Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Развитие новых подходов к синтезу биологически активных веществ на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования

На правах рукописи

Кокорекин Владимир Алексеевич

Развитие новых подходов к синтезу биологически активных веществ на основе реакций азидирования, тиоцианирования и

азолирования

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

5 ДЕК 2013

Москва-2013

005541848

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации и в ФГБУН Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук.

Научные руководители:

Рамеиская Галина Владиславовна - доктор фармацевтических наук, профессор Терентьев Александр Олегович - доктор химических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Белобородое Владимир Леонидович - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой органической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Пятин Борис Михайлович - доктор фармацевтических наук, профессор, руководитель опытно-технологического отдела ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Защита состоится «25» декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан ■ > ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В мировой практике активно ведутся работы по созданию новых эффективных лекарственных средств. Начальный этап таких работ составляют исследования по скринингу новых биологически активных веществ, выявлению эффективности их использования по отношению к тем или иным видам биологических мишеней, а также по разработке простых и экологически привлекательных методов получения таких веществ.

Настоящая диссертационная работа посвящена реализации комплекса таких исследований в области химии органических азидов, органических тиоцианатов и Ы-арилазолов. Выбор этих классов веществ не случаен.

Интерес к органическим азидам обусловлен их антибактериальной и противовирусной активностью (азидоциллин и азидоамфеникол - антибиотики широкого спектра действия, препарат зидовудин используется при лечении ВИЧ). Кроме того, органические азиды используются в синтезе биологически активных производных азиридина и 1,2,3-триазола, обладающих антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью.

Органические тиоцианаты обладают выраженной фунгицидной активностью, помимо этого они являются полупродуктами синтеза биологически активных тиосульфонатов, тиазолов и тиолов.

Азольные гетероциклы - структурные элементы большого числа разнообразных лекарственных средств (метронидазол, кетоконазол, клотримазол, флуконазол, итраконазол, метамизол-натрий и т.д.) обладающих антибактериальной, противогрибковой, противопротозойной, обезболивающей, противовоспалительной и другими видами активности.

В связи с тем, что существующие методы синтеза органических азидов и тиоцианатов требуют, как правило, высоких (до 80 °С) или низких (до - 10 °С) температур, дорогостоящих растворителей и реагентов (в ряде случаев труднодоступных или взрывоопасных), а возможности синтеза Ы-арилазолов по классическому методу Ульмана весьма ограничены, актуальным является

разработка новых эффективных и низкозатратных методов синтеза на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования с получением соответствующих веществ (в том числе ранее не описанных).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель исследования - разработка новых, эффективных, низкозатратных и экологически привлекательных методов азидирования, тиоцианирования и азолирования алифатических и ароматических соединений и оценка их биологической активности.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

1. Поиск новых подходов к получению целевых структур на основе анализа литературных данных по реализации процессов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических веществ различных классов.

2. Разработка и оптимизация оригинальных эффективных и экологически безопасных способов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических соединений с применением химических и электрохимических методов, а также методов выделения и очистки целевых продуктов.

3. Изучение механизма электрохимической трансформации исходных реагентов с использованием данных циклической вольтамперометрии и оптимизация процессов электросинтеза на основании полученных данных.

4. Установление строения целевых веществ с помощью комплекса современных физико-химических методов (одномерной спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н, |3С и 14N; двумерной спектроскопии ЯМР с использованием последовательностей НМВС, HSQC и NOESY; масс-спектрометрии; ИК-спектроскопии) и квантово-химических расчетов. Оценка физико-химических свойств полученных веществ (температуры плавления, растворимости, смешиваемости).

5. Определение in vitro антибактериальной и противогрибковой активности синтезированных соединений, оценка влияния строения вещества на его активность и выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего изучения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенных исследований:

• Разработан новый, простой и низкозатратный способ синтеза вицинальных азидойодидов (выход до 77%) действием системы ИаИз-Ь на алкены. Получено 12 веществ (из них 5 ранее не описаны).

• Предложен новый, удобный и безопасный метод химического получения арилтиоцианатов из производных анилина, пиррола и индола (выход до 87%) с использованием системы К5СН-Си804-К28208. Синтезировано 11 арилтиоцианатов. По результатам данного исследования подана заявка на получение патента РФ.

• Реализован оригинальный, селективный и экологически привлекательный процесс электрохимического тиоцианирования производных анилина, пиррола, индола и азола с выходом целевых продуктов до 92%. Методом циклической вольтамперометрии изучен механизм реакции и показана роль диродана как ключевого интермедиата процесса. Из 10 синтезированных целевых веществ 3 ранее не описаны в литературе и 8 впервые получены электрохимическим методом.

• В рамках развития методологии 8ы"(Ап)-реакций впервые осуществлен электроиндуцированный процесс региоселективного кросс-сочетания пирролов и азолат-анионов. Получено 6 ранее не описанных Ы-пирролилазолов (выход до 75%). На основании данных циклической вольтамперометрии определены механизмы данного процесса.

• Выявлена противогрибковая (в том числе к резистентным грибам) и антибактериальная активность ряда полученных соединений, сопоставимая по уровню минимальной подавляющей концентрации со стандартными препаратами сравнения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Созданы эффективные, одностадийные, малозатратные, экологически привлекательные и пригодные для масштабирования способы функционализации органических веществ на основе использования фармакологически активных (азидных, тиоцианатных и азольных) групп и доступных реагентов. Разработанные методы синтеза внедрены в работу

лаборатории исследования гемолитических реакций №13 и лаборатории органического электросинтеза №37 ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Проведенные в Государственном научном центре по антибиотикам микробиологические испытания 39 синтезированных веществ на примере стандартных бактериальных и грибных контрольных штаммов (Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei и Aspergillus niger) показали, что большинство из них обладает выраженной активностью. Ряд азидов и тиоцианатов показал высокую противогрибковую и антибактериальную активность, что является предпосылкой для направленного создания лекарственных средств на их основе. Выявлено 2 наиболее перспективных производных 2,5-дитиоцианатопиррола, предназначенных для дальнейшего углубленного изучения. Полученные азиды, тиоцианаты и азолы могут использоваться как полупродукты синтеза различных групп биологически активных веществ - азиридинов, азолов, тиолов, тиазолов и тиосульфонатов, обладающих, согласно литературным данным, антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты проведенных исследований доложены на VIII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ-РАН-ВУЗЫ (Москва, 2008 г.), Всероссийской конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва, 2009 г.), 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (Воронеж, 2010 г.), VI Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций» (Москва, 2011 г.), VII Всероссийской с международным участием конференции-школе по электрохимии органических соединений «ЭХОС-2012» (Тамбов, 2012 г.), IV Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 2012 г.).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена обработка, научное обоснование и интерпретация полученных экспериментальных данных. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их экспериментальной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1 и 2 паспорта.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 01200606352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01200907145).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Метод синтеза алкилазидов из алкенов реакцией с системой ЫаМ3-12 в смеси метанола с водой.

2. Метод синтеза арилтиоцианатов из аренов реакцией с системой KSCN-CuS04-K2S208 в смеси ацетонитрила с водой и электрохимическим путем в среде ацетонитрила.

3. Метод синтеза N-пирролилазолов в результате электроиндуцированного SNH(An)-процесса региоселективного кросс-сочетания пирролов и азолат-анионов.

4. Результаты определения in vitro антибактериальной и противогрибковой активности полученных веществ, выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего углубленного изучения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 135 страницах (включая приложения 1 - 3). Она содержит 25 рисунков, 29 схем и 21 таблицу. Библиография включает 169 ссылок, из них 34 отечественных источника. В первой главе систематизирован материал по биологической активности и основным способам получения азидов, тиоцианатов и N-арилазолов. Вторая глава посвящена интерпретации и обобщению собственных результатов. Третья глава представляет собой экспериментальную часть работы и включает в себя описание методов исследования, использованных в работе, условия экспериментов и аналитические данные. Далее представлены выводы по проделанной работе и список литературы. В приложениях к диссертационной работе приведены соответствующие копии заявки на получение патента (приложение 1) и актов внедрения (приложения 2 и 3).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, а также подана заявка на получение патента РФ.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта президента Российской Федерации НШ-4945.2010.3, гранта 8651 программы Министерства образования и науки РФ "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, гранта Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 12-03-00517) и гранта программы ОХНМ по направлению 1.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез вицинальных азидойодидов действием системы на алкены.

На первом этапе предложен новый эффективный и безопасный метод синтеза вицинальных азидойодидов, основанный на реакции алкенов с системой НаЫ3-[2 в растворителе метанол-вода (схема 1).

_ЫаИз-!;_ 'чД1

яП*2 МеОН / Н20, 20 - 25 °С ' ^ я? + я' я2 А-1 - А-12 Б-1 - Б-12 Г-7, Г-10, Г-12

62-77% 12-29%

А-1, Б-1: С4Н9; Я2=Н; А-2, Б-2: Я'=-(СН2),-; Я2=Н; А-3, Б-3: П'=-(СН2)Г; Я2=Н; А-4, Б-4: Я^ЧСН,),,-; К-=ГI; А-5, Б-5: К'И; ЯНЧк А-6, Б-6: Я'=Н: Я2=4-МеРЬ; А-7, Б-7. Г-7: Я'=Н; Я2=-РЬСН2-; А-8, Б-8: Я'=-(СН2)20-: Я2=П; А-9, Б-9: Я'=-(СН2)зО-; Я2=Н; А-10, Б-10. Г-10: Я'=СООМе; Я2=Н; А-11, Б-11: Я'СООЕц К2=Мс; А-12, Б-12, Г-12: Я'=Ме, СООМе; Я2=Н;

Схема 1. Синтез азидойодидов из алкенов.

Реакция протекает в мягких условиях за 2 - 4 ч (в зависимости от строения исходного алкена) с хорошим выходом (62 - 77%). Данный процесс не требует катализаторов, дорогостоящих растворителей и значительных избытков реагентов. В случае индена А-7 и акриловых эфиров А-10 и А-12 при увеличенном времени реакции (24 - 48 ч) с выходом 12 - 29% образуются диазиды Г-7, Г-10 и Г-12, вероятно, в результате нуклеофильного замещения атома йода азидо-группой в азидойод-аддуктах Б-7, Б-10 и Б-12.

Азидойодиды Б-1 - Б-12 (кроме Б-7) и диазиды Г-7, Г-10 и Г-12 - бесцветные маслянистые жидкости. Азид Б-7 - твердые бесцветные кристаллы (т. пл. 55 - 57 °С). Азиды Б-1 — Б-6, Б-8 — Б-12 в любых соотношениях смешиваются с полярными органическими растворителями (МеОН, ЕЮН, СН2С12, СНСЬ, ТНИ) и не смешиваются с водой. Азид Б-7 растворяется в тех же органических растворителях и не растворим в воде. Все вещества хранятся без разложения при температурах — 10 -н -15 °С в течение 1 года. При идентификации азидов и диазидов наиболее информативной является спектроскопия ЯМР ,3С. При этом наиболее характеристичным является сигнал СЫ3-группы: 60.0 - 75.0 м.д. (Б-1 - Б-7 и Г-7), 50.0 - 60.0 м.д. (Б-10 - Б-12, Г-10, Г-12), 90.0 - 100.0 м.д. (Б-8 и Б-9).

2. Синтез арилтиоцианатов.

2.1. Действием системы К8С№Си804-К28208 на производные анилина, пиррола и индола.

На втором этапе разработан эффективный метод синтеза арилтиоцианатов, основанный на реакции производных анилина, пиррола и индола с системой КБСМ-СиБС^-КгЗгОв в растворителе МеСМ-Н20 (схема 2). Процесс протекает в мягких условиях и не требует значительных избытков реагентов.

Д-1-Д-5

KSCN-K2S,08-CUS04

MeCN/H20.20 - 25 °С

SCN

Е-1 - E-S; Ж-4

58 - 87%

iVsCN

r4 Е-6, Ж-6, Ж-7 45-61%

SCN

N R6

Е-8 - Е-10

75 - 80%

Д-1, Е-1: Ri=R2=R-!=II; Д-2, Е-2: R'=H; R2=R'1=Mc; Д-3, Е-3: R'=II; R2=R1=Et; Д-4: R'=H;

R2=H; R3=PIiSCN; Ж-4: R'=H; R2=H; R3=4-PhSCN; Д-5, E-5: R^R^ -CH=CH-CH=CH-;

R2=R3=H; Д-6: R4=Me; E-6: R4=Me; RHl; Ж-6: R4=Me; R5=SCN: Д-7: R4=Pli; Ж-7: R4=Ph;

R5=SCN; Д-8, E-8: R6=R7=H; Д-9, E-9: R6=Me; R7=H; Д-10, E-10: Rf,=H; R7=OMe;

Схема 2. Тиоцианирование производных анилина, пиррола и нидола.

В ходе оптимизации синтеза изучали влияние природы растворителя, тиоцианата, окислителя, соли металла переменной валентности, а также молярного соотношения реагентов на конверсию и выход целевых продуктов. В результате оптимальная реакционная система включала в себя 2 моль KSCN, 1 моль bC^S^O^ и 0.1 моль CuS04 на 1 моль арена в среде водного ацетонитрила. В случае дифениламина Д-4, N-метилпиррола Д-6 и N-фенилпиррола Д-7 при увеличеннии избытка реагентов в 1.5 - 2 раза и времени реакции до 24 ч с выходом 55 - 61% получены соответствующие продукты дитиоцианирования (Ж-4, Ж-6, Ж-7).

2.2. Электросинтез арилтиоцианатов из производных анилина, пиррола, индола и азола.

На третьем этапе нами предложен экологически привлекательный электрохимический метод тиоцианирования аренов в среде ацетонитрила (схема 3) при потенциале окисления тиоцианат-аниона 0.7 В (отн. нас. к.э.). я1

НЫ

Д-1.Д-4 Д-6.Д-7

Д-8-Д-10 ^

Я? I

Д-И.Д-12

О

N Я2

я3

О

ын2 ын.

М-^СИ, ЕАП=0.7 В

0.1М ЫсаС\Оа МсСЫ

2

Е-1, Е-4

БСЫ 65%, 72%

О^вСК Е.6, Е-7 ¿2 53%, 75 % БСЫ

Тп

Ч^Ц/ Е-8-Е-10 ^з 80-92%

Я'

8СЫ

Я5

N11,

Р=(

Е-11, Е-12

75%, 65%

Е-13

59%

Д-13 я7

Д-1, Е-1: Я'=Н; Д-4, Е-4: Я^РЬ; Д-6, Е-6: К2=Мс; Д-б, Е-7: Я2=РЬ; Д-8, Е-8: Я3=Я4=Н;

Д-9, Е-9: Я3=Ме; Я4=Н; Д-10, Е-10: Я3=Н; Я4=ОМе; Д-11, Е-11: Я5=Ме; Я6=Рг; Д-12, Е-12:

Я5=СН2РЬ; Я6=Ме; Д-13, Е-13: Я7=РЬ.

Схема 3. Электрохимическое тиоцианирование аренов.

На основании данных циклической вольтамперометрии нами был установлен механизм процесса (схема 4). Согласно ему, тиоцианат-анион окисляется до тиоцианат-радикала А, который димеризуется с образованием диродана Б. Диродан как псевдогалоген присоединяется к индолу по механизму электрофильного ароматического замещения с образованием целевого продукта В.

X 2 _ ,ол>хп Аг-Н

БСЫ-

•БСЫ-А

• (вСЫ), Б

-шсы

-Аг-БСЫ В

Схема 4. Общий механизм электрохимического тиоцианирования аренов.

Арилтиоцианаты E-l - Е-13 (кроме Е-6) и дитиоцианаты Ж-4, Ж-6 и Ж-7 -бесцветные кристаллы, пирролилтиоцианат Е-6 представляет собой бесцветную маслянистую жидкость. Вещества Е-1 - Е-5, Е-7 - Е-10 умеренно растворимы в воде (Е-6 с ней смешивается) и хорошо растворимы в органических растворителях -МеОН, EtOH, СН2С12, CHCI3, THF (Е-6 смешивается с ними в любых соотношениях). Азолилтиоцианаты Е-11 - Е-13 хорошо растворимы в воде и в полярных органических растворителях - МеОН, EtOH, MeCN, умеренно растворимы - в СН2С12, СНС13, THF. Все вещества при температуре +10 + +15 °С хранятся без разложения в течение 2 лет, при температуре +20 + +25 °С - в течение 1 года. При идентификации тиоцианатов и дитиоцианатов наиболее информативной является спектроскопия ЯМР на ядрах ,3С и ИК-спектроскопия. При этом наиболее характеристичными являются низкоинтенсивные сигналы SCN-группы в области 100 - 120 м.д на спектрах ЯМР 13С и интенсивные сигналы валентных колебаний SCN-группы в интервале 2140 - 2180 см"1 на ИК-спектрах. На рис. 1 - 3 для 2,5-дитиоцианато-Ш-пиррола Ж-6 представлены: спектр ЯМР |3С (виден сигнал SCN-групп при 108.44 м.д.), ИК-спектр (наблюдается сигнал на частоте 2160 см"1) и масс-спектр (видны интенсивные пики молекулярного иона с m/z 195 — 197).

Рис. 1. Спектр ЯМР 13С 2,5-дитиоцианато-Ш-пиррола Ж-6.

lOO

9U

50

30

20

Рис. 3. Масс-спектр 2,5-дитиоцианато-1//-пиррола Ж-6.

l»ily loollUK о! Ог|ж* Cbumiuy. ilniw. K/«le MS ÍO(LX) St® «S S

30 60

oo Aimba ТО с V T-»0C Diiwi вхгоЛи-Поп probe. Opr KiJocyrtlnJ N O..

iWcl

J

3. Электрохимический синтез N-пирролилазолов.

На четвертом этапе нами получены ранее не описанные N-пирролилазолы (схема 5). Процесс протекает при потенциале окисления пиррола в присутствии азолат-аниона в разделенной ячейке и представляет собой электрохимический

аналог реакций /фосс-сочетания.

f\ --_ ^

N 0.1 М NaC104 MeCN/MeOH 4/1 4N R R

Д-7.Д-8 3-1-3-6

45 - 75 %

02N NO,

N-^ V-^ N-^ "

3-1: R = Me; Az N; 3-3: R = Me; Az - \, N;3-5: R = Me; Az = ^XIN: NN N

H 02NH H NO,

N~\\ )ri\ "

3-2: R = Ph; Az = N: 3-4: R = Ph; Az = ч N¡3-6: R = Ph; Az = N.

H H H

Схема 5. Синтез N-пирролилазолов. На основании данных циклической вольтамперометрии предложен механизм процесса (схема 6). Согласно ему, на первой стадии пиррол окисляется до катион-радикала А. Катион-радикал взаимодействует с азолат-анионом и образует радикал Б, который окисляется до катиона В. Затем катион депротонируется с образованием целевого продукта.

NO,

О— ©^©^у—у -vChC

N

/-»■ Г. -»-Р. I -»"С-'/^ГЧ I -Г"*" ^ У 1X1 I

N N N ы=< N -Н+ N ^

СН, СП, СП, N0, ¿Н, N0, ¿И, N0,

А Б В

Схема 6. Механизм электрохимического азолирования пирролов (на примере К-метил пиррола).

Так как Ы-пирролилазолы были получены впервые, необходимо было точно установить их строение. Для этого на примере 3-5 были получены спектры ЯМР на ядрах 'Н, 13С и 14Ы, двумерные спектры НМВС, ИБС^С и ЫОЕБУ и произведены квантово-химические расчеты с помощью программы РГШЮБА®. В результате

установлено, что пирролы реагируют по положению 2, а амбидентные азолат-анионы - по положению 1.

Полученные N-пирролилазолы 3-1 - 3-6 - желтоватые кристаллы. Они мало растворимы в воде и хорошо растворимы в органических растворителях - МеОН, ЕЮН, СН2С12, СНС13, THF. Все вещества при температуре +10 + +15 °С хранятся без разложения в течение 3 лет, при температуре 20 + 25 °С - в течение 2 лет. В спектрах ЯМР отсутствуют какие-либо характеристичные сигналы для данной группы веществ, поэтому наиболее подходящий метод идентификации - масс-спектрометрия.

4. Определение антибактериальной и антигрибковой активности полученных соединений. Оценка влияния строения вещества на его активность.

Согласно литературным данным, азиды, тиоцианаты и азолы обладают достаточно широким спектром биологической активности, поэтому можно ожидать наличия аналогичных свойств у синтезированных нами соединений.

В первую очередь, представляет интерес изучение антибактериальных и антигрибковых свойств полученных в настоящей работе веществ, тем более что для существующих антибактериальных и противогрибковых лекарственных средств характерно постоянное появление резистентных к ним штаммов микроорганизмов.

Исследования проведены в отделе микробиологических исследований Государственного научного центра по антибиотикам в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04), рекомендациями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) и European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).

В качестве контрольных штаммов были выбраны Staphylococcus aureus АТСС 29213 (S. aureus, SA), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus АТСС 44330 (MRSA), Escherichia coli АТСС 25922 (Е. coli, ЕС), Candida albicans АТСС 24433 (С. albicans, CA), Aspergillus niger ГНЦА 37a (A.niger, AN) и клинические изоляты Candida tropicalis 30.1.9 (С. tropicalis, CT) и Candida krusei 432M (C. krusei, CK).

Оценку эффективности синтезированных веществ проводили путем сопоставления их минимальных подавляющих концентраций (МПК) со значениями МПК ряда современных антибактериальных и противогрибковых лекарственных средств различных классов, представленных в табл. 1 и 2. Для контроля правильности исследований были использованы соответствующие растворы субстанций хломрамфеникола (ХА), ципрофлоксацина (ЦПФ), гентамицина сульфата (ГС), амфотерицина Б (АМБ) и флуконазола (ФЛАЗ).

Таблица 1

МПК стандартных современных антибактериальных лекарственных средств (в соответствии с МУК 4.2.1890-04)

Препарат (класс) МПК, м кг/мл

SA MRSA ЕС

Ампициллин (пенициллины) 0.5-2.0 - 2.0-8.0

Гентамицин (аминогликозиды) 0.12 -1.0 - 0.25-1.0

Левофлоксацин (фторхинолоны) 0.06-0.5 - 0.008-0.06

Тетрациклин (тетрациклины) 0.12-1.0 - 0.5-2.0

Цефотаксим (цефалоспорины III поколения) 1.0-4.0 - 0.03-0.12

Хлорамфеникол (нитрофенилалкиламины) 2.0-8.0 - 2.0-8.0

Ванкомицнн (трициклические гликопептиды) 0.5-2.0 0.5-2.0 -

Оксациллин (пенициллины) 0.12 - 0.5 - -

Кларитромицин (макролнды) 0.12-0.5 - -

Таблица 2

МПК стандартных современных противогрибковых лекарственных средств (в соответствии с рекомендациями СЬв! и ЕиСАвТ)

Препарат (класс) МПК, м кг/мл

CA CT CK AN

Амфотерицин Б (полиепы) 0.06 -1.0 0.12-1.0 0.25-2.0 0.5-4.0

Нтраконазол (имидазолы) 0.06-0.5 0.12-0.5 0.5-4.0 0.06-0.25

Флуконазол (триазолы) 32.0 -128.0 32.0 -128.0 16.0-64.0 -

Тербинафин (аллиламины) 25.0 -100.0 0.08-0.32 0.08-0.32 0.05 -1.56

Каспофунгин (эхинокандины) 0.06-0.25 0.12 -1.0 1.0-2.0 0.25 -1.0

Флуцитозин (пирнмидииы) 0.06-0.25 0.06-0.25 1.0-4.0 -

Определение активности вицинальных азидойодидов и диазидов. Активность азидов Б-1 - Б-12 и диазидов Г-7, Г-10 и Г-12 (рис. 5) определяли методом диффузии в агар. В табл. 3 приведены значения МПК испытуемых образцов, при которых диаметр подавления зон роста был не менее 15 мм. Следует отметить, что все азиды малоактивны в отношении MRSA, С. tropicalis и С. krusei (МПК > 250.0 мкг/мл).

а: гх: *

N3 U^J ,

Б-3 Б-4 Б-5

N, I

Nj

-о

Г-7 Б-8 Б-9

N3 О О О

"OEt Nj^f^OMe Nj^f^OMe I I N3

Б-11 Б-12 Г-12

Рис. 5. Азидойодиды и диазиды, для которых определяли антимикробную актинность

Алкилазидойодиды Б-1 - Б-4 (табл. 3) проявляют низкую активность в отношении S. aureus и более выраженную - в отношении Е. coli, С. albicans и А. niger (МПК 3.9 - 7.8 мкг/мл). Азид Б-5, содержащий бензольное кольцо, более активен в отношении бактерий (МПК 3.9 - 15.6 мкг/мл) и грибов (МПК 0.48 - 0.96 мкг/мл). Введение метильной группы в ароматическое кольцо (азид Б-6) приводит к незначительному снижению антимикробных свойств по сравнению с Б-5.

Аннелированное бензольное кольцо у Б-7 усиливает антимикробный эффект по сравнению с Б-2, особенно в отношении С. albicans и A. niger (МПК 0.24 - 0.48 мкг/мл). Кислород в циклах Б-8 и Б-9 заметно увеличивает активность по сравнению с соответствующими азидами Б-2 и Б-3.

Наличие сложноэфирных групп у Б-10, Б-11 и Б-12 обеспечивает наиболее выраженные антимикробные свойства среди всех представленных азидойодидов. В

отношении грибов МПК составляет 0.12 мкг/мл. Замена йода на азидогруппу (диазиды Г-7, Г-10 и Г-12) приводит к дальнейшему росту антигрибковых свойств по сравнению с соответствующими азидойодидами Б-7, Б-10 и Б-12.

Таблица 3

Антимикробная активность азидов Б-1 - Б-12, Г-7, Г-10 и Г-12.

Образец МПК, мкг/мл)

Бактерии Грибы

Грам + Грам —

SA MRSA ЕС СА СТ СК AN

Б-1 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9

Б-2 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9

Б-3 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9

Б-4 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9

Б-5 15.6 >250 3.9 0.98 >250 >250 0.49

Б-6 31.2 >250 7.8 0.98 >250 >250 0.98

Б-7 3.9 >250 3.9 0.24 >250 >250 0.49

Г-7 3.9 >250 3.9 0.12 >250 >250 0.24

Б-8 15.6 >250 3.9 0.24 >250 >250 0.24

Б-9 15.6 >250 3.9 0.24 >250 >250 0.24

Б-10 1.9 >250 1.9 0.12 >250 >250 0.12

Г-10 1.9 >250 1.9 0.06 >250 >250 0.06

Б-11 1.9 >250 1.9 0.12 >250 >250 0.12

Б-12 1.9 >250 1.9 0.12 >250 >250 0.12

Г-12 1.9 >250 1.9 0.06 >250 >250 0.06

ХА 3.9 - 0.96 - - - -

ЦПФ 0.24 - 3.9 - - - -

ГС 0.12 - 0.96 - - - -

АМБ - - - 0.48 0.48 0.48 0.96

ФЛАЗ - - - 0.48 7.8 32 125

Определение активности арилтиоцианатов и дитиоцианатов. Активность тиоцианатов Е-1 - Е-13 и дитиоцианатов Ж-4, Ж-6 и Ж-7 (рис. 6) определяли методом двойных серийных разведений. В табл. 4 приведены значения МПК испытуемых образцов, при которых отсутствовал видимый рост микроорганизмов.

Тиоцианаты анилинового ряда Е-1, Е-2 и Е-3 (табл. 4) малоактивны или неактивны в отношении бактерий (МПК > 62.5 мкг/мл) и более активны в отношении грибов (МПК 31.2 — 125 мкг/мл). Моно- и дитиоцианатопроизводные

дифениламина Е-4 и Ж-4 не проявляют активности (МГЖ> 250 мкг/мл). Наличие аннелированного бензольного цикла у 4-тиоцианато-1-аминонафталина Е-5 усиливает антимикробный эффект по сравнению с Е-1, в отношении грибов (МПК 7.8 - 15.6 мкг/мл) и бактерий (МПК 3.9 - 15.6 мкг/мл), за исключением Е. coli (МПК > 250 мкг/мл).

Ме. Ме EU. ..Et f|) NH, N N Ц^А

NCS

fVsCN £^SCN ' NCS

"N NCS N

Me Me

E-6 Ж-6 E-7

fCN . /SCN 4 SCN

T

H

■N Ч/^N N'N-HiH,

Me H

E-9 E-10 E-ll

Рис. 6. Тиоциаиаты и дитиоцианаты, для которых определяли антимикробную активность

Антимикробные свойства 2-тиоцианатопиррола Е-6 сопоставимы с Е-5, однако он подавляет рост Е. coli (МПК 31.2 мкг/мл). Замена метальной группы на фенильную (в случае Е-7) снижает активность по сравнению с Е-6.

Образец Ж-6, содержащий 2 SCN-группы, обладает выраженной активностью в отношении бактерий S. aureus, Е. coli (МПК 3.9 мкг/мл), MRSA (МПК 0.48 - 0.96 мкг/мл) и высокой активностью в отношении грибов С. albicans, С. krusei, А. niger (МПК 0.12 мкг/мл) и С. tropicalis (МПК 7.8 мкг/мл). Замена метальной группы при атоме азота Ж-6 на фенильную (дитиоцианат Ж-7) существенно снижает активность Ж-7 в отношении E.coli, MRSA и С. krusei, Вместе с тем сохраняется его довольно высокая активность по отношению к С. albicans (МПК 0.48 мкг/мл), С. tropicalis

(МПК 15.6 мкг/мл) и А. ш§ег (МПК 0.48 мкг/мл), что позволяет сделать вывод о более высокой селективности Ж-7 по отношению к грибам.

Таблица 4

Антимикробная активность Е-1 - Е-13, Ж-4, Ж-6 и Ж-7

Азид Минимальная подавляющая концентрация (МПК, мкг/мл)

Бактерии Грибы

Грам + Грам -

вА М1«А ЕС СА ст СК AN

Е-1 125 62.5 >250 62.5 31.2 62.5 125

Е-2 62.5 62.5 >250 31.2 62.5 31.2 31.2

Е-3 125 62.5 >250 >250 62.5 62.5 62.5

Е-4 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250

Ж-4 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250

Е-5 3.9 15.6 >250 15.6 7.8 7.8 7.8

Е-6 15.6 15.6 31.2 7.8 15.6 7.8 7.8

Ж-6 3.9 0.48 3.9 0.12 7.8 0.12 0.12

Е-7 62.5 >250 >250 31.2 62.5 >250 62.5

Ж-7 15.6 >250 >250 0.48 15.6 >250 0.48

Е-8 31.2 15.6 62.5 7.8 31.2 250 31.2

Е-9 31.2 62.5 >250 7.8 31.2 7.8 15.6

Е-10 15.6 31.2 250 62.5 62.5 62.5 31.2

Е-11 62.5 62.5 250 125 62.5 125 31.2

Е-12 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250

Е-13 62.5 62.5 250 125 62.5 125 31.2

ХА 3.9 - 0.96 - - - -

ЦПФ 0.24 - 3.9 - - - -

ГС 0.12 - 0.96 - - - -

АМБ - - - 0.48 0.48 0.48 0.96

ФЛАЗ - - - 0.48 7.8 32 125

Производные индола (Е-8, Е-9 и Е-10) проявляют более низкую антимикробную активность (МПК 15.6 - 62.5 мкг/мл) по сравнению с производными пиррола Ж-6 и Ж-7.

Тиоцианаты аминоазола (Е-11) и изоксазола (Е-13) обладают слабо выраженными антимикробными свойствами (МПК 62.5 - 125 мкг/мл), за исключением А. ш§ег (МПК 31.2 мкг/мл). Замена метальной группы при атоме азота у Е-11 на бензильную в случае Е-12, полностью подавляет активность (МПК > 250 мкг/мл).

Определение активности N-пирролилазолов. Активность N-пирролилазолов (рис. 7), как и в случае арилтиоцианатов, определяли методом серийных разведений. Из табл. 5 следует, что все N-пирролилазолы практически не обладают антибактериальной и противогрибковой активностью. Слабо выраженная активность наблюдается только в отношении S. aureus и MRSA (МПК 31.2 - 62.5 мкг/мл) у производных N-метилпиррола 3-1 и 3-5, содержащих 1,2,4-триазол или 3-нитро-1,2,4-триазол.

О-О1 ^ (TVnV02

(XS Ч f\

-N К

■N | N N'

■N N'

Me f \\ Me

3-1 3-2 3-3 3-4

Me " ^J

3-5 3-6

Рис. 7. N-пирролилазолы, для которых определяли антимикробную активность.

Таблица 5

Антимикробная активность 3-1 - 3-6.

Азид Минимальная подавляющая концентрация (МПК, мкг/мл)

Бактерии Грибы

Грам + Грам-

SA MRSA ЕС СА СТ СК AN

3-1 31.2 31.2 125 125 >250 125 >250

3-2 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250

3-3 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250

3-4 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250

3-5 62.5 62.5 250 250 >250 250 >250

3-6 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250

ХА 3.9 - 0.96 - - - -

ЦПФ 0.24 - 3.9 - - - -

ГС 0.12 - 0.96 - - - -

АМБ - - - 0.48 0.48 0.48 0.96

ФЛАЗ - - - 0.48 7.8 32 125

В результате проведенных микробиологических испытаний выявлены антибактериальные и противогрибковые свойства азидов и тиоцианатов. Производные ТЧ-арилазола не показали выраженной активности, что не исключает наличие других видов биологической активности, поиск которой может стать предметом дальнейших исследований.

Наибольшая антибактериальная и антигрибковая активность, сопоставимая со стандартными препаратами сравнения (см. табл. 1 и 2) наблюдается у диазидов и дитиоцианатов. Это создает предпосылки для дальнейших исследований в плане направленного создания новых лекарственных средств на их основе.

Вместе с тем, учитывая физико-химические свойства, дитиоцианатопроизводные пирролов Ж-6 и Ж-7 (рис. 8) являются наиболее перспективными антигрибковыми соединениями среди всех полученных нами веществ, в связи с чем на способ получения данных веществ подана заявка на получение патента РФ.

Рис. 8. Наиболее перспективные противогрибковые вещества !Ч-метил-2,5-дитиоцианато-1 //-пиррол Ж-6 и 1Ч-феинл-2,5-дитиоцианато-1//-пиррол Ж-7.

1. На основании анализа литературных данных сформулированы основные идеи по реализации процессов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических веществ.

2. Предложены одностадийные, малозатратные, экологически привлекательные и пригодные для масштабирования способы функционализации органических веществ в мягких условиях с применением доступных реагентов:

Ж-6

Ж-7

ВЫВОДЫ

а) Азидирование алкенов с использованием новой системы NaN3-I2 и получением вицинальных азидойодидов с выходом до 77%.

б) Тиоцианирование аренов при использовании новой системы KSCN-CuS04-K2S2O8 с выходом целевых продуктов до 87%.

в) Электросинтезы в мягких условиях арилтиоцианатов с выходом до 92% и N-пирролилазолов с выходом до 75%, которые позволяют отказаться от применения однократно используемых (подчас дорогостоящих) реагентов, с их заменой на электрический ток.

2. На основании данных циклической вольтамперометрии установлены механизмы электросинтеза арилтиоцианатов и N-пирролилазолов, позволяющие управлять данными процессами и прогнозировать влияние строения исходных реагентов и условий эксперимента на эффективность реализации процессов;

3. С помощью спектроскопии ЯМР *Н и 13С (в ряде случаев двумерных спектров ЯМР НМВС, HSQC и NOESY), ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии и элементного анализа подтверждено строение целевых продуктов и определена регионаправленность процессов. Проведена оценка физико-химических свойств полученных веществ (температуры плавления, растворимости, смешиваемости).

5. Синтезировано 39 целевых (в том числе 19 ранее не описанных) соединений. В опытах in vitro выявлено, что вещества, содержащие 2 азидные или 2 тиоцианатные группы, обладают высоким уровнем противогрибковой и антибактериальной активности, сопоставимой по уровню действия со стандартными препаратами сравнения. Выявлено 2 наиболее перспективных производных 2,5-дитиоцианатопиррола, предназначенных для дальнейшего углубленного изучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Terent'ev А.О., Krylov I.B., Kokorekin V.A., Nikishin G.I. Facile Method for the Synthesis of Vicinal Azidoiodides by the Reaction of the NaN3-h System with Unsaturated Compounds. // Synth. Comm. - 2008. - Vol. 38, № 21. - P. 3797-3809.

2. Кокорекин B.A., Терентьев А.О., Крылов И.Б., Никишин Г.И. Удобный метод получения азидоиодидов как предшественников синтеза 1,2,3-триазолов действием

системы NaN3-I2 иа непредельные соединения. - В сборнике материалов VIII ежегодной международной конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ "БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА" (11-13 ноября 2008 года). - Москва: ИБХФ РАН, 2008. - С. 108-109.

3. Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Крылов И.Б., Симакова Е.А., Никишин Г.И. Удобный метод получения вицинальных азидоиодидов действием системы NaN3-I2 на непредельные соединения. Определение антимикробной активности азидоиодидов. - В сборнике материалов Всероссийской конференции по органической химии, посвященная 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (25 - 30 октября 2009 года). -Москва: ИОХ РАН, 2009. - С. 223.

4. Кокорекин В.А. Синтез вицинальных азидоиодидов действием системы NaN3-I2 на алкены. Определение антимикробной активности азидоиодидов. - В сборнике материалов 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (24 - 26 апреля 2010 года). - Воронеж: ВГУ, 2010.-Т. 2.-С. 193-194.

5. Кокорекин В.А., Петросян В.А. Электроиндуцированное гомолитическое роданирование аренов. - В сборнике материалов VI Всероссийской конференции-школы «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций». - Московская область: 2011. - С. 23.

6. Electrochemical Azolation of N-substituted Pyrroles: A New Case in SNH(An) Reactions / Sigacheva V.L., Kokorekin V.A., Strelenko Y.A., Neverov S.V., Petrosyan V.A. // Mend. Comm. - 2012. - Vol. 22, №5. - P. 270-272.

7. Кокорекин В.А. Прямое электрохимическое азолирование и тиоцианирование аренов. - В сборнике материалов VII Всероссийской с международным участием школы по электрохимии органических соединений (ЭХОС - 2012). - Тамбов: ТГТУ, 2012. - С. 94-97.

8. Кокорекин В.А., Раменская Г.В., Родионова Г.М., Петросян В.А. Электросинтез биологически активных веществ на основе роданирования и азолирования гетероаренов. - В сборнике материалов IV международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования

в физиологии, медицине, фармакологии" (1-2 ноября 2012 года). - Санкт-Петербург: 2012. -Т. 1. - С. 40-42.

9. Заявка № 2013107735. Способ получения ^замещенных 2,5-днтиоцианато-Ц^-пирролов / Терентьев А.О., Кокорекин В.А., Петросян В.А., Грамматикова Н.Э.; Заявитель: ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН. - Дата подачи заявки 22.02.2013

10. Синтез и противогрибковая активность арилтиоцианатов / Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Раменская Г.В., Грамматикова Н.Э., Родионова Г.М., Иловайский А.И. // Хим.-фарм. журнал - 2013. - Т. 47, №8. - С. 26 - 29

Подписано в печать: 20.11.13

Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 154 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru