Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади

На правах рукописи

СИТНИК Наталья Павловна

РАЗРАБОТКА ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИРАБИЧЕСКОГО ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЛОШАДИ

14 00 36 - «Аллергология и иммунология»

003 1В20У1

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2007

003162071

Работа выполнена в лаборатории препаратов крови филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препарат ам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Алсынбаев Махамат Махаматуллович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Маннапова Рамзия Тимергалеевна, доктор медицинских наук Азнабаева Лилия Фаритовна

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Защита состоится 13 ноября 2007 г в 14 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002124 01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу 450014, г Уфа,ул Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 450014, г Уфа, ул Новороссийская, 105

Автореферат разослан « » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Лукманова К А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

По данным ВОЗ (2005), в мире ежегодно регистрируется от 35000 до 55000 случаев смерти людей от бешенства и около 500000 случаев активно-пассивной иммунизации [Goudsmit J et al, 2006] Проблема бешенства актуальна и для России, где эпидемиологическая обстановка по бешенству характеризуется как неблагоприятная [Оншценко Г Г, 2003, Медуницын H В , 2004] Клиническая картина заболевания бешенством характеризуется тяжелым поражением нервной системы и без специфического лечения приводит к летальному исходу Комитет ВОЗ по бешенству рекомендовал применение антирабического иммуноглобулина (АРИГ) во всех случаях возможного заражения людей бешенством, так как профилактика бешенства одной антирабической вакциной не всегда эффективна [Tomasiewicz К et al, 2006] Препарат АРИГ входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств РФ (2007) и в состав перечня ВОЗ основных лекарственных средств (2000) Высокоочищенный АРИГ из сыворотки крови лошади является эффективной, доступной, дешевой и относительно безопасной альтернативой гомологичному препарату АРИГ, который почти недоступен из-за трудностей иммунизации волонтеров и небольшого объема производства [WHO, 2005, Sudarshan M К et al, 2007] Согласно рекомендациям Европейского агентства по контролю качества лекарственных препаратов (2002), качество гетерологичных препаратов иммуноглобулина (ИГ) должно определяться не только эффективностью их применения, но и безопасностью, которая обеспечивается высокой электрофоретической чистотой, минимальным содержанием полимеров, Fc-фрагментов и высоким содержанием Б(аЪ)2-фрагментов иммуноглобулина G, реактогенность которых примерно в 3 раза ниже реактогенности мономеров [Theakston R D G et al, 2003] Использование недостаточно очищенных гетерологичных серопрепаратов сопровождается высоким риском возникновения побочных реакций Частота и тяжесть нежелательных реакций, возникающих на ксеногенные сывороточные препараты, в значительной степени зависит от технологии их получения, степени очистки и состава [Wilde H et al, 1989] В России зарегистрированы два препарата иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади производства - ЗАО «Биолек» (Украина) и Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», получаемые при иммунизации продуцентов штаммом фиксированного вируса бешенства «Москва» и обладающие достаточно высокой специфической активностью Однако, согласно нормативно-технической документации, в этих препаратах допускается содержание примесных а- и р-глобулинов до 20 %, а у-глобулинов -не менее 80 % [ФСП 42-412ВС-93, ФСП 42-0020441303], что свидетельствует о недостаточно высокой степени очистки препаратов и возможности дальнейшего совершенствования технологии получения иммуноглобулина Кроме того, они не контролируются на степень агрегации и фрагментации иммуноглобулина, а также на осмолярность, которые являются показателями безопасности иммуноглобулиновых препаратов

Цель исследования

Разработка иммунологических критериев качества и безопасности вирусного антигена и антирабической плазмы и оптимизация технологии получения высокоспецифичного и высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади

Задачи исследования

1 Определить причинность реактогенности гетерологичного антирабического иммуноглобулина в отношении иммунореактивных примесных компонентов антигена вируса бешенства бычьего сывороточного альбумина, почек сирийского хомяка и яселатозы

2 Разработать метод удаления из реактогенной антирабической плазмы антител к антигену клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства

3 Разработать требования к антирабической вакцине, предназначенной для иммунизации животных - продуцентов, и к гетерологичной антирабической плазме, предназначенной для получения антирабического иммуноглобулина

4 Оптимизировать технологию производства антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади для получения высокоспецифичного и высокоочищенного Р(аЬ)г-препарата с физиологичной осмолярностью

5 Сравнить разработанный препарат антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади с коммерческими аналогами на соответствие требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам, и изучить стабильность качественных характеристик во время хранения и транспортировки

Научная новизна

Выявлена причинная связь между реактогенностью гетерологичного антирабического иммуноглобулина и содержанием в нем антител к клеткам почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства

Обоснована необходимость использования для иммунизации животных -продуцентов очищенного вируса бешенства, в котором остаточное содержание антигена субстрата репродукции - первичной культуры клеток почек сирийского хомяка составляет не более 0,5 мкг/мл (получен патент РФ)

Предложен контроль антирабической вакцины на содержание в ней антигена клеток почек сирийского хомяка методом ракетного иммуноэлектрофореза, с чувствительностью 0,5 мкг/мл

Впервые предложен метод удаления антител к антигену клеток почек сирийского хомяка из пула реактогенной антирабической плазмы с использованием соответствующего нерастворимого антигена, полученного из лизата почек сирийского хомяка обработкой 96-процентным этанолом

Разработанный препарат антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади характеризуется повышенной электрофоретической чистотой у-глобулинов - более 90 %, а- и Р-глобулинов - менее 10 % Содержание Р(аЬ)г-фрагментов - не менее 90 %, удельная специфическая активность - не менее 4МЕ/мл, содержание натрия хлорида - не более 0,45 %, физиологичная осмолярность - не более 360 мОсм/кг

Научно-практическая значимость работы

Метод ракетного иммуноэлектрофореза для контроля остаточного содержания антигена клеток почек сирийского хомяка, с чувствительностью 0,5 мкг/мл, рекомендуется внести в фармакопейную статью предприятия как на антирабическую вакцину, так и на все вакцины, использующие в качестве субстрата репродукции вируса первичную культуру клеток почек сирийского хомяка, что позволит повысить безопасность как вакцин, так и получаемых с их помощью иммуноглобулиновых препаратов

Гипериммунизация лошадей - продуцентов с использованием низких доз сорбированного на алюминия фосфате вируса бешенства, в котором остаточное содержание антигена субстрата менее 0,5 мкг/мл, позволяет получить ареактогенную высокоспецифичную антирабическую плазму, свободную от нежелательных антител к субстрату репродукции вируса бешенства, и снизить затраты на вирусный антиген

Антирабическая вакцина, полученная на перевиваемой культуре клеток Vero, при равной иммуногенности с вакциной, репродуцированной на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка, позволяет получать более высокий титр вируснейтрализующих антител, поэтому для культивирования вируса бешенства рекомендована замена субстрата репродукции с первичной культуры клеток почек сирийского хомяка на перевиваемую культуру клеток Vero

Предложенный метод контроля гетерологичной антирабической плазмы на реактогенность - внутривенное введение кроликам иммунной плазмы в объеме 10 мл/кг массы - позволяет оценить качество исходного сырья Разработанный метод истощения антител к антигену субстрата репродукции вируса бешенства из реактогенной антирабической плазмы позволяет сохранить исходное сырье от выбраковки Данный подход может быть применен для получения других специфических препаратов гетерологичных иммуноглобулинов Модифицированная технология получения препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, с использованием комбинированного каприлатно-спиртового метода фракционирования с протеолизом, позволяет получить высокоочшценный и безопасный специфичный иммуноглобулин, и может послужить основой для создания гетерологичных противовирусных иммуноглобулиновых препаратов Использование двух дополнительных методов контроля разработанного антирабического иммуноглобулина - контроля молекулярных параметров и осмолярности позволяет предупредить возникновение побочных реакции

Внедрение результатов исследования в практику

На базе иммуноклиники и сывороточного цеха филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ получены две экспериментально-производственные серии лошадиной антирабической плазмы и три экспериментально-производственные серии препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, которые прошли контроль в отделе биологического и технологического контроля департамента качества филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (г Уфа) В проект

фармакопейной статьи предприятия на разработанный препарат иммуноглобулина антирабического внесены методы контроля молекулярных параметров, стабилизаторов - мальтозы и глицина, каприловой кислоты и осмолярности Проекты нормативно-технической документации (Фармакопейная статья предприятия и Инструкция по применению препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади) одобрены решением Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (выписка из протокола № 4 заседания Ученого Совета от 19 сентября 2007 г) Метод ракетного иммуноэлектрофореза для контроля остаточного содержания антигена клеток почек сирийского хомяка был использован контрольно-аналитической лабораторией филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ для выбора серий концентрированной очищенной культуральной антирабической вакцины, предназначенных для иммунизации лошадей

По материалам исследований в Федеральный институт промышленной собственности поданы две заявки на изобретение № 2006126555 «Способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки» (получено положительное решение о выдаче патента РФ от 3 сентября 2007 г, приоритет от 21 07 2006 г) и № 2006141874 «Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения и способ его получения» (приоритет от 28 11 2006 г )

Основные положения, выносимые на защиту

1 Выявлена причинная связь между реакгогенностью антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади и содержанием антител к первичной культуре клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства, подтвержденная

- специфическими иммунологическими реакциями связывания комплемента и иммунопреципитации в геле по Оухтерлони,

- методом истощения антител к клеткам почек сирийского хомяка (с исчезновением нежелательных реакций),

- реактогенными свойствами антител, элюированных с антигена клеток почек сирийского хомяка

2 Разработаны иммунологические критерии качества и безопасности вирусного антигена, предназначенного для иммунизации животных -продуцентов, и гетерологичной антирабической плазмы, предназначенной для получения антирабического иммуноглобулина

3 Оптимизирована технология получения высокоочищенного, высокоспецифичного и стабильного Р(аЬ)2-препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, включающая получение высокоспецифичной антирабической плазмы, фракционирование каприлатно-спиртовым способом с протеолизом, позволившая получить препарат с содержанием Р(аЪ)2-фрагментов иммуноглобулина не менее 90 %, электрофоретической чистотой не менее 90 %, со специфической активностью не менее 400 МЕ/мл, соответствующий требованиям Европейской фармакопеи

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на ряде научных форумов1 Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), VIII Международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (Канны, 2002), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Томск, 2004), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), I Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение» (Уфа, 2005)

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (протокол от 19 09 2007 г № 4) и на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002 124 01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол от 04 10 2007 г №64)

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 15 научных работ Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 12 таблиц и 11 рисунков Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (3 главы), заключения и выводов Список литературы включает 209 источников (60 отечественных и 149 зарубежных)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие материалы и методы Материалы:

- вирусный антиген бешенства в объеме 5617 мл, репродуцированный на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка, и 573 мл вируса бешенства, культивированного на перевиваемой культуре клеток Vero (В) (ГУП «Иммунопрепарат», г Уфа),

- штамм вируса бешенства «Внуково-32», адаптированный к первичной культуре клеток почек сирийского хомяка и перевиваемой культуре клеток Vero,

- ангирабическая плазма 510 морских свинок,

- две экспериментально-производственные серии лошадиной антирабической плазмы,

десять экспериментальных серий антирабического, ^¡цмуноглобу/щна из плазмы крови морских свинок и тридцать семь экспериментальных серий антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лещади, три экспериментально-производственные серии препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади (ГУЛ «Иммунопрепарат», г. Уфа), отраслевой стандартный образец специфической активности антирабического гамма-глобулина ОСО-42-28-200-99 (РГИСК МБП им Л А Тарасевича, г Москва),

иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий, по

ФСП 42-412ВС-93, производства ЗАО «Биолек» (Украина, г Харьков),

иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий по ФСП

42-0020441303 производства РосНИИЧИ «Микроб» (г Саратов),

адъювант Фрейнда, ДЭАЭ-декстран, арлацел А (Германия, «Merck»),

алюмокалиевые квасцы (ТУП «Иммунопрепарат», г Уфа),

алюминия гидроокись (ГУЛ «Иммунопрепарат», г Уфа),

алюминия фосфат (ГУП «Иммунопрепарат», г Уфа),

натрия нуклеинат (ЗАО «Биоамид», г Саратов),

пирогенал (НИИЭМ им Н Ф Гамалеи/Медгамал, г Москва),

полиоксидоний (НПО «ПЕТРОВАКС ФАРМ», г Москва),

глицин (Германия, «Merck»),

мальтоза (Германия, «Merck»),

белые беспородные мыши массой 10—11 г (4715 голов), кролики породы «Шиншилла», массой 2,5-3,0 кг (117 голов), морские свинки массой 350-400 г (510 голов), лошади массой 300-350 кг (6 голов)

Методы:

содержание антител к антигену клеток почек сирийского хомяка, бычьему сывороточному альбумину и желатозе определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Оухтерлони с использованием соответствующих антигенов,

нерастворимый антиген клеток почек сирийского хомяка получали осмотическим лизисом клеток почек, с последующей обработкой осадочной и надосадочнай части 96 % этанолом, 5 % формальдегидом, 3 М калия хлоридом, 2,5 % глютаральдегидом,

выделение у-глобулинов проводили методами анионообменной хроматографии; спиртового, сульфатного, риванольного и каприлатного фракционирования, с проведением и без стадии протеолиза, экспериментально-производственные серии антирабического

иммуноглобулина из плазмы крови лошади получены методом каприлатно-спиртового фракционирования со стадией протеолиза,

электрофоретическую однородность определяли методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (ФС 42-3874-99, с 20),

молекулярные параметры определяли методом гельфильтрации (ФС 42-387499, с 28),

специфическую активность определяли в тесте протекгивной защиты in vivo

на белых беспородных мышах с фиксированным вирусом бешенства, штамм «CVS», против 100-1000 LD50 относительно отраслевого стандартного образца специфической активности антирабического гамма-глобулина,

- содержание антител к клеткам почек сирийского хомяка и Vero определяли методом ракетного иммуноэлекхрофореза, чувствительность 0,5 мкг/мл,

- тест на перемешивание, который является аналогом условий транспортировки препарата, осуществлялся путем перемешивания в течение 2 ч и при температуре 20 °С, при частоте 80 горизонтальных осцилляций в минуту

- тест на ускоренное старение осуществлялся выдерживанием препарата в термостате при температуре 37 "С в течение 4 недель, что является аналогом условий хранения в течение 2 лет (Европейская фармакопея, изд III-2000, V 2 6 20, монография № 0918),

- статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием компьютерных программ «Excel 4 0» и «Statistica 5 7»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка способа получения лошадиной антирабической плазмы с высокой специфической активностью

Для получения высококачественного препарата антирабического иммуноглобулина большое значение имеет разработка способа получения исходного сырья - антирабической плазмы с высокой специфической активностью Согласно требованиям ВОЗ, необходимо доказать, что используемый для иммунизации животных антиген не вызывает выработки нежелательных антител Однако до сих пор не решен вопрос о пороговых значениях содержания примесных веществ в вирусном АГ, используемом для иммунизации продуцентов, которые при гипериммунизации могут стимулировать образование и накопление антител с нежелательной активностью Поэтому, на первом этапе работы перед нами стояла задача провести исследования по влиянию очистки вируса бешенства, репродуцированного на первичной культуре клеток ПСХ, на качественные характеристики антирабического иммуноглобулина С этой целью мы провели иммунизацию морских свинок вирусным АГ разной степени очистки, в котором содержание общего белка было от 75,0 до 250,0 мкг/мл, бычьего сывороточного альбумина (БСА) - от 0,2 до 0,6 мкг/мл Из полученной антирабической плазмы методом спиртового осаждения по Кону без протеолиза были приготовлены 10 серий препарата антирабического иммуноглобулина Все серии ИГ обладали высокой электрофоретической чистотой содержание у-глобулинов было более 90 %, а- и (5-глобулинов - менее 10 %, альбумина - менее 0,5 % Анализ молекулярных параметров показал, что во всех сериях препарата содержание агрегатов было не более 1 %, димеров - менее 10 %, мономеров - более 90 %, Fe-фрагментов -менее 5 % Однако при контроле на пирогенность шесть из десяти серий препарата вызвали побочные реакции три серии АРИГ при внутривенном введении вызвали у кроликов анафилактическую реакцию, три - высокую температурную реакцию В результате встала задача выяснить причины этого явления и возможные пути ее решения

Известно, что бактериальный пироген, находящийся в плазме, при повторном {через 72 ч) внутривенном введении пироге иной плазмы не вызывает повышения температуры тела [Козлова М.А., 1970], Повторное внутривенное введение кроликам антирабической плазмы, из которой был получен реа кто генный препарат АРИГ, продолжало вызывать высокую температурную реакцию, суммарное превышение нормы составило более 2,3 "С. Следовательно, возникающая температурная реакция на введение реактогенных антирабической плазмы и иммуноглобулина вызвана веществами ненирогенной природы.

Для выявления компонентов, ответственных за развитие побочных реакций на внутривенное введение реактогенных антирабической плазмы и АРИГ, был проанализирован состав вирусного материала, которым иммунизировали животных. В качестве субстрата репродукции вируса бешенства, согласно регламенту производства, использовалась первичная культура клеток ПСХ, в качест ве ростовой добавки -- сыворотка крупного рогатого скота, стабилизатора -желатоза, Все эти компоненты обладают иммупогенноегью. (1оэтому необходимо было определить, какие именно примесные вещества в вирусном АГ вызывают образование антител, обладающих реактогенной активностью.

В результате проведенных исследований была установлена причинная связь между содержанием Л У к антигенам клеток ПСХ (субстрату репродукции вируса бешенства) и реактогенностью препарата АРИГ, подтвержденная реакцией связывания комплемента и иммунопрсципитацией по Оухтерлони (рисунок 1), а также путем истощения реактогенного препарата унтирабического нммуноглобулина клетками ПСХ с исчезновением побочных реакций, и реактогенными свойствами АТ, элшированных с антигена клеток почек.

Рисунок 1 - Имиунодиф фузия по Оухтерлони - антирабнческн й иммуноглобулин (центральная лунка) против антигена клеток ночек сирийского хомяка (1 и 2), бычьего сывороточного альбумина (3 и 4), желатозы (5 и 6)

Следует отметить, что ИГ, вызывающий анафилактическую реакцию, после истощения ВСЛ и желцтозой, продолжал вызывать у кроликов анафилактический шок. Таким образом, анафилактическая и температурная реакции на внутривенное введение кроликам реактогенных антирабической плазмы и ИГ обусловлены наличием в них АТ к антигену почек сирийского хомяка.

, 6

Следовательно, неходкая плазма, полученная при иммунизации продуцентов вирусным АГ, должна контролироваться на присутствие а ней AT к антигену субстрата репродукции вируса и на реакто ген н ость, и при необходимости подвергаться истощению соответствующим антигеном.

В связи с отсутствием стандартных методов получения тканевых АГ для истощения соответствующих нежелательных AT, на следующем этапе работы нами было исследовано несколько способов получения нерастворимого АГ клеток почек, сирийского хомяка. Для перевода АГ в стабильную нерастворимую форму клеточный лизат ПСХ обрабатывали 96 % этанолом, 5 % формальдегидом, 3 М калия хлоридом [Muller М. et al„ 1975], 2,5 % глютаральдегилом [Ochoa ГГ., 1978].

Из апробированных методов получения тканевых АГ предпочтительным оказался способ, вклкй5ающий осмотическим душ« клеток ПСХ, с последующей обработкой осадочной части 96 % этанолом (рисунок 2).

Реактогенная антирабическая плазма, истощенная полученным нерастворимым АГ при соотношении объемов 25-30 к 1, не вызывала температурной реакции при внутривенном введении кроликам в объеме 10 мл/кг массы и сохраняла специфическую активность. Контроль истощенных серий антирабической плазмы на остаточное содержание внесенного нерастворимого антигена клеток ПСХ был отрицателен.

I

S S

tí »

I i

3 з л

■......ДТитр......I,-.......■ , д-1 - - - -ПределдолустимоЕ!темиерзчурнийреакции ■—♦—Темг.ера тура

Рисунок 2 - Специфическая активность истощенной антирабической плазмы п температурная реакции на ее введение в зависимости от способа получения нерастворимого антигена клеток почек сирийского хомяка

На следующем этапе исследования изучалась возможность получения зреактогенной антирабической плазмы с высокой специфической активностью, не содержащей АТ к антигену субстрата репродукции вируса бешенства. Получение от Животных вы со кос пециф НЧной сыворотки зависит от условий иммунизации, при этом большое значение имеют качество и доза применяемого антигена. Поэтому необходимо было определить зависимость образования

1 I

вирус нейтрализующих и примесных антител от дозы вирусного АГ и остаточного содержания в нем субстрата. Антительный ответ изучали при иммунизации морских свинок различными дозами вирусного АГ: 0,10; 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 и 2,50 мл. В вирусном материале содержание белка было 200 мкг/мл, антигена клеток IICX - 0,9 мкг/мл (рисунок 3).

Из рисунка 3 видно, что доза АГ оказывает сильное влияние на степень антителообразования. Экспериментальные серии антираби ческой плазмы, полученные при иммунизации морских свинок вирусным АГ в дозах от 0,10 до 0,50 мл, при которых остаточное содержание антигена клеток ПСХ было не более 0,5 мкг/мл, при внутривенном введении крошкам не вызывали температурной реакции.

4 - . .. г 6р

0,1 Q,2S 0,5 0,75 i 2,5

Дсоа вирусного Лмл

E-Z3 Температура Антиген клеток ПСХ 1 ♦ Тигр аируснейграотоующих АТ

Рисунок 3 - Температурная реакции па внутривенное введение кроликам антирабической плазмы в зависимости от остаточного содержания антигена клеток почек сирийского хомяка в антигене пи рус а бешенства и титр виру ci i е йгр ал изую щи х антител (па 130-е сутки)

Анализ специфической активности показал, что кривая гитров вируснейтрализуюших антител имеет волнообразный характер и на разные иммунизирующие дозы вирусного АГ был получен близкий ттр специфических антител, например, при введении 0,10 и 0,75 мл; 0,25 и 1,00 мл. При этом динамика титра вируснейтрализующих антител сохранялась во времени. Таким оopaiом, иммунизация животных с использованием низких доз вирусного AF, в котором остаточное содержание антигена клеток ПСХ было менее 0,5 мкг/мл, позволила получить ареактогенную высокоспсцифичную антирабич еску ю плазму, свободную от нежелательных АТ к антигену субстрата репродукции вируса бешенства, и снизить нагрузку по антигену клеток ночек сирийского хомяка.

Следовательно, антиген вируса бешенства, используемый для иммунизации продуцентов, должен контролироваться не только на содержание общего белка и БСА, как предусмотрено фармакопейной статьей на культу рал ьную

йнтирабичеекую вакцину, но и на остаточное содержание антигена субстрата репродукции вируса бешенства.

Дли количественного определения остаточного содержания антигена клеток ПСХ в вирусе бешенства, полученном на первичной культуре клеток ПСХ, нами был предложен модифицированный метод ракетного иммуноэлектрофореза, с чувствительностью 0,5 мкг/мл.

Более значительного повышения специфической активности иммунной плазмы можно достичь при иммунизации продуцентов вирусным антигеном с адьюваытом [Медуницын М.В., 2004]. Поэтому мы изучили влияние различных адъювантов на образование вируснейтрализующих антител. Для исследования использовали адьюванты, наиболее часто применяемые для стимуляции иммуногенеза: адьювант Фрейнда, ДЭАЭ-декстран е арлацелом, алюмокалиевые квасцы, алюминия гидроокись, алюминия фосфат, натрия нуклеинах, ннрогенал и полиоксидоннй.

Анализ специфической активности показал, что алюминия фосфат но сравнению с другими адью вантами по силе стимуляции антительного ответа на вирус бешенства имел преимущество - формировался в 1,5-4,9 раза (р<0,05) более высокий гуморальный иммунный ответ (рисунок 4).

5 180-,

150-, 120 " 40 -60

Ü.

£

::

и

I г

ti Qu

5 е

•I 11

Адьювант

.•у

-. С rt

г« I

; ¡ I

■ 42-е сутки .ri .r,ннзацни

□ £6-с ::> : к-' ткункшре!

Рисунок 4 — Специфическая активность антирабичеекдй плазмы в зависимости от алмованта, ие пол ьзопанно ю при иммунизации морских енииок вирусом бешенства

Кроме того, использование в качестве адъюванта геля алюминия фосфата предпочтительнее вследствие его более высокой безопасности [Levenbook I.S. el al., 1986; Rosado-Vallado M. el al., 2005].

Далее перед нами стояла задача уточнить оптимальную концентрацию адъюванта алюминия фосфата в АГ вируса бешенства. Наиболее высокий титр |ируснейтралнзующих АТ выявлялся при концентрации ионов алюминия 0,5 мг/мл.

В связи с использованием адъюванта, была изучена возможность получения высокой специфической активности антирабическоЙ сыворотки при более низких дозах сорбированного антигена. Анализ титра вируенейтрализуюших антител

показал, что сорбция вируса бешенства на алюминия фосфате позволила получить высокий титр специфических антител при снижении дозы сорбированного АГ в 3,3-5,0 раз (р<0,05), что позволяет уменьшить затраты на антиген вируса бешенства

Далее мы изучили, как зависит антительный ответ от вируса бешенства, культивированного на разных субстратах В зависимости от вида субстрата в культуральной вируссодержащей жидкости содержится от 107 до 0,5 109 БОЕ/мл вируса бешенства [Emerson S U., 1989] Низкое содержание гликопротеина в антирабической вакцине вызывает недостаточную индукцию специфических антител [Keller Н et al, 1984] В связи с этим, нами были проведены исследования по изучению влияния субстрата репродукции и иммуногенности вируса бешенства на антительный ответ, вызываемый вирусным антигеном при иммунизации животных Поскольку в предыдущих исследованиях было установлено, что сорбированный на алюминия фосфате вирус бешенства, полученный на первичных клетках ПСХ, вызывает более сильный гуморальный ответ, по сравнению с АГ без адъюванта, важно было установить, сохранится ли это преимущество при переходе на другой субстрат Поэтому для иммунизации морских свинок использовали нативный, концентрированный и сорбированный на алюминия фосфате вирус бешенства, репродуцированный на первичной культуре клеток ПСХ и перевиваемой культуре клеток Vero Для сорбции вируса бешенства использовали алюминия фосфат с концентрацией ионов алюминия 0,5 мг/мл.

Анализ титра вируснейтрализующих антител показал, что вирус бешенства, полученный на перевиваемой культуре клеток Vero, вызывал статистически значимо более сильный гуморальный ответ как при использовании нативного - в 3,2 раза, так и концентрированного - в 3,9 раза, и сорбированного - в 4,9 раза, вируса, по сравнению с вирусом, культивированным на первичных клетках почек сирийского хомяка (таблица 1), несмотря на практически одинаковую иммуногенность соответствующих антигенов

Таблица 1 - Титр вируснейтрализующих антител в зависимости от субстрата репродукции и иммуногенности вируса бешенства

Показатели Субстрат репродукции вируса бешенства

Первичная культура клеток ПСХ Перевиваемая культура клеток Vero (В)

нативный концентр сорбир нативный концентр. сорбир.

1 2 3 4 S 6

Иммувогеняость вируса бешенства, МЕ/мл 1,5 13,8 16,4 2,6 14,0 16,5

Титр вируснейтрализую Щ11Х антител, МЕ/мл 1,9±0,6 11,7±2,3 31,5±5,0 6,1±1,7 46,2±5,0 154,5±10,0

Р Pi 2<0,05 Р2,з<0,05 Pi,3<0,05 Р4,5<0,05 Р5, 6<0,05 Р4,б<0,05

Pi 4<0,05, Р2,5<0,05, Рз,6<0,05

Максимальный тигр специфических ЛТ был получен при иммунизации морских свинок сорбированным вирусом бешенства, репродуцированным нз перевиваемых клетках Vero.

Один и тот же адыовант у различных видов животных может стимулировать иммунитет в разной степени. Поэтому важно было установить, будет ли сорбированный на алюминия фосфате вирус бешенства, полученный па перевиваемой культуре клеток Veto, вызывать и у лошадей продуцентов специфических сывороток более высокий антительный ответ, по сравнению с вирусом, полученным на субстрате клеток почек сирийского хомяка, С целью получения экспериментально-производстве иных серий антирабической плазмы была проведена гипериммунизация лошадей сорбированным на алюминия фосфате вирусом бешенства вакцинным штаммом «Внуково 32», полученном, соответственно, на первичной культуре клеток ПСХ и перевиваемой культуре клеток Vero, в котором индекс иммуногешюсти был 13,5 и 11,25 МЕ/мл, я содержание антигена клеток ПСХ и Vero - менее 0,5 мкг/мл.

На неем протяжении иммунизации специфическая активность антирабической плазмы, полученной при иммунизации лошади сорбированным антигеном вируса бешенства на основе субстрата плеток Vero, но сравнению с Первичной культурой клеток ПСХ была статистически значимо выше, и кратность увеличения возрастала с каждой последующей иммунизацией or 1,5 до 2,4 раза (рисунок 5).

J 78-е

208-е

26R-C сути»

Рисунок 5 - Специфическая активность лошадиной антирабической плазмы в зависимости от сорбированного вирусного антигена, репродуцированного на различных субстратах

Таким образом, смена субстрата репродукции вируса бешенства с первичной культуры клеток ПСХ fia перевиваемую культуру клеток Vero при иммунизации сорбированным вирусом существенным образом повысила специфическую активность антирабической плазмы как морских свинок, так и лошадей.

Во всех полученных экспериментально-производственных сериях лошадиной антирабической плазмы специфическая активность была выше 75 МЕ/мл м не выявлялись АТ к примесным компонентам антирабической вакцтавд. Все серии специфической плазмы не вызывали температурной реакции при внутривенном

введении кроликам (в дозе 10 мл/кг), что подтверждает обоснованность допустимого остаточного содержания антигена субстрата репродукции и низких доз вируса бешенства, используемого для иммунизации лошадей Таким образом, была получена высокоспецифичная ареактогенная лошадиная антирабическая плазма, пригодная для получения препарата антирабического иммуноглобулина

Разработка технологии получения высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади

В силу определяющей роли показателя безопасности при создании гетерологичного препарата иммуноглобулина, перед нами стояла задача получения высокоочищенного АРИГ с максимальным содержанием гамма-глобулинов Поэтому нами было проведено сравнение различных методов выделения у-глобулинов анионообменной хроматографии, сульфатного, риванольного и каприлатного методов с проведением и без проведения стадии протеолиза

При всех методах фракционирования стадия протеолиза, обеспечивающая получение Р(аЪ)2-препарата, повышала содержание иммунологически активной фракции у-глобулинов и значительно снижала содержание реактогенных примесеи - альбумина и а- и р-глобулинов Анализ полученных серий препарата АРИГ по электрофоретической чистоте и выходу специфической активности показал преимущество каприлатно-спиртового способа с протеолизом, который и был выбран в качестве основного метода получения препарата антирабического иммуноглобулина В готовую форму препарата добавляли натрия хлорид в пределах 0,45-0,20 % и стабилизировали глицином с мальтозой Комбинация стабилизаторов и натрия хлорида была подобрана в концентрациях, обеспечивающих физиологичную осмолярность разрабатываемого препарата иммуноглобулина в пределах 250-350 мОсм/кг

На конечном этапе работы мы провели сравнение разработанного препарата АРИГ с коммерческими аналогами производства ЗАО «Биолек» (Украина) и Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Препарат, полученный по нашей технологии, характеризовался большей электрофоретической чистотой повышено содержание иммунологически активной фракции у-глобулинов с 87,2-88,7 % до 96,5 % и снижено содержание примесных а- и р-глобулинов с 12,6-11,0 % до 3,3 % Анализ молекулярных параметров показал, что полученный нами АРИГ является Р(аЬ)2-препаратом Содержание Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулина в составляло не менее 90 %, а содержание Бс-фрагментов снижено с 17,1—15,3 % до 2,3 % Кроме того, в нашем препарате повышена удельная специфическая активность с 2,9-3,1 до 4,4 МЕ/мл Осмолярность разработанного препарата снижена в 2 раза и доведена до физиологичного уровня Снижение содержания натрия хлорида в препарате с 0,90 до 0,45-0,20 %, внесение дополнительного стабилизатора мальтозы в конечную лекарственную форму обеспечило стабильность препарата в тестах на ускоренное старение и перемешивание

17

ВЫВОДЫ

1 Выявлена причинная связь между реактогенностью гетерологичного антирабического иммуноглобулина и содержанием в нем антител к антигену клеток почек сирийского хомяка, подтвержденная двумя независимыми специфическими иммунологическими реакциями m vitro иммунопреципитацией и реакцией связывания комплемента, а также m vivo -методом истощения антител к антигену клеток почек сирийского хомяка и реактогенными свойствами антител, элюированных с антигена клеток почек сирийского хомяка

2 Разработан метод удаления антител к антигену клеток почек сирийского хомяка из реактогенной антирабической плазмы с использованием нерастворимого антигена клеток почек сирийского хомяка, полученного обработкой лизата клеток почек 96-процентным этанолом

3 Разработаны требования к антигену вируса бешенства, предназначенного для иммунизации продуцентов остаточное содержание антигена клеток почек сирийского хомяка - менее 0,5 мкг/мл, сорбция вируса бешенства на адъювант алюминия фосфат при концентрации иона алюминия 0,5 мг/мл, индекс иммуногенности сорбированного вирусного антигена - не менее 10 МЕ/мл, требования к гетерологичной антирабической плазме - отсутствие анафилактической и температурной реакций при внутривенном введении кроликам иммунной плазмы в объеме 10 мл/кг массы тела

4 Оптимизирована технология производства высокоспецифичного и высокоочшценного F(ab)2-npenapaTa иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, включающая получение антирабической плазмы со специфической активностью не менее 75 МЕ/мл, фракционирование каприлатно-спиртовым способом с протеолизом, внесение стабилизаторов и натрия хлорида в концентрациях, соответствующих физиологичной осмолярности, позволившая получить препарат с содержанием F(ab)2-фрагментов иммуноглобулина не менее 90 %, электрофоретической чистотой не менее 90 % и со специфической активностью не менее 400 МЕ/мл

5 Сравнение с зарубежными и отечественными коммерческими аналогами показало, что разработанный препарат иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади является F(ab)2-npenaparOM - содержание F(ab)-¿-фрагментов иммуноглобулина G составило не менее 90 %, и продемонстрировало высокие качественные характеристики препарата -повышение удельной специфической активности в 1,5 раза и содержания у-глобулинов на 10 %, снижение содержания реактогенных а- и р-глобулинов в 4 раза, Fc-фрагментов - в 8 раз, осмолярности - в 2 раза Качественные характеристики разработанного препарата иммуноглобулина антирабического стабильны в тестах на ускоренное старение и перемешивание и соответствуют требованиям Европейской фармакопеи

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Алсынбаев М М, Исрафилов А Г, Баталова Т А, Евченко Т А, Загидуллин Н В, Байрушин Ф Т, Ситник Н П Избранные вопросы сывороточного производства // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов материалы Всероссийской научной конференции - Уфа, 2000 - Ч 1 -С 140-148

2 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Алсынбаев М М, Кулагин В Ф, Загидуллин Н В, Шафеева Р С, Шамсувалеева А К, Крутилина Д В., Трофимов В А, Кудашева Г Б., Латыпова Д Р Антирабический иммуноглобулин 1 Разработка метода сорбции антител, обусловливающих пирогенную, анафилактическую реакции при контроле препарата на пирогенность // International Journal on Immunorehabilitation - 2002 - T 4, № 1 -С 73

3 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Алсынбаев М М, Кулагин В Ф, Шамсувалеева А К, Загидуллин Н В, Шафеева Р С, Трофимов В А, Баталова Т А , Якин О Г, Лаггыпова Д Р, Дистанова Э У Антирабический иммуноглобулин II Некоторые свойства // International Journal on Immunorehabilitation - 2002 - T 4, № 1 - С 73

4 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Крутилина Д В, Шафеева Р С, Кунцевич Ю Г, Загидуллин Н В., Кулагин В Ф Антительный ответ морских свинок на вакцинацию антирабической вакциной с различными адыовантами // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в ХХЗ веке материалы Всероссийской научной конференции - Пермь, 2003 -С 56-57

5 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Крутилина Д В, Шафеева Р С, МухачеваА В Зависимость титра вируснейтрализующих антител от дозы концентрированной очищенной культуральной антирабической вакцины // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых - Уфа, 2004 - С. 199-201

6 Ситник Н П, Исрафилов А Г , Крутилина Д В., Шафеева Р С Влияние различных адъювантов на величину гуморального ответа // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов материалы Всероссийской научной конференции

- Томск, 2004 - С 67-70.

7 Ситник Н П, Исрафилов А. Г, Крутилина Д В , Шафеева Р С, Загидуллин Н. В , Мухачева А В Влияние дозы концентрированной очищенной культуральной антирабической вакцины на величину гуморального ответа // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» тезисы докладов

- Москва, 2004 - С 835

8 Ситник Н П., Исрафилов А. Г, Крутилина Д В, Шафеева Р С, Загидуллин Н В, Кунцевич Ю Г Влияние различных адъювантов на гуморальный ответ при иммунизации морских свинок концентрированной очищенной культуральной антирабической вакциной // Там же - С. 835

9 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Шафеева Р С., Туйгунов М М, Крутилина Д В , Загидуллин Н В Влияние алюминия фосфата на гуморальный ответ антирабической вакцины // Российская научно-практическая конференция «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» материалы конференции - Санкт-Петербург, 2004 - С 220

10Ситник Н П, Еникеева Л Ф, Исрафилов А Г, Петрова И И, Шафеева Р С, Трофимов В А, Загидуллин Н В, Поспеева Н А Влияние некоторых параметров на полноту сорбции вируса бешенства гелем фосфата алюминия // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке • разработка, производство и применение материалы Всероссийской научной конференции с международным участием - Уфа, 2005 - Ч 1 - С 246-248

11 Ситник Н П , Исрафилов А Г, Баталова Т А, Туйгунов М М, Усанова Л С, Шафеева Р С, Загидуллин Н В Получение гетерологичного антирабического иммуноглобулина//Там же - Ч 2 - С 53-56

12 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Еникеева Л Ф, Петрова И И, Атангулова Р Г, Кунцевич Ю Г, Баталова Т А , Шафеева Р С , Крутилина Д В, Хлысова Н С , Евченко Т А , Трофимов В А , Загидуллин Н В Зависимость гуморального ответа от типа антирабической вакцины и используемого адъюванта//Там же - С 57-60

13 Ситник Н П, Исрафилов А Г, Кунцевич Ю Г, Шафеева Р С, Крутилина Д В, Загидуллин Н В Влияние дозы адъюванта на антительный ответ морских свинок//Там же - С 61-62

14 Атангулова Р Г, Исрафилов А Г, Ситник Н П Определение антител к гликопротеину вируса бешенства в препарате антирабического иммуноглобулина с помощью иммуноферментного метода // Там же - С 78-80

Заявки на изобретения и патенты Российской Федерации

1 Ситник Н П, Загидуллин И В , Исрафилов А Г, Еникеева Л Ф, Мухачева А В., Шафеева Р С , Кунцевич Ю Г , Петрова И И Способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки (положительное решение о выдаче патента РФ от 03 09 2007 г по заявке на изобретение № 200612655 от 21 07 2006 г )

2 Ситник Н П , Исрафилов А Г , Загидуллин Н В , Алсынбаев М М , Тимербаева Р X Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения и способ его получения (приоритетная справка по заявке на изобретение № 2006141874 от 28 11 2006 г )

Ситник Наталья Павловна

РАЗРАБОТКА ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИРАБИЧЕСКОГО ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЛОШАДИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ответственный за выпуск М X Шарафутдинов

Подписано в печать 10 10 07 г Бум офсетная Формат 60x84 1/16 Гарнитура «Times New Roman Суг» Отп на ризографе Уел печ л 1,16 Уч-изд л 1,5 Тираж 100 экз Заказ №1616

РИО ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарат» 450014, г Уфа, ул Новороссийская, 105, тел (347) 229-92-86

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ (2005), в мире ежегодно регистрируется от 35000 до 55000 случаев смерти людей от бешенства и около 500000 случаев активно-пассивной иммунизации [Connelly К.Р., 2004; Goudsmit J. et al., 2006]. При этом 99 % смертности от гидрофобии приходится на развивающиеся государства [WHO, 2005; Sriaroon С. et al., 2006; Sudarshan M.K. et al., 2007], где в числе погибших находятся лица, которым отказано в лечении из-за дефицита антирабических препаратов, в особенности антирабического иммуноглобулина [Рахимова Ф.И. и др., 1995]. Случаи человеческого бешенства имеют место даже в благополучных странах Европы и Америки [Krebs J.W. et al., 2005; Sadkowska-Todys M., Labunska E., 2005; O'Bell S.A. et al., 2006; Tomasiewicz K. et al., 2006]. Проблема гидрофобии актуальна и для РФ, где эпидемиологическая обстановка по бешенству характеризуется как неблагоприятная [Мовсесянц А.А., 2003; Онищенко Г.Г., 2003; Медуницын Н.В., 2004].

Во всем мире эпизоотологическая ситуация по бешенству обусловлена наличием постоянно действующих природных очагов рабической инфекции, из которых нереально искоренить вирус бешенства [Joshi D.D., Bogel К., 1988; Wunderli P.S. et al., 2006; Sudarshan M.K. et al., 2007], особенно среди летучих мышей [Warrell М.J., Warrell D.A., 2004; Morris J., Crowcroft N.S., 2006; Tordo N. et al., 2006], что представляет постоянную угрозу заражения людей вирусом бешенства [Ведерников В.А. и др., 2002; Макаров В.В., 2002].

Бешенство - острая нейроинфекция теплокровных животных, вызываемая рабдовирусом. Инкубационный период заболевания длится от двух недель до шести месяцев [Sudarshan М.К. et al., 2007]. Клиническая картина заболевания бешенством характеризуется тяжелым поражением нервной системы и без специфического лечения неизменно приводит к летальному исходу. Комитет

ВОЗ по бешенству рекомендовал применение АРИГ во всех случаях возможного заражения людей бешенством, так как профилактика бешенства одной антирабической вакциной не всегда эффективна [Suwansrinon К. et al., 2006; Tomasiewicz К. et al., 2006]. Препарат АРИГ входит в состав перечня ВОЗ (2000) основных лекарственных средств. Кроме того, длительная вакцинация часто сопровождается аллергическими реакциями на примесные компоненты антирабической вакцины [Медуницин Н.В., 2004; Sudarshan М.К. et al., 2005].

Гомологичный АРИГ из сыворотки крови человека отличается хорошей переносимостью [Suwansrinon К. et al., 2005]. Однако он почти недоступен из-за высокой стоимости и небольшого объема производства, которые обусловлены трудностями иммунизации волонтеров и недостаточностью сырьевой базы [Wilde Н., Chutivongse S., 1990; Pancharoen С. et al., 2001]. Кроме того, заготовка донорской крови все больше ограничивается расширением противопоказаний к сдаче крови из-за низких физиологических показателей доноров и роста инфекций, передающихся через кровь [Райхер Л.И., Райхер И.И., 1995].

Экономичнее (приблизительно в пять раз по сравнению с ЧАИГ) профилактика бешенства АРИГ из плазмы крови лошадей [Wilde Н et al., 1991; Pancharoen С. et al., 2001; Goudsmit J. et al., 2006]. Использование последнего поколения очищенного ксеногенного АРИГ намного безопаснее применения лошадиной антирабической сыворотки: частота побочных реакций уменьшилась до 1-2 % [WHO, 2005]. Высокоочищенный препарат АРИГ из плазмы крови лошади является эффективной, доступной, экономичной и относительно безопасной альтернативой гомологичному препарату антирабического иммуноглобулина [WHO, 2005; Sudarshan М.К. et al., 2007].

В настоящее время многие мировые производители из-за давления, которое оказывают на них защитники прав животных, отказались от производства препаратов гетерологичного антирабического иммуноглобулина [Wilde Н. et al., 2002]. В развивающихся странах производством ксеногенного

АРИГ занимаются национальные фармацевтические компании, препараты которых плохо очищены и характеризуются высокой реактогенностью, и не удовлетворяют национальные потребности [Wilde Н. et al., 1996, 2002; Sriaroon С. et al., 2006].

В России зарегистрированы два препарата иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади - производства ЗАО «Биолек» (Украина) и РосНИПЧИ «Микроб» (Россия), получаемые при иммунизации продуцентов штаммом фиксированного вируса бешенства «Москва» и обладающие достаточно высокой специфической активностью. Однако, согласно нормативно-технической документации, в этих препаратах допускается содержание примесных а- и р-глобулинов до 20 %, у-глобулинов -не менее 80 % [ФСП 42-412ВС-93; ФСП 42-0020441303], что свидетельствует о недостаточно высокой степени очистки препаратов и возможности дальнейшего совершенствования технологии получения иммуноглобулина. Кроме того, они не контролируются на степень агрегации и фрагментации иммуноглобулина, а также на осмолярность, которые являются показателями безопасности иммуноглобулиновых препаратов и могут быть причиной побочных реакций.

Существующие методы фракционирования не позволяют получить гетерологичный препарат АРИГ с высокой степенью концентрации AT, поэтому большое значение имеет разработка способов получения исходной высокоспецифичной антирабической плазмы. Трудности, связанные со способом получения специфической плазмы, таких как: невысокие иммуногенность и качество используемого для иммунизации вируса бешенства, невысокая специфическая активность гипериммунной плазмы, и проблемы фракционирования гетерологичных иммуноглобулинов [Sriprapat S. et al., 2003], ведут к ограниченному производству и высокой стоимости гетерологичных препаратов антирабического иммуноглобулина. Таким образом, оптимизация технологии получения высокоочищенного АРИГ из плазмы крови лошади остается актуальной. На основании вышеизложенного была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Разработка иммунологических критериев качества и безопасности вирусного антигена и антирабической плазмы и оптимизация технологии получения высокоспецифичного и высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади.

Задачи исследования

1 Определить причинность реактогенности гетерологичного антирабического иммуноглобулина в отношении иммунореактивных примесных компонентов антигена вируса бешенства: бычьего сывороточного альбумина, антигенов клеток почек сирийского хомяка и желатозы.

2 Разработать способ удаления из реактогенной антирабической плазмы антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства.

3 Разработать требования к антигену вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных, и к гетерологичной антирабической плазме - сырью для получения препарата антирабического иммуноглобулина.

4 Оптимизировать технологию производства антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади для получения высокоспецифичного и высокоочищенного F(ab)2-npenapaTa с физиологичной осмолярностью.

5 Сравнить разработанный препарат антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади с коммерческими аналогами на соответствие требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам, и изучить стабильность качественных характеристик разработанного препарата во время хранения и транспортировки.

Научная новизна

Впервые показано, что реактогенность гетерологичного антирабического иммуноглобулина обусловлена присутствием в нем антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства.

Впервые разработан способ удаления реактогенных антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка, присутствующих в антирабической плазме, путем ее истощения нерастворимым антигеном клеток почек сирийского хомяка.

Установлены иммунологические критерии качества и безопасности антигена вируса бешенства, предназначенного для иммунизации лошадей, и антирабической плазмы - исходного сырья для получения препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади.

Впервые предложен контроль антигена вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных - продуцентов антирабической плазмы, на остаточное содержание в нем антигенов клеток почек сирийского хомяка методом ракетного иммуноэлектрофореза.

Впервые показано, что антиген вируса бешенства полученный на перевиваемой культуре клеток Vero, при равной иммуногенности с вирусом, репродуцированном на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка, позволяет получать более высокий титр вируснейтрализующих антител.

Предложен оптимизированный способ получения ареактогенной высокоспецифичной гетерологичной антирабической плазмы (получен патент РФ).

Разработана технология производства стабильного высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, в котором содержание Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулина G составляет не менее 90 %, фракция у-глобулинов - более 90 %, а- и Р-глобулинов -менее 10%, специфическая активность - не менее 400 МЕ/мл, содержание натрия хлорида - не более 0,45 %, физиологичная осмолярность - в пределах 250-350 мОсм/кг (приоритетная справка по заявке на изобретение РФ).

Научно-практическая значимость работы

Для антигена вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных - продуцентов антирабической плазмы, установлены пороговые значения качественных характеристик: по остаточному содержанию антигенов клеток почек сирийского хомяка, иммуногенности вирусного антигена и концентрации адъюванта алюминия фосфата при сорбции вируса бешенства, что в производственных условиях позволяет получать ареактогенную высокоспецифичную лошадиную антирабическую плазму.

Метод ракетного иммуноэлектрофореза для контроля остаточного содержания антигенов клеток почек сирийского хомяка рекомендуется внести в фармакопейную статью предприятия на антирабическую вакцину, при получении которой в качестве субстрата репродукции вируса используется первичная культура клеток почек сирийского хомяка, что позволит повысить безопасность вакцин и получаемых с их помощью специфических иммуноглобулиновых препаратов.

Для получения антирабической вакцины рекомендована замена субстрата репродукции вируса бешенства с первичной культуры клеток почек сирийского хомяка на перевиваемую культуру клеток Vero, так как вирусный антиген, полученный на культуре клеток Vero, позволяет получать более высокий титр вируснейтрализующих антител.

Гипериммунизация лошадей низкими дозами сорбированного на алюминия фосфате вируса бешенства позволяет получить антирабическую плазму с высокой специфичной активностью и снизить затраты на вирусный антиген.

Контроль антирабической плазмы на реактогенность - внутривенное введение кроликам гипериммунной плазмы в дозе 10 мл/кг массы тела позволяет оценить качество исходного сырья.

Разработанный способ удаления антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка путем истощения пула реактогенной антирабической плазмы нерастворимым антигеном клеток почек сирийского хомяка позволяет сохранить исходное сырье от выбраковки.

Модифицированная технология получения иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, с использованием комбинированного каприлатно-спиртового метода фракционирования с протеолизом, внесением натрия хлорида и стабилизаторов с учетом физиологичной осмолярности, позволяет получить высокоочищенный F(ab)2-npenapaT, который соответствует требованиям Европейской фармакопеи.

Высокие качественные характеристики и их контроль в разработанном антирабическом иммуноглобулине повышают безопасность препарата и позволяют предупредить возникновение возможных побочных реакций.

Внедрение результатов исследования в практику

На базе иммуноклиники и сывороточного цеха филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ получены две экспериментально-производственные серии лошадиной антирабической плазмы и три экспериментально-производственные серии препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, которые прошли контроль в отделе биологического и технологического контроля департамента качества филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (г. Уфа). В проект фармакопейной статьи предприятия на разработанный препарат иммуноглобулина антирабического внесены методы контроля молекулярных параметров, стабилизаторов - мальтозы и глицина, каприловой кислоты и осмолярности. Проекты нормативно-технической документации (Фармакопейная статья предприятия и Инструкция по применению препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади) одобрены решением Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (выписка из протокола № 4 заседания Ученого Совета от 19 сентября 2007 г). Метод ракетного иммуноэлектрофореза для контроля остаточного содержания антигена клеток почек сирийского хомяка был использован контрольно-аналитической лабораторией филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ для выбора серий концентрированной очищенной культуральной антирабической вакцины, предназначенных для иммунизации лошадей.

По материалам исследований в Федеральный институт промышленной собственности поданы две заявки на изобретение: № 2006126555 «Способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки» (получено положительное решение о выдаче патента РФ от 3 сентября 2007 г., приоритет от 21.07.2006 г.) и № 2006141874 «Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения и способ его получения» (приоритет от 28.11.2006 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1 Выявлена причинная связь между реактогенностью гетерологичного антирабического иммуноглобулина и содержанием в нем антител к антигенам первичной культуры клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства.

2 Разработаны иммунологические критерии качества и безопасности вирусного антигена, предназначенного для иммунизации животных -продуцентов, и гетерологичной антирабической плазмы, предназначенной для получения антирабического иммуноглобулина.

3 Оптимизирована технология получения высокоочищенного, высокоспецифичного и стабильного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, включающая получение ареактогенной высокоспецифичной антирабической плазмы, фракционирование каприлатно-спиртовым способом с протеолизом, позволившая получить F(ab)2-препарат с содержанием Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулина не менее 90 %, электрофоретической чистотой не менее 90 %, со специфической активностью не менее 400 МЕ/мл, соответствующий требованиям Европейской фармакопеи.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на ряде научных форумов: Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), VIII Международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (Канны, 2002), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Томск, 2004), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), I Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» (Уфа, 2005).

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (протокол от 19.09.2007 г. № 4) и на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол от 04.10.2007 г. №64).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 15 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 страницах, содержит 12 таблиц и 11 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (3 главы), заключения и выводов. Список литературы включает 209 источников (60 отечественных и 149 зарубежных).

106 Выводы

1 Выявлена причинная связь между реактогенностью гетерологичного антирабического иммуноглобулина и содержанием в нем антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка, подтвержденная независимыми специфическими иммунологическими реакциями in vitro и in vivo.

2 Разработан способ удаления антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка путем истощения реактогенной антирабической плазмы нерастворимым антигеном клеток почек сирийского хомяка, полученного обработкой осадочной части лизата клеток почек сирийского хомяка вначале 96 % этанолом, затем 0,3 М трис-буфером и 3,0 М мочевиной, при соотношении 1 к 25-30.

3 Разработаны требования к антигену вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных - продуцентов антирабической плазмы: остаточное содержание антигенов клеток почек сирийского хомяка - менее 0,5 мкг/мл, сорбция вируса бешенства на адъювант алюминия фосфат при концентрации ионов алюминия 0,5 мг/мл, индекс иммуногенности сорбированного вирусного антигена -не менее 10 МЕ/мл; требования к гетерологичной антирабической плазме -отсутствие анафилактической и температурной реакций при внутривенном введении кроликам гипериммунной плазмы в дозе 10 мл/кг массы тела.

4 Оптимизирована технология производства высокоспецифичного и высокоочищенного F(ab)j-npenapaTa иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, включающая получение ареактогенной лошадиной антирабической плазмы со специфической активностью не менее 75 МЕ/мл, фракционирование каприлатно-спиртовым способом с протеолизом, внесение 0,2-0,45 % натрия хлорида и стабилизаторов - 0,50-3,00 % мальтозы и 0,70-1,50 % глицина в концентрациях, соответствующих физиологичной осмолярности в пределах 250-350 мОсм/кг.

5 Сравнение с коммерческими аналогами показало, что разработанный препарат иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади является F(ab)2-npenapaTOM - содержание Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулина G составило не менее 90 %, и продемонстрировало высокие качественные характеристики препарата: содержание у-глобулинов - более 90 %, а- и р-глобулинов - менее 10 %, специфическая активность -не менее 400 МЕ/мл и физиологичная осмолярность - не более 350 мОсм/кг. Качественные характеристики разработанного препарата иммуноглобулина антирабического стабильны в тестах на ускоренное старение и перемешивание и соответствуют требованиям Европейской фармакопеи.

Заключение

До сих пор бешенство остается одним из наиболее опасных заболеваний, которое во всем мире представляет постоянную серьезную угрозу для здоровья людей [Briggs D., Hanlon С.А., 2007; Tepsumethanon S. et al., 2007]. Проблема бешенства актуальна и для России с ее обширными территориями, на которых издавна существуют многочисленные природные очаги этой инфекции [Онищенко Г.Г., 2003; Медуницын Н.В., 2004]. Единственным средством профилактики бешенства остается совместное введение антирабической вакцины и АРИГ, который по требованию ВОЗ должен вводиться во всех случаях возможного заражения людей вирусом. Высокоочищенный препарат иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади является эффективной, доступной и экономичной альтернативой препарату гомологичного происхождения, особенно в развивающихся странах с низким доходом населения [Рахимова Ф.И. и др., 1995; Wilde Н. et al., 1987; Lang J. et al., 1998; Suwansrinon K. et al., 2007]. Качество препаратов гетерологичных ИГ должно определяться не только эффективностью их применения, но и безопасностью. Однако все еще существует множество проблем связанных с получением гетерологичного АРИГ с высокой степенью очистки, соответствующего требованиям Европейской фармакопее. Поэтому проблема разработки иммунологических критериев качества и безопасности вирусного АГ и антирабической плазмы и оптимизация технологии получения высокоспецифичного и высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади остается до сих пор актуальной проблемой.

Для получения высококачественного препарата АРИГ большое значение имеет разработка способа получения исходного сырья -антирабической плазмы с высокой специфической активностью. Согласно требованиям ВОЗ, необходимо доказать, что используемый для иммунизации животных АГ не вызывает выработки антител, обладающих реактогенной активностью. Однако до сих пор не решен вопрос о пороговых значениях содержания примесных веществ в вирусном АГ, используемом для иммунизации продуцентов, которые при гипериммунизации могут стимулировать образование и накопление AT с нежелательной активностью. Поэтому на первом этапе работы перед нами стояла задача провести исследования по влиянию очистки вируса бешенства, репродуцированного на первичной культуре клеток ПСХ, на качественные характеристики иммуноглобулина. С этой целью мы провели иммунизацию морских свинок вирусным АГ разной степени очистки, в котором содержание общего белка было от 70 до 250 мкг/мл, БСА - от 0,2 до 0,6 мкг/мл. Из полученной антирабической плазмы методом спиртового осаждения по Кону без протеолиза были получены 10 серий препарата иммуноглобулина антирабического. Все серии АРИГ обладали высокой электрофоретической чистотой. Анализ молекулярных параметров показал, что во всех сериях содержание агрегатов было не более 1 %, димеров - менее 10 %, мономеров -более 90 %, Fc-фрагментов - менее 5 %. Однако при контроле на пирогенность шесть серий препарата из десяти вызвали побочные реакции. Поэтому встала задача выяснить причины этого явления и возможные пути ее решения.

Известно, что бактериальный пироген находящийся в плазме, при ее повторном внутривенном введении не вызывает повышения температуры тела. Повторное внутривенное введение кроликам антирабической плазмы, из которой был получен реактогенный препарат АРИГ, вызывало высокую температурную реакцию. Следовательно, возникающая высокая температурная реакция реактогенных антирабической плазмы и ИГ вызвана веществами непирогенной природы.

Для выявления компонентов, ответственных за развитие побочных реакций, был проанализирован состав вирусного материала, которым иммунизировали животных. В качестве субстрата репродукции вируса бешенства использовалась первичная культура клеток ПСХ, в качестве ростовой добавки - сыворотка КРС, стабилизатора - желатоза. Все эти компоненты обладают иммуногенностью, поэтому необходимо было выяснить, какие именно примесные вещества в вирусном АГ вызвали образование AT, обладающих реактогенной активностью.

В результате проведенных исследований была установлена связь между содержанием AT к антигенам клеток ПСХ и реактогенностью препарата АРИГ, подтвержденная реакцией связывания комплемента и иммунопреципитацией по Оухтерлони, а также путем истощения реакогенного иммуноглобулина клетками ПСХ с исчезновением побочных реакций, и реактогенными свойствами AT, элюированных с АГ клеток почек сирийского хомяка. Следует отметить, что ИГ, вызывающий анафилактическую реакцию, после истощения БСА и желатозой, продолжал вызывать у кроликов анафилактический шок. Таким образом, анафилактическая и температурная реакция на внутривенное введением кроликам реактогенных антирабической плазмы и ИГ связана с наличием в них антител к антигенам почек сирийского хомяка. Следовательно, исходная плазма, полученная при иммунизации продуцентов АГ вируса бешенства, должна контролироваться на присутствие в ней AT к субстрату репродукции вируса и на реактогенность, и при необходимости подвергаться истощению соответствующим антигеном.

В связи с отсутствием стандартных методов получения тканевых АГ для истощения соответствующих нежелательных AT, на следующем этапе работы нами был разработан способ получения нерастворимого АГ из клеток почек сирийского хомяка. Для перевода тканевого АГ в стабильную нерастворимую форму клеточный лизат почек обрабатывали 96 % этанолом, 5 % формальдегидом, 3 М калия хлоридом, 2,5 % глютаральдегидом.

Из апробированных методов получения нерастворимых АГ предпочтительным оказался способ, включающий осмотический лизис клеток ПСХ, обработку осадочной части 96 % этанолом, с последующей депирогенизацией тканевого АГ 0,3 М трис-буфером и 3,0 М мочевиной.

Реактогенная антирабическая плазма, истощенная полученным АГ, не вызывала температурной реакции при внутривенном введении кроликам в дозе 10 мл/кг массы и полностью сохраняла специфическую активность. Контроль истощенных серий плазмы на остаточное содержание внесенного нерастворимого антигена клеток ПСХ был отрицателен.

На следующем этапе исследования изучалась возможность получения антирабической плазмы с высокой специфической активностью, не содержащей AT к субстрату репродукции вируса бешенства. Поэтому необходимо было определить зависимость образования вируснейтрализующих и примесных AT от дозы вирусного АГ и остаточного содержания в нем АГ клеток почек сирийского хомяка.

Было обнаружено, что доза АГ оказывала сильное влияние на степень антителообразования. Экспериментальные серии антирабической плазмы, полученные при иммунизации морских свинок вирусным АГ в дозах от 0,10 до 0,50 мл, при которых остаточное содержание антигена клеток ПСХ было не более 0,5 мкг/мл, при внутривенном введении не вызывали температурной реакции.

Анализ специфической активности показал, что кривая титров вируснейтрализующих AT имеет волнообразный характер и на разные иммунизирующие дозы вирусного АГ был получен близкий титр специфических AT, при этом динамика титра вируснейтрализующих AT сохранялась во времени, что согласуется с данными О.Г. Анджапаридзе с соавт. (1957) и Р.В. Гнутовой (1985). Таким образом, иммунизация животных с использованием низких доз вирусного АГ, в котором остаточное содержание антигена клеток ПСХ было менее 0,5 мкг/мл, позволила получить ареактогенную высокоспецифичную антирабическую плазму и снизить нагрузку по АГ клеток почек сирийского хомяка.

Следовательно, АГ вируса бешенства, используемый для иммунизации продуцентов, должен контролироваться не только на содержание общего белка и БСА, как предусмотрено ФС на культуральную антирабическую вакцину, но и на остаточное содержание субстрата репродукции вируса бешенства.

Для количественного определения остаточного содержания АГ клеток ПСХ в вирусном материале нами был предложен модифицированный метод ракетного иммуноэлектрофореза, с чувствительностью 0,5 мкг/мл.

Более эффективного повышения специфической активности иммунной плазмы можно достичь при совместной иммунизации продуцентов вирусным АГ с адъювантом. Поэтому мы изучили влияние наиболее часто применяемых адъювантов на образование вируснейтрализующих антител.

Анализ специфической активности показал, что алюминия фосфат имел преимущество по сравнению с другими адъювантами и вызывал в 1,54,9 раза (р<0,05) более высокий гуморальный иммунный ответ.

Далее перед нами стояла задача уточнить оптимальную концентрацию адъюванта алюминия фосфата в АГ вируса бешенства.

Анализ динамики содержания вируснейтрализующих AT в антирабической плазме показал, что снижение концентрации адъюванта в АГ вируса бешенства не всегда ведет к снижению специфической активности. Высокая концентрация алюминия фосфата стимулировала высокий ранний, а низкая - высокий поздний гуморальный иммунный ответ. Следовательно, при длительной иммунизации продуцентов антирабической плазмы предпочтение следует отдавать более низким концентрациям алюминия фосфата в вирусном антигене. Концентрация ионов алюминия в АГ вируса бешенства - 0,5 мг/мл является оптимальной для сорбции вируса бешенства, т.к. она эффективно стимулировала антителообразование на всех стадиях иммуногенеза.

В связи с использованием адъюванта, была изучена возможность получения высокой специфической активности антирабической плазмы при более низких дозах сорбированного антигена. Сорбция вируса бешенства на алюминия фосфате позволила получить высокий титр вируснейтрализующих AT при снижении дозы сорбированного АГ в 3-5 раз, что позволяет снизить затраты на вирусный АГ при гипериммунизации продуцентов. При этом наиболее высокий титр вируснейтрализующих AT выявлялся при концентрации ионов алюминия 0,5 мг/мл.

Далее мы изучили, как зависит антительный ответ от вируса бешенства, культивированного на разных субстратах. Поскольку в предыдущих исследованиях было установлено, что сорбированный на алюминия фосфате вирус бешенства, полученный на первичных клетках ПСХ, вызывает более сильный гуморальный ответ по сравнению с АГ без адъюванта, важно было установить, сохранится ли это преимущество при переходе на другой субстрат. Поэтому для иммунизации морских свинок использовали нативный, концентрированный и сорбированный на алюминия фосфате вирус бешенства, репродуцированный на первичной культуре клеток ПСХ и перевиваемой культуре клеток Vero.

Анализ титра вируснейтрализующих AT, на 42-е сутки иммунизации, показал, что вирус бешенства, полученный на перевиваемой культуре клеток Vero, вызывал статистически значимо более сильный гуморальный ответ как при использовании нативного - в 3,2 раза, так и концентрированного - в 3,9 раза и сорбированного вируса - в 4,9 раза по сравнению с вирусом, культивированным на первичных клетках ПСХ, несмотря на практически одинаковую иммуногенность использованных АГ. Максимальный титр специфических AT был получен при иммунизации морских свинок сорбированным вирусом бешенства, репродуцированным на перевиваемых клетках Vero.

Важно было установить, будет ли сорбированный на алюминия фосфате вирус бешенства, полученный на перевиваемой культуре клеток Vero, вызывать и у лошадей-продуцентов более высокий антительный ответ по сравнению с вирусом, полученным на субстрате клеток почек сирийского хомяка.

На всем протяжении иммунизации специфическая активность антирабической плазмы, полученной при иммунизации лошадей сорбированным АГ вируса бешенства на основе субстрата клеток Vero, по сравнению с первичной культурой клеток ПСХ была статистически значимо выше, и кратность увеличения возрастала с каждой последующей иммунизацией от 1,5 до 2,4 раза. Во всех полученных сериях лошадиной антирабической плазмы титр вируснейтрализующих AT был выше 75 МЕ/мл и не выявлялись AT к примесным компонентам антирабической вакцины, что подтверждает обоснованность допустимого остаточного содержания субстрата репродукции и низких доз вирусного АГ, используемого для иммунизации. Таким образом, была получена высокоспецифичная ареактогенная лошадиная антирабическая плазма, пригодная для получения препарата антирабического иммуноглобулина.

В силу определяющей роли показателя безопасности при создании гетерологичного препарата ИГ, перед нами стояла задача получения высокоочищенного F(ab)2-npenapaTa с максимальным содержанием у-глобулиновой фракции. Поэтому нами было проведено сравнение различных методов выделения у-глобулинов: анионообменной хроматографии, сульфатного, риванольного, риванол-сульфатного, риванол-спиртового, каприлатного, каприлатно-сульфатного и каприлатно-спиртового с проведением и без стадии протеолиза .

При всех методах фракционирования стадия протеолиза, обеспечивающая получение F(ab)2-npenapaTa, повышала содержание у-глобулиновой фракции и снижала содержание реактогенных примесей -альбумина и а- и р-глобулинов. Анализ полученных серий АРИГ по электрофоретической чистоте и выходу специфической активности показал преимущество каприлатно-спиртового способа с протеолизом, который и был выбран в качестве основного метода получения препарата. В готовую форму препарата добавляли натрия хлорид в пределах 0,20-0,45 % и стабилизаторы: 0,7-1,5 % глицин и 0,5-3,0 % мальтозу. Комбинация стабилизаторов и натрия хлорида была подобрана в концентрациях, обеспечивающих физиологичную осмолярность разрабатываемого препарата иммуноглобулина в пределах 250-350 мОсм/кг.

На конечном этапе работы мы провели сравнение разработанного препарата АРИГ с коммерческими аналогами фирм «Биолек» и «Микроб». Препарат, полученный по нашей технологии превосходил препараты сравнения по качеству. Он характеризовался большей электрофоретической чистотой, содержание у-глобулинов превышало аналоги на 10 %, содержание реактогенных а- и р-глобулинов снижено в 4 раза. Анализ молекулярных параметров показал, что полученный нами АРИГ является F(ab)2-npenapaTOM. Содержание Р(аЬ)2-фрагментов IgG составляло не менее 90 %, а содержание Fc-фрагментов снижено в 3,3-7,5 раза. Кроме того, наш препарат обладал в 1,5 раза большей удельной специфической активностью. Осмолярность разработанного препарата снижена в 2 раза и доведена до физиологичного уровня - 300 мОсм/кг. Снижение содержания натрия хлорида в препарате с 0,9 до 0,45-0,1 %, внесение дополнительного стабилизатора мальтозы в конечную лекарственную форму обеспечило стабильность препарата в тестах на ускоренное старение и перемешивание.

Таким образом, в результате настоящих исследований была разработана собственная модификация технологического процесса, позволяющая получить ареактогенный высокоочищенный F(ab)2-npenapaT иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, обладающий высокими качественными характеристиками и стабильностью в условиях хранения и транспортировки, что позволит свести к минимуму риск возникновения нежелательных реакций при терапии больных.