Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Реакции генетического аппарата гепатоцитов и нервных клеток крыс с разной наркологической устойчивостью в онтогенезе

П

« 1 1Д ГЧ п

На правах рукописи

УЖ 615.212.7:547.943.015.4:82.014.2.076.9

ЛИПКИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

"РЕАКЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ГЕПАТОЦИТОВ И НЕРВНЫХ КЛЕТОК КШС С РАЗНОЙ НАНЮЛОГИЧЕСШй УСТОЙЧИВОСТЬЮ В 01ГГОГЕНЕЗЕ"

14.00.23 - Гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата, медицинских наук

МОСКВА - 1996

Диссертация выполнена в Российском Государственной Медицинском Университете.

Научный рукошд-ггечь:

академик РАШ, профессор В.Н.Ярып-ш

оцшшшные ога юноши:

доктор медицинских наук, профессор В.В.Банин доктор медицинских наук, профессор В.В.Яглов

Ведущее. учре:зд^ще:

Институт Биологам Развития РАН

Защита состоится 1996 г. в " " часов на засеш

Сиещштзиропалного „Ученого Совета Л.084.14.04 Российск

Государственного Медощинского Университета.

(Москва, 11786У, ул. Острэвигянова.д.!)

0 диссертацией можно ознакомиться в библиотеке универсш Автореферат разослан " "..........._..................1996 г.

Ученый секретарь Спещшмзировшшого совета Л.084.14.04

доктор медицинских наук,

i грорессор А. Н. Тихому

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I» Актуальность проблемы-

Выявление иеханизнов действия наркотических веществ не •танизм„ лежащих в основе развития толерантности и зависи™ эсти,, является необходимым этапом в изучении этих феноменов цельи) и к предотвращения и коррекции«

Известно, что развитие толерантности и зависимости от и р к о т и ч ее к их с р е д с т ¿i с о п р о г? о ж да е т сн и з и е е н и е и с о с т оя н игi гдиаторных систем мозга,, наряду с изменениями в системе зн~ :тенных опиоидов и свойств опиатных рецепторов (Зайцев С,Б. соавти 190óч Звартау 3„3,, 1973, Латкина I-LA. с соавт. ? В ó )., Таким образом, общий дисбаланс: в состоянии частей 1ИОИДНОЙ системы и сопряженных с ней нейроиедиаторных и ^йроиодуллторных систем приводит к дезорганизации всей parra мозга в целом и имеет патогенетическое значение в раз-•¡тми Феноменов привыкания (зависимости) и снижения чувствительности (толерантности) (Воробьева Т =, Mс соавт, i'?S4,. н ч e н к: о Л » Ф,., Б р у с о в 0 « С - 198-1 ),.

Мозг состоит из большого числа функциональных компарт-îhtob, каждой из которых обладает своей архитектоникой и гоей системой связей., поэтому исследование мозга в цело»! íB03M0ü;H0 без детального изучении структур, его составляю-•1Х„ Опиомдная система в значительной степени связана с ио-:^аиинергической системой мозга (Еулаев В„п., Раевский Л„ С„ ?82). Показано преимущественное участие некоторых структур jpBHOM систему в механизмах Формирования влечения к нарко-'¡ческмм средствам (Molenan Г. с соавт,, 198'I í Ssuíín v» •::: jaeít. 1990; Trsíübiay E,, С* , Charíon G„ 1981).

Склонность к формировании Физической и психической зави--

симости, a также скорость развития толерантности яшлнютс какой-то мере генетически предопределенными у людей и ¡к и в ных (Борисова Е.В. с соавт. 1992), Индивидуальную чувст ге/ьность к наркотическим средствам могут' определять раз чин ь системах ноноаминов и эндогенных опиоидое у разных ганмзмов (Судаков С.,К„ с соавт,, 1991; Sudakov S. К. с coa 1993),,

Одно и:;:- направлений исследования наркотических сред заключается в выяснении молекулярных механизмов дейст названных веществ« в том числе, влияние их на работу гене ческого аппарата клетки.. Известно, что наркотики могут вы вать мутации кода ДНК, изменять транскрипцию с ДНК, зам лять синтез белка., изменять свойства некоторых Фермент участвующих в биосинтезе макромолекул (Зайцев C.B., Яры К»H » 1993? Ли Н„п„ с соавт» 19815 Clouât D. H. 1971). С местное применение в эксперименте другого вещества с изве ным механизмом действия может облегчить исследование, при использовании ингибитора протеаз антипаина било шяс но, что некоторые эффекты морфина осуществляются протенз путем (Бибаева Л.3. 1990).

Относительно е-ну гриклеточнах механизмов воздейст морфина известно,, что ¡Реализация зФФектов данного вещее возможна но только через морфино-рецепторы,, но и другими тямм., в том числе путем непосредственного взаииодейст опиата с хроматином клеточного ядра (мещеряков н.Ф., Суда С. К. 1991; Erikвson Р.З., 1939). В связи с этим самостоя'; •„ ный интерес пред'...тавляг:т гепатоцити, лишенные рецепте Mis-тина ÍSamavilQva к,. N. с соавт. 1988).

Опиоидергическая и моноаммнергическап системы прете!"

акт определенные перестройки в процессе индивидуального ^звития (Дыгало I-LH«, Шишкина Г/Г. 1990; Зайцев С., В», Яры-'¡н KJ-L 1993; Раевский У, Б. 1991; Kir itsy-Roy J» и. с соавт„ ?92).. Возрастные .'вменения затрагивают и работу генетичес-iiro аппарата клетки СБердышев Г» Д. 1977; Григорьева Л* В-, •'ыгмн В. Н» :1?31> и Таким оврагом, является актуальным иссле-:■ ванне механизмов внутриклеточного действия морфина, в 1Стности на работу аппарата транскрипции., в процессе онто-жеза»

11 _ ...Цель работы.

Сравнительное исследование возрао ной динамик:!-! реакции а воздействие морфина и антмпаина аппарата транскрипции iвнык чипов клеток нервный и не нервных структур крыс линий \6/Б и F344n отл;.-:чак:»ика'! чувст:;я4 гельностью к: морфину»

III, Задачи исследования-

1„ Оценить транскрипционную активность нейронов равный гр у к тур и гепатоцитов крыс в условиях применения: морфина и ■¡гибитора протеаз ан гипаина,,

2» Исследовать изменение транскрипционной способности ;;йроиов и гепатоцитов крыс на разных этапах индивидуального ¡звмтия '¡¡ивотннх (новорождённый период., инфантильным пери-т., молодой и зрелый репродуктивный возраст).,

3. Сравнить транскрипционную активность нейронов и ге-

ГТОЦИТОВ КрЫС,, ОТЛИЧЗ!ОЩМХСЯ ЧУ ВСТВИТеЛЬНОСТЫО К МОрфИНу

¡иний WAü/G и F344),.

ГУ».......Научная новизна.....работы,,

Впервые исследовано влияние морфина на синтез РН клетках нервной и не нервной природы у крыс с неодинако наркологической устойчивостью (линий WAG/G и F344). Показ различия реакции на норфин аппарата транскрипции клеток кивотных с равной генетической устойчивостью к наркотмчес средствами

Впервые выявлены индивидуальные различия гранскринци ной активности нейронов и гепатоцитов крыс на равный эта онтогенеза. Показано, что в основе изменений реакции arma та транскрипции нейронов и гепатоцитов на морфии в ходе тогенеза могут быть различные механизмы, не совпадавшие г е н о т и п и1ч е с к и о т л и ч а м ¡ц и х ся ¡к и в от н ы х.

У ». Практическая ценность.....работы,,

Выявление центральных механизмов лежащих в основе р вития Феноменов толерантности и зависимости к опиатам, о рывает широкие перспективы для создания патогенегиче обоснованных средств и методов лечения наркологических и да иных психических заболеваний, а такие поиска новых под дов к устранению нежелательных побочных эффектов от приме ния наркотических средств в целях обезболивания по медици ким показаниям»

II.;.......Апробация работы.

Материалы и результаты настоящего диссертационного и ледования представлены на научных семинарах кафедры биоло РГМУ в 1992-1994 годах,, в лаборатории Фармакологии парке ков и экспериментальной Фармакотерапии наркомании Научн центра медико-биологических проблем наркологии НЗ России 1993 году, на научных конференциях ''Университеты Росс

"(в,¿61 "h "о a s hoi/o "()6¿t " я " o w].'!::í:>íp¡.|) -эй Ei/u и coi в i-, ni о не j о j. и о з rhoi-, Azw omodox ir :i л до; Л. л нпмолйвй':::о!'! .гоз ¡-i:>i:::iei-,n.iou::d[j " и д d d i -í г:? ö lc c: ! -i n ■::! 1..1 иоз&кехх wo ~rv.<! :;:oioi гя s--¡ HiMn;¡;9¡.'ííEHMd:j yoaíiHEJix moi-iWo и и Vi ¡-.пу A uou кпнзе :.!úio¡/::i eííiieumxhe и ehmidow ç^rxrycero::: eh exedeuue о ...¡союз h и -л не J Hi'i'roi'cs.j ь'иизь Л i:!.! о JOH4!.№¡/!/edeu я.ооижоы-:;: 03 oi/eíie!; ox " ÍJOOiSi) Wí!!'J! !T-J vUMt;:" мянивга wnHxdeîi и (¡jj) öm.u:

ó О ¡/ С' J ''(НИЗ) EijAUEi/EXO! !И._! О-J'бы SO!¡4i.íGÍ'¡tí5HCbJXH3.3 "(«iJO) -ÍRÁi/OU ХМППГГОч EdCO! BEHdOXOWCCjHOT 'З/ПУМ И jr¡,'£.j ИИН|.'Н/ ~4"íd

¡•¡¡••;.~хгй-!г- yomadôh !■•: yoh^ii/edihö'n i^d/uoi/v-ri о

/у) -;h5i-,eu язикс еяоз-íi/oi с-н f.ioiohoo 5-эх г* л ke:>! g

........„...

шнез6$¥|7эзй.....hj .....pe'íííqq

ÍT и ïï у 1 ci в о о и tr " z Г; ТТ^ж d з tío 3

"3Od0XSE К ¡-¡H i-iE —.!.s-i¡--1 XOyEd ¿7Ï И НПННвЗ! Э 61-. 6.LO 901 ХаМ^ПЕХГ'СО жож:..п "¡.iweíihí/qex л и иие:,-!1'Д:::ф1о от f h e з о ■:.! и d х : j ом/ if и гонпе.! ds -эй?! "xe'nHMEdlD р/. EH !■ ¡ ? ¡k о !/? и !/EMdeXEH HOiiaOHDn "EX~Oi3X о -ОНЗИМСИ- !ИЫЕМ riïiNl iE di ¡;7í Х^ЬМ/ЗЕХПКО HXOJEd Ы&ЧйО MriltiyQ

"?r:!axed?xhi/ üi/6xeíe:}ía '.-moi tíx я ¡/л sed минэшк/ьоо пезо ti в 30XEX;:ü/Á¿rí?d ч'инЕзойеиоои aoïioxsw и >iOi/e¡-id?xEW b^hvohü

"i;¡ iAXEdOXHí/ EdOSOO M.íHHOtí-Sfl.'j SU XMOXDCO Ui-i'ilE Id? ГО Up

''»FiJofEíi.....fd?;:rs?;dio......"Tn

"("j „ии

- o i/o,S.! o w и о л D i-1 i-'i 'п и ii i? r fooduoa 5»;ня!1 eá.íoíu „ " ( "j i7¿¿r "" ?::.ool;

- ó -

Исследуемые структуры нервной системы каракл ермзую высоким содержанием норадреналин--, дофамин-- и серотонин--дерм:аи!их нейронов, рецепторов ¡с катехоламинаи, опиатам опиоидным пептидам Силенjb С»И» 1987)и Показано участие кик структур в механизмах формирования влечения к нарко ческим средствам и трансформации пристрастия к наркотика патологическое состояние (Булаев Б» tí. „ Раевский С„1>„19 Панченко Л.Ф. 19В4) , В области С И К обнаружены гетерогенны структ урмо~Фун!;:циональнои отношении групп;.,! нервных ¡еле (Максимова Е«Б, 1990). Некоторые из них участвуют в они дергической регуляции. D CÍÍFÍ большое количество нейро эгсспрессирумт опиоидные рецепторы, в том 'числе мм-типа» мембранах нейронов ГП также обнаружены рецепторы мю-т (¡larris Ь.С» 1991). ГП участвует в проявлении поведенчес реакций синдрома отмены, развитии зависимости и толерант!-. ти и является удобной моделью для изучения механизмов де твия наркотических средств CGuitart X. с соавт. 1992:; Hol Р. У., с соавт,. 1995; Зогт С.М. 1995).,

Исследование реакции гелатоцитов на воздействие мор'! представляет особый интерес, так как известно, ч го все Фекты препарата на клетки печени производятся без учас иорФино-рецепгоров и, возможно, осуществляются путем нет родственного взаинодеПствия опиата с хроматином клеточг ядра (Бибаева Л.Б. 1990; Зайцев C.B., Ярыгин К.Н. 1993; iiiovilova M- U, с соавт. 1988).

В экспериментах использовали инбредных крыс линий Fi h er-344 CF344) и Wisiar Albino Glaxo (WAb/GSto),, разли'-щихся чувствительностью к морфину- Неодинаковое военри;-подкреплямщего действия морфина обусловлено генотипическ

¡собенностями крыс каждой линии- В насгоящее время обнаруже--¡ы отличия характеристик: рецепторного связывания в иеибранах :оры головного мозга у крыс этих линий (Борисова £.. В., с со-;вт. 1992). Причем,, различия концентраций и чувствительности •ецелторов имеются как для опиатных рецепторов, так и для ■ецепторов к моноаиинам,. Показано,, что крысы линии F34-1 ока-ывакг предпочтение потреблении) раствора морфина и менее ус-ойчпвы к формировании зависимости и толерантности от опиа • OB, чем крысы линии WAG/G (Sudakov З-К» с соавт,, 1993),,

до начала эксперимента крыс содержали в помещении с юстоянной температурой» в условиях стандартного освещения, ри свободном доступе к воде и пище»

Исследовали пять возрастных групп животных:: периода Х'вороиденности (3-х,, 1-'!-ти дневные), инфантильного ( 1-ие-ячные),, молодого и зрелого репродуктивного возраста (6-ти, 2-ти месячные). Возраст животных определяли по датам роиде--ия„ Всего в работе использовано 136 "¡ивотных,.

Исследуемые вещества

Порфмн является одним из наиболее изученных алкалоидов пия и широко применяется для исследования механизмов разви-ия толерантности и зависимости у людей и вивотных» Имеется емало данных о влиянии морфина на работу генетического аппарата клетки, в том числе синтез РНК (Мещеряков А,. Ф„, Суда--ов С.К. 1991; Clouei !)„Н„ 1971- Eriksson F\, 3,, 1939),,

О л игопептид антипаии применялся для исследования коми--екса ЗиЗН>ункций и выявления протеазных механизмов в раз змии 3ÖS ответа у Escherichia coli (Pieiraykowska I. с соавт. 933), Антипаии является ингибитором протеаз широкого спек: г-

... я -

ра действия (iloriinoto Т. с соавт. 1990; Virgin I. с: coa 1991). Имеются данные о влиянии препарата на экспрессию нов ССадпапа п.,, Kennedy A.. R» 1989; Citan <;í с coa

1985; Hiwasa Т. с соавт. 1987),, на синтез РНК у зароды земноводных (ííiyata S. с: соавт.. 1988) *

Применение антипаина наряду с морфином в настоящем з пернменте даег возможность выявления и подтверждения на ли протеазных механизмов действия опиата на транскрипцион активнос ть клеток. (Ембаева h» L.. 1990)«

М е т о д и ica и с с п е д о ва н ия.

П;i проведении исследования использовались данные., луче: ¡ ни е а в т о ра д и о г ра Ф и ч е с к и м м е т о д о м. П р и м е н е н и е мет о д а диоактивной индикации к перевивающим срезан имеет ряд пр мушествг достаточно высокая чувствительность, простота полнения и меньшие затраты радиоактивного вещества, че методе in vivo (Ми tí о шов М„И. 1986),, животных забивали помощи декапитации,, выделяли сенсомоторную кору, вентроме а ль но е ядро гипоталамуса,, голубое пятно, верхний шейный с патический ганглий,, печеньu Части исследуемых структур (В 100 мг) помещали в среду 199» Перевивающие срезы получ путей измельчения исследуемого материал..-;. до разме 1хО„охО»5 ммКультивирование срезов проводили при темпе туре 37° С в чашках Петри диаметром 40 мм в среде 199 с бавлением 20л сыворотки крупного рогатого скота, 70 мкг таммна С и 5 мг глюкозы на 1 ил среды,. Время преинкуба составляло 30 минут., порФин и антипаин вносили в инку бац и нум .смесь в концентрациях 8m¡1 и 0„0БмК, соответственно,, рез 60 минут инкубации с препаратами в смесь вносили Н3-у

g Hi/ESOdHrOii^bOW И ИОЙОЗ HCM IHCSOaWin/HlDi-ib1 Ei.í ïitfJLD HE3¡"¡H0dü HI .-.ElíiEdj-iOdU CHHVIXGOJ "JoZ£ OdÁXEdOUMOX Hclll XEXDOWdeX -3 ЛЛНИЫ (); ен h¡/e!¡®mo!.¡ rerodo и:'э«:з исч-!ноит1еол:;-!ни lftiüoj.jheh stoojj

"оннязлэхэзхоо::' °u:n-î ¿ и ¡,¡w сФ'О :;;.;>M.Ed.i не'ппо-: :

ЧЭЭЮ (¡lAHHOMÏiE-j/OiHW 3 И1/И00НЗ НИЕНИХНЕ И НИф'.!ОМ "ФХД-Н^;:

б()"0 M ;'Т:1!н: с "^ТЭ^Н ^¡м ¿ '¿-iJ hyj.î! Ч'ЛУ 9 "О Ol •EL/O; -ví ~:O Í ^т «hrinio;;;.;-: ЕХЕфя!/л:.< qp "HEodEXE:

I !::í¡.,; Q г T '^эфАо г ]•-"'и d.i. G0Ï Ï 3 «¿tossdoVjco "язои:

¡h л !■ n-i o i s V¡ Д :>u i i хин eh HiiHDOHEH у к n ï! o з eh винЕзитЛпяз o ¡/::■•:>: ' ( Ï ;; T ) El- ! О ).5нР и EjOHEJ-S иэзн:< -i И1/Е>Кк:1н:0!Иф i Л H ИИ S 3HH5h5. •:.. и епеюхз si-s ¡XEwWodu eh и1/Ешоиои >¡ ОТ-Б уониЬшох \цп ¡=i:

—З-иЬ O 1ЧЧ И О ,.l О И d 510.).. D W j "ИИНИ!/ yotíiKE>! 3!"idíi XG..ÍJL X ¡,;дк "00! 01 !i!/EdQ (УИО) ШНЕ.ЗОЙЭЬ'ГОИ ¡::<!.íW l/EHd5.l.EW "(8¿AI ' "И"«Г9 Я.ЛОО[| WOd,-'U-,l M!::HHO;KOIj Wodü ¿ € Ed в И Uli OÜ-¡,¡l-|,:¡ К ПН H S ...IО tf H С И Д. 00:13 И i. 51E HM!

- ~> ¡/ я if в d ¡. i о о j о :>;::: ei-, и ф е d ...i о и W с d о i. а е У о х 5 и нь-индыи.; о о н я?/ о ± и н i.¡ о i

-Ou яа'ПЫООИ-Р i': IL! Li /v.J. J M0H.i.r<EdE03 ИМНИ Li ХИЭОО OHdJl I-ЯД?

"(8861 "3"!

eí30eh0j.| ''"tí "g MMSoWodg) уи'ггкЕаф (Т) yohndoa ldecIoho íoíídw; И (d) MOWMdO:l3.I.DEdOJ.OJy~'MJi ЯХ00НЗИХ>1Е0ИИеН Hl/Htf 0tí0dl.!0 ,¡ ¿~E. _.дд dOXE3Hi/EHy,, 05!Mh.l6hD H O i-i H О И Vi b'!/ U И X H И 'H ~¡ EH И (Ed03X3Ed i/ ëH UüUOU -¡ I "OLÍLÍ -i i? "00T X hhoi.Hdi. ¡/w oqc "eí/oái/ox ¡/m oí.? d 0.1. Mi/ i/ ti.!.. НИ 'il Э M in-.fi/3EyO tí H!..' ЕИ 3 "Oo9G OdAXEdOUM?.! WdU JiO.LÁ:

"Hi ÍEhO.Í 3 EH ИЫЕИ J Л.;.! О 3.10 Ed >,n; 3 И !,i'bid03i.0Ed И НЬ'ЕИЗ iSHiiXEb: 3 И'/Ell! 0 HOU ЯЗОНЗ l! i-iOXdHUD 0у/ Hi/EOHJiOELCOUO REEdj "XÁHHH (>.:

obiüoi,:;■.). з j 0¡;. и du лх.1. wodoaxDEd vq Hi/EanxEjEdçso и rí/еиз ora

■•••хоь::! a иь'Еывиои ';Е1.!И--ое1У5!лн ojohokowoh иодхпч'ЗИ о (j.-.?) ¿ü'

Motíodo I; ! О !■ I tí 01.Í О X HUEiJI'll-IXO I"i30d0 WEÍ.E". "j ,,./Ç edA.l.EdOUHOi. Hd¡

.¡.Aiü-iW 0£ ОИНОЬОХ 3 Я-i.O•:.!!--¡9ЛHl'i Hi/EHii/oWodU и (T...i/ 5igj АС;;

яхоонзи.'-гле ыеняуоуд "htiodo м0! !н0и'пе9л>]ни -^.jyw ïiqu ß " () ) hwi

... ¿ „

- 10 -

течение 30 минут в смеси этанола и уксусной кислоты (3: Затеи препараты на 15 иинут погружали в За-ный раствор (при 4°С) для удаления невкл^чившихся предшественников, п> ле чего тщательно промывали прогонной водой в течение 30 I нут,.

Авторадиографический отпечаток получали, покрывая сте! эмульсией типа М и проявляя фотографическим способом по< 15-дневной экспозиции- Уровень матричной активности крона' на оценивали, подсчитывая количество зерен восстановлена серебра над ядрышком и нуклеоплазмой в отдельности. Су! указанных величин служила показателем общего ядерного ме* ния„

Используеиый метод оценки транскрипции основан на вьи лении активности эндогенных РНК-полимераз в области сай' ДНК, транскрибируемых в момент Фиксации (Григирьева А.! Ярыгин В., Н„ 1981; Ярыгин В. И. с соавт,, 1990). Метод им-свои преимущества, так как позволяет избежать слоыност! связанных с ¡течением РНК г а уз.уо. Включение метки не зави" ни от транспорта предшественников в клетку, ни от их захв; во внутриклеточные пулы,, а вновь синтезированные ¡-¡олет: РНК остаиггся фиксированными на ДНК-матрице.

Статистический анализ,

Результаты выражали в удельной радиоактивности ере: (ммп/мин/иг ткани). Рассчитывали величину общего мечена уридина, равнуи) сумме радиоактивности двух фракций РА-::р-которая позволяет судить о проницаемости срезов для уриди! Поправку на проницаемость вводили двумя способам!'!. Пер! приводил к величинам (Р/гЧ) где Р - средня?! величина п|

¡ицаемост и для каждой исследуемой структуры, а - для

юнкретиой группы срезов., Второй способ расчета определял :олю включения от суммарной радиоактиккости 1аЛ:,1, т.е. зф~ ■ективность использования меченого предшественника (Бродский !« Я., Нечаева Н„В„ 1988).

Е: ме тодике,, предложенной Муром (Мосте О'., Р.. п. 19/3), осу-^ствляли подсчет числа зерен восстановленного серебра, не ¡енее чем в 100 клетках для каждого случая.

Для дальнейшей обработки полученных величин и оценки остовернос г и результатов с помощью I--критерия Стьюдента ользовались пакетом прикладных программ ¡•■¡а 1ВИ--РС по стз--истике: ЗТАТиКАРН1С8 (УЗ.,0) (Тюрин И). Ми 1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Согласно полученным результатам., клетки разных популяций дной ткани и клетки разной тканевой принадлежности отличатся но транскрипционной активности. Для 3-х дневных крыс аибольшие показатели включения! изотопа в суммарную РНК вы-влились в нейронах ВшСГ (таб.. 1).. У 14-ти дневных крыс обеих иний в нейронах ГП и гепатоцитах отмечались невысокие пока-атели включен'':; ! метки в суммарную РНК (таб.. 2). Нейроны ВШСГ -иесячпых крыс обе;!!; линий отличались большей транскрыщи-иной активностью, а нейроны ГП - меньшей, относительно ару-их исследованных структур. У 1-месячных крыс ¡-34 4 низкая ранскрипционнал активность наблюдалась также нервных летках ВпЯ (таб.3).

\ линия СЕРИЯ 1 ВШСГ СЫН ВЫЯ гп П

1 1 1 \ | Е34.4 ! 1 | • Контроль 160.72 + 7. 45 43. 53 + 6. 33 47. 53 +8. 27 52. 15 +2. 29 50. 61 + 12. 79

Норйин -53.04 -5.86 +131.8 -15. 53 +23.32

Антипаин -41.54 -22. 01 + 0. 29 +6.33 -17. 19

Морф.+Ант. -40.19 -42.13 -4. 14 -7. 25 -11.82

1 МАС/С 1- Контроль 165.82 +17.93 39. 19 +6. 52 91. 19 +9. 68 50. 88 + 5. 80 32. 24 + 8. 79

Морфин + 7. И -13.83 -49.44 +18.55 -4. 87

Антипаин -45.33 -14.19 -55.67 -31. 25 +43.33

Морф.+Ант. +16.96 -18.96 -6. 13 +35.00 + 21. 28

Таб. 1 Изменения включения Н:::;~уридина в суммарную I нервных клеток и гепагоцитов 3-х дневных крысят Г344 и !л!А1 в условия?; применения морфина и антипаина (в л к контролю

- ЛИНИЯ СЕРИЯ ВШСГ смк вмя ГП П

1 1 ! Контроль 241.70 +9. 13 217.49 + 26. 54 238.59 +52.24 123. 33 +8. 91 163.82 +21.37

Г344 Морйин -37.36 -19.87 +3. 02 +11.16 -52.43

Антипаин -2.95 + 0. 42 -21. 64 +24.91 -52.80

Мор®.+Ант. -70.08 -16.89 + 2. 10 +105.9 -49.87

Контроль 154.29 +5.82 155.93 +33. 17 293.29 +56.00 50. 54 +16.53 67. 27 + 5. 68

МАБ/С Морйин -29.02 +70.74 -39.23 + 129.5 +27.66|

Антипаин + 2. 06 +67.08 -36. 60 +282.5 + 6. 04

-- Морф.+Ант. -31.40 +114.8 -20. 38 +236.3 -18. 70

Таб.2 Изменения включения Н:-"-уридина в суммарную ! нервных клеток и гепатоцитов 14-дневных крысят Р344 и ЫА! в условиях применения морФина и антипаина (в % к контролю

Контрольные показатели в таблицах 1 и 2 выражены имп/мин/мг ткани ("+" - прирост по отношений; к контролю,' -- падение по отношению к контроль).

Выделены достоверные различия по отношению к контро, р<(), 01) ,

линия | СЕРИЯ 1 ВШСГ СМК вмя ГП п !

Р344 Контроль ! 455.32 ±58.39 54. 80 +6. 18 24. 60 + 6. 53 20. 33 + 4. 23 42.77! +4.82|

1 Морфин \ -62.71 +15.89 -12. 77 +63.70 + 41.59 ]

Антипаин \ 1 -71.50 -20.31 +68.37 +102.6 -32. 52 |

Морй.+Ант.| -69.59 -37.19 +21. 42 +21.64 -7. 95 |

«АС/С с-- Контроль 1 | 128.76 +18.37 68. 93 +9. 21 48. 21 + 0. 72 24. 67 + 1. 26 48.831 + 11. 48|

! Морфин | -50.42 +143.9 + 10.31 + 142.2 -19.071

[ Антипаин ! -12.82 +25.95 -8. 01 -7. 13 -7. 661

Морй.+Ант.| -37.06 +32.52 -21.66 +60.64 + 12. 1б| -!

Таб.З изменения включения Н-:~уридина с суммарную РНК ервных клеток и гепатоцитов 1-месячных крыс Р34Ф и !л!А&/& & словмях применения морфина и антипанна (в X к контролю).

!'-— II линия СЕРИЯ | ВШСГ СМК ВМЯ ГП -, П I

Г344 1 Контооль * 213. И +48.22 40. 69 + 6. 53 13.51 + 1. 42 12. 20 +3. 13 30.79 1 +5. 17 I

Морфин -78.51 -15. 56 +0.37 +123.7 +13.58|

Антипаин -84.21 -47.60 +82.46 +96.39 -20. 14 \

Морф.+Ант.I -85.15 -12. 98 +8. 51 +50.25 +4.61I

МАЙ/С 1 1 -1 Контроль | 28. 00 + 0. 40 34. 25 +3. 62 31. 67 + 1.38 15. 52 + 0. 15 19.601 + 4. 021

Морбин | +59.30 -24. 67 -22.10 -4. 57 1 +69.95I

Антипаин \ +30.89 -59.47 -37.67 +50.77 + 154.1 1

Моой. +Ант. 1 ——-; +29.82 -47.91 +16.99 -19.07 +228.51 !

Таб.4 Изменения вклинения Н;":-урмдина в суммарную РН:> ерв!-!ык клеток и гепатоцитов 12-месячных крыс Г344 и ЫАБ/Б в словиях применения морфина и антипаина <в % ¡с контролю).

Контрольные показатели в таблицах 3 .и 4 выражен;::! в мп/иин/нг ткани (1! + !1 - прирост по отношении! к контролю,, падение по отноиеп:-;;: к контроль;.

Выделены достоверные различия по отношении к контролю;

■:":'• Л'! ';

ВШСГ ШК BUS ш п Рк.1 Vpoacib тралскршщионяой алшоаи нейронов игшатоцитов 14-дниню крысят WAG/G и F344

Иы наблюдали изменение : тмвности транскрипции на раз; а та па к и н д и в и д у а ль и о ¡ " о ра в ¡< i ■ крыс, что подтверждает реву, таты проводимых ранее иссле( ванмй (Бибаева Л „В,. 1990). 14-ти дневных крыс обеих ли! отмечался высокий уровень с; теза РНК в большинстве струг ( та б „ 2., р и с., 1}„ 3 т о ,, Ei о з м о ш !

СВЯЗЗНО С ИНТеНСМВНЫМ рОСТО! о к о i-¡ ч а т е л ь :■ ¡ы м с о в р е ва ноем н релых элементов изучае структур,, а такье относи гель в о з ра стан и е м ф у н к ц и о ¡-1 а ль ¡■нагрузки на ткань (Григорь А„ В»., Ярыгин В.Н. 1981;. 12-ти месячных крыс показат т р a i i с к р и п ц и о н н о й а к: т и в н о с т и ли невысоки (таб.4, рис.2). можно объяснить изменением зм.с о - х и м и ч е с к и х с: в о й •:.: т в к ¡ ■ о тина с возрастом пивотных с i -¡ и жен и е м с о д е р ка имя а к т и в ¡ ¡ хроматина в клетке. Исключен являлись толы:: о нейроны D крыс F344„

Анализ результатов пока вает межлинейные раз л и

ВШСГ СЖ ВИЛ Ш П Psc.2 Vpcmib транофиадионкоа аяташсги нейронов и гепатоцитов !2-несачныд крыс WAG/G и F344

вшсг сшс выя ш п

í.3 Урстепь траиекрипцяопнса ашиюсга неярм: я тйчздятсв 3-х дневных крксзт WAG/G и F

I

50т

SWAG nFW

БШСГ СШ БМЯ ГП П z.4 Уромиьтранофипцнонной ашвносганенронсв и гелатоцитоз 1 -неспнш крыс WAG/G и F344

15 -•

т ра н с к р и п ц и о н и о й а к г и в н о с т и клеток: одинаковых а труктур У крыс одного возраста. Достоверно отличаю гея показатели вклинения метки в суммарную РНК нейронов ВИЯ 3-дневных крысят двух линий (рис.3). У 14-ти дневных крысят F344 в нейронах ВШСГ, ГП и клетках П синтез РНК был значимо выше, чем у крысят WAG/G (рис„1)„ Для возрастных групп 1-месячные и 12-ти месячные межлинейные различия транс-к р или, и о н н ой актив н о с я-: на б л: о дались в случае ВШСГ и ВИЯ (рис„2,,4)„ Различия уровня синтеза РНК преимущественно в мо-н оа м и 11 е р г и ч е с к и х с т р у к: т у г а х г е -нотипически отличающихся крыс,, вознокно объясняется тем, что животные, отличающиеся по наркологической устойчивое тм, имеют определен! :ые особенности ::: системе моноаминов (Борисова £. 3, с coaвт „ 1992;; Судаков С „К, с coa в т. 1991),,

эогаордааг-показазшвкшешН5 -уридинав инзрную РНК, иап/иин/игюш), грелкой указаны достоверные различи неэду шниш >ыс(р<0,01)

Для 6--ТИ МОСНЧНЫХ 1С|

мешлинейные различия показа лей синтеза РНК в клетках и ледуемых структур не выявл (рис.5).

Согласно нашим данный, ¡ акция нервных клеток на мор-изменяется с возрастом во b¡ исследованных структурах ¡q обеих линий (риСиб, 7).Исклю' нием являлись нейроны СМК крыс F344 всех возрастных rpy¡ где введение морфина в инкубационную сиесь не изменяло д< товерно показатели включения изотопа., порфин оказывал пот-циирующий или угнетающий транскрипцию зффект, причем в не! торых случаях в одних и тех м:е структурах наблюдался про' вополо;кнв!Й зффе!;:т в зависимости от возраста крыс (нейр' ВШСГ крыс обеих линий и нейроны СпК крыс WA6/G).,

Интересный Факт, что реакция нервных клеток на мор' 14-ти дневных крыс совпадала с реакцией у 1-месячных Kpi соответственно для каждой линии, исключение составляло крыс F344 (рм::„ í., 7). Кроме того, у 1-иесячпых крыс не н: ч;-¡далось меилинейных различий реакции на морфин, кроме m ронов СпК„ Это мол;ет указывать на i о,, что изменения, про; ходяшие в нейронах крыс зтого возраста (от 14-тм дней до месяца) не затрагивают морфин-чувствительную группу re¡ клетки или это происходит в незначительной степени»

Особенности влияния морфина на активность.; транскрипц! у крыс одной и той ¡не линии, но разных возрастных групп, ¡ гут являться следствием качественных и количественных из1

вшсг см выя га п

Рнс.5 VpcœeHb транофипцнонной ашвносга нейронов

и гаатоцитоз б-весячньн крас WAG/G и F344 (по оси ординат -похашшБШЛсикя H ' -урвдшв (уйИрНуЮ РНК, Hlf/l/tfíí IL/bfT TEoJírí).

¡ений транскрибируемых ¡Х":ледовательностей ДНК, в частное ги : морФин-чувстчлгтельных, в процессе онтогенеза. 6 структу-ах» имеющих опиатные рецепторы, конечным эффект вещества., ависиг такые от плотности распределения и характеристик вязывающих свойств рецепторов на определенных этапах онто-енева (Зайцев C.B., Ярыгип К.Н. 1993) „

Реакция хроматина нервных клеток на введение аптипаина инкубационную смесь изменялась с возрастом у крыс обеих иний, как и в случае с морфином. Неключе;¡нем были нейроны M Я крыс Г-3'14, где препарат не вызывал изменений показателей интеза РНК по сравнению с контролем у крыс всех возрастных pyrin (рис. 7),, Во многих случаях действие аптипаина совпада-о с аффектом морфина на нейроны одних и тех й:е структур, а прим ер., з то наблюдалось для СИ К и Г и крыс линии WA&/G в озрасте 3-х, 14-ти дней (рис.6).

При совместном введении морфина и антипаина в инкубаци--иную среду эффект от воздействия морфина частично, либ>> олностьн снимался в ряде случаев. Полно отметить, что это роисходило в одних и тех те структура,4; у крыс обеих линий ВШСГ, !::ил„ !'"!"!)., но в разных возрастных группах. Это указывает на существование протеазного механизма активации мори i- ! — '"S у в с т ви 'т ель ны х сайтов ДНК в этих с груктуpax у крыс соот-етствующих возрастных групп (Бибаева Л. В. 19';;,0).

В ряде случаев совместное введение препаратов оказывалсГ ФФект, превышающий., производимый одним иорфинои (СНК и ГП 4—Tii дневных крысят WAG/G, ВШСГ" 14-ти дневных крысят F344) таб., 2), Уто свидетельствует в пользу других путей регуляции ктивности морфин-чувствительной группы гепов., кроме протезного»

МОРФИН

АНТИПАИН

МОРФЙН+АНТИПАИК

. я

£ Ц

а ^

Ю* н

к

<к

л

<К

» о 1 Г! и « 1

о и Ф • £ О п 1 к О

(1) Ф 2 гг1 Л ¡-г ч (!) 5) А К н ¡1)

ы А 3 М ч й Л А N Ч £

(Л и г! 0 г< Я т! г1

1 ! 1 а г 1 1 ПЙ'лг 1

Г . { ! !

I Ьп.Ч

ГП

]Т

; СНхС

IВ ГШ

¡1 1!

"1 г

<К

п п

и

(!) А

м

•н

БШСГ

£ БМЯ

I! П

пг

л

Рис.6 Возрастная дшнхка взненанкя уровня транскрипции в нервных клетках и. гепатоцитах крас ййб/6 при наздайствии нервна и анткпанна

МОРФИН

я

9

. . .Г!

ко о ®

ч I Ф 3

% Я 01

н г! 0 н

Ж К

<к ж <к

вяз

П Р

Ц"

П

- 19 -

АНТИПАМИ

МОРФИН+АНТИПАИН

ВШСГ

ж к

{К

см ж === к

п ж

<к

. о

X О и I

Ф Ф А

А 3 01

•п г! (у г!

!

¡взсг

I

л

л

гп

. ж о

II!

Й И Н

"ТЛ

ж <к

IС Г1X ж

<к

л.

IЕМЯ ж

г

о ж

0

ф

гН

А

01 гЧ

БШСГ

<ж

Б К Я

гп

1 Г'

н ! ;

Рис.7 Возрастная динамка игненевия уровня транскрипции в нервных клетках и гепатитах крас Р344 при згздействня моряка и антипа.нна

- 20 -

В ходе; эксперимента выявлена определенная специФ воздействия исследуемых веществ на клетки не нервной при дьи Реакция аппарата транскрипции гепатоцигов на введе обоих препаратов не отличалась от таковой на введение мор на и антипаина в отдельности. Зто наблюдалось для крыс об линий всех возрастных групп (рис. 6, 7). У крыс линии ИЛ достоверные изменения! показателей синтеза РНК происход только в возрасте 12-ти месяцев. Наксимальный прирост вк чения изотопа отмечался в случае действия обоих препарат что было возможным суммированием эффектов морфина и антип на в отдельности (таб.4). У 14-ги дневных крыс линии Р344 всех случаях воздействия! препаратов на гепатоциты синтез подавлялся. У 6-ти месячных крыс згой же линии препараты вывали усиление транскрипционной активности с наибольшим Фектом в случае совместного их введения (таб.. 5).

линия СЕРИЯ ВШСГ емк ВЫЯ ГП п

Г344 Контроль 48. 41 + 2. 62 45. 30 + 7. 12 32. 30 + 2. 67 30. 74 + 5.55 23. 10 +3. 09

Морфин +62.88 +21.92 +87.40 -16. 14 +43.72

Антипаин -28.26 + 1.24 +24.02 -14.09 +113.3

Морб.+Ант. 1+23.30 -42.78 +44.74 -17. 08 +168.1

\lfiiGZG Контроль 42. 42 + 2.98 71. 42 +16.69 32.37 + 5. 09 44. 23 + 5. 24 35. 84 + 5. 84

Морфин +103.5 -57.55 -35.93 +77.44 -23. 24

Антипаин -34.82 -05.04 +13.81 -43.23 -23. 66

Морф.+Ант. I -26.87 -63.99 -11. 96 -33. 85 -14.20

Таб.5 Изменения включения ¡Р-уридина в суммарную нервных клеток и гепасоцитов ¿-месячных крыс Р344 и ¡дйиЛ: условиях применения морфина и антипаина (о % к контрол Контрольные показатели выражены в имп/мин/иг ткани (" + '" прирост по отношению к контролю,"-" - падение по отношен!' контролю. Выделены достоверные различия по отношению к кс ролю5 р<0,()1).

- 21 -

Исследование изменения интенсивности внутриядерного ме-ения пирамидных нейронов срезов СМК ó-ти месячных крыс обе-х линии показывает, что реакция аппарата транскрипции опре-еленной группы нервных клеток на воздействие препаратов моет отличаться от реакции всех нейронов,, входящих в состав а иной структуры. У крыс линии WAG/G инкубация срезов CÍ1K с орфином и 'актипаином не вызывала достоверного изменении ¡сличения Н;!;"Уридкна в ядрах пирамидных нейронов по сравнены с кон тролем,, В параллельном зкснеримен re у крыс WAG/G того же возраста реакция! аппарата транскрипции нейронов СМ К арактермзовалась снижением уровня синтеза РНК во всех случаях воздействия веществ (рис.8). у крыс линии F344 морфин е оказывал влияния на транскрипционную) а к: твность нейронов "1К в обоих эксперимента.-;. Различия наблюдались в случае оздействия антипаина и препаратов совместно (рис.9). Песо-гветствие полученных для одной и той ке структуры результа-.'.<в может свидетель»:::гзовать,, чго конечное действие вещества тределяется как суммирующее всех зффек г\>:зпроизв-одммых :шмык веществом на определенные группы клеток,, входящих в эстав с; рук туры.,

В заключение следует подчеркнуть, что полученные ре-■/ ль т a ты с в и д с- т е ль с т в уыг об участии генетического аппарата тетки в реализации действия наркотического вещества;; неко--:/рые ¡4 3 внутриклеточных аффектов мор!-ина осуществляются "■отеазным путем;: различия проявлении действия морфина и ■ггипаина на нервные клетки и гепатоциты мен;ду линиями крыс

у С Л О В ЛеНЫ Г е H О Г И П и Ч е С к: и М и О с О б е Н H О С Т я М и ж и в О Т! !Ы X „

Контроль

.... 2'? ■•■■

Морфин Антипаин 1порф. 1 ! | { ■»■Ант.,

! !

' ■ 1 ! ( ! ! i 1 1 i

Морфин Антипаин 1 ! i 1 порФ» ■»•Ант.

(1)

(2)

Контроль <КО! ¡ТрОЛЯ

Рис.8 Реакция аппарата транасрипции нейронос СпК 6-

сячных крыс ЫА&/Б на воздействие морфина и антипаина.

Жонтроля Контроль <КонтроЛй

К о 11 ч р о ля Контроль <Контроля

Морфин ! Аитипами

порф. +Ант.

]...........

(1)

(2)

Морфин

Антипаин 1 Морф.+Ант.

Рис.9 Реакция аппарата транскрипции нейронов СМК 6-

снчных крыс Г344 на воздействие морфина и антипаина.,

(1) •"• реакция всех нейронов сре^о;.:- СпК:;

(2) - реакция пирамидных нейронов СМК.

выводы

1» Транскрипционная активность нервных клеток верхнего ейного симпатического ганглия, сенеоноторной коры больших олушарий, вентромедиального ядра гипоталамуса и голубого ятна заднего мозга, а такие гепатоцнтов крыс на разных зга-ах онтогенеза (период новорожденности, инфантильный период, олодой и зрелый репродукгивный возраст) изменяется неодина-ово для генотипически отличающихся животных»

2. Действие морфина на транскрипционную активность кле-ок зависит от возраста животных и неодинаково для клеток азных структур нервной системы и печени;

а) в нейронах верхнего шейного симпатического ганглия рис линий ИАб/ь и Р344,, сенсомоторной коры к рис УАб/б и ге-атоцитах крыс Г344 эффект морфина с возрастом изменялся на ро 1 ивополомный,

б) на нейроны голубого пятна морфин оказывал только по-енциирующий транскрипцию эффект (1+~тм дневные, 1-иесячные

6-ти месячные крысы ИА(3/Ь5 1-месячные и 12-ти месячные рысь Р344)„

3. Реакция аппарата транскрипции нейронов и гепатоцитов а воздействие норфина неодинакова у крыс разных линий, отличающихся по своей чувствителычости к опиатам:

а) морфин не оказывал значимого влияния на уровень синева РНл в ядрах нейронов сенсомоторной коры крыс Р344 всех озрастных групп, в отличие от крыс ЫАБ/Ь.,

б) на нейроны вентромедмального ядра гипоталаиуса крыс

344 морфин оказывал только потенциирующий транскрипцию эф.....

окт (3-х дневные, 6-ти месячные); у крыс [4А5/Б наблюдался

.... 24- -

ингибируищий зФФекг ( 3-х дневные, 12-ти месячные).

4. Влияние морфина на синтез РНК в клетках одной и же структуры нервной системы (сенсомоторная кора) может личаться для нейронов равного морфо-функционального ти Конечный эффект морфина на транскрипционную способность к: ток исследуемой структуры в целом мокет являться суммой Фектов, производимых веществом на определенные типы ней нов, входящих в состав данной структуры,,

5. Ингибитор протеаз антипаин влияет на синтез РН клетках исследуемых структур (верхний шейный симпатичес ганглий, сенсомоторная кора, вентромедиальное ядро гипота муса, голубое пятно и гепатоциты) в зависимости от ста мнд и в и д у а ль i-1 о г о ¡"'а з в и т ия к ры с.

6п Реакция аппарата транскрипции гепатоцитов одинак в случае воздействия морфином,, антипаином м обоими препа тами совместно. Зто проявлялось у крыс обеих линий (WA и F344) соответствующих возрастных групп.

7. Реализация эффектов морфина на работу аппар транскрипции осуществляется разными пу тями,, в том .числе п теазным (нейроны верхнего шейного симпатического гангл вентроиедиалыюго ядра гипоталамуса, голубого пятна).

8. У крыс линии WAG/G на протяжении изученных зта онтогенеза чаще выявляется потенциирующий транскрипции) нейронах и гепатоцитах эффект морфина и протеазний нехан воздействия морфина на синтез РНК,, чем у крыс Г344,

Праклические рекомендации:

Нсигучеинш кячостшшиле л ю.итч^-ш-аяя-в лишаю несла -цования механизмов воздействия наркотического вещества на фыс. генотипически отличающихся чуЕсгатгелыюстыо к морш-зу, могут бьггь использованы в лекционных курсам на кафедрах медицинских и биологических ВУЗов, могут являться источником щформации для учебных и методических пособий по биологии,-пцш более глубокого изучения механизмов толерантности и за-зисимости от наркотических средств с целью их предотвращения ■I коррекции в медицинской практике.

СПИСОК.РАБОТ, ОШЫШСОВАННЬКДЮ ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:.

I. Влияние морфина на синтез РИС в некоторых структурах го говного крыс с неодинаковой наркологической устойчивостью.//Ешл. зксп. биол. мед.- 1994.-N1.-С.100-102. в со-шт. с В.Н.Ярыгином, А.Г.Муста?зиным, С.К.СудакоЕЫМ. г. Сравнительное исследование 1ранскрипщюнной активности юрвных клегок некоторых структур ШС крыс с неодинаковой 'стойчивостью к опиатам.//В сб. .• "Университеты Рос-:Ш1" .-Москва. -1994-С. 142-145. В соавт. с В.Н.Ярыгиным, ^.Г.МустаФинш, С.К.Судаковым, Ю.В.Липиной. I. Исследование транскрипции в нервных клетках и гепатоцитах даю с неодинаковой наркологической устойчивостью в раннем юстнатальном онтогенезе.//Билл. эксп. биол. мед.- 1996.-N5. -С.565-567. В соанг. с В.Н.Ярыгиным. А.Г.МустаФиным, Э.Г.ЛШШШШ, СЛС.СудакоЕым.