, D. Felten, N. Cohen. New-York: Acad, press inc. - 1991. -P.447-513.

120. Muraki Y., Yamanaka A., Tsujino N., Kilduff Th.S., Goto K., Sakurai T. Serotonergic Regulation of the Orexin/Hypocretin Neurons through the 5-HT1A Receptor // J. Neurosci. 2004. - Vol.24. - P.7159-7166.

121. Muroya S., Uramura K., Sakurai T., Takigawa M. and Yada T. Lowering glucose concentrations increases cytosolic Ca2+ in orexin neurons of the rat lateral hypothalamus // Neurosci. Lett. 2001. Vol.309. - P.165-168.

122. Nakamura T., Uramura K., Nambu T., Yada T., Goto K., Yanagisawa M., and Sakurai T. Orexin-induced hyperlocomotion and stereotypy are mediated by the dopaminergic system // Brain Res. 2000. - Vol.873. - P.181-187.

123. Nambu T., Sakurai T., Mizukami K., Hosoya Y., Yanagisawa M., Goto K. Distribution of orexin neurons in the adult rat brain // Brain Res. 1999. -Vol. 827. - P.243-260.

124. Naslund E., Ehrstrom M., Ma J., Hellstrom P.M., Kirchgessner A.L. Localization and effects of orexin on fasting motility in the rat duodenum // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002. - Vol.282. - P.G470-G479.

125. Novikova N.S., Perekrest S.V., Kazakova T.B., Rogers V.J., and Korneva E.A. Morphometric analysis of hypothalamic cells showing c-Fos proteins after movement restriction and EHF-irradiationi // Pathophysiology. 2008. -Vol.15.-P. 19-24.

126. Ovadia H., Abramsky O., Barak V. Conforti N., Saphier D., Weidenfeld J. Effect of interleukin-1 on adrenocortical activitv in intact and hypothalamic deafferentated male ratsH //. ExP.brain res. 1989. - Vol.76. - P.246-249.

127. Panina-Bordignon P., Mazzeo D., Lucia P.D. Beta2-agonists prevent Thl development by selective inhibition of interleukin 12 // J.Clin invest. 1997. -Vol.100.-P.1513-1519.

128. Peyron C., Tighe D.K., van den Pol A.N., de Lecea L., Heller H. C., Sutcliffe G., Kilduff Th.S. Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems // J. Neuroscience 1998. - Vol. 18, №23. - P.9996-10015.

129. Phelps C., Chen L.-T Brain response to endotoxin. In Cytokines and the brain. / Edited by Phelps C. and Korneva E. 2008. - P.435^155.

130. Quan N., Sundar S.K., Weiss J.M. Induction of interleukin-1 in various brain region after peripheral and central injections of lipopolysaccharide. / N. Quan, // J. neuroimmunol. 1994. - Vol.49. - P.125-134.

131. Richman D.P.and Arnason B.G. Nicotinic acetylcholine receptor:evidence for a functionally distinct receptor of human lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol.76. - P.4632-4635.

132. Rivest S., Laflamme N., Nappi R. E. Immune challenge and immobilization stress induce transcription of the gene encoding the CRF receptor in selective nuclei of the rat hypothalamus // J. of neurosci. 1994. - Vol.15, №4. -P.2680-2695.

133. Rivest S., Torres G., Rivier C. Differential-effects of central and peripheral injection of interleukin-l-beta on brain c-fos expression and neuroendocrine function // Brain res. 1992. - Vol.587, №1. - P. 13-23.

134. Rodgers R.J., Halford J.C., Nunes de Souza R.L., Canto de Souza A.L., Piper D.C., Arch J.R. and Blundell J.E. Dose-response effects of orexin-A on food intake and the behavioural satiety sequence in rats // Regul. Pept. 2000. -Vol.96.-P.71-84.

135. Rosin D.L., Weston M.C., Sevigny C.P., Stornetta R.L., Guyenet P.G. Hypothalamic orexin (hypocretin) neurons express vesicular glutamate transporters VGLUT1 or VGLUT2 // J Comp Neurol. 2003. - Vol.465, №4. - P.593-603.

136. Rothwell N.J., Hopkins S.J. Cytokines and the nervous system: II. Actions and mechanisms of action // Trends Neurosci. 1995. - Vol.18. - P. 130-136.

137. Russell S.H., Small C.J., Dakin C.L., Abbott C.R, Morgan D.G.A, Ghatei M.A., Bloom S.R. The central effects of orexin-A in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in vivo and in vitro in male rats // J. Neuroendocrinol. -2001.-Vol. 13. -P.561-566.

138. Sagar S.M., Price K.J., Kasting N.W., Sharp F.R. Anatomic patterns of Fos immunostaining in rat-brain following systemic endotoxin administration // Brain res. bul. 1995. - Vol.36, №4. - P.381-392.

139. Sakurai T., Moriguchi T., Furuya K., Kajiwara N., Nakamura T., Yanagisawa M., Goto K. Structure and function of human preproorexin gene // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 247. - P. 17771-17776.

140. Samson W.K., Taylor M.M., Follwell M., Fergunson A.V.Orexin actions in hypothalamic paraventricular nucleus: physiological consequences and cellular correlates // Regul Pept. 2002. - Vol. 104. - P.97-103.

141. Samson, W.K., Gosnell B., Chang J.K., Resch Z.T., and Murphy T.C. Cardiovascular regulatory actions of the hypocretins in brain // Brain Res. -1999. -Vol.831. -P 248-253.

142. Scammell T.E., Estabrooke I.V., McCarthy M.T., Chemelli R.M., Yanagisawa M., Miller M.S., and Saper C.B. Hypothalamic arousal regions are activated during modafinil-induced wakefulness // J. Neurosci. 2000. -Vol.20 - P.8620-8628.

143. Schumann R.R., Leong S.R., Flaggs G.W., Gray P.W., Wright S.D., .Mathison J.C., Tobias P.S., Ulevitch R.J. Structure and function oflipopolysaccharide binding protein // Science. 1990. - Vol.249. - P.1429-1431.

144. Shibahara M., Sakurai T., Nambu T., Takenouchi T., Iwaasa H., Egashira S.I., Ihara M., Goto K. Structure, tissue distribution, and pharmacological characterization of Xenopus orexins // Peptides. 1999. - Vol. 20. - P.l 1691176.

145. Shirasaka T., Nakazato M., Matsukura S., Takasaki M., and Kannan H. Sympathetic and cardiovascular actions of orexins in conscious rats // Am. J. Physiol. Regul. Integr. ComP.Physiol. 1999. - Vol.277. - P.R1780-R1785.

146. Smith E.M., Blalock J.E. Human lymphocyte production of ACTH and endorphin-like substances // Association with leukocyte interferon. Proc Natl Acad Sci USA. 1981. - Vol.78. - P.7530-7534.

147. Snow E.C. Insulin and growth hormone function as minor growth factors that-potentiate lymphocyte activation // J. immunol. 1985. - Vol. 135. -P.776s-778s.

148. Stanisz A., Scicchitano R., Payan D., Bienenstock J. In vitro studies of immunoregulation by substance P and somatostatin // Ann. NY Acad. Sci. -1987. Vol.496. - P.217-255.

149. Steininger T.L., Alam M.N., Gong H., Szymusiak R, McGinty D. Sleep-waking discharge of neurons in the posterior lateral hypothalamus of the albino rat // Brain Res. 1999. - Vol.840, №1-2. - P.138-147.

150. Stricker-Krongrad A., Beck B. Modulation of hypothalamic hypocretin/orexin mRNA expression by glucocorticoids // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - Vol.296, №1. - P. 129-133.

151. Svenson M., Kayser L., Hansen M.B. et al. Interleukin-1 receptors on human thyroid cells and on the rat thyroid cell line FRTL-5 // Cytokines. 1991. -Vol.3-P.135-130.

152. Swanson LW, Sanchez-Watts G, Watts AG. Comparison of melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin mRNA expression patterns in a new parceling scheme of the lateral hypothalamic zone // Neuroscience Letters 2005. - Vol.387. - P.80-84.

153. Swanson LW. Brain maps III. Structure of the rat brain. 3rd rev ed. San-Diego, Cal. USA: Elsevier acad press. 2004.

154. Sweet D.C., Levine A.S., Billington C.J., and Kotz C.M. Feeding response to central orexins // Brain Res. 1999. - Vol.821. - P.535-538.

155. Taheri S. Mahmoodi M., Opacka-Juffiry J., Ghatei M.A., Bloom S.R. Distiribution and quantification of immunoreactive orexin A in rat tissues // FEBS Letters. 1999. - Vol. 457. - P. 157-161.

156. Takahashi N., Okumura T., Yamada H., and Kohgo Y. Stimulation of gastric acid secretion by centrally administered orexin-A in conscious rats // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - Vol.254. - P.623-627.

157. Takao T., Culp S.G., Newton R.C., De Souza E.B. Type I interleukin-I re-septors in the mouse brain-endocrine-immune axis labeled with (1251) recombinant human iterleukin-I receptor antagonist // J. neuroimmunol. -1992.-Vol.41.-P.51-60.

158. Tchelingerin J.L., Quinonero J., Booss J., Jacque. Localization of TNFa and IL-la immunoreactivities in striatal neurons after surgical injury in the hippocampus //Neuron. 1993. - Vol.10. - P.213-224.

159. Terao A., Peyron C., Ding J., Wurts S.W., Edgar D.M., Heller H.C., Kilduff T.S. Prepro-hypocretin (prepro-orexin) expression is unaffected by short-term sleep deprivation in rats and mice // SleeP- 2000. Vol.23, №7. -P.867-874.

160. Thannickal T.C., Moore R.Y., Nienhuis R., Ramanathan L., Gulyani S., Aldrich M., Cornford M., and Siegel J.M. Reduced number of hypocretin neurons in human narcolepsy // Neuron 2000. - Vol.27. - P.469^174.

161. Tkacs N.C., Strack A.M. Systemic endotoxin induces fos-like immunoreactivity in rat spinal sympathetic regions // J. of the autonomic nervous system. 1995. - Vol.51, №1. - Pl-7.

162. Torrealba F., Yanagisawa M., Saper C.B. Colocalization of orexin A and glutamate immunoreactivity in axon terminals in the tuberomammillary nucleus in rats // Neuroscience. 2003. - Vol.119, №4. - P. 1033-1044.

163. Trivedi P., Yu H., MacNeil D.J., van der Ploeg L.H., Guan X.M. Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain // FEBS Letters. 1998. - Vol. 438. -P.71-75.

164. Tsagarakis S. Gillies G., Rees L.H., Besser M., Grossman A. Interleukin-1 directly stimulates the release of corticotrophin releasing factor from rat hypothalamus / S. Tsagarakis // Neuroendocrinol. 1989. - Vol.49. - P.98-101.

165. Turnbull A.V., Prehar S., Kennedy A.R., Little R. A., Hopkins S. J. Interleukin-6 is an afferent signal to the hypothalamo-pituitary-adrenal axis during local inflammation in mice / et al // Endocrinology. 2003. - V.144, №5.-P. 1894-1906.

166. Turnbull A.V., Rivier C.L. Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis by cytokines: Actions and mechanisms of action // Physiol Rev. 1999. -Vol. 79.-P. 1-71.

167. Van den Pol A.N., Gao X.B., Obrietan K., Kilduff T.S., and Belousov A.B. Presynaptic and postsynaptic actions and modulation of neuroendocrine neurons by a new hypothalamic peptide, hypocretin/orexin // J. Neurosci. -1998b Vol. 18. P.7962-7971.

168. Van den Pol A.N., Patrylo P.R., Ghosh P.K., and Gao X.B. Lateral hypothalamus: early developmental expression and response to hypocretin (orexin).// J. ComP.Neurol. 2001. - Vol. 433. - P.349-363.

169. Van den Pol L., de Lecea H.C., Heller J.G., Sutcliffe T.S., Kilduff, Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems // J. Neurosci. 1998. - Vol.18. - P.9996-10015.

170. Vizi E.S, Orso E., Osipenko O.N., Hasko G., Elenkov I.J. Neurochemical, electrophysiological and immunocytochemical evidence for a noradrenergic link between the sympathetic nervous system and thymocytes // Neurosci. -1995 Vol.68. - P.1263- 1276.

171. Wan W., Wetmore L., Sorenson C. M. Neural and biochemical mediators of toxin and stress-induced c-fos expression in the rat brain // Brain Res. Bull. -1994.-Vol. 34: P.7-14.

172. Watanabe S., Kuwaki T., Yanagisawa M., Fukuda Y., Shimoyama M. Persistent pain and stress activate pain-inhibitory orexin pathways // Neuroreport 2005. - Vol.16, №1. - P.5-8.

173. Watkins L.R., Wiertelak E.P., Goehler L.E. , Mooney-Heiberger K., Martinez J., Furness L., Smith K.P., Maier S.F. Neurocircuitry of illness-induced hyperalgesia // Brain Res. 1994. - Vol.639. - P.283-299.

174. Webel D.M., Finck B.N., Baker D.H., Johnson R.W. Time Course of Increased Plasma Cytokines, Cortisol, and Urea Nitrogen in Pigs Following Intraperitoneal Injection of Lipopolysaccharide // J. Anim. Sci. 1997. - Vol. 75. -P.1514-1520.

175. Weidenfeld J., Abramsky O., Ovadia H. Evidence for the involvement of the central adrenergic system in interleukin 1-induced adrenocortical response // Neuropharmacol. 1989. - Vol.,28. - P. 1411-1414.

176. Wenner M., Kawamura N., Ishikawa T. Reward linked to increased natural killer cell activity in rats // Neuroimmuno Modulation. 2000. - Vol. 7. -P. 1-5.

177. Werb Z., Foley R., Munck A. Interaction of glucocorticoids with macrophages. Identification of glucocorticoid receptors in monocytes and macrophages // J. exP.med. 1978. - Vol.147. - P.1684-1694.

178. Willie J.T., Chemelli R.M., Sinton C.M. Yanagisawa M. To eat or to sleep? Orexin in the regulation of feeding and wakefulness // Annu. Rev. Neurosci. 2001. - Vol. 24. - P.429-458.

179. Wrona D., Trojniar W. Chronic electrical stimulation of the lateral hypothalamus increases natural Killer cell cytotoxicity in rats // J. Neuroimmunol. 2003. Vol.141, №1-2 -P.20-29.

180. Yamanaka A., Kunii K., Nambu T., Tsujino N., Sakai A., Matsuzaki I., Miwa Y., Goto K., Sakurai T. Orexin-induced food intake involves neuropeptide Y pathway // Brain Res. 2000. - Vol.859, №2. - 404^09.

181. Yamanaka A., Tsujino N., Funahashi H., Honda K., Guan J.L., Wang Q.P, Tominaga M., Goto K., Shioda S., and Sakurai T. Orexins activate histaminergic neurons via the orexin 2 receptor // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - Vol. 290. - P.1237-1245.

182. Yi-Hong, Jan Lu J.K., Elmquist, J.K., Saper C.B. Lipopolysaccharide activates specific populations of hypothalamic and brainstem neurons that project of the spinal cord // J. of Neuroscience. 2000. - Vol.20, №17. -P.6578-6586.

183. Yu B., Wright S.D. Catalytic properties of lipopolysaccharide (LPS) binding protein. Transfer of LPS to soluble CD14 // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P.4100-4105.

184. Zhang G., Ghosh S. Toll-like receptor-mediated NF-kappa b activation: A phylogenetically conserved paradigm in innate immunity H J. Clin. Invest. -2001.-Vol. 107. P.13-19.

185. Zhang S., Blache D., Vercoe P.E., Adam C.L., Blackberry M.A., Findlay P.A., Eidne, K.A., Martin G.B. Expression of orexin receptors in the brain and peripheral tissues of the male sheep // Regul. Pept. 2005. - Vol. 124. -P.81-87.

186. Zhang Y., Lu J., Elmquist J.K., Saper C.B. et al Lipopolysaccharide activates specific populations of hypothalamic and brainstem neurons that project to the spinal cord // J. of Neurosci. 2000. - Vol. 20, №17. - P.6578-6586.

187. Zhu L., Onaka T., Sakurai T., Yada T. Activation of orexin neurones after noxious but not conditioned fear stimuli in rats // Neuroreport. 2002. -Vol.13, №10.-P.1351-1353.