Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Нестабильность генома как критерий выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации в атмосферном воздухе

На правах рукописи

004605237

Легостаева Татьяна Борисовна

Нестабильность генома как критерий выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации в атмосферном воздухе

14.02.01. - гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 И ЮН 1Щ

Москва-2010

004605237

Работа выполнена на кафедре биомедицинских и экологических знаний Магнитогорского государственного университета и в лаборатории генетического мониторинга Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н.Сысина РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук Ингель Фаина Исааковна

доктор медицинских наук Антипанова Надежда Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Любовь Федоровна Курило заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук, профессор Мигмар Александрович Пинигин

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится 24 июня 20 Юг в 11-00 на заседании Диссертационного совета Д 001.009.01 при НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н.Сысина РАМН по адресу: 119992, Москва, ул. Погодинская, д.Ю/15, стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н.Сысина РАМН

Автореферат разослан «24 мая» 2010 года

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Хорошо известно, что здоровье формируется под влиянием ложного комплекса разнохарактерных воздействий (Онищенко Г.Г., Рахманин Ю.А. и ф., 2004). В реальной жизни человек может одновременно контактировать с тысячами ¡еществ, что делает выбор химических соединений, приоритетных для регламентации, )дной из важнейших задач гигиенических исследований.

Опасность не только для ныне живущих, но и для будущих поколений представляют (ещества, повышающие нестабильность генома - мутагены и канцерогены. Рост школогической заболеваемости, наблюдаемый в последние десятилетия во всем мире ВОЗ, 2009), делает особо актуальным выявление генотоксикантов, приоритетных для юрмирования.

/словия для постоянной экспозиции людей генотоксическими соединениями, :одержащимися в выбросах в атмосферу от бытовых источников, предприятий и ранспорта, создаются в промышленных городах (Пинигин М.А., 2001; Пинигин М.А. и Ф, 2005). Так как чувствительность генома у детей выше, чем у взрослых (Neri М. et al, 2003), изучению нестабильности генома детей во всем мире уделяется серьезное внимание. Однако эти исследования далеки от завершения. Так, в доступной литературе не удалось обнаружить сведений о стабильности генома лимфоцитов крови детей, проживающих в городах с развитой отраслью черной металлургии - базовой для экономики России и большинства развитых стран.

Для выбора генотоксикантов с целью регламентации их содержания в атмосферном воздухе перспективным может быть анализ стабильности генома детей, проводимый параллельно с анализом состава загрязнения воздуха. Для выбора территории, удобной для проведения таких исследований, представляется целесообразным проведение экспресс-оценки суммарной мутагенности на биологической модели. Однако небольшие концентрации веществ, присутствующих в атмосферном воздухе, затрудняют реализацию этого похода.

Естественным аккумулятором загрязнения атмосферного воздуха является снежный покров. Хотя химический анализ снега часто используют в гигиенических исследованиях, ограничиваются, как правило, определением небольшой группы веществ - например, металлов (Василенко В.Н. и др, 1985; Ревич Б.А. и др, 1990, Артемов A.B. и др. 1999). Нам удалось найти единственную работу, в которой оценивали генотоксические эффекты проб снега - на Allium сера (Blagoevich Е, 2009). Классическая модель генетических исследований Drosophila melanogaster не менее изучена, информативна, удобна в эксперименте и рекомендована для оценки мутагенных эффектов отдельных химических соединений и сложных смесей, включая лекарственные препараты (Хабриев Р.У. - ред, 2005). Прогностическая ценность теста на индукцию летальных мутаций в половых клетках дрозофилы близка к таковой для тестов на млекопитающих (Voogd С.Е., 1981;

Hardin BD et la, 1983; McGregor DB et al, 1983). Можно ожидать, что использование этого теста для интегральной оценки генотоксичности проб снега будет эффективно. В НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН разработан и апробируется новый информативный подход к оценке нестабильности генома человека, позволяющий выявить большинство известных цитогенетических повреждений, особенности пролиферации и уровень апоптоза лимфоцитов крови, культивируемых в условиях цитокинетического блока (Ингель Ф.И., 2006). Мы предположили, что этот методический подход будет эффективным при разработке системы выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации.

Исходя из сказанного выше, целью исследования является разработка экспериментального подхода для выбора генотоксических соединений, подлежащих учету и/или гигиенической регламентации, среди присутствующих в атмосферном воздухе промышленного города с развитой отраслью черной металлургии на примере Магнитогорска.

Для ее достижения сформулированы следующие задачи:

1. Оценить информативность теста на индукцию доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster для оценки интегральных генотоксических эффектов проб снега, собранных в разных районах Магнитогорска, и определить связь изученных показателей с составом загрязнения проб снега.

2. Определить уровни нестабильности генома детей, проживающих в Магнитогорске в местах сбора проб снега, а также индивидуальную чувствительность их генома к дополнительной генотоксической нагрузке in vitro в микроядерном тесте на культуре лимфоцитов крови и оценить связь этих показателей с составом загрязнения проб снега.

3. Разработать систему методов для выявления химических соединений, приоритетных для гигиенической регламентации в атмосферном воздухе населенных мест с учетом генотоксичности.

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Разработан метод выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации по содержанию в атмосферном воздухе промышленного города, базирующийся на данных по химическому составу проб снега, собранного в конце снежного периода в разных районах города, суммарной генотоксической активности жидкой фазы этих проб на Drosophila melanogaster; оценке нестабильности и индивидуальной чувствительности генома здоровых жителей районов сбора этих проб;

2. В результате апробации метода в Магнитогорске обнаружена согласованность между генотоксическими эффектами проб снега, определенными в тесте на индукцию мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster, и уровнями нестабильности и чувствительности генома здоровых детей, проживающих в районах сбора этих проб;

к Установлено, что интегральные показатели нестабильности и чувствительности енома здоровых детей, проживающих в Магнитогорске в местах сбора проб снега, соррелируют с содержанием некоторых компонентов загрязнения этих проб. Зрактическая значимость исследования заключается в том, что:

> Предложена стратегия выбора приоритетных генотоксикантов из множества |еществ, которые реально могут оказывать неблагоприятное воздействие на человека, и 1уждаются в разработке гигиенических нормативов по содержанию в атмосферном юздухе.

> Подход апробирован в городе с развитой отраслью черной металлургии Магнитогорске, где для нормирования по содержанию в атмосферном воздухе с учетом -енотоксичности рекомендованы 2-метил-2-циклопентен-1-он и метилфенантрен; для точнения имеющихся нормативов с учетом генотоксической активности - 2-метилфенол, >-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранон, 7Н-бенз[с1е]антрацен-7-он и аценафтен.

• Результаты генетико-гигиенических, цитогенетических, биохимических и психологических исследований, а также данные по заболеваемости, полученные при обследовании детей, переданы в ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области» для определения эпидемиологического риска онкологической заболеваемости и репродуктивных рисков здоровью населения (акт от 05.05.2010).

• Результаты исследования и разработанные методические подходы используются при подготовке специалистов и включены в лекционные материалы по курсам «Гигиенические основы здоровья», «Экология человека», «Основы медицинских знаний», «Медико-биологическая подготовка», «Основы генетики», «Основы генетики и цитологии» в Магнитогорском государственном университете и «Промышленная экология», «Медико-биологические основы жизнедеятельности» в Магнитогорском государственном техническом университете им. Г.И.Носова (акт от 23.04.2010 и акт от 11.05.2010).

• Результаты исследования использованы при обосновании «Городской целевой программы природоохранных мероприятий, направленных на улучшение экологической обстановки в городе Магнитогорске в 2006-20 Югг», утвержденной решением Магнитогорского городского собрания депутатов от 28 июня 2006 года № 126 (акт внедрения от 13.04.2010).

• Материалы исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Выбор генотоксикантов для гигиенической регламентации по содержанию в атмосферном воздухе населенных мест», утвержденных председателем Межведомственного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А. Рахманиным.

Личный вклад автора составляет 80%. Работа выполнена на кафедре биомедицинских и экологических знаний Магнитогорского государственного университета и в лаборатории

генетического мониторинга научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН в рамках плановой темы «Влияние качества жизни на нестабильность генома детей, проживающих в городе с развитой металлургической промышленностью» (№ гос. регистрации 01.2.00703762). Часть исследований проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетического мониторинга и лаборатории биохимии НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН.

Положения, выносимые на защиту;

1. Метод выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации, алгоритм которого включает анализ химического состава проб снега, собранных в конце снежного периода, когда в них аккумулирован практически полный состав многокомпонентного загрязнения воздуха; модельный эксперимент по индукции мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster жидкой фазой снеговых проб; оценку нестабильности и индивидуальной чувствительности генома к стандартному мутагену in vitro у здоровых людей, проживающих в местах сбора снеговых проб с учетом интегральных показателей повреждения, пролиферации и апоптоза культивированных лимфоцитов крови и корреляционно-регрессионный анализ связей изученных показателей с составом загрязнения проб снега.

2. Результаты апробации метода в Магнитогорске, которые продемонстрировали, что:

- в состав загрязнения проб снега, собранных в разных районах города, входят 293 органических соединения и ионы 30 металлов.

- частоты доминантных летальных мутации в половых клетках Drosophila melanogaster, индуцированных жидкой фазой этих проб снега и интегральные показатели нестабильности и индивидуальной чувствительности генома здоровых детей, проживающих в местах отбора проб снега, коррелируют с содержанием некоторых компонентов этого загрязнения;

3. Для углубленного изучения с целью регламентации по содержанию в атмосферном воздухе Магнитогорска рекомендованы 2-метил-2-циклопентен-1-он и метилфенантрен, для уточнения имеющихся нормативов с учетом генотоксической активности - 2-метилфенол , 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранон, 7Н-бенз[(1е]антрацен-7-он и аценафтен.

Апробация диссертации проведена 28 декабря 2009 г на межкафедральном семинаре Магнитогорского Государственного университета и 8 апреля 20 Юг на совместном заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН. Материалы диссертации доложены на: Всероссийской конференции «Проблемы экологически обусловленных нарушений состояния здоровья населения промышленных городов Южного Урала с развитой отраслью черной металлургии», Магнитогорск, РФ, 2004; Международном экологическом форуме, Санкт-Петербург, РФ, 2008; V съезде Вавиловского общества генетиков и

селекционеров, Москва, 2009; III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, РФ, 2009; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Охрана здоровья населения промышленных регионов: стратегия развития, инновационные подходы и перспективы», Екатеринбург, 2009; VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010, «Il-nd Central & Eastern Europe Conference on Health and the Environment», Bratislava, Slovak Republic, 2006; «lll-rd Central & Eastern Europe Conference on Health and the Environment», Cluj-Napoca, Romania, 2008; Third WHO International Conference on «Children's Health and the Environment "From Research and Knowledge to Policy and Action»; Busan, Korea, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, 1- в издании, рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 189 страницах машинописи, включая приложения, иллюстрирован 39 таблицами и 14 рисунками. Указатель литературы содержит 200 источников, из них 88 отечественных и 112 иностранных авторов. Материалы, методы и объем исследований.

Экспериментальное исследование проведено в Магнитогорске, где градообразующим предприятием является ОАО «Магнитогорский металлургический комбинат» (ММК) -крупнейший в РФ металлургический комплекс с полным производственным циклом. С учетом удаленности от ММК и особенностей застройки мы выбрали шесть территорий, на которых расположены муниципальные детские сады, расположенные на расстоянии 2,6-6,6 км от ММК: д/с №№ 126, 163 и 179 находятся в поселках вокруг ММК, д/с №№ 18, 170, 122, 141, 146 - на противоположном берегу р.Урал (рис.1). Дети во всех д/с находились в условиях единого режима дня и на централизованном питании. Для анализа загрязнений атмосферы использовали:

- первичные протоколы стационарных постов мониторинга загрязнения воздуха за 20032007гг, любезно предоставленные службой Росгидромет по Магнитогорску (проанализировано более 122 000 протоколов);

- пробы снега, собранные в 2003-2006гг в конце каждого снежного периода на горизонтальных крышах беседок во всех обследованных д/с (РД 52.04.186-89). Эти пробы использовали для определения суммарной мутагенной активности в тесте на индукцию доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в половых клетках Drosophila melanogaster (проанализировано 109 000 яиц). Химический анализ экстрактов проб, собранных в 2005г, проводили на химическом факультете МГУ им М.В.Ломоносова с использованием

Благодарим начальника лаборатории мониторинга атмосферного воздуха Магнитогорского филиала ФГУ «Челябинский ЦГМС» В.А.Серову за возможность работы с первичными материалами.

методики 8270 USEPA на хроматомасс-спектрометре Pegasus 4D (LECO) с капиллярной силиконовой колонкой DB-5 (30м).

В мае 2005г был проведен анализ заболеваемости детей 5-7 лет, посещающих выбранные детские сады и проживающих рядом с ними в течение всей жизни. Для всех детей, соответствующих этим критериям (1364 ребенка), анализировали первичную заболеваемость и распространенность заболеваний за предшествующие 12 месяцев. Для этого копировали данные медицинской документации формы № 112-у и № 026-у и использовали международную статистическую классификацию болезней, травм и причин смерти десятого пересмотра (МКБ 10). Всего проанализировано более 2700 единиц документации.

Для углубленного обследования из 1364 детей выбрали только имевших группу здоровья 1 или 2, и соответствовавших следующим критериям: 1) родители до рождения ребенка не работали на коксохимическом производстве ММК; 2) дети в течение 2 месяцев до начала обследования не болели, не получали лекарственной и др. видов терапии и/или хирургических вмешательств; 3) за 10-14 дней до обследования дети имели нормальный уровень тревоги, определенный по 8-цветовому тесту Люшера (Собчик Л.Н., 2003). Такой способ формирования групп исключает максимальное количество факторов, возможно, влияющих на показатели нестабильности генома детей. В соответствии с этими требованиями на левом берегу р.Урал были выбраны 81 ребенок, на правом - 85 детей. В детских садах, находящихся рядом (№№ 18 и 170, а также №№ 141 и 146 - все с правого берега р.Урал), формировали сводные группы.

Лимфоциты крови детей культивировали по Titenko-Holland N. et al, (1998). Для оценки индивидуальной чувствительности генома в параллельные культуры крови всех детей вводили стандартный мутаген М-метил-Ы'-нитро-Т^-нитрозогуаниднн (МННГ) в дозе 0,07мМ (Slamenova D. Et al, 1997). Цитогенетический анализ с использованием расширенного варианта протокола по показателям повреждения, пролиферации и апоптоза (всего 22 показателя) проводили по Fenech М et al, (2003) и Ингель Ф.И., (2006). Индивидуальную чувствительность генома оценивали по каждому цитогенетическому показателю отдельно как кратность превышения эффекта МННГ над спонтанным уровнем. Всего было проанализировано более 360 000 клеток.

У выбранных детей определяли активность каталазы и Ы-ацетил-Ь-О-глюкозаминидазы (НАГ) в сыворотке крови и N-ацетил-Ь-О-глюкозаминидазы (НАГ) в моче (Климентьева и др., 1989; Мухамбетова Л.Х. и др., 2004).

На проведение обследования было получено разрешение главного педиатра Магнитогорска и письменное согласие родителей всех обследованных детей.

Все исследования проводили в зашифрованном виде с расшифровкой только после завершения анализа всех данных.

По результатам исследований были созданы две базы данных: а) на 166 детей, в состав которой входили показатели нестабильности и индивидуальной чувствительности детей к действию МННГ in vitro, данные о концентрациях веществ, содержащихся в пробах снега, собранных на территориях детских садов, которые посещали обследованные дети, а также результаты оценки суммарной мутагенности этих проб снега; б) на 1364 ребенка: данные о заболеваемости детей, о концентрациях веществ, содержащихся в пробах снега, собранных на территориях детских садов, которые посещали обследуемые дети, а также результаты оценки суммарной мутагенности этих проб снега в тесте на Drosophila melanogaster.

Рисунок 1. Схема расположения детских садов относительно металлургического

комбината (АО ММК)

Для статистической обработки результатов исследования использовали стандартные компьютерные программы Excel 7.0 и Statistica for Windows 6.0. Результаты исследования

Анализ литературы показал, что в атмосфере промышленного города с развитой отраслью черной металлургии формируется многокомпонентное загрязнение, состав которого изучен недостаточно, но известно, что в нем присутствуют вещества с мутагенной и канцерогенной активностью. Это предполагает возможность повышения уровня нестабильности генома у рабочих, занятых в черной металлургии, и жителей городов, где расположены эти предприятия.

Анализ первичных протоколов мониторинга загрязнения атмосферного воздуха Росгидромет, показал, что в Магнитогорске в 2003-2007гг на каждом стационарном посту из объявленных 24 компонентов анализировались концентрации только 13: хрома, свинца, марганца, никеля, цинка, меди, железа и кадмия, взвешенных веществ (без учета размеров), диоксида серы и диоксида азота, а также сероводорода и фенола, что несопоставимо с реальным составом загрязнения атмосферы промышленного города. Химический анализ проб снега, собранных в Магнитогорске на территориях выбранных детских садов, обнаружил 293 органических соединения, концентрации которых варьировали от 0,01 мкг/л (лимонен, пропилбензол, 4,5-дигидро-бензо[а]пирен, этиловый эфир гексановой кислоты, М-(2-метилфенил)-формамид, трифенилфосфат, пентанол, нафтоксантен, метилхризен, 11Н-бензо[а]флуорен и др.) до 36,00 мкг/л (дибутилфталат). Кроме того, в пробах снега присутствовали ионы 30 металлов в концентрациях от 0,02 мкг/л (бериллий) до 71 000 мкг/л (кальций). Важно, что различий в качественном и количественном составе загрязнений проб из разных районов города выявлено не было, что может быть связано с географическими особенностями расположения города. Результаты оценки суммарной генотоксичности проб снега, на половых клетках Drosophila melanogaster (табл.1) показали, что фертильность самцов мух, экспонированных жидкой фазой проб снега, не различалась между районами Магнитогорска, но в 87% случаев была ниже, чем в контроле, что свидетельствует о присутствии в пробах соединений, обладающих гонадотоксическим действием. 79,2 % всех изученных проб индуцировали поздние доминантные летальные мутации (ПЭЛ) - показатель истинной мутагенности - частоты которых в 1,6-4,3 раза превышали уровень контроля (X2 = 2,0 -19,0). Это свидетельствует о наличии генотоксической активности изученных проб и указывает на присутствие генотоксикантов в этих пробах, а также позволяет предположить возможность возникновения эффектов нестабильности генома, гонадо- и эмбриотоксических эффектов в у жителей районов сбора этих проб. В этих экспериментах концентрации стирола, лимонена (дифенила), 2-метил-нафталина, 2-этокси-2-метил-бутана, пропилбензола, бензилового спирта, 2-метилфенола, изобензофуранона, дибутилового эфира гександиоловой кислоты, 1,8-нафталевого ангидрида в пробах снега коррелировали с частотами мутаций в половых клетках дрозофилы (R=0,89-0,97; р < 0,04-0,000), причем регрессионный анализ подтвердил значимость этих корреляций (р< 0,01-0,003).

Как видно в табл.1, максимальные частоты поздних эмбриональных леталей (ПЭЛ) в половых клетках дрозофилы были индуцированы пробами, собранными с территорий д/с №№ 18, 170 и №122 (правый берег), а также д/с №126 (левый берег) в 2004-2005гг. Именно в эти годы в районе расположения д/с №№ 18 и 170 А.Г. Уральшин А.Г. с соавторами (2007) обнаружили наибольшую в Магнитогорске распространенность детских заболеваний, а H.A. Антипанова с соавторами (2007) выявили у детей, проживающих в

районе расположения этих ц/с, самый высокий прирост частоты заболеваний органов дыхания.

Поскольку эпидемиологические исследования, проведенные в Магнитогорске, неоднократно указывали на связь заболеваемости детей с загрязнением воздуха (Иродова Е.В., 1974; Кошкина B.C., 2004; Антипанова Н. А. и др., 2000, 2004, Уральшин А.Г. и др, 2007), мы предположили, что с составом загрязнения воздуха, отраженным в пробах снега, может быть связана как заболеваемость детей в обследованных детских садах, так и частота ДЛМ в половых клетках дрозофилы.

Как видно, связь между распространенностью детских заболеваний, считающихся маркерными для промышленных городов (Вельтищев Ю.Е,1985; Студеникин МЛ,Ефимова A.A., 1998) и характерных для детей в Магнитогорске (H.H. Котляр, 2000; Антипанова H.A. и др., 2004, и 2007; Кошкина B.C., 2004), концентрациями некоторых компонентов загрязнения проб снега и частотами ДЛМ, индуцированными жидкой фазой этих проб в половых клетках Drosophila melanogaster, действительно существует (табл.2) и свидетельствует о значительном вкладе загрязнения воздуха в развитие указанных заболеваний. Концентрации 2-метилфенола, метилхинолина, бензонафтофурана, нафталевого ангидрида и ионов алюминия в пробах снега на высоком уровне значимости были связаны как с распространенностью заболеваемости детей, так и с уровнем индукции ПЭЛ в половых клетках дрозофилы. Эти данные указывают на генотоксичность этих веществ и демонстрируют возможность использования ДЛТ на дрозофиле для прогноза распространенности заболеваемости детей, проживающих в районах сбора проб снега. Результаты оценки генотоксических эффектов в половых клетках дрозофилы трудно перенести на человека, прежде всего, из-за генетически обусловленных различий (гомология между геномом дрозофилы и человека составляет 75% - Human Genome Project) и связанной с этим разницы в метаболизме. Кроме того, существенной может быть разница в путях поступления в организм веществ из жидкой фазы проб снега. Поэтому эффекты, выявленные на дрозофиле, лишь указывают на потенциальную опасность для человека, причем надо иметь в виду, что повышать нестабильность генома человека могу г не только те вещества (или даже совсем иные), которые индуцируют эффекты на дрозофиле.

Результаты анализа нестабильности генома лимфоцитов крови здоровых детей, посещавших детские сады в местах сбора проб снега, показаны в табл.3.

Частоты ранних (РЭЛ) и поздних (ПЭЛ) эмбриональных летальных мутаций, индуцированных пробами снега в половых клетках дрозофилы (кратность превышения над контролем)

длм Год сбора пробы Левый берег р.Урал (ММК) Правый берег р.Урал

д/с № 163 д/с № 179 д/с № 126 д/с № 122 д/с № 18 и 170 д/с № 141 и 146

Фер-тильнос ть' Превышен ие над контролем Фертиль ность' Превыше ние над контролем Фертильно сть1 Превышение над контролем Фертиль ность1 Превы шение над контро -лем Фертиль ность Превы шение над контро -лем Фер тиль ность' Превы шение над контролем

1

РЭЛ 2003 91,24 1,72* 82,76 3,63* 71,93 1,48 86,15 1,36 81,99 1,31 74,31 0,99

2004 69,34 2,08* 74,14 1,31 74,61 1,80* 83,28 1,5 74,51 0,8 81,85 0,89

2005 74,17 1,29 72,44 1 68,57 1,68* 63,98 1,06 69,19 1,04 78,26 1,2

2006 85,52 1,90* 117,44 1,24 99,48 1,64 92,28 1,2 92,28 2,65* 107,84 1,74*

ПЭЛ 2003 91,24 2,30* 82,76 1,61* 71,93 2,46* 86,15 2,34* 81,99 2,74* 74,31 1,61*

2004 69,34 1,49 74,14 2,41* 74,61 2,97* 83,28 1,59* 74,51 2,76* 81,85 2,15*

2005 74,17 2,56* 72,44 2,23* 68,57 2,86* 63,98 3,12* 69,19 4,47* 78,26 1,87*

2006 85,52 1,59* 117,44 1,57* 99,48 1,17 92,28 1,17 92,28 1,11 100,84 1,26

) % от контроля (дистиллированная вода) *) различия с контролем значимы, р<0,01

Как видно, частота двуядерных клеток с микроядрами - показатель, который в международных исследованиях считается единственным маркером нестабильности генома (Fenech et al., 2003), не только не различалась между группами детей из разных районов Магнитогорска, но и не отличалась от среднеевропейских уровней (Neri et al.,2005). Использование расширенного протокола цитогенетического анализа позволило выявить большее количество повреждений, существовавшее в клетках всех обследованных детей, а также более высокий уровень повреждений генома у детей, проживающих на левом берегу р.Урал вокруг ММК, по сравнению с их ровесниками с правого берега, где нет крупных промышленных предприятий. Это сочеталось с большей митотической активностью клеток в культуре, большим объемом пролиферативного пула и большей долей в нем ускоренно делящихся клеток (прошедших более одного митоза за стандартное время культивирования).

Причина различий в показателях нестабильности генома между детьми из двух районов Магнитогорска может быть связана с индивидуальной чувствительностью генома к воздействию средовых факторов. Для проверки этого предположения мы оценили чувствительность лимфоцитов крови обследованных детей к стандартному мутагену МННГ in vitro по всем показателям расширенного протокола микроядерного теста. В табл.4 показаны значимые различия в чувствительности лимфоцитов крови к действию стандартного мутагена МННГ, обнаруженные между группами детей из разных районов. Оказалось, что влияние МННГ на лимфоциты крови детей из 2-х районов Магнитогорска, было однотипным и проявилось в снижении митотической и пролиферативной активности клеток по сравнению со спонтанным уровнем, увеличении частоты клеток с цитогенетическими повреждениями и увеличении частоты апоптоза. Однако больший индекс токсичности МННГ и более выраженное подавление пролиферации клеток под действием МННГ наблюдалось в культурах крови детей с левого берега р.Урал. Анализ полученных данных показал, что интегральные индексы повреждения, пролиферации и апоптоза лимфоцитов оказались более чувствительны к действию МННГ in vitro, чем частота двуядерных клеток с микроядрами, стандартно используемая как маркер нестабильности генома человека. Это доказывает преимущество расширенного протокола цитогенетического анализа микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока, над стандартным методом цитогенетического анализа (Fenech et al, 2003). Чтобы оценить эффективность прогноза нестабильности генома человека по результатам тестов на дрозофиле мы провели корреляционный анализ между показателями нестабильности и индивидуальной чувствительности генома детей к МННГ и частотами доминантных летальных мутаций, индуцированными у Drosophila melanogaster пробами снега с территорий обследованных д/с (табл.5). Как видно, у детей, проживающих в местах сбора проб снега, спонтанная частота 1-ядерных (не делящихся) клеток и подавление

Связь распространенности заболеваемости детей болезнями, маркерными для промышленных городов и характерными для детей в Магнитогорске, с составом загрязнения снега и частотой эмбриональных летальных мутаций в половых клетках Ого5орЫ1а те!апо§аз(ег

Заболевания Вещество Коэфф. корреляции Спирмена распространенности заболеваемости загрязнением снега Уровень значимости Р= Показатель ДЛМ Коэфф.корреляции Спирмена распространенности заболеваемости и частоты ДЛМ Уровень значимости Р=

Болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ (Е00-Е90) 2-метилфенол 0,97 0,0048 ПЭЛ 0,83 0,039

метилхинолин (изомер) 0,97 0,0048

Болезни органов пищеварения (КОО-К93) метилхинолии (изомер) 0,97 0,0048 пэл 0,83 0,042

2-метилфенол 0,97 0,0048 ПЭЛ 0,83 0,042

Болезни нервной системы (вОО-099) Бензонафтофуран 0,97 0,0048 пэл 0,85 0,034

1,8-Нафталевый ангидрид 0,97 0,0048 РЭЛ 0,83 0,041

Болезни органов дыхания (ТОО-Д99) Алюминий 0,94 0,0048 пэл 0,87 0,021

Б-ни глаза и его придаточного аппарата (Н00-Н59) пэл 0,93 0,008

Б-ни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм (050-089), железодефицитная анемия пэл 0,83 0,039

Спонтанные уровни нестабильности генома в культуре крови здоровых детей, _проживающих в разных районах г. Магнитогорска_

Левый берег (ММК) Правый берег Уровень значимости различий

Ср Ст. Отклон. Ср Ст. Отклон.

Апоптоз (%) 1,05 1,10 1,04 0,98 0,841

Показатели пролиферации

Митоз (%) 4,07 1,42 3,46 1,31 0,012

Соотношение частот митоза и апоптоза 0,33 0,51 0,38 0,49 0,226

1-ядерных клеток (%) 33,72 7,71 39,76 8,56 0,000

1 -ядерных клеток с МЯ (%) 0,29 0,47 0,23 0,34 0,719

2-ядерных клеток (%) 38,72 4,97 37,58 5,11 0,225

3-ядерных клеток (%) 6,27 2,67 5,54 2,49 0,059

4-ядерных клеток (%) 17,80 5,18 14,41 5,46 0,001

Полиядерных клеток (%) 3,08 1,87 2,71 1,64 0,236

Соотношение частот ускоренно делящихся клеток (2-й митоз: %3ядерных клеток / %4-ядерных клеток) 0,36 0,15 0,46 0,36 0,092

Пролиферативнын пул (%) 69,94 7,06 63,70 9,24 0,000

Ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле (%) 40,72 8,50 36,86 9,09 0,017

Индекс пролиферации клеток 1,93 0,14 1,83 0,15 0,000

Индекс репликации ядер 2,01 0,17 1,89 0,18 0,000

Показатели повреждения

1-ядерных клеток с МЯ (%) 0,29 0,47 0,23 0,34 0,719

2-яд клеток с мостом (%) 0,45 0,40 0,33 0,40 0,008

2-ядеркых клеток с МЯ (%) 0,52 0,39 0,70 0,83 0,880

2-ядерных клеток с множеств МЯ (%) 0,04 0,10 0,03 0,07 0,865

2-ядерных клеток с МЯ типа «разбитое яйцо» (%) 0,39 0.73 0,27 0,60 0,554

2-ядерных клеток с повреждениями (МЯ+мост; %) 0,96 0,66 1,03 1,09 0,205

3-ядерных клеток с мостом (%) 5,55 7,60 4,00 4,75 0,269

3-ядерных клеток с МЯ (%) 5,63 5,46 4,45 5,74 0,109

3-ядерных клеток с повреждениями (МЯ+мост;%) 11,18 10,10 8,46 8,57 0,032

4-ядерных клеток с мостом {%) 2,71 2,71 2,36 2,68 0,161

4-ядерных клеток с МЯ (%) 4,33 3,68 3,46 3,74 0,038

4-ядерных клеток с повреждениями (МЯ+мост; %) 8,28 6,61 8,48 10,05 0,250

Полиядерных клеток с мостом (%) 4,09 7,77 2,61 6,82 0,029

Полиядерных кл с МЯ (%) 5,37 7,83 6,90 8,11 0,185

Полиядерных клеток повреждениями (МЯ+мост; %) 9,46 11,03 9,51 11,53 0,984

Делящихся клеток повреждениями (%) 1,60 0,91 1,36 0,92 0,034

Ускоренно делящихся клеток с МЯ (%) 4,72 3,67 4,04 3,39 0,252

Ускоренно делящихся клеток с мостом (%) 3,30 3,10 2,57 2,47 0,036

Ускоренно делящихся клеток с повреждениями (МЯ+мост; %) 8,02 5,28 6,60 4,44 0,094

Таблица 4.

Значимые различия в чувствительности генома детей, проживающих на разных берегах р.Урал, к действию стандартного мутагена

Показатель Левый берег (ММК) Правый берег Уровень значимости различий

Ср Ст. Отклон. Ср Ст. Отклон

1-ядерных клеток 1,66 0,38 1,49 0,32 0,013

4-ядерных клеток 0,30 0,16 0,44 0,33 0,007

Ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле 0,54 0,18 0,69 0,26 0,000

Индекс токсичности 40,02 13,28 35,9 15,1 0,03

2-ядерных клеток с повреждением (микроядрами и/или мостами) 2,29 1,88 2,71 1,56 0,025

Делящихся клеток с повреждением 1,47 1,14 1,92 1,38 0,010

митотической активности клеток в культуре под действием МННГ коррелировали с увеличением токсических эффектов в половых клетках дрозофилы (РЭЛ). В то же время, наблюдаемое под действием МННГ in vitro уменьшение объема пролиферативного пула и увеличение степени асимметрии деления лимфоцитов в культуре крови детей, было ассоциировано с увеличением частоты истинных мутаций у дрозофилы (ПЭЛ).

Как отмечалось выше, максимальные частоты ПЭЛ в 2005г (год взятия крови у детей) были обнаружены в пробах снега территорий д/с №№ 122, 18 и 170 на правом берегу р.Урал, где нет крупных промышленных предприятий, а РЭЛ - на территории д/с №126, находящегося на минимальном (из всех обследованных д/с) расстоянии от коксохимического производства ММК. Таким образом, обнаружение корреляционных

Таблица 5

Связь показателей суммарной мутагенной активности, индуцированной пробами снега в половых клетках дрозофилы, с показателями нестабильности и чувствительности генома

детей, посещавших детские сады в местах сбора проб снега

Показатель СМА Показатель нестабильности и чувствительности генома детей Коэффициент корреляции Спирмэна Уровень значимости Р=

РЭЛ Спонтанный уровень Частота 1-ядерных клеток (%) 0,87 0,024

Чувствительность генома к МННГ Митотическая активность -0,90 0,0149

ПЭЛ Чувствительность генома к МННГ Соотношение частот 3 и 4-ядерных клеток (2-й митоз) 0,84 0,036

Пролиферативный пул -0,99 0,0003

связей между генотоксическими эффектами проб снега и уровнями нестабильности и чувствительности генома детей, проживающих в районах сбора этих проб, свидетельствует в пользу закономерности проявления обнаруженных эффектов и говорит о существовании

у коррелирующих эффектов единого индуктора - веществ, присутствующих в пробах снега, и - в основном - аккумулированных из воздуха.

Поэтому мы проанализировали возможность связи между концентрациями веществ в пробах снега, собранных в 2005г, и средними уровнями всех изученных показателей нестабильности и индивидуальной чувствительности генома детей, посещающих д/с в месте сбора этих проб и проживающих рядом с этими д/с. Значимыми считали корреляции при р<0,005. Оказалось, что концентрации 4-(1-метилэтокси) бутанола, 2-метил-бензальдегида, изомера пропилбензола, метилхинолина, метилфенантрена, метилэтилового эфира бутановой кислоты, 1-метилнафталина, изомера этилнафталина, триметилпиридина и 2-бутокси-этанола коррелировали как с показателями нестабильности, так и с показателями чувствительности генома детей (11=0,97). Кроме того, с различными показателями нестабильности генома детей коррелировало содержание в снеге 2-метилфенола, 2-пропанола-1,Г-оксибис, изомера бензо[к]флуорантена, диметилового эфира карбаминовой кислоты, 2-метил-2-циклопентена-1-он, бензо(е)пирена, 2-метилфенола и 7Н-Бенз[с1е]антрацена-7-он. С чувствительностью генома к МННГ было ассоциировано (11=0,97) содержание в снеге 2(ЗН)-фуранон-5-гептилдигидро, 2-деценаля, 4-гидрокси-9-флуоренона, бензо[Ь]хинолина, бензонафтофурана, гексилового эфира уксусной кислоты, гептаналя, дибенз[а,Ь]антрацена, дибензофурана, изопропилпальмитата, нафталина, тетрадекана, 2-метил-циклопентена-1-он-, аценафтена, трифенилена, а также общая масса загрязнений снега (на уровне 11=0,97).

Анализ существующей нормативной базы показал, что концентрации пропилбензола, бензальдегида, 2(ЗН)-фуранона, гексилового эфира уксусной кислоты, гептаналя, аценафтена, дибенз[а,Ь]антрацена, 2-метилфенола и нафталина нормированы по содержанию в атмосферном воздухе, хотя нормативы во всех случаях, за исключением бенз(а)пирена и дибенз[а,Ь]антрацена, устанавливались без учета канцерогенной активности).

Для уточнения приоритетности веществ из всех изученных 44 цитогенетических показателей мы выбрали только те, которые дают интегральную оценку интегральным показателям состояния генома - уровню повреждения ядер, пролиферативной активности клеток в культуре и частоте апоптоза. Результаты анализа корреляций между содержанием веществ в снеге и интегральными цитогенетическими показателями, значимые на уровне р<0,005, показаны в табл.6. Как видно, концентрации 2-циклопентена-1-он, метилфенантрена, 2-метилфенола, 7Н-бенз[<Зе]антрацена-7-он, дибенз[а,Ь]антрацена, 2(ЗН)-фуранона-5-гептилдигидро- и аценафтена, а также ионы молибдена, свинца, никеля и меди в пробах снега коррелировали с интегральными показателями нестабильности и чувствительности генома детей. Значимость этих связей подтверждена результатами регрессионного анализа. Из этих соединений только дибенз[а,11]антрацен, 2-метилфенол и

аценафтен отмечены в литературе как присутствующие в выбросах в атмосферный воздух от металлургических комбинатов.

Обсуждение результатов.

Как показали результаты нашего анализа, концентрации в снеге семи органических соединений и ионов четырех металлов были связаны с интегральными показателями нестабильности генома здоровых детей, проживающих в районах сбора этих проб и посещающих детские сады рядом с домом. Из указанных веществ 2-циклопентен-1-он-2-метил и метилфенантрен не имеют норматива. 7Н-бенз[с1е]антрацен-7-он, 2(ЗН)-фуранон-5-гептилдигидро и аценафтен имеют ориентировочные уровни безопасности воздействия загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест, для 2-метилфенола установлена максимально разовая концентрация в атмосферном воздухе, а концентрации дибенз[а,Ь]антрацена и всех ионов металлов имеют ПДК для атмосферного воздуха населенных мест (табл.7). Но из этих соединений только референтная доза дибенз[а,Ь]антрацена в атмосферном воздухе была определена с учетом канцерогенного потенциала вещества.

Принципиальным является вопрос о том, действительно ли вещества, проявившие корреляционные связи (подкрепленные результатами регрессионного анализа), обладают генотоксической активностью, поскольку наличие корреляций с показателями нестабильности генома для веществ, находящихся в смеси, даже с учетом результатов регрессионного анализа, строго говоря, доказательством не является. Для ответа на этот вопрос мы провели факторный анализ, который продемонстрировал, что на интегральные показатели нестабильности и чувствительности генома детей оказывают влияние три группы веществ: метилфенантрен, влияние которого оценено в 76,9%; в группу показателей 2-го фактора, (21,5 %) вошли: 2-Циклопентен-1-он-2-метил, 7Н-Бенз[с)е]антрацен-7-он, 2(ЗН)-Фуранон-5-гептилдигидро, молибден, свинец и никель; в группу показателей воздействия 3-го фактора (12,3 %) вошли: 2-метилфенол, дибенз[а,1"1]антрацен, аценафтен и ионы меди. Таким образом, результаты факторного и регрессионного анализов показали, что присутствие в пробах снега указанных соединений действительно могут оказывать влияние на показатели нестабильности и чувствительности генома детей, проживающих в районах сбора этих проб. Синергические эффекты с МННГ, обнаруженные для всех этих веществ, позволили предположить у этих веществ наличие генотоксического потенциала.

Связь интегральных цитогенетичееких показателей генома детей с загрязнением проб снега,

Показатель Органическое соединение Ион металла Коэффициент корреляции Спирмена R Уровень значимости Р=

Спонтанный уровень нестабильности генома Частота поврежденных клеток (%) 2-Циклопентен-1-он, 2-метил- Молибден, свинец 0,974 0,0048

пролиферативный пул 2-Метилфенол 0,974 0,0048

% ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле 2-Метилфенол 0,974 0,0048

Индекс пролиферации клеток 2-Метил фенол Никель 0,974 0,0048

Индекс репликации ядер 2-Метилфенол Никель 0,974 0,0048

Частота клеток в состоянии апоптоза (%) 7Н-Бенз[с1е]антрацен-7-он Медь 0,974 0,0048

Частота клеток в состоянии митоза (%) Д ибенз [а,Ь ] антрацен 0,974 0,0048

Чувствительность генома к действию МННГ in vitro Индекс токсичности Метилфенантрен 0,974 0,0048

Частота поврежденных клеток (%) 2(ЗН)-Фуранон, 5-гептилдигидро- 0,974 0,0048

Частота клеток в состоянии апоптоза (%) Аценафтен 0,974 0,0048

VO

Таблица 7

Вещества, нормированные по содержанию в атмосферном воздухе населенных мест, концентрации которых в пробах снега были ассоциированы с интегральными показателями нестабильности и чувствительности генома обследованных детей

Вещество Имеющийся норматив Группа канцерогенности

2-Циклопентен-1-он, 2-метил-

Метилфенантрен 3

2-Метилфенол ПДК мр

7Н-Бенз[ёе]антрацен-7-он ОБУВ

Дибенз[а,1т|антрацен ПДКсс, референтная концентрация 2А

2(ЗН)-Фуранон, 5-гептилдигидро- ОБУВ 3

Аценафтен ОБУВ

Медь ПДКсс

Никель ПДКсс 2В

Свинец ПДКсс 2А

Молибден ПДКсс

Для проверки этого заключения был проведен анализ литературы, результаты которого показали, что:

метилфепантреп индуцировал образование аддуктов ДНК клеток линии HepG2, что коррелировало с активностью генов CYP1A1, PRKCA, SLC22A3, NFKB1A, CYP1A2 and C.YP2D6 (Staal YC et al, 2006), а также клеток легкого крыс (Staal YC et al, 2007), причем активность метилфенантрена была выражена слабее, чем у бенз(а)пирена и других ПАУ. 1-метилфенантрен и 9-метилфенантрен вызывали мутации в тесте Эймса на штаммах ТА98 и ТА100 (LaVoie EJ et al, 1983), а также ТА 97 (Miyuki Sakai et al, 1985). Производное метилфенантрена 7-изопропил-1-метилфелантрен вызывало специфическое заболевание рыб, связанное с влиянием на клеточную мембрану путем индукции оксидантного стресса, аналогично действию 2,3,7,8-тетрахлордибенз(р)диоксина (Bauder MB, Palace VP, Hodson PV, 2005). 3 группа канцерогенности (IARC, 1997, Supplemeent 7).

аценафтеп вызывал генотоксические эффекты в тесте Эймса с метаболической активацией на штамме ТА 102 (Jian Yan et al, 2004) и ТА 100 (Izzotti A et al, 1996), но не ТА 1537 и ТА 1538 (Gatehouse DJ980). В смеси с другими ПАУ аценафтен индуцировал мутации в тесте Эймса, а также хромосомные аберрации, микроядра, двуядерные эпителиоциты, аддукты ДНК и опухоли в легких крыс (Izzotti A et al, 1996). Кроме того, установлено, что аценафтен - митотический яд, разрушающий веретено деления с образованием полиплоидных клеток, ингибирующий пролиферацию Candidal. У микроорганизмов в присутствии

аценафтена обнаруживалось нарушение колониеобразования, морфологии клетки, снижение митотической активности, увеличение содержания ДНК, а также размеров ядер и биомассы клеток (Имшенецкий А. А и др, 1979, 1985). Интенсивная фрагментация хромосом Allium сера в присутствии аценафтена была отмечена в (Final Report of the expert Panel to review SAS veteran's health concern, 2003), однако данных для заключения о канцерогенности оказалось недостаточно (IARC 1983). Нитропроизводные аценафтена вызывали мутации в тесте Эймса без метаболической активации (Kangsadalampai Ket al, 1997).

2(311) фуранон-5-гептилдигидро: не индуцировал мутаций в тесте Эймса как без, так и в присутствии метаболической активации и рецессивных сцепленных с полом мутаций у Drosophila melanogaster, но ингибировал фосфорилирование митоген-активированной протеинкиназы, оказывал влияние на организацию микротрубочек, поведение хроматина и продолжительность клеточного цикла, а также на созревание и фертилицацию ооцитов свиньи in vitro (Sun QY et al, 2002). К генотоксическим эффектам этого соединения относят ингибирование ДНК-репликации в экстрактах яиц Xenopus (Someya A et al, 1994) и задержку митоза на клеточных линиях простаты человека (Suzuki M et al, 1999). Цитотоксический эффект связан с задержкой митоза в результате образования структурных повреждений ДНК, что, в свою очередь, связано с анеуплоидией и последующим канцерогенезом (Knecht A, Humpf HU, 2006; Sun F, Handel MA, 2008). У самцов мышей было отмечено снижение пролиферативной активности и первичная гиперплазия, 2-метилфенол: опухолевый промотор, активность которого при длительном нанесении на кожу крыс проявлялась в индукции папиллом и карцином при совместном действии с дибензантраценом - (Berenblum I., Shubik, P. А, 1947; Druckrey H. et al, 1953; Boutwell R. K.et al, 1955 - 1957; Bock, F. G., Mund, R. A, 1958; Boutwell RK, Bosch DK, 1959).

2-циклопентен-1-он-2-метил: индуцировал разрывы ДНК плазм иды pBR322 в присутствии меди; обработка ДНК тимуса теленка в присутствии меди вызывала образование долгоживущего повреждения ДНК 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина, что в совокупности свидетельствует об индукции супероксид-радикала; 2-циклопентен-1-он-2-метил- индуцировал апоптоз, в том числе, по механизму активации каспазы 3 (López-Antón N et al, 2007; Rosetti M et al, 2008) и фагоцитоз в культуре макрофагов (López-Antón N et al, 2007). Механизм генотоксичности связан с образованием эпокси-производных (Krivobok S et al, 1987). Цитотоксическая активность метил-циклопентанона и его производных доказана по выраженным эффектам на 6 раковых

линиях клеток, а также по отношению к нормальным фибробластам легкого человека (Mansoor ТА et al, 2004; You J et al, 2010).

Мутагенность 7H-6en3[de]aiimpaneiia-7-on была доказана в тесте Эймса на штаммах ТА98, ТА 100 как без, так и в присутствии метаболической активации (Brown JP, Dietrich PS., 1979; Yonezawa Y et al, 1999). Аналогично, нитропроизводные этого вещества, присутствующие в выхлопах автотранспорта, также проявляли мутагенную активность в тесте Эймса на штаммах ТА98, ТА100, YG1021 и YG1024 как без, так и в присутствии метаболической активации (Takamura-Enya Т et al, 2006). 7Н-бенз[ёе]антрацена -7-он и его производные, обладали цитотоксической активностью на 5 опухолевых клеточных линиях (Diaz F et al, 2004); эти эффекты связаны с образованием аддуктов ДНК, причем активность 7Н-бенз[(1е]антрацена -7-он была выше, чем у его производных (Nagy Е et al, 2007).

Из приведенных данных следует, что все органические соединения, предложенные в настоящей работе как кандидаты на определение или уточнение норматива по содержанию в атмосферном воздухе населенных мест с учетом генотоксической активности, не были изучены систематически, но проявляли мутагенные свойства в тесте Эймса и/или генотоксические эффекты в разных тестах.

Заключение. Обобщая все результаты, полученные в настоящей работе, можно заключить, что химические соединения, концентрации которых в пробах снега коррелировали с цитогенетическими показателями нестабильности и индивидуальной чувствительности генома детей, постоянно проживающих в районах сбора этих проб, обладают генотоксической активностью и могут быть рекомендованы для углубленного изучения биологической активности с целью последующей гигиенической регламентации в атмосферном воздухе населенных мест по показателям генотоксичности. Однако нельзя исключить, что норматив для указанных веществ будет установлен по общетоксическому или иному действию, в том случае, если это действие окажется лимитирующим признаком вредности, либо по какому-то другому специфическому эффекту, отличному от генотоксического.

По результатам проведенного исследования разработан методический подход, пригодный для выявления генотоксикантов, присутствующих в воздухе промышленных городов и приоритетных для гигиенической регламентации. Этот подход включает:

- сбор суммарных проб снега - как субстанции, аккумулирующей загрязнения воздуха;

- химический анализ этих проб;

- оценку частоты доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster, индуцированных этими пробами - как ориентировочных показателей для выбора объекта исследования, для прогноза возможных генотоксических эффектов и заболеваемости жителей районов, в которых эти пробы отобраны;

- оценку индивидуальной чувствительности генома у группы жителей выбранных районов по результатам цитогенетического анализа лимфоцитов крови, культивированных в условиях цитокинетического блока, как в присутствии модельного мутагена, так и без него. Для выявления ассоциативных связей с содержанием загрязнений проб снега предпочтительно использовать интегральные цитогенетические показатели: частота делящихся клеток с повреждениями, митотическая активность, объем пролиферативного пула, доля ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле, соотношение симметрично и несимметрично делящихся клеток во втором митозе, частота апоптоза и индекс токсичности;

- при формировании групп для генетико-гигиенических исследований с применением микроядерного теста на культуре крови необходимо учитывать психосоматический статус и состояние здоровья ребенка, модифицирующие нестабильность генома.

Выводы

1. В условиях города за счет разнообразных промышленных, бытовых, транспортных и других источников выбросов формируется многокомпонентное загрязнение воздуха, в состав которого могут входить, обладающих мутагенной и канцерогенной активностью, гигиенические нормативы которых не разработаны.

2. С целью выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации по содержанию в атмосферном воздухе с учетом генотоксического действия предложен метод, основанный на использовании снеговых проб, отбираемых в конце зимнего сезона, когда в них аккумулирован практически полный состав многокомпонентного загрязнения воздуха.

3. Алгоритм метода включает: сбор проб снега с определением их качественного и количественного состава; модельный эксперимент по индукции жидкой фазой снеговых проб доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster (прямая индикация генотоксической активности веществ, загрязняющих атмосферный воздух); оценку нестабильности и индивидуальной чувствительности генома к стандартному мутагену in vitro у здоровых людей, проживающих в местах сбора снеговых проб (непрямая индикация генотоксичности веществ, загрязняющих атмосферу) по интегральным показателям повреждения, пролиферации и апоптоза; выбор генотоксикантов для гигиенической регламентации их содержания в атмосферном воздухе на основе корреляционно-регрессионного анализа взаимосвязи

интегральных показателей нестабильности генома обследованных людей и частоты доминантных летальных мутаций в половых клетках ЭгозорЫк те1аш^аз1ег с веществами, содержащимися в снеговых пробах.

4. Метод апробирован в городе Магнитогорске, где в экстрактах снеговых проб, собранных в разных районах города на территориях детских садов, обнаружено 293 органических соединения, концентрации которых колебались от 0,01 мкг/л (лимонен, пропилбензол, 4,5-дигидро-бензо[а]пирен, этиловый эфир гексановой кислоты, М-(2-метилфенил)-формамид, трифенилфосфат, пентанол и др.) до 36,00 мкг/л (дибутилфталат), а также ионы серы, бора, брома и 30 металлов, концентрации которых варьировали от 0,02 мкг/л (бериллий) до 71 000 мкг/л (кальций).

5. Жидкие фазы проб снега из Магнитогорска повышали частоту поздних доминантных летальных мутаций в половых клетках ОгозорЬйа те1апо§аз1ег в 1,614,27 раза по сравнению с контролем (х2=2,0 - 19,86), что указывает на присутствие в пробах генотоксикантов.

6. У здоровых детей 5-7-лет с нормальным психосоматическим статусом, которые в течение всей жизни проживали рядом с обследованными детскими садами в Магнитогорске и посещали их, средняя спонтанная частота двуядерных клеток с микроядрами (общепринятый маркер нестабильности генома) составляла 5,2-7,0 клеток на 1000, а средняя частота всех делящихся клеток с повреждениями 13,6-16,0 на 1000. Действие стандартного мутагена Ы-нитро-Н-метил-К-нитрозогуанидина на лимфоциты крови обследованных детей проявлялось в увеличении асимметрии деления и снижении пролиферативной активности клеток в культуре. Эти эффекты коррелировали с частотами поздних доминантных летальных мутаций, индуцированных в половых клетках ОгозорЬПа melanogaster экстрактами проб снега с территорий обследованных детских садов (11=0,84-0,99; р=0,036-0,0003).

7. Интегральные показатели спонтанного уровня нестабильности генома обследованных детей из Магнитогорска коррелировали (11=0,97; р<0,005) с концентрациями в снеге: 2-циклопентен-1-он-2-метила, а также ионов молибдена и свинца (частота поврежденных клеток); 2-метилфенола и ионов никеля (показатели пролиферации клеток в культуре); 7Н-бенз[с1е]антрацена-7-он и ионов меди (частота апоптоза); дибенз[а,11]антрацена (митотическая активность клеток в культуре). Интегральные показатели индивидуальной чувствительности генома детей к действию М-нитро-М-метил-М-нитрозогуанидина на лимфоциты крови коррелировали (11=0,97; р<0,005) с концентрациями в снеге метилфенантрена (индекс токсичности), 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранона (частота поврежденных клеток), аценафтена (частота апоптоза). Из этих веществ 2-метилфенол,

дибенз[а,Ь]антрацен и аценафтен присутствуют в выбросах металлургического комбината в атмосферный воздух.

8. 2-метил-2-циклопентен-1-он и метилфенантрен рекомендованы как приоритетные для нормирования по содержанию в атмосферном воздухе населенных мест. Для уточнения имеющихся нормативов с учетом генотоксической активности рекомендованы 2-метилфенол - коканцероген для ПАУ (для которого определена максимально разовая концентрация в атмосферном воздухе населенных мест), 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранон, 7Н-бенз[(1е]антрацен-7-он и аценафтен (для которых имеются ориентировочно безопасные уровни воздействия в атмосферном воздухе населенных мест).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

В издании, рекомендованном ВАК:

1. Коганова З.И., Ингель Ф.И., Легостаева Т.Б., Антипанова H.A., Полякова О.В. Оценка адаптационных возможностей организма детей г. Магнитогорска по активности некоторых ферментов детоксикацни //Гигиена и санитария. 2010. № 3. С.60-64.

В других изданиях

2. Легостаева Т.Б. Методологические и методические подходы к оценке генотоксичности объектов окружающей среды // Наука на рубеже веков. Проблемы окружающей среды и здоровье: Сборник научных статей. СПб: Нестор, 2002. С. 2630.

3. Легостаева Т.Б. Проблемы биотестирования в оценке генотоксичности объектов окружающей среды // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды: Материалы II региональной научной конференции. Челябинск: Изд-во Челябинского Гос. пед. университета, 2002. С. 145-150.

4. Кошкина B.C., Антипанова H.A., Легостаева Т.Б. Врожденные аномалии как показатель мутагенного "груза" в популяции промышленных городов // Здоровье семьи - XXI век: Материалы VII Международной научной конференции. Пермь. 2003. С. 96-97.

5. Легостаева Т.Б.. Донерьян Л.Г., Ингель Ф.И., Кошкина B.C. Оценка токсичности и генотоксичности снегового покрова города Магнитогорска с использованием методов биотестирования //Проблемы экологически обусловленных нарушений состояния здоровья населения промышленных городов Южного Урала с развитой отраслью черной металлургии: Сб.докладов Всероссийской конференции. Магнитогорск. 2004. С. 113-119.

6. Легостаева Т.Б.. Донерьян Л.Г., Ингель Ф.И. Кошкина B.C. Динамика суммарных токсических и генотоксических эффектов проб снега, отобранных в г.Магнитогорск //Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. № 3 (23). Приложение 2. С.79.

7. Ингель Ф.И. Юрченко В.В., Кривцова Е.К., Легостаева Т.Б., Хусаинова Ш.Н., Косдаулетова Г, Эрдингер Л., Иккль П. Стресс как биомаркер комплексного действия экотоксикантов //Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. № 3 (23). Приложение 2. С.78.

8. Ингель Ф.И., Хусаинова Ш.Н., Легостаева Т.Б. Парадоксальные генотоксические эффекты стресса //Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 2009. Часть II. С.337.

9. Ингель Ф.И., Легостаева Т.Б. Генетические эффекты вегетативного дисбаланса у детей в Магнитогорске. Ростов-на-Дону, 2009. С.161.

J0. Ингель Ф.И., Юрцева Н.А., Кривцова Е.К., Легостаева Т.Б. Стресс у человека как иидикатор и инструмент для прогноза генотоксических эффектов факторов среды // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Екатеринбург, 2009. С.28-30.

11. Ингель Ф.И., Легостаева Т.Б.. Юрцева Н.А., Кривцова Е.К., Косдаулетова Г.К., Хусаинова Ш.Н., Антипанова Н.А., Степанова А.А., Степанова О.П. Как вегетативная нервная система модифицирует эффекты нестабильности и чувствительности генома: Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону, 2010. //Медицинская генетика. 2010. С. 76.

12.10рченко В.В., Легостаева Т.Б., Ингель Ф.И., Кривцова Е.К., Юрцева Н.А. Оценка нестабильности генома детей из Магнитогорска в микроядерном тесте на эпителии щеки и культуре крови: Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010// Медицинская генетика. 2010. С.201-202.

13.Legostaeva Т.. Doner'jan L. Total toxicity and total mutagenicity of the snow samples in city of black metallurgy // II-nd Central &Eastem Europe Conference on Health and the Environment. Bratislava, Slovak Republic, 22- 25 October. 2006. Abstract Book, P.62.

14. F.Ingel, T.Legostaeva, Sh.Khussainova, N. Antipanova, N. Yurtseva, E. Krivtsova, V. Yurchenko, Lothar Erdinger, Peter Eckl. Children's genome instability - methodology of comparative analysis /Cetntral European Journal Occupational and Environmental Medicine. 2008.V.14, No 1, P.37-38.

15.Faina Ingel, Sholpan Khussainova, Lothar Erdinger, Peter Eckl, Tatiana Legostaeva. Nadezhda Antipanova. Role of environmental pollution in children's stress /Consequences of vicious circle. Third WHO International Conference on Children's Health and the Environment "From Research and Knowledge to Policy and Action. Korea. Busan. 7-10 June 2009." PS 20-05 (RN 145) http://www.ceh2009.org

Список иршштш сокращений

д/с - детский сад

ДЛМ - доминантный летальный тест

ДЛТ - доминантный летальный тест

ММК - магнитогорский металлургический комбинат

МННГ - М-метил-М-нитро-К-нитрозогуанидин

ПАУ- полициклические ароматические углеводороды

ПЭЛ - поздние эмбриональные летали

РЭЛ - ранние эмбриональные летали

Заказ № 140-а/05/10 Подписано в печать 24.05.2010 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ni; е-таП:т/о@с/г.ги

Сегодня считается неоспоримым, что здоровье человека формируется под воздействием сложного комплекса химических, физических и биологических воздействий [63]. Поэтому при оценке риска здоровью необходимо учитывать множество факторов различной природы, а также непредсказуемую возможность синергических, антагонистических либо аддитивных взаимодействий между ними, разнообразие путей метаболической трансформации химических соединений, присутствующих в окружающей среде и пр. Проблема осложняется тем, что в реальной жизни человек может одновременно контактировать с тысячами веществ, среди которых много соединений, биологическая активность которых изучена недостаточно или не определена. Поэтому выбор химических соединений, приоритетных для изучения биологической активности для последующей регламентации является одной из важнейших задач гигиенических исследований.

Особую опасность не только для ныне живущих, но и для будущих поколений представляют вещества, повышающие нестабильность генома -мутагены и канцерогены. Так, например, была выявлена прямая корреляционная связь между уровнем нестабильности генома человека и риском развития у него рака через 10-20 лет [150, 166, 177]. Рост онкологической заболеваемости, отмечаемый в последние десятилетия среди детей и взрослых во всем мире, делает выявление приоритетных для нормирования генотоксических факторов особо актуальным.

Условия для постоянной экспозиции жителей генотоксическими соединениями, содержащимися в атмосферных выбросах предприятий и транспорта, создаются в промышленных городах [65, 66]. Поскольку чувствительность генома у детей выше, чем у взрослых [153, 160], наибольшее влияние генотоксические компоненты выбросов оказывают именно на них. Поэтому изучению условий и особенностей формирования нестабильности генома детей во всем мире уделяется серьезное внимание.

Однако эти исследования далеки от завершения. Так, например, в доступной литературе не удалось обнаружить сведений об изучении нестабильности генома лимфоцитов крови детей, проживающих в городах с развитой отраслью черной металлургии — базовой для экономики России и большинства развитых стран.

В НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН разработан и апробируется новый информативный подход к оценке нестабильности генома человека, позволяющий выявить большинство известных цитогепетических повреждений, особенности пролиферации и уровень апоптоза лимфоцитов крови, культивируемых в условиях цитокинетического блока [33]. Мы предположили, что этот методический подход может быть с успехом использован для разработки метода выявления генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации.

Известно, что снежный покров аккумулирует значительную часть веществ, присутствующих в атмосфере, и поэтому является информативным индикатором загрязнения воздуха [8, 15, 42, 70]. В гигиенических исследованиях широко используют химический анализ проб снега, но, как правило, определяют содержание небольшой группы веществ — например, ионов металлов, что представляется недостаточным для оценки реальной ситуации. Мы предположили, что химический анализ состава загрязнений снега, собранного в конце снежного периода, когда в нем аккумулирован практически полный состав загрязнений воздуха [15], может быть использован как основа экспериментального подхода для обнаружения генотоксикантов с целью углубленно изучения биологической активности для дальнейшей гигиенической регламентации.

Исходя из всего сказанного выше, целью исследования является разработка экспериментального подхода для выбора генотоксических соединений, подлежащих учету и/или гигиенической регламентации, среди присутствующих в атмосферном воздухе промышленного города с развитой отраслью черной металлургии на примере Магнитогорска.

Для ее достижения сформулированы следующие задачи:

1. Оценить информативность теста на индукцию доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster для оценки интегральных генотоксических эффектов проб снега, собранных в разных районах Магнитогорска, и определить связь изученных показателей с составом загрязнения проб снега.

2. Определить уровни нестабильности генома детей, проживающих в Магнитогорске в местах сбора проб снега, а также индивидуальную чувствительность их генома к дополнительной генотоксической нагрузке in vitro в микроядерном тесте на культуре лимфоцитов крови и оценить связь этих показателей с составом загрязнения проб снега.

3. Разработать систему методов для выявления химических соединений, приоритетных для гигиенической регламентации в атмосферном воздухе населенных мест с учетом генотоксичности.

Научная новизна исследования заключается в том, что :

1. Разработан метод выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации по содержанию в атмосферном воздухе промышленного города, базирующийся на данных по химическому составу проб снега, собранного в конце снежного периода в разных районах города, суммарной генотоксической активности жидкой фазы этих проб на Drosophila melanogaster; оценке нестабильности и индивидуальной чувствительности генома здоровых жителей районов сбора этих проб.

2. В результате апробации метода в Магнитогорске обнаружена согласованность между генотоксическими эффектами проб снега, определенными в тесте на индукцию мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster, и уровнями нестабильности и чувствительности генома здоровых детей, проживающих в районах сбора этих проб.

3. Показано, что показатели нестабильности генома здоровых детей, проживающих в Магнитогорске в местах сбора проб снега, коррелируют с содержанием некоторых компонентов загрязнения этих проб

Практическая значимость исследования заключается в том, что:

• Предложена стратегия выбора приоритетных генотоксикантов из множества веществ, которые реально могут оказывать неблагоприятное воздействие на человека, и нуждаются в разработке гигиенических нормативов по содержанию в атмосферном воздухе;

• Подход апробирован в городе с развитой отраслью черной металлургии Магнитогорске, где для нормирования по содержанию в атмосферном воздухе с учетом генотоксичности рекомендованы 2-метил-2-циклопентен-1-он и метилфенантрсн; для уточнения имеющихся нормативов с учетом генотоксической активности - 2-метилфенол, 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранон, 7Н-бенз[с1е]антрацен-7-он и аценафтен.

• Результаты генетико-гигиенических, цитогенетических, биохимических и психологических исследований, а также данные по заболеваемости, полученные при обследовании детей, переданы в ФГУЗ «Центра гигиены и эпидемиологии в Челябинской области» для определения эпидемиологического риска онкологической заболеваемости и репродуктивных рисков здоровью населения (акт от 05.05.2010). Результаты исследования и разработанные методические подходы используются при подготовке специалистов и включены в лекционные материалы по курсам «Гигиенические основы здоровья», «Экология человека», «Основы медицинских знаний», «Медико-биологическая подготовка», «Основы генетики», «Основы генетики и цитологии» в Магнитогорском государственном университете и «Промышленная экология», «Медико-биологические основы жизнедеятельности» в Магнитогорском государственном техническом университете им. Г.И.Носова (акт от 23.04.2010 и акт от 11.05.2010).

• Результаты исследования использованы для обоснования «Городской целевой программы природоохранных мероприятий, направленных на улучшение экологической обстановки в городе Магнитогорске в 2006

2010гг», утвержденной решением Магнитогорского городского собрания депутатов от 28 июня 2006 года № 126 (акт внедрения от 13.04.2010).

• Материалы исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Выбор генотоксикантов для гигиенической регламентации по содержанию в атмосферном воздухе населенных мест», утвержденных председателем Межведомственного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А. Рахманиным. Личный вклад автора составляет 80%.

Работа выполнена на кафедре биомедицинских и экологических знаний Магнитогорского государственного университета и в лаборатории генетического мониторинга научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМЫ в рамках плановой темы «Влияние качества жизни на нестабильность генома детей, проживающих в городе с развитой металлургической промышленностью» (№ гос. регистрации 01.2.00703762). Часть исследований проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетического мониторинга, лаборатории гигиены почвы и лаборатории биохимии НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

1. метод выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации, алгоритм которого включает анализ химического состава проб снега, собранных в конце снежного периода, когда в них аккумулирован практически полный состав многокомпонентного загрязнения воздуха; модельный эксперимент по индукции мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster жидкой фазой снеговых проб; оценку нестабильности и индивидуальной чувствительности генома к стандартному мутагену in vitro у здоровых людей, проживающих в местах сбора снеговых проб с учетом интегральных показателей повреждения, пролиферации и апоптоза культивированных лимфоцитов крови и корреляционно-регрессионный анализ связей изученных показателей с составом загрязнения проб снега;

2. результаты апробации метода в Магнитогорске, которые продемонстрировали, что:

- в состав загрязнения проб снега, собранных в разных районах города, входят 293 органических соединения и ионы 30 металлов;

- частоты доминантных летальных мутации в половых клетках Drosophila melanogaster, индуцированных жидкой фазой этих проб снега и интегральные показатели нестабильности и индивидуальной чувствительности генома здоровых детей, проживающих в местах отбора проб снега, коррелируют с содержанием некоторых компонентов этого загрязнения;

3. для углубленного изучения с целью регламентации по содержанию в атмосферном воздухе Магнитогорска рекомендованы 2-метил-2-циклопеитен-1-он и метилфенантрен, для уточнения имеющихся нормативов с учетом генотоксической активности - 2-метилфенол , 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранон, 7Н-бенз[с1е]антрацен-7-он и аценафтен

Апробация диссертации проведена 28 декабря 2009 г на межкафедральном семинаре Магнитогорского Государственного университета и 8 апреля 2010 на совместном заседании межотдельчсской комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН. Материалы диссертации доложены на: Всероссийской конференции «Проблемы экологически обусловленных нарушений состояния здоровья населения промышленных городов Южного Урала с развитой отраслью черной металлургии», Магнитогорск, РФ, 2004; Международном экологическом форуме, Санкт-Петербург, РФ, 2008; V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009; III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, РФ, 2009; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Охрана здоровья населения промышленных регионов: стратегия развития, инновациоиные подходы и перспективы», Екатеринбург, 2009; VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону. 2010, «11-nd Central & Eastern Europe Conference on Health and the Environment», Bratislava, Slovak Republic, 2006; «TII-rd Central & Eastern Europe Conference on Health and the Environment», Cluj-Napoca, Romania, 2008; Third WHO International Conference on «Children's Health and the Environment "From Research and Knowledge to Policy and Action»; Busan, Korea, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, 1 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на .страницах машинописи, иллюстрирован . таблицами и . рисунками. Указатель литературы содержит .источников, из них .отечественных и . иностранных авторов.

Заключение

Обобщая результаты, полученные в настоящей работе, следует заключить, что химические соединения, концентрации которых в пробах снега коррелировали с интегральными цитогенетическими показателями нестабильности и индивидуальной чувствительности генома здоровых детей, находящихся в нормальном психо-соматическом состоянии и постоянно проживающих в районах сбора этих проб, являются перспективными для оценки генотоксической активности и могут быть рекомендованы для углубленного изучения биологической активности с целью последующей гигиенической регламентации в атмосферном воздухе населенных мест по показателям генотоксичности. Однако, нельзя исключить, что норматив для указанных веществ будет установлен по общетоксическому или иному действию, в том случае, если это действие окажется лимитирующим признаком вредности, либо по какому-то другому специфическому эффекту, отличному от генотоксического.

По результатам проведенного исследования разработан экспериментальный метод, пригодный для выявления генотоксикантов, присутствующих в воздухе промышленных городов и приоритетных для гигиенической регламентации.

Алгоритм метода включает:

- сбор суммарных проб снега - как субстанции, аккумулирующей загрязнения воздуха;

- химический анализ этих проб;

- оценку частоты доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster, индуцированных этими пробами - как ориентировочных показателей для выбора объекта исследования, для прогпоза возможных генотоксических эффектов и заболеваемости жителей районов, в которых эти пробы отобраны;

- оценку индивидуальной чувствительности генома у группы жителей выбранных районов по результатам цитогенетического анализа лимфоцитов крови, культивированных в условиях цитокинетического блока, как в присутствии модельного мутагена, так и без него. Для выявления ассоциативных связей с содержанием загрязнений проб снега предпочтительно использовать интегральные цитогенетические показатели: частота делящихся клеток с повреждениями, митотическая активность, объем пролиферативиого пула, доля ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле, соотношение симметрично и несимметрично делящихся клеток во втором митозе, частота апоптоза и индекс токсичности;

- при формировании групп для генетико-гигиенических исследований с применением микроядерного теста на культуре крови необходимо учитывать психосоматический статус и состояние здоровья ребенка, модифицирующие нестабильность генома;

1. В условиях города за счет разнообразных промышленных, бытовых, транспортных и других источников выбросов формируется многокомпонентное загрязнение воздуха, в состав которого могут входить, вещества, обладающие мутагенной и канцерогенной активностью, гигиенические нормативы для которых не разработаны.

2. С целью выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации по содержанию в атмосферном воздухе с учетом генотоксического действия предложен метод, основанный на использовании снеговых проб, отбираемых в конце зимнего сезона, когда в них аккумулирован практически полный состав многокомпонентного загрязнения воздуха.

3. Алгоритм метода включает: сбор проб снега с определением их качественного и количественного состава; модельный эксперимент по индукции жидкой фазой снеговых проб доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster (прямая индикация генотоксической активности веществ, загрязняющих атмосферный воздух); оценку нестабильности и индивидуальной чувствительности генома к стандартному мутагену in vitro у здоровых людей, проживающих в местах сбора снеговых проб (непрямая индикация генотоксичности веществ, загрязняющих атмосферу) по интегральным показателям повреждения, пролиферации и апоптоза; выбор генотоксикантов для гигиенической регламентации их содержания в атмосферном воздухе на основе корреляционно-регрессионного анализа взаимосвязи интегральных показателей нестабильности генома обследованных людей и частоты доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster с веществами, содержащимися в снеговых пробах.

4. Метод апробирован в городе Магнитогорске, где в экстрактах снеговых проб, собранных в разных районах города на территориях детских садов, обнаружено 293 органических соединения, концентрации которых колебались от 0,01 мкг/л (лимонен, пропилбензол, 4,5-дигидро-бензо[а]пирен, этиловый эфир гексановой кислоты, 1М-(2-метилфенил)-формамид, трифенилфосфат, пентанол и др.) до 36,00 мкг/л (дибутилфталат), а также ионы серы, бора, брома и 30 металлов, концентрации которых варьировали от 0,02 мкг/л (бериллий) до 71 000 мкг/л (кальций).

5. Жидкие фазы проб снега из Магнитогорска повышали частоту поздних доминантных летальных мутаций в половых клетках Drosophila melanogaster в 1,61- 4,27 раза по сравнению с контролем (% =2,0 — 19,86), что указывает на присутствие в пробах генотоксикантов.

6. У здоровых детей 5-7-лет с нормальным психосоматическим статусом, которые в течение всей жизни проживали рядом с обследованными детскими садами в Магнитогорске и посещали их, средняя спонтанная частота двуядерных клеток с микроядрами (общепринятый маркер нестабильности генома) составляла 5,2-7,0 клеток на 1000, а средняя частота всех делящихся клеток с повреждениями 13,6-16,0 на 1000. Действие стандартного мутагена 1Ч-нитро-М-метил-1ч[-нитрозогуанидина на лимфоциты крови обследованных детей проявлялось в увеличении асимметрии деления и снижении пролиферативной активности клеток в культуре. Эти эффекты коррелировали с частотами поздних доминантных летальных мутаций, индуцированных в половых клетках Drosophila melanogaster экстрактами проб снега с территорий обследованных детских садов (R=0,84-0,99; р=0,036-0,0003).

7. Интегральные показатели спонтанного уровня нестабильности генома обследованных детей из Магнитогорска коррелировали (R=0,97; р<0,005) с концентрациями в снеге: 2-циклопентен-1-он-2-метила, а также ионов молибдена и свинца (частота поврежденных клеток); 2-метилфенола и ионов никеля (показатели пролиферации клеток в культуре); 7Н-бенз[«1е]антрацена-7-он и ионов меди (частота апоптоза); дибенз[а,1г]антрацена (митотическая активность клеток в культуре). Интегральные показатели индивидуальной чувствительности генома детей к действию М-нитро-М-метил-Ы-нитрозогуанидина на лимфоциты крови коррелировали (R=0,97; р<0,005) с концентрациями в снеге метилфенантрена (индекс токсичности), 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранона частота поврежденных клеток), аценафтена (частота апоптоза). Из этих веществ 2-метилфенол, днбенз[а,Ь]антрацен и аценафтен присутствуют в выбросах металлургического комбината в атмосферный воздух. 8. 2-метил-2-циклопентен-1-он и метилфенантрен рекомендованы как приоритетные для нормирования по содержанию в атмосферном воздухе населенных мест. Для уточнения имеющихся нормативов с учетом генотоксической активности рекомендованы 2-метилфенол — коканцероген для ПАУ (для которого определена максимально разовая концентрация в атмосферном воздухе населенных мест), 5-гептилдигидро-2(ЗН)-фуранон, 7Н-бенз[<1е]антрацен-7-он и аценафтен (для которых имеются ориентировочно безопасные уровни воздействия в атмосферном воздухе населенных мест).