Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Разработка технологии фиксации изолированных клеток при субретинальной трансплантации



На правах рукописи

МИРГОРОДСКАЯ СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФИКСАЦИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПРИ СУБРЕТИНАЛЬНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

14.01.07 - глазные болезни 14.01.24 - трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

15 ЯН(3 2015

Москва-2014

005557286

005557286

Работа выполнена в ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.

Федорова» Минздрава России

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Белый Юрий Александрович Заместитель директора по научной работе Калужского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Темпов Андрей Александрович Руководитель лаборатории клеточных и физико-химических медицинских технологий НИИ Скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Ченцова Екатерина Валериановна

доктор медицинских наук, профессор, и.о. руководителя отдела травматологии и реконструктивной хирургии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России

Ведущая организация:

Лекишвили Михаил Васильевич

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией «тканевой банк» ФГБУ «ЦНИИТО им. H.H. Приорова» Минздрава России

ФГБУ «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится «2» марта 2015 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Автореферат разослан «30» декабря 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

И.А. Мушкова

Список сокращений

ВМД возрастная макулярная дегенерация ДР диабетическая ретинопатия

КТ компьютерная томография

ММСК мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки MIT реагент - 3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2Н-тетразолия бромид

ПЭМИ полимерный эластичный магнитный имплантат GFP green fluorescent protein (зеленый флюоресцентный белок)

НЕК human embryonic kidney (линия клеток эмбриональной почки

человека)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В современной офтальмологии существует множество способов лечения патологии сетчатки, включающих в себя медикаментозные, лазерные, ультразвуковые, электро- и магнитостимуляции и комбинации вышеперечисленных. Однако при всем многообразии методов лечения такие заболевания сетчатки, как посттравматические и воспалительные, гипертоническая ангиопатия сетчатки, постгромботическая ретинопатия, возрастные макулярные дегенерации (ВМД), диабетическая ретинопатия (ДР) и наследственные заболевания по-прежнему остаются ведущими причинами слабовидения и слепоты во всем мире.

Одним из перспективных методов лечения заболеваний сетчатки является клеточная и генная терапия.

На начальных этапах исследований на экспериментальных животных было показано, что темп нейродегенерации в глазу может быть замедлен при местном введении в патологически измененную ткань нейротрофических,

3

\

антиапоптотических цитокинов и факторов роста. Однако эти белки обладают коротким дистантным действием и подвергаются быстрой инактивации ферментными системами организма, что исключает их системное введение (Chaum Е., 2003; LaVail М.М. et al., 1992, 1998; Wenzel A. et al., 2005). Для пролонгирования терапевтического действия нейротрофических факторов и цитокинов необходимо субретинальное введение генетических или клеточных конструкций, осуществляющих продукцию белковых молекул непосредственно в пораженной ткани (Bennett J., 2000; Borras T., 2003; Hauswirth W. et al., 1998; Hermens W.T. et al., 1998; Isenmann S. et al., 2004; Martin K.R. et al., 2002; Surace E.M. et al, 2003).

Оптимальным считается использование стволовых или прогениторных клеток, трансфецированных генетическими конструкциями и продуцирующих нейротрофические и другие факторы в патологическим очаге (Гундорова P.A., 2008; Ченцова Е.В, 2007; Aramant R.B. et al., 2005; Banin E. et al, 2006; Böhm M.R. et al, 2012; Cramer A.O. et al, 2013; Das A.M. et al, 2005; Klassen H. et al, 2004; Lund R.D. et al, 2001, 2003). Среди клеток, пригодных для трансфекции генов и последующей трансплантации в сетчатку глаза, следует выделить клеточную культуру эмбриональных стволовых клеток почки человека НЕК-293 (human embryonic kidney), которая легко поддается трансфекции как маркерных, так и потенциально терапевтических генов (Amar L. et al, 2006; Graham F.L. et al, 1977; Jimenez J.C. et al, 2004).

Однако эффект клеточной терапии при лечении патологии сетчатки резко снижается из-за того, что трансплантированные клетки, обладая homing-эффектом, мигрируют из зоны введения в привычное для себя микроокружение - в орган, из которого они выделены.

В настоящее время популярным направлением становится использование магнитных технологий для направленной доставки клеточного материала и возможной его фиксации. Впервые с этой целью клетки, содержащие магнитные наночастицы, были использованы для движения клеток при внутривенном введении к области печени (Arbab A.S. et al, 2004; Song M. et al, 2010). Затем стволовые клетки с магнитными наночастицами были

4

использованы для движения к месту повреждения сосудов и сердца (Kyrtatos P.G. et al., 2009; Leong W.S. et al., 2010). Однако в эксперименте in vitro к 24 часам жизнеспособность клеток, меченных по указанной авторами технологии, составляла лишь 30%.

В 2012 году Yanai А. с соавт. доказали возможность использования магнитных наночастиц для направленной доставки стволовых клеток в область сетчатки, но авторы не ставили перед собой цель длительной фиксации трансплантированного материал в зоне введения.

Таким образом, актуальной представляется разработка технологии введения магнитных частиц в цитоплазму клеток, позволяющей получать функционально активные и жизнеспособные клетки. Кроме того, разработка способа локального введения и фиксации клеток в области повреждения является перспективным и многообещающим направлением в генной и клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний сетчатки.

Цель работы

Разработать и экспериментально обосновать эффективность технологии контролируемой субретинальной трансплантации клеточного материала, обладающего потенциальным терапевтическим эффектом, и его фиксации.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать технологию введения микронных магнитных частиц в эмбриональные стволовые клетки почки человека линии НЕК-293, трансфецированные геном GFP.

2. Разработать оригинальный магнитный имплантат для эписклеральной фиксации.

3. Разработать хирургический способ и устройства для локальной субретинальной трансплантации клеток линии НЕК-293, содержащих магнитные частицы.

4. Провести клинико-морфологическое обоснование эффективности способа субретинальной трансплантации клеточных элементов, меченных магнитными частицами, их фиксации в эксперименте in vivo.

Научная новизна результатов исследования

Впервые разработана технология введения микронных магнитных частиц в цитоплазму клеточной культуры, используемую для проведения генной терапии и позволяющую получить функционально активную клеточную популяцию, длительно сохраняющую жизнеспособность после субретинальной трансплантации.

Впервые доказано, что магнитные частицы, введенные в цитоплазму клеток, используемых для генной терапии, не влияют на активность трансфецированного гена.

Впервые создан оригинальный полимерный эластичный магнитный имплантат с лазерным зондом для эписклеральной фиксации.

Впервые разработаны хирургический способ и устройство для локальной дозированной субретинальной трансплантации клеточного материала, содержащего магнитные частицы.

Впервые доказано, что предложенный способ позволяет осуществить длительную фиксацию трансплантированного клеточного материала в зоне его локального введения, и исключает миграцию клеток из субретинального пространства в полость стекловидного тела.

Практическая значимость результатов работы

Разработанная технология введения магнитных частиц в клетки линии НЕК-293 позволяет использовать полученную культуру для направленной доставки и фиксации клеточного материала в зону повреждения.

Разработанный полимерный эластичный магнитный имплантат с лазерным зондом осуществляет интраоперационную диафаноскопию, что открывает широкие перспективы для проведения генной и клеточной терапии в экспериментальной офтальмологии.

Разработанное устройство дает возможность точно дозировать объем суспензии, вводимой субретинально, и обеспечивает доступ pars plana в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией сетчатки и окружающей ткани, что может использоваться для подачи жидкостей, вводимых при витреоретинальных операциях в офтальмологии.

Разработанный хирургической способ позволяет осуществлять контролируемую локальную трансплантацию клеточного материала в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией окружающих тканей, а также фиксировать трансплантированный клеточный материал в зоне введения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Трансфецированные геном GFP клетки линии НЕК-293 с введенными в них микронными магнитными частицами сохраняют активность генетической конструкции и остаются жизнеспособными после трансплантации в сетчатку глаза экспериментальных животных.

2. Разработанная методика локальной субретинальной трансплантации клеточного материала, меченного магнитными частицами, с помощью оригинального устройства дозирования и полимерного эластичного магнитного имплантата позволяет осуществлять трансплантацию с минимальной травматизацией окружающей ткани и фиксировать материал в месте введения сроком до 21 дня.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на VIII Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2013), на XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения-2013» (Москва, 2013), на научно-клинической конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва, 2014).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 7 - в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Имеется один патент РФ на изобретение, подана заявка на получение патента РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 64 рисунками, содержит 2 таблицы. Список использованной литературы включает 176 источников, из них - 29 отечественных и 147 зарубежных.

Исследование безопасности и эффективности технологии насыщения магнитными частицами стволовых клеток клеточной линии НЕК-293 GFP в эксперименте in vitro выполнялось на базе лаборатории клеточных и физико-химических медицинских технологий ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского» и Института биологии гена Российской академии наук под руководством д.м.н. A.A. Темнова.

В качестве источника слабого постоянного магнитного поля использовали оригинальные имплантаты на основе полимерных эластичных магнитных материалов, разработанные нами совместно с ООО НЭП «Микрохирургия газа» (Москва), намагничивание проводили в ООО «ЭЛМАТ-ПМ» (Калуга). Оптоволокно (лазерный световод), имплантированное внутрь магнита, производства ООО «Полироник» (Москва).

Экспериментальные исследования in vivo выполнены на базе Калужского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (директор - д.м.н. A.B. Терещенко) под руководством зам. директора по научной работе - д.м.н., проф. Ю.А. Белого.

Морфологические исследования выполнены на двух базах: лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза Центра фундаментальных и

8

прикладных медико-биологических проблем (зав. центром - д.м.н. С.А. Борзенок) ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, при непосредственном участии зав. лабораторией, к.м.н. A.B. Шацких; отдела геномики и клеточных технологий Института биологии гена Российской академии наук, при непосредственном участии старшего научного сотрудника группы нейрогенетики и генетики развития (руководитель группы - д.б.н., профессор Г.В. Павлова), к.б.н. A.B. Ревищина.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовалась линия стволовых клеток НЕК-293 GFP (human embryonic kidneys), полученная из клеток почки эмбриона человека и выращенная в культуре ткани («Биолот», Санкт-Петербург, Россия) и транфецированная GFP-плазмидой («Clontech», США).

Исследование безопасности и эффективности технологии насыщения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293 магнитными частицами и оценка их взаимодействия с магнитным имплантатом в эксперименте in vitro

В данной работе были использованы магнитные микрочастицы Dynabeads М-280 («Invitrogen», США) для введения в цитоплазму клеток линии НЕК-293, трансфецированных GFP-плазмидой. Данная методика насыщения использовалась впервые и подробно описана в главе «Результаты исследования».

Оценка пролифератнвной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами

Пролиферативная активность оценивалась методом МТТ теста. Реагент МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетразолий бромид) восстанавли-

вается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатдегидрогеназы до водонерастворимого темноокрашенного формазана.

Формазан может быть эллюирован из клеток с помощью органических сольвентов (изопропанол, диметилсульфоксида (ДМСО) и т.д.). Определено, что оптическая плотность эллюатов при длине волны 570 нм (максимум поглощения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце.

После внесения в культуру клеток магнитных частиц оценивали их жизнеспособность на 1-е, 2-е и 3-й сутки. В качестве контроля использовалась культура клеток без магнитных частиц. Для этого в лунки вносили МТТ и инкубировали в присутствии МТТ (0,25 мг/мл, Serva, Германия) в течение еще 3 часов. Формазан эллюировали с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 30 минут при 37°С и проводили измерение оптической плотности эллюата на планшетном спектрофотометре Multiscan (Nhermo Scientific, США) при длине волны 570 нм.

Оценка прочностных, токсикологических, цитотоксических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов

В работе в качестве магнитных имплантатов, которые размещали эписклерально и фиксировали узловыми швами, использовали полимерные эластичные магнитные имплантаты (ПЭМИ) оригинальной конструкции с лазерным зондом, подробно описанные в главе «Результаты исследования».

Для оценки механических и прочностных свойств магнитного имплантата производили его гидротермообработку по методике ускоренного старения, принятой для испытания полимерных магнитов. Имплантаты выдерживали при температуре 90°С в течение 2 недель, что соответствует 5 годам эксплуатации при нормальных условиях. Затем проводили контроль внешнего вида под микроскопом на наличие механических повреждений.

Для оценки токсикологических свойств проводили исследование, разработанное в ФГБУ «МНТК «Микрохиругия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России» для офтальмологических изделий в

10

соответствии с требованиями Международного стандарта ISO 10993-1. Выполняли РН-метрию, ультрафиолетовую спектроскопию,

иммунотоксический тест, оценивали выживаемость клеток на тест-объекте, наличие аутоиммунных молекулярных комплексов и мутагенности по микроядерному тесту. Измерения проводили относительно контроля (воды). Результаты сравнивали с пороговыми значениями.

Исследование цитотоксических, цитостатических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов было проведено путем со-культивирования с культурой мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека (ММСК), оценивали рост культуры ММСК на магнитных имплантатах.

Исследование локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного нмплантата на структуры глаза

Было проведено исследование на 24 глазах 12 кроликов породы шиншилла в возрасте 6 месяцев весом от 2,5 до 3,5 кг. После выполнения анестезии, кроликам в области проекции верхней прямой мышцы, отступя 3 мм от лимба, проводили разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 3-4 мм и выделяли верхнюю прямую мышцу. Далее, отступив от лимба 7 мм к склере, в верхнем сегменте нитью 5-0 Dacron (Alcon, США) подшивали полимерный эластичный магнитный имплантат толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм с лазерным зондом, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл, после чего лазерный зонд отрезали конъюнктивальными ножницами на уровне магнитного материала. ПЭМИ подшивали таким образом, чтобы 'А часть имплантата находилась под мышцей (12 глаз). В контрольной группе (12 глаз) аналогично имплантировали силиконовый материал (марки CJI-150) без магнитного наполнителя. На конъюнктиву накладывали шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon, США). Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде проводили стандартное клиническое офтальмологическое обследование для животных на 1-е сутки, 1-ю неделю, 1 и 3 месяца. Глаза

И

энуклеировали с последующим морфологическим исследованием проводилась в эти же сроки.

Оценка эффективности взаимодействия внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата

В эксперименте in vitro под чашки Петри с клетками, меченными магнитными частицами, подводили магнитные имплантаты с разной напряженностью от 1 до 5 мТл и производили маятникообразные колебательные движения, оценивая интенсивность намагничивания. Таким образом определяли оптимальную напряженность магнитного поля, необходимую для удержания клеток в эксперименте in vivo.

Исследование эффективности метода субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами, в эксперименте in vivo

Третьим этапом выполняли исследование in vivo на 96 глазах 48 кроликов породы шиншилла в возрасте 6 месяцев весом от 2,5 до 3,5 кг. Все правые глаза были опытными (48 глаз), а левые (48 глаз) - контрольными. Всем кроликам в оба глаза за 30 минут до операции в конъюнктивальную полость инсталлировали 1-2 капли 1% раствора атропина и 1% тропикамида для достижения медикаментозного мидриаза. В качестве анестезии выполняли общий наркоз, который осуществляли внутримышечным введением 1% раствора гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли трехкратной инстилляцией в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина. Перед операцией всем экспериментальным животным промывали конъюнктивальную полость раствором фурациллина 1:5000. Иммобилизацию животных производили путем тугого бинтования.

В опытной группе (48 глаз) после установки блефаростата, отступя 3 мм от лимба, с помощью конъюнктивальных ножниц в нижнем сегменте производили разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 10 мм. Далее выделяли нижнюю прямую мышцу, брали ее на шов-держалку. Затем

12

в 7 мм от лимба в нижнем сегменте на 7 часах подшивали комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата (ПЭМИ) толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл с лазерным зондом. В 3 мм от лимба в верхнем и верхне-наружном сегменте устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела на 1, 2 и И часах, фиксировали инфузионную систему, световод, витреотом, выполняли срединную витрэктомию. Суспензию объемом 0,02 мл, содержащую стволовые клетки (n ~ 6000), меченные магнитными частицами, вводили субретинально в область лазерного пятна, полученного в результате диафаноскопии. Клетки вводили субретинально при помощи разработанного нами устройства для дозирования с иглой 25G, на конце которой расположена изогнутая канюля 41G с заточенным нижнем краем. Для предотвращения выхождения клеток через ретинотомическое отверстие сразу после их введения в витреальную полость вводили газо-воздушную смесь в количестве 1,0-1,2 мл. По завершению эксперимента лазерный зонд обрезали на уровне полимерного эластичного магнитного имплантата. На склеротомические отверстия и конъюнктиву накладывали шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon, США). В группе контроля (48 глаз) хирургическое введение стволовых клеток проводили субретинально, но без фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата с лазерным зондом.

Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде через 3 часа, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 сутки и 1 месяц проводили биомикроскопию, офтальмоскопию глазного дна с фотографированием, ультразвуковое офтальмосканирование, компьютерную томографию (КТ), морфологическое исследование (крио-гистологические срезы).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода культивирования клеток и насыщения магнитными частицами

Для культивирования НЕК-293 применялась среда DMEM (ПанЭко, Россия), при добавлении 10% фетальной сыворотки крови (Perbio HyClone,

13

США), L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 4% гентамицина (ПанЭко, Россия). Культура клеток инкубировалась при 37°С в СО2 инкубаторе. Клетки росли на площади 25 см2, во флаконах («Costar», США). По мере нарастания культуры

клеток почек эмбриона человека НЕК-293 до концентрации 1,5 х 105 клеток

мл"', клетки подвергались трансфекции полученными конструкциями: EGFP-N1 («Clontech», США). Трансфекция осуществлялась с помощью реагента ExGene 500 (Fermentas, R0511, США), согласно протоколу. Селекция клонов, несущих встроенную конструкцию, проводилась с помощью реагента-антибиотика гиницитина (G418, Invitrogen # 15750045, США), в течение десяти дней. После селекции с использованием антибиотика клоны, устойчивые к G418, были использованы для анализа с помощью микроскопа (Olympus, Япония). Все колонии были GFP-позитивными. Клетки были рассеяны на 3-см чашки Петри («Corning», США) в количестве около 300 тысяч. Через 24 часа к клеткам были добавлены магнитные частицы Dynabeads М-280 («Invitrogen) (в соотношении 1:100), которые были предварительно обработаны 4% раствором поверхностно активного вещества проксанола 268. Комбинация клеток HEK/GFP с магнитными частицами культивировалась 24 часа при температуре 37°С в СОг инкубаторе. Через 24 часа трансгенная культура по гену GFP с магнитными частицами была пятикратно промыта раствором Хенкса (ПанЭко, Россия) и обработана раствором трипсина (ПанЭко, Россия). Коллекцию клеток осуществляли в 1,5 мл эппендорф фирмы Corning (США). Клетки были осаждены на центрифуге фирмы Eppendorf (Германия) в течение 3 минут при 1500 оборотов в минуту.

Результаты оценки пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами

По результатам эксперимента in vitro было показано, что проникновение магнитных частиц внутрь стволовых клеток незначительно (до 15% через 72 часа инкубации) снижает пролиферативную активность. Это говорит о том, что жизнеспособность клеток при данной технологии составляет до 95%.

По проведенному анализу литературы были выявлены результаты других авторов, использующих магнитные наночастицы. Жизнеспособность клеток по приведенной ими технологии, достигала лишь 30% к первым суткам (КугШоБ Р.в. й а1., 2009; Leong е1 а1., 2010), что доказывает преимущества

разработанной нами технологии.

Таким образом, разработанная технология культивирования клеток НЕК-293 вРР с магнитными частицами является безопасной, эффективной и может использоваться в экспериментальной практике с целью маркировки или фиксации материала.

Результаты разработки оригинального магнитного имплантата для эпнсклеральной фиксации

Из полимерного эластичного магнитного материала были разработаны имплантаты (пластины толщиной 0,35 мм), круглой формы, диаметром 4 мм, которые намагничивались в импульсных полях индукцией 1,0 Тл. Таким образом, были созданы ПЭМИ с индукцией магнитного поля от 1 до 5 мТл с шагом в 1 мТл.

Намагничивание и измерение магнитных свойств материала производилось на аппаратуре фирмы ЗАО «Элмат-ПМ» (Калуга).

В центре ПЭМИ располагается лазерный зонд производства ООО «Полироник» (Москва), представляющий собой полимерное оптоволокно диаметром 0,25 мкм с изогнутым под 60° концом, где располагается рассеивающая микролинза. Микролинза позволяет фокусировать лазерное излучение на расстоянии 1,0 мм.

Результаты оценки прочностных, токсикологических, цнтотоксическнх, цнтостатических и ростстнмулирующих свойств магнитных имплаптатов на культурах клеток

Проведенные исследования показали, что предложенный полимерный эластичный магнитный нмплантат оригинальной конструкции является прочным и нетоксичным материалом. Доказано, что ПЭМИ не подвергаются механическим повреждениям в результате гидротермообработки,

15

токсикологические их свойства не выявлены, они не влияют на скорость пролиферации и не обладают ростостимулирующими свойствами, так как ММСК не растут на данном материале.

Результаты исследования локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза

Эписклеральное расположение имплантатов вызывало у всех экспериментальных животных развитие умеренно выраженной воспалительной реакции. По данным морфологического исследования вокруг эписклерального ПЭМИ постепенно отмечено развитие фиброзной капсулы, с начальными признаками на 7-е сутки и окончательным формированием к сроку 1 месяц. Далее (до 3 месяцев) пролиферативные явления сменялись склерозированием, что вызвало уплотнение капсулы, и к окончанию эксперимента она была представлена зрелой фиброзной тканью.

Таким образом, можно сделать заключение, что разработанный полимерный эластичный магнитный имплантат может применяться для экспериментальной офтальмологии.

Результаты оценки эффективности взаимодействия

внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата

При оценке эффективности взаимодействия клеток, меченных магнитными частицами, и внешнего магнитного имплантата, подведенного под чашки Петри было выявлено, что клетки прикрепляются к поверхности магнита напряженностью 5 мТл в течение 1-го часа и распластываются на поверхности. Это говорит о нетоксичности данного материала и пригодности для полноценного функционирования клеток, а также определяет оптимальную напряженность магнитного поля, равную 5 мТл, достаточную для удержания стволовых клеток, меченных магнитными частицами, в предполагаемой области введения в последующем эксперименте in vivo.

Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретиналыюго введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами

По результатам бномикроскопии в сроки наблюдения 1-3 суток в обеих группах отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, которая проходила к 5-м суткам. На всех сроках наблюдения швы конъюнктивы и склеротомических отверстий были адаптированы. Оптические среды были прозрачны, кроме 3 глаз опытной группы и 2 - контрольной, где визуализировалось помутнение в хрусталике, связанное с повреждением во время проведения хирургического вмешательства. Воспалительных явлений ни в одном случае не наблюдалось.

По результатам офтальмоскопии на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки в зоне введения клеток, дефект сетчатки и сосудистой оболочки. К 3-м суткам отслойка сетчатки не визуализировалась, но дефект сетчатки и сосудистой оболочки сохранялся. В дальнейшие сроки наблюдения было сложно визуализировать место локального введения клеток. В 3 случаях из опытной группы и в 2 из контрольной проведение офтальмоскопии было затруднительно в связи с помутнением хрусталика.

По данным ультразвукового исследования на всех глазах опытной и контрольной групп на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки высотой 1,0-1,4 мм, которая к 3-м суткам уменьшилась до 0,4-0,7 мм, а к 5-м суткам полностью регрессировала. Во все сроки наблюдения в обеих группах визуализировалась мелкодисперсная взвесь в стекловидном теле, а в опытной группе - эхо-тень от магнита.

Данные КТ во всех случаях подтверждали расположение ПЭМИ в правом ретробульбарном пространстве в нижне-латеральном квадранте. Левые орбиты были интактны, патологических очагов выявлено не было.

По проведенным клиническим исследованиям можно сделать заключение, что предложенная хирургическая методика локального субретинального введения клеточного материала, обладающего потенциальным терапевтическим эффектом, является контролируемой и малоинвазивной, риск

17

травматизации тканей минимален в связи с возможностью визуализации места расположения ПЭМИ за счет диафаноскопии и разработанного устройства дозирования, осуществляющего деликатный доступ в субретинальное пространство.

По данным морфологического исследования (флюоресцентной микроскопии криосрезов энуклеированных глазных яблок) в первые сутки на всех б глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались в месте их введения под сетчаткой, в стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были. На всех глазах контрольной группы были обнаружены единичные клетки или группы клеток НЕК-293 GFP в полости стекловидного тела, не связанные с другими структурами глаза.

На 3-й сутки на всех глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались также в месте введения под сетчаткой. При добавлении на срезы красителя бисбензимида, окрашивающего ядра живых клеток, доказано, что группа клеток, находящихся под сетчаткой, являются живыми. В контрольной группе в 3 случаях из 6 в полости стекловидного тела были обнаружены скопления клеток НЕК-293 GFP, не связанные с другими структурами глаза, в остальных 3 случаях клетки НЕК-293 GFP обнаружены не были.

В сроки наблюдения 5, 7, 10, 14, 21 сутки в опытной группе клетки НЕК-293 GFP также располагались в месте их введения, но количество клеток снижалось на каждом последующем сроке наблюдения. К сроку 1 месяц клетки обнаружить не удалось ни в одном случае, но на всех 6 глазах наблюдалась присклеральная флюоресценция в зоне подшивания ПЭМИ. В контрольной группе в сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток и 1 месяц клетки не визуализировались.

В ходе проведенного морфологического исследования было выявлено, что предложенный способ субретинального введения клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, и эписклеральной фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата, является эффективным способом фиксации клеточного материала в месте его локальной имплантации сроком до 21 суток.

В результате проведения анализа литературных данных, была найдена лишь одна работа по использованию стволовых клеток, меченных суперпарамагнитными частицами для направленной доставки клеточного материала в область сетчатки. Для этого авторы со-культивировали мезенхимальные стволовые клетки с суперпарамагнитными наночасптцалш и метили клетки маркером С>-Тгаскег 655. В результате проведенных криогистологических срезов авторы получили достоверные данные о нахождении клеток во внутренних слоях сетчатки в области фиксации магнита только на сроке 1 неделя.

Таким образом, можно сделать заключение, что впервые разработан комбинированный хирургический способ локального субретинального введения клеток НЕК-293 ОРР, меченных магнитными частицами, который является эффективным способом фиксации клеточного материала в зоне трансплантации на длительный срок, открывает возможности для пролонгирования действия клеток, обладающих терапевтическим потенциалом, в зоне локального повреждения и позволяет избежать в будущем осложнений, вызванных клеточной трансплантацией, таких как Ьот^-эффект и туморогенный эффект.

Выводы

1. Разработанная технология введения магнитных частиц в цитоплазму эмбриональных стволовых клеток почки человека линии НЕК-293 позволяет получить функционально активную и жизнеспособную клеточную популяцию, пригодную для экспериментальной трансплантации.

2. Разработанный оригинальный магнитный имплантат с лазерным световодом для эписклеральной фиксации позволяет локализовать место фиксации магнита, является прочным и устойчивым материалом, не обладает токсическим воздействием на ткани глаза и может использоваться в экспериментальной и клинической офтальмологии.

3. Разработанное оригинальное устройство для субретинального дозированного введения стволовых клеток позволяет точно дозировать объем

19

вводимой суспензии и обеспечивает доступ pars plana в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией сетчатки и окружающих тканей, может использоваться для подачи жидкостей, вводимых при витреоретинальных операциях в офтальмологии.

4. Комбинация разработанного хирургического способа трансплантации клеток в субретинальное пространство и взаимодействия стволовых клеток, меченных магнитными частицами, с внешним полимерным эластичным магнитным имплантатом позволяет осуществить фиксацию материала в зоне введения и снижает возможность миграции клеток в полость стекловидного тела.

5. В результате проведенных клинико-морфологических исследований доказано, что предложенная методика с использованием магнитных технологий позволяет осуществить фиксацию клеточного материала в месте локального введения сроком в 7 раз дольше, в сравнении с группой контроля, где магнитные технологии не использовались.

Практические рекомендации

1. Проведенные исследования in vitro доказали эффективность и безопасность предложенной технологии введения магнитных частиц в цитоплазму стволовых клеток линии НЕК-293, что позволяет использовать данную технологию в последующих экспериментальных исследованиях.

2. Разработанный оригинальный комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата с лазерным зондом осуществляет интраоперационную диафаноскопию, локализует место фиксации имплантата и может использоваться в экспериментальной офтальмологии.

3. Разработанное оригинальное устройство дозирования точно регулирует объем вводимой суспензии и обеспечивает доступ pars plana в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией сетчатки, что может быть использовано для введения жидкостей в офтальмологии.

4. Хирургический способ локального субретинального введения клеточного материала, меченного магнитными частицами, позволяет

фиксировать трансплантированный материал в месте введения на длительный срок, и может быть использован в экспериментальной офтальмологии для пролонгирования эффекта генной терапии при различной патологии сетчатки и зрительного нерва.

Список публикаций по теме диссертации

1. Белый Ю.А., Темное A.A., Миргородская С.А. Разработка технологии культивирования мезенхнмальных стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2013. - № 4. - С. 40-43.

2. Белый Ю.А., Темнов A.A., Миргородская С.А. Технология культивирования мезенхимальных стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения // Восток- Запад: Научно-практ. конф. с междунар. участием: Сб. науч. тр. / ГБУ «Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней Академии наук Республики Башкортостан»; Под ред. М.М. Бикбова. - Уфа: ДизайнПресс, 2013. - С. 431432.

3. Миргородская С.А., Темнов A.A., Белый Ю.А. Разработка технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения // Актуальные проблемы офтальмологии: Всерос. науч. конф. молодых ученых, 8-я: Сб. науч. работ / Под ред. Б.Э. Малюгина. - М.: Офтальмология, 2013. - С. 180-182.

4. Миргородская С.А., Белый Ю.А., Темнов A.A. Методика локального субретинального введения мезенхимальных стволовых клеток, меченных магнитными частицами // Актуальные проблемы офтальмологии: Всерос. науч. конф. молодых ученых, 8-я: Сб. науч. работ / Под ред. Б.Э. Малюгина. -М.: Офтальмология, 2013.-С. 182-184.

5. Белый Ю.А., Темнов A.A., Терещенко A.B., Миргородская С.А. Мезенхимальные стволовые клетки с магнитными частицами для субретинального введения // Федоровские чтения-2013: Всерос. научно-

практ. конф. с междунар. участием, 11-я: Сб. материалов / Под ред. Б.Э. Малюгина. - М„ 2013. - С. 139-140.

6. Белый Ю.А., Темнов A.A., Терещенко A.B., Миргородская С.А. Мезенхимальиые стволовые клетки с магнитными частицами для субретинального введения в офтальмологии // Офтальмология. - 2013. -Т. 10.-№ 3.- С. 72-74.

7. Белый Ю.А., Терещенко A.B., Миргородская С.А., Темнов A.A., Семенов A.B., Ревищин A.B., Павлова Г.В., Куст H.H. Разработка и экспериментальное обоснование эффективности методики локального субретинального введения ксеногенных стволовых клеток, меченных магнитными частицами // Офтальмология. — 2014. — Т. 11 - № 3. — С. 45-51.

8. Темнов A.A., Белый Ю.А., Миргородская С.А., Семенов А.Д., Шацких A.B., Ревищин A.B., Павлова Г.В., Куст H.H., Склифас А.Н. Использование магнитных частиц для фиксации изолированных клеток при субретиналыгой трансплантации II Трансплантология. - 2014. - № 4. - С. 12-20.

9. Темнов A.A., Ревищин A.B., Белый Ю.А., Терещенко A.B., Миргородская С.А., Семенов А.Д., Павлова Г.В., Куст H.H. Локальное субретинальное введение ксеногенных стволовых клеток в эксперименте // Инновационная офтальмология: Междунар. науч. конф. офтальмологов Причерноморья «BSOS-XII - Sochi-2014», 12-я: Сб. тез. - Сочи, 2014.-С. 146-147.

10. Белый Ю.А., Темнов A.A., Терещенко A.B., Семенов А. Д., Миргородская С.А. Возможности и перспективы применения в офтальмологии стволовых клеток, меченных магнитными частицами // Катарактальная и рефракционная хирургия. - 2014. - Т. 14. - № 3. - С. 34-38.

И.Белый Ю.А., Терещенко A.B., Миргородская С.А., Темнов A.A., Семенов А.Д., Ревищин A.B., Павлова Г.В., Куст H.H. Локальное субретинальное введение ксеногенных стволовых клеток, меченных

магнитными частицами, в эксперименте // Офтальмохирургия. - 2014. -№ 4. - С. 46-52.

12. Темпов A.A., Белый Ю.А., Миргородская С.А., Семенов А.Д., Ревищин A.B., Павлова Г.В., Куст H.H. Экспериментальное исследование возможности локального субретинального введения ксеногенных стволовых клеток, меченных магнитными частицами // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2014. - № 12. - С. 301306.

Патенты РФ на изобретения по теме диссертации Белый Ю.А., Терещенко A.B., Темное A.A., Миргородская С.А. Способ лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии. Патент РФ на изобретение №2494712 от 10.10.2013.

Белый Ю.А., Терещенко A.B., Миргородская С.А., Темнов A.A. Устройство для субретинального дозированного введения стволовых клеток. Заявка на изобретение №2014141386 от 15.10.2014.

Биографические данные

Миргородская Светлана Александровна, 1988 года рождения, в 2009 г. закончила Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова по специальности «Лечебное дело».

С 2009 по 2011 г. проходила обучение в клинической ординатуре по специальности «Офтальмология» на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. С 2011 по 2014 г. обучалась в очной аспирантуре на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Является автором 12 печатных работ, 1-го патента на изобретение и одной заявки на изобретение.

Подписано в печать: 25.12.14

Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 543 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru