Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Разработка нового биокомпозиционного материала, содержащего фактор роста эндотелия сосудов, для замещения костных дефектов (экспериментальное исследование)
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.01.14
Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка нового биокомпозиционного материала, содержащего фактор роста эндотелия сосудов, для замещения костных дефектов (экспериментальное исследование)
На правах рукоптеи
4853240
Рябова Валентина Михайловна
«Разработка нового биокомпозиционного материала, содержащего фактор роста эндотелия сосудов, для замещения костных дефектов (экспериментальное исследование)»
14.01.14 - Стоматология
Автореферат
Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
2 2 СЕН 2011
Нижний Новгород - 2011
4853246
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России».
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук, профессор
Иванов Сергей Юрьевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор
Доктор медицинских наук, профессор
Казарина Лариса Николаевна (Нижегородская государственная медицинская академия, г. Н.Новгород)
Лепилин Александр Викторович (Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского, г. Саратов)
Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет, г. Москва.
Защита состоится «50» сентября 2011 года в часов на заседании Диссертационного совета (Д 208.061.03) при Нижегородской государственной медицинской академии (603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина, д. 10/1)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии (603063, г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д.ЗА)
Автореферат разослан «ЗО» августа 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Дурново Е.А.
Общая характеристика работы Актуальность темы.
В практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, для заполнения дефектов, возникающих после удаления зубов, опухолей и опухолеподобных образований, с целью предотвращения возможных осложнений, а также для ускорения регенерации костной ткани используется большое количество биогенных и синтетических материалов (Белозеров М.Н., 2003, Панин A.M., 2004, Аснина С.А. и соавт., 2004).
В настоящее время ведется поиск новых биологических и синтетических агентов, добавление которых в имплантируемый костезамещающий материал будет способствовать улучшению микроциркуляции в области операции, ускорению прорастания сосудов и репаративной регенерации костной ткани в месте дефекта (Германов В.Г. и соавт.,2006, Кирилова H.A. и соавт.,2007, Володина Д.Н.и соавт.,2008, Трунин Д.А. и соавт.,2008).
Большой интерес представляют исследования иностранных авторов, посвященные биологической роли фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС, от англ. vascular endothelial growth factor - VEGF) в регенерации костной ткани (Gerber HP., 1999; Zelzer E, 2002; Maes С., 2002, 2004).
Доказано, что фактор рост эндотелия сосудов может синергично взаимодействовать с остеогенными протеинами, такими как ВМР4 , стимулируя костеобразование и заживление кости увеличивая мобилизацию клеток, пролонгируя их жизнеспособность и индуцируя ангиогенез (Deckers ММ и др. 2002). Также было показано, что активность фактора роста эндотелия сосудов важна для ВМР2-индуцированного костеобразования. Фактор рост эндотелия сосудов увеличивает ВМР2-индуцированное костеобразование и регенерацию за счет стимулирования ангиогенеза. Взаимодействие фактора роста эндотелия сосудов, ВМР2 и ВМР4 имеет различные, пока еще не изученные механизмы (Peng Н., 2005). Таким образом, перспективным является создание новых комбинированных костезамещающих материалов, обладающих наряду с остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, способностью индуцировать ангиогенез и обеспечивать на молекулярном уровне активацию и дифференцировку остеобластов.
Цель исследования
Провести in vitro и in vivo исследования нового биокомпозиционного материала, содержащего фактор роста эндотелия сосудов для оценки его эффективности при замещении костных дефектов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработка методики получения биокомпозиционного костезамещающего материала на основе костного недеминерализованного коллагена, насыщенного фактором роста эндотелия сосудов.
2. Исследование влияния нового биокомпозиционного материала, насыщенного фактором роста эндотелия сосудов, на культуру клеток.
3. Изучение в эксперименте на животных биосовместимости разработанного материала.
4. Исследование влияния разработанного материала на регенерацию костной ткани в эксперименте на животных.
Научная новизна
В результате проведенных работ получен новый биокомпозиционный материала, содержащий биологически активный фактор роста эндотелия сосудов.
Впервые разработан нетоксичный костезамещающий материал на основе костного недеминерализованного коллагена в композиции с фактором роста эндотелия сосудов, который обладает остеоиндуктивными, остеокондуктивными свойствами и свойствами индуктора неоангиогенеза.
Впервые в эксперименте показано, что использование биоматериала, насыщенного фактором роста эндотелия сосудов, для замещения костных дефектов увеличивает число кровеносных сосудов в регенерате на единицу площади соединительной ткани в 4 раза, а площадь сосудистого русла в 8 раз.
Практическая значимость
Экспериментальными исследованиями обоснована и подтверждена эффективность использования костезамещающего материала на основе недеминерализованного коллагена, насыщенного фактором роста эндотелия сосудов, для заполнения костных дефектов, возникающие при хирургических вмешательствах в челюстно-лицевой области.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Улучшение остео (индуктивных и остеоиндуктивных свойств биокомпозиционного материала материал на основе недеминерализованного коллагена может быть достигнуто за счет включения в его состав ФРЭС.
2. Предложенный материал улучшает регенерацию костной ткани и формирование сосудистого русла in vivo.
Внедрение результатов исследования
Результаты проведенных исследований используются на кафедре челюстно-лицевой хирургии и имплантологии ФПКВ Нижегородской государственной медицинской академии при проведении лекций и практических занятий по постдипломной подготовке клинических ординаторов, интернов и слушателей ФПКВ.
Апробация диссертации
Диссертация апробирована 29 апреля 2011 г. (протокол №4) на совместном заседании кафедр терапевтической, ортопедической, пропедевтической стоматологии, стоматологии детского возраста, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, кафедр стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и имплантологии факультета повышения квалификации врачей Нижегородской государственной медицинской академии.
Личное участие автора выразилось в самостоятельном проведении экспериментальных исследований на животных, анализе и обработке полученных результатов.
Публикации по теме диссертации По теме диссертационной работы опубликованы 4 научные работы, в том числе 3 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 104 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы экспериментальных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Список литературы включает 244 источника, из них 45 отечественных и 199 зарубежных. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 47 рисунками.
Основное содержанке работы
Материалы и методы. В нашей экспериментальной работе мы использовали фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) производства ЗАО «Протеинсинтез». ФРЭС представляет собой порошок, белого цвета легко растворим в воде. В качестве матрицы-носителя для ФРЭС был выбран коммерческий недеминерализованный костный коллаген производства ООО «НПК ВИТАФОРМ» (г. Москва, per. уд. № ФС 01262005/1950-05 от 20.07.2005. Сертификат соответствия: РОСС RU. ИМ 18.В 00029). Использовались 2 формы материала: блоки (размер блоков 5x5x5 мм) и крошка (дисперстность крошки 100500 мкм). Мы обосновывали свой выбор для матрицы-носителя именно этого материала благодаря его положительным биологическим свойствам, которые доказаны в ранее проведенных исследованиях. Указанный материал обладает не только остеокондуктивными, но и остеоиндуктивными свойствами, активно влияет на регенерацию кости благодаря содержанию в нем сульфатированных гликозаминогликанов. Доказано, что матрица на основе костного коллагена и содержащая гликозаминогликаны поддерживают остеогенную активность в реципиентном ложе (Иванов С.Ю.. 1999). Мы предположили, что добавление в недеминерализованный костный коллаген, содержащий гликозаминогликаны, ФРЭС должно увеличить его регенераторный потенциал.
Работа проходила в 4 этапа (таблица № 1).
Таблица № 1
Этапность разработки и исследования биологической активности материала на основе недеминерализованного костного коллагена, содержащего ФРЭС.
1 >тап ¡Разработка композиции недеминерализованного костного коллагена и
ФРЭС
ЯЯШШЛ ¡Изучение влияния на культуру клеток недеминерализованного
костного, коллагена, насыщенной-'ФРЭС;'
¡Изучение биосовместимости и влияния на апгиогенез
fllltllllllllllfll ¡недеминерализованного костного коллагена, насыщенного ФРЭС in
¡vivo
■■■■ jMíyiC'IHC H.IHHIlH»' МЧ.' Ni)! г IIC ICV И 1 ЮМ IH «4« II1IIDIO ICHC.IIOIO
ШШшШШШШШш^ коллагелл. j > ,J uv¡ ^ ¡ r 1 vOjnnit .sdii i in uo
Получение ФРЭС.
Используемый в работе ФРЭС синтезировали по технологии получения рекомбинантных белков. Процедура состоит из получения генетической конструкции на основе плазмидной ДНК, содержащей к ДНК ФРЭС-А165 человека. Плазмидный вектор был сконструирован на основе модифицированного вектора pBK-CMV для экспрессии в эукариотических клетках. В качестве продуцента были выбраны клетки линии СНО (от англ. Chinese hamster ovary - яичники китайского хомячка). Наработанный клетками СНО белок ФРЭС очищали из культуральной среды методом аффинной хроматографии. Чистоту полученного белка ФРЭС анализировали методом электрофореза в акриламидном геле, а биологическую активность с использованием анализа пролиферации ФРЭС зависимых клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC.
Разработка композиции недеминерализованного костного коллагена и ФРЭС.
Конъюгирование (перекрестную сшивку, крослинкинг) ФРЭС с костным недеминерализованным коллагеном проводили с использованием трех различных методик. Кросслинкерные методики выбирали с учетом их химической активности, совместимости с используемым материалом, размера формирующихся между белками мостиков, растворимости в воде и физиологических жидкостях организма конечных продуктов конъюгации, сохранения целевых биологических свойств материала, в частности способности эффективно индуцировать рост новых кровеносных сосудов. Задачей данного этапа работы являлось выбрать оптимальный вариант конъюгации ФРЭС и недеминерализованного костного коллагена.
В полученных образцах изучали эффективность кроссшивки, а именно, процент связавшегося с коллагеном белка ФРЭС. Это особенно актуально, так как при проведении конъюгации происходят высокие потери дорогостоящего рекомбинантного белка ФРЭС.
В качестве первого метода связывания ФРЭС и коллагеновых матриц использовали формирование кроссшивок между ФРЭС и коллагеном с использованием глутарового альдегида. Данный способ является одним из наиболее простых и технологичных методов сшивки белков. Для конъюгации инкубировали коллагеновые блоки или коллагеновую крошку в растворе ФРЭС с
концентрацией 2,5 мг/мл на фосфатном буфере в течение 20 мин при +4 с С при постоянном перемешивании. Затем в раствор добавляли глутаровый альдегид до конечной концентрации 0,1% и инкубировали в течение 60 мин. Остатки не связавшихся белков и отмывали на воронке с обратным током буфера. Стерилизацию материала проводили с использованием гамма-облучения.
Вторым способом, использованным для нанесения и связывания ФРЭС с костным недеминерализованным коллагеном было селективное формирование кросшивок по аминогруппам с использованием NHS-аминореактивного эфира -бис(сульфосукцинимидил) суберата производства Pierce (США). Данный способ является более мягким, чем предыдущий и позволяет белкам в большей степени сохранять свою конформацию и биологическую активность, так как связывание проводить при физиологических условиях. Для конъюгации инкубировали коллагеновые блоки или коллагеновую крошку в растворе ФРЭС с концентрацией 2,5 мг/мл на фосфатном буфере в течение 20 мин при +4 0 С при постоянном перемешивании. Кросслинкерный реагент готовили в соответствии с рекомендацией производителя до конечной концентрации 1мМ. Инкубировали реакционную смесь в течение 2-х часов на ледяной бане с постоянным перемешиванием. Затем останавливали реакцию добавлением избытка ТрисНС1 буфера до конечной концентрации 50мМ на 15 минут. Остатки не связанных реагентов отмывали на воронке с обратным током буфера. Стерилизацию материала проводили с использованием гамма-облучения.
Для реализации третьего способа использовали водорастворимый карбодиимидный крослинкерный реагент 1-Этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид (ЭДАК) гидрохлорид производства Pierce (США) в соответствии с рекомендацией производителя. Данная реакция ведет к образованию связей между карбоксильными группами и первичными аминами. Реакцию проводили в 0,1 М MES-буфере рН - 5,0 в течение 2 часов при +4° С. Не прореагировавшие остатки реагентов нейтрализовали с добавлением гидроксиламина в реакцию до конечной концентрации 10 мМ. Остатки не связанных реагентов отмывали на воронке с обратным током буфера Стерилизацию материала проводили с использованием гамма-облучения.
Оценка эффективности конъюгации недеминерализованного коллагена сФРЭС
В образцах реакционной жидкости после проведения кроссшивок анализировали остаточное количество ФРЭС с целью выбрать метод, приводящий к наименьшим потерям дорогостоящего рекомбинантного белка ФРЭС. Концентрацию ФРЭС определяли с использованием набора для ИФА определения ФРЭС человека производства Peprotech (США) в соответствии с рекомендацией производителя.
Оценка токсичности недеминерализованного коллагена содержащего ФРЭС
Полученные образцы конъюгированных материалов анализировали на предмет токсичности в отношении культивируемых клеток: трансформированных фибробластов мыши линии L929 и эндотелиальных клеток человека HUVEC.
Фибробласты были выбраны в качестве модельных клеток, во-первых, потому, что они являются важными участниками процессов регенерации и формирования новой кости, во-вторых, токсичность именно в отношении фибробластов может нарушать процессы нормального послеоперационного восстановления, в-третьих, фибробласты активно функционируют в условиях in vitro и успешно и стабильно перевиваются в культуре. Все выше перечисленное свидетельствует о целесообразности оценивать предварительные токсичные эффекты новых материалов на основе анализа пролиферативной активности фибробластов.
Суть метода оценки состоит в использовании тест-системы, представляемой перевиваемыми линиями фибробластов и эндотелиальных клеток. Зная характеристики тест-системы и следя за их изменением после добавления к культуре клеток фрагментов изучаемых биоматериалов, можно заключить насколько токсичны сами материалы или их компоненты для клеток L929 и HUVEC.
Регуляция пролиферации фибробластов и эндотелиальных клеток может осуществляться благодаря присутствию в биоматериале проангиогенных факторов или токсических соединений, обладающих как стимулирующим, так и ингибирующим действием. Отличительной особенностью метода явиляется использование двух исходных концентраций засеваемых клеток, что
соответственно создает условия для высокого и низкого уровня пролиферации, так как клетки отличаются различным уровнем чувствительности к супрессорным и стимулирующим факторам при различных уровнях пролиферации. Для каждой экспериментальной точки использовали три параллельные пробы. Учет пролиферации проводили с использованием CellTiter 96® AQueous Cell Proliferation Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя.
Индекс пролиферации (ИП) рассчитывали по формуле: ИП=ОП (культура+биоматериал)/ОП(интактная культура) х 100%, где ОЩкультура+биоматериал) - значение оптической плотности, полученное в лунках клеток культивируемых в присутствии биоматериала;
ОП (интактная культура) — значение оптической плотности, полученное в контрольных лунках содержащих интактные клетки.
Результаты оценки эффективности конъюгации
недеминерализованного коллагена с ФРЭС
В ходе работы по конъюгации ФРЭС с костным недеминерализован-ным коллагеном были обнаружены следующие эффективности связывания, приведенные в таблице 2.
Таблица 2
Количество несвязавшегося с биоматериалом ФРЭС в растворе после остановки химической реакции.
Тип кроссшивки Количество свободного ФРЭС, ставшегося в реакции, в % от исходной концентрации
Глутаровый альдегид 37,4
NHS-аминореактивный эфир 29,8
ЭДАК 69,2
3.2. Результаты оценки токсичности разработанного материала in
vitro.
При анализе влияние биоматериалов на пролиферацию клеток L929 и HUVEC были получены следующие значения индекса пролиферации (таб.3 и таб.4)
Таблица 3
Значения ИП клеток L929 для различных биоматериалов._
Материал ИП, %
Костный коллаген 72
Костный коллаген + ФРЭС 32
(Глутаровый альдегид)
Костный коллаген +ФРЭС 64
(Ъ1Н8-аминореактивный эфир)
Костный коллаген +ФРЭС 47
(ЭДАК)
Таблица 4 Значения ИП клеток HUVEC для различных биоматериалов.
Материал ИП, %
Костный коллаген (негативный контроль) 11
Костный коллаген + ФРЭС (позитивный контроль) 63
Костный коллаген + ФРЭС (Глутаровый альдегид) 24
Костный коллаген +ФРЭС (ЫН8-аминореактивный эфир) 37
Костный коллаген +ФРЭС (ЭДАК) 33
Таким образом, по итогам данных экспериментов можно сделать заключение, что наименнее токсичным в условиях in vitro моделей, на основе потенциальных клеток мишеней, которые наиболее вероятно будут являться основными клеточными элементами в участке регенерации тканей является биоматериал, полученный с использованием кроссшивок недеминерализованного костного коллагена и ФРЭС с использованием NHS-аминореактивного эфира. Именно эта методика получения биоматериалов использовалась в дальнейшем для наработки материала при проведении опытов in vivo.
Далее проводили изучение влияния ФРЭС, нанесенного на недеминерализованный костный коллаген на культуру клеток (П этап). Для оценки сохранности биологической активности ФРЭС фрагменты биоматериалов покрытых ФРЭС и контрольного исходного коллагена инкубировали в среде ЕВМ-2 в течение 24 часов при 37 °С. В дальнейшем образцы среды, полученной таким
образом, использовали в прояиферативком тесте клеток HUVEC. Параллельно с экспериментальными пробами, полученными при инкубации покрытого ФРЭС матрикса, готовили образцы контрольной среды, полученной при инкубации исходного не модифицированного коллагена в среде ЕВМ-2. Полученные среды добавляли в культивируемые клетки HUVEC и определяли их пролиферативную активность в ответ на присутствующий в средах ФРЭС.
С использованием стандартного теста для оценки пролиферативной активности (Cell Tetev 96: Aqueuos Cell Rvo Promega) за сто процентов ответа принимали значение оптической плотности после остановки реакции в лунках планшета, содержащих 50 нг/мл контрольного рекомбинантного ФРЭС с известной ED50 равной 2,3 нг/мл (рис. 1).
Пролиферации клеток HUVEC в %
120
' Отрицательный' Пролиферации КЛеЮК ГфОЛИч'ерЛЦИН !*■-■:о■ контроль Пролиферация при добавлении ч.кпл'О при добавлении плеток без ФРЭС ФРЭС 50 нг/мл колл,); (зачтенного
ФРЭС
Рис.1. Результаты определения биологической активности ФРЭС в супернатантах, полученых в ходе инкубирования коллагена, покрытого ФРЭС и контрольного исходного образца в среде ЕВМ-2. Результаты эксперимента выражены в процентах от максимального значения пролиферации, вызванной культивированием клеток ННУЕС в присутсвии рекомбинантного ФРЭС
Среды, полученные в ходе инкубации с препаратами костного коллагена, покрытого ФРЭС, проявляли биологическую активность, свойственную образцам чистого ФРЭС, что нашло отражение в пролиферации ФРЭС зависимых клеток НиУЕС. Аналогичные результаты наблюдались в статьях (\Vernike й а1, 2010).
Таким образом, по результатам II этапа исследования можно говорить о наличии у насыщенного ФРЭС коллагена высокой проангиогенной активности in vitro в рамках традиционных моделей. Полученные положительные результаты свидетельствовали о целесообразности проведения дальнейших экспериментальных исследований разработанного материала на животных.
Экспериментальные исследования по изучению костного недеминерализованного коллагена, насыщенного ФРЭС, in vivo были сделаны на базе ННИИТО (Нижегородский Научный Исследовательский Институт травматологии и ортопедии). Все морфологические исследования по биосовместимости костного деминерализованного костного коллагена, насыщенного ФРЭС, проводили на базе кафедры патологической анатомии Нижегородской Государственной медицинской академии под руководством профессора, доктора медицинских наук A.A. Артифексовой.
На III этапе исследовали разработанный материал на биосовместимость и его влияние на ангиогенез. Оценивали влияние внутримышечной имплантации материала на течение послеоперационного периода и формирование кровеносных сосудов.
Методы статистической обработки данных
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программы «StartSoft» и пакета прикладных программ «STATISTICA W. 6.0». Для оценки достоверности полученных результатов использовался коэффициент Стьюдента.
Для проведения эксперимента использовали 40 кроликов породы Шиншилла массой 2-3 кг, которые были разделены на 2 группы: опытную и контрольную, по 20 животных в группе. В качестве имплантируемого материала применяли недеминерализованного коллаген в виде блоков размером 5x5x5 мм, для опытной группы (1 группа) насыщенный ФРЭС, для контрольной группы (2 группа) -ненасыщенный. Материал имплантировали в толщу мышц верхней трети бедра.
В сроки 6 часов, 48 часов, 2 недели, 1 и 2 месяца по 4 животных из каждой группы проводили эвтаназию летальными дозами тиопентала натрия (приказ министерства высшего и среднего образования № 742 13.11.84).
Иссекали фрагмент мышцы с имплантированным блоком и проводили гистоморфологическое исследование.
Результаты исследования
Ранние сроки эксперимента (6 и 48 часов) характеризуются одинаковыми тканевыми изменениями в окружающей имплантат мышечной такни. Регенераторные изменения в обеих группах минимальны, а имплантат проявляет структурную стабильность как в контроле, так и у животных с использованием ФРЭС.
Через 2 недели эксперимента воспалительные изменения изменяют свой характер, сменяя фазу экссудативного воспаления на пролиферативное (таб. 5), однако у животных контрольной группы в зоне контакта имплантат-мышца еще сохраняется зона демаркационного воспаления, где в инфильтрате преобладают нейтрофильные лейкоциты.
У животных опытной группы в эти сроки эксперимента имплантат начинает подвергаться резорбции путем гладкого и пазушного рассасывания; при этом формируется множественные очаги грануляционной ткани, содержащей большое количество кровеносных сосудов капиллярного типа с тонкой стенкой. На периферии этих очагов появляются фокусы созревания грануляций с формированием зрелой соединительной ткани, растущей из периферических зон со стороны фиброзно-мышечной ткани, окружающей имплантат (таб.6).
Таблица 5
Клеточные соотношения в мышце кролика вблизи имплантата через 2 недели
эксперимента.
Группы Число эритроцитов на 100 клеток Число нейтрофильных лейкоцитов на 100 клеток Число макрофагальных элементов на 100 клеток
Контрольная группа п=20 10 ±2 55±3 33±7
Опытная группа (с ФРЭС) п=20 12±3 17±4 70±13
п- количество экспериментальных животных
Таблица 6
Тканевые соотношения в имплантате через 2 недели эксперимента.
Группы Некроз Костная ткань имплантата Костные лакуны Гранудяцион ная ткань Соединительн ая ткань
Контрольная группа п=20 0 33,6±7,1 37,6±4,2 11,1±1,3 15,1±3,3
Опытная группа (с ФРЭС) п=20 0 24,8±3,9 20,9±6,5 30,9±7,5** 24,6±8,6
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,001)
п- количество экспериментальных животных
Полученные данные свидетельствуют о выраженной ангиогенной активности имплантированного материала. Строение сосудов в данные сроки характеризует их как незрелые (тонкая стенка), что характерно для процесса регенерации соединительной ткани на указанных сроках и соответствует данным других авторов (Uchida et al., 2003; Komatsu and Hadjiargyrou, 2004; Kleinheinz et al., 2005). Отсутствие воспаления у опытных животных, в отличие от контрольных, позволяет предположить наличие противовоспалительного действия у ФРЭС. Подобные данные получены (Uchida et al., 2003; Komatsu and Hadjiargyrou, 2004; Kleinheinz et al., 2005).
Гистологическое изучение имплантата и окружающих его тканей у контрольных животных через 1 месяц эксперимента, показало, что имплантат лизирован остеокластами на больших участках, лакуны расширяются, в них врастает соединительная ткань. У животных опытной группы имплантат представляет собой отдельные островки, не связанные друг с другом, разделенные прослойками новообразованной соединительной ткани. Грануляционная ткань присутствует у животных обеих групп, однако занимаемая ею площадь у животных опытной группы достоверно ниже контроля (таб. 7).
Таблица 7
Тканевые соотношения в имплантате через 1 месяц эксперимента._
Группы Костная ткань имплантата Грануляционная ткань Соединительная ткань
Контрольная группа п=20 30,6±4,1 31,1±4,0 32,1±3,2
Опытная группа (с ФРЭС) п=20 8,8±1,9** 15,3±0,6** 74,6±1 !,!♦*
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,001)
п- количество экспериментальных животных
Гистологические исследование зоны имплантации через 2 месяца после проведения операции у животных опытной группы показало, что имплантат в препаратах не определяется, вся его площадь замещена зрелой волокнистой соединительной тканью, тогда как в контроле даже в эти сроки определяются единичные островки имплантата, подвергающегося макрофагалъной резорбции (таб. В).
Таблица 8
Тканевые соотношения в имплантате через 2 месяца эксперимента.
Группы Костная ткань имплантата Грануляционная ткань Соединительная ткань
Контрольная группа п=20 2,2±0,1 25,6±5,7 69,1±5,3
Опытная группа (с ФРЭС) п=20 0 5,3±1,6^ 92,6±7,1^
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,001) п- количество экспериментальных животных
Новообразованная соединительная ткань у исследуемой животных характеризуется наличием нежных волокнистых структур, расположенных без определенной ориентации, содержащей большое количество кровеносных сосудов.
Большое количество молодых сосудов свидетельствует о том, что ФРЭС продолжает выделяться из имплантата до конца его полной резорбции в тканях. В свою очередь, это подтверждает, что ФРЭС надежно соединен с костным недеминерализованным коллагеном матрицы-носителя, что обеспечивает его пролонгированное выделение в ткани по мере резорбции имплантата. Данное свойство материала в дальнейшем может быть полезно для регенерации больших по объёму костных дефектов (большего размера, чем критический костный дефект).
Выяснение причин достоверно более быстрого хода регенераторного процесса в экспериментальной группе животных привело нас к необходимости морфометрического анализа площади кровеносного русла в зоне регенерации, поскольку процесс регенерации должен быть обеспечен полноценной доставкой к тканям кислорода и питательных веществ. Известно, что в грануляционной ткани присутствует большое количество тонкостенных кровеносных сосудов капиллярного типа, за образование которых ответственен именно ФРЭС, тогда как в зрелой соединительной ткани определяются сосуды с наличием полноценно сформированной стенки (таб.9, рис. 2).
Таблица 9
Площадь кровеносного русла в разные сроки эксперимента.
-—--—---------- 2 Площадь кровеносного русла (мкм )
Группы 48 часов 2 недели 1 месяц 2 месяца
Контрольная группа 0 10,2±0,6 34,6±3,8 37,3±6,6
Опытная группа (с ФРЭС) 5,2±1,1 34,5±4,1* 156,8±14,7** 124,3±9,0**
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (*р<0,05; **р<0,001)
п- количество экспериментальных животных
Таким образом, в области имплантата прогрессивно нарастает площадь микроциркуляторного русла, что особенно выражено в исследуемой группе, где максимальная площадь кровеносного русла наблюдается в срок 1 месяц и длится до момента разрушения имплантата и окончания выделения из него ФРЭС. В этот срок площадь грануляционной ткани также является максимальной. В последующие сроки площадь кровеносных сосудов несколько снижается, оставаясь, однако, достоверно выше, чем в контрольной группе животных.
Это связано с процессом созревания грануляционной ткани и трансформацией ее в зрелую фиброзную ткань, в которой определяются зрелые кровеносные сосуды, обеспечивающие адекватное питание ткани. В свою очередь это свидетельствует о прекращении действия ФРЭС и созревании сосудов.
156
160 ■ 140 120 100 -
60
34
40
20 ■ 5 Ю
^ «да? .■:.
я
124
<0Ш
® контроль & опыт
30 60
Рис. 2 Изменения показателей площади микроциркуляторного русла в разные
сроки эксперимента
Следующим этапом нашей работы было исследование влияния разработанного материала на регенерацию костных дефектов (IV этап).
В качестве экспериментальной модели процесса репаративной регенерации создавался костный дефект в гребне подвздошной кости кроликов. В опытной группе (1 группа) дефект заполняли разработанным материалом - крошкой из недеминерализованного коллагена, насыщенного ФРЭС. В контрольной группе (2 группа) дефект заполняли простой крошкой из недеминерализованного коллагена (рис. 3, 4). Исследование влияния разработанного материата на регенерацию
костной ткани проводилось на экспериментальных животных в сроки 2 недели, 1 месяц.
| (ЯШ 1 ё у 14.
ш ¡¡Шя® адр тШШШ 5 мм ■ щ
Рис. 3. Схема формирования дефектов в Рис. 4. Заполнение дефектов
подвздошной кости в эксперименте. костезамещающим материалом.
Гистологическое исследование костной ткани животных контрольной группы через 2 недели после операции выявило, что крошка из недеминерализованного коллагена практически по всей площади дефекта сохраняет свою структуру. Вокруг костных фрагментов имеет место диффузный воспалительный инфильтрат, в котором доминируют макрофагальные элементы с наличием небольшого количества нейтрофильных лейкоцитов. Кроме того, есть единичные фокусы рассасывания крошки макрофагами. У животных опытной группы срок 2 недели характеризуется практически полным отсутствием крошки из недеминерализованного коллагена с наличием множественных зон лакунарного и пазушного рассасывания имплантированной крошки (таб.10,11).
Таблица 10
Клеточные соотношения в срок 2 недели эксперимента._
Группы Число мононуклеаров на 100 клеток Число нейтрофильных лейкоцитов на 100 клеток
Контрольная группа п=8 76,7±21,3 21,9±4,3
Опытная группа (с ФРЭС) п=8 86,3±11,4 10,5±1,7*
Достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) п- количество экспериментальных животных
Таблица 11
Тканевые соотношения в срок 2 недели эксперимента.
Группы Площадь костной крошки Площадь соединительной ткани Площадь грануляционной ткани Площадь костных лакун
Контрольная группа п=8 25,3±4,2 6,2±0,4 22,0±2,5 44,7±6,9
Опытная группа (с ФРЭС) п=8 5,7±0,6** 19,8±2,5# 57,6± 11,2* 10,2±2,1**
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (*р<0,05;м р<0,001)
п- количество экспериментальных животных
В опытной группе животных происходит более быстрая резорбция крошки макрофагами и формирование грануляционной ткани, которая, созревая, трансформируется в зрелую соединительную ткань, что видно особенно на периферии костного дефекта.
Гистологическое исследование костных фрагментов животных контрольной группы через 1 месяц эксперимента выявило отсутствие фрагментов крошки с формированием на ее место грануляционной и соединительной ткани в обеих группах. Причем в контрольной группе соединительная ткань формируется на периферии костного дефекта и представляет собой тонковолокнистую ткань с небольшим числом кровеносных сосудов.
В тот же срок эксперимента у животных опытной группы в центре костного дефекта определяются зоны зрелой соединительной ткани с большим количеством тонкостенных кровеносных сосудов, а на периферии дефекта идет формирование зон хрящевой и костной ткани. Причем костная ткань формируется в виде зрелой кости с наличием остеонов типичного строения (таб.12).
Таблица 12
Тканевые соотношения в зоне регенерации через 1 месяц эксперимента
Группы Костная крошка Грануляци онная ткань Соедините льная ткань Новообразованная хрящевая ткань Новообразованная костная ткань
Контроль ная группа п=8 6,6±1,1 31,1±4,0 52,1±7,2 0 4,5±0,3
Опытная группа (с ФРЭС) п=8 0 5,3±0,6*^ 34,6±9,1* 15,8±3,3 43,11±12,0**
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (*р<0,05;** р<0,001) п- количество экспериментальных животных
Оценку площади сосудистого русла мы провели только в фокусах разрастания соединительной ткани в регенерате, поскольку хрящевая и костная ткань в силу своих анатомических особенностей содержит небольшое количество сосудов. Морфометрически измеряли площадь кровеносных сосудов, число сосудов на единицу площади соединительной ткани и коэффициент отношения площади кровеносных сосудов к площади соединительной ткани. В опытной группе животных определяется большая площадь кровеносных сосудов в зрелой соединительной ткани (таб. 13).
Таблица 13
Соотношение площади сосудистого русла в зоне соединительной ткани в регенерате через 1 месяц эксперимента
Группа Площадь сосудистого русла (мкм2) Сосудисто-тканевой коэффициент Число сосудов на ед площади сУгкани
Контрольная группа п=8 5,6±0,7 0,105±0,001 2,1±0,1
Опытная группа (с ФРЭС) п=8 43,2±3,5++ 0,937±0,002^ 8,4±0,9^
♦♦достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,001) п- количество экспериментальных животных
Таким образом, из таблицы видно, что в опытной группе, где использовали костный недеминерализованный коллаген, насыщенный ФРЭС площадь сосудистого русла достоверно выше, чем в контрольной группе без ФРЭС в 8 раз, сосудисто-тканевой коэффициент в 9 раз и число сосудов на единицу площади соединительной ткани в 4 раза, что подтверждается результатами статистической обработки (р<0,001).
Этот факт является ключевым в развитии конечных этапов регенераторного процесса - созревания грануляционной ткани с последующим формированием зрелой фиброзной ткани с наличием всех функционально-морфологических ее элементов (в частности, кровеносных сосудов), что обеспечивает формирование костной ткани через этап образования хрящевой ткани. Последовательность процессов соответствует физиологической полной регенерации (реституции), обеспечивая развитие новообразованной костной ткани в области костного дефекта. В то же время в группе контроля к концу первого месяца эксперимента в зоне костного дефекта формируется грубоволокнистая соединительная ткань в виде грубого рубца, содержащего небольшое количество кровеносных сосудов, что не только замедляет процесс регенерации, но и приводит к неполной репарации ткани (субституции), что снижает прочностные характеристики кости.
Таким образом, разработанный нами материал на основе костного недеминерализованного коллагена, содержащий ФРЭС, способствует процессу репаративной костной регенерации в области костных дефектов. Новая костная ткань формируется по механизму энхондрального окостенения. Также можно отметить, что полноценная репаративная регенерация костного дефекта при его заполнении разработанным материалом происходит без использования барьерных мембран. Это может быть обусловлено биологическими свойствами ФРЭС, который направляет процесс регенерации в сторону костной ткани.
Выводы
1. Получен новый биокомпозиционный материал для замещения костных дефектов на основе недеминерализованного костного коллагена, насыщенного ФРЭС, обладающий остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами и свойствами индукции неоангиогенеза.
2. Материал на основе костного недеминерализованного коллагена и ФРЭС обладает способностью индуцировать эндотелиальные клетки человека.
3. Экспериментально доказано, что материал на основе костного недеминерализованного коллагена и ФРЭС является биосовместимым и хорошо интегрирует в окружающие ткани при имплантации.
4. Материал на основе недеминерализованного коллагена и ФРЭС способен более эффективно индуцировать регенерацию костной ткани, по сравнению с немодифицированным коллагеновым матриксом, преимущественно за счет формирования кровеносного русла в зоне регенерации
Практические рекомендации
1. Для изучения эффективности репаративного остеогенеза наиболее информативной является экспериментальная модель с подсадкой изучаемых материалов в искусственно воспроизведенный костный дефект, а при изучении токсических свойств и биосовместимости - подсадка исследуемых препаратов под кожу и внутримышечно у экспериментальных животных.
2. При разработке новых биоматериалов для замещения костных дефектов целесообразно включать в их состав ФРЭС, как фактор оптимизации процессов репаративного остеогенеза.
3. Исследуемый костный недеминерализованный коллаген, насыщенный ФРЭС хорошо пропитывается кровью, плотно фиксируется в ране и обеспечивает сохранение ее объема в течение всего срока резорбции, может быть рекомендован для дальнейшего внедрения в практическое здравоохранение.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Губова, В.М. Перспективы использования фактора роста эндотелия сосудов (УЕСтР) для создания нового поколения костнопластических материалов / С.Ю.Иванов, А.А.Мураев, Е.В. Ларионов, В.Л. Астафьев // Сборник научных трудов X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». Саратов, 2010.- С. 78-80.
2. Губова, В.М. Перспективы использования морфогенов к ростовых факторов в составе костнопластических материалов для направленной
регенерации костной ткани / С.Ю.Иванов, А.А.Мураев, С.С.Ларин, Е.В. Ларионов // Ж. Российский вестник дентальной имплантологии.-2010.-№1(21).-С. 44-48.
3. Губова, В.М. Экспериментальное исследование особенностей регенерации костных дефектов, заполненных биоматериалами из недеминерализованного коллагена «Остеопласт-К», с использованием и без использования мембраны из недеминерализованного коллагена «Остеопласт» / С.Ю.Иванов, А.А.Мураев, А.Б.Зайцев, Н.Ф.Ямуркова, С.А.Мигура, И.Е.Янцен // Ж. Российский вестник дентальной имплантологии.-2010.-№2(22).-С. 66-71.
4. Губова, В.М. Экспериментальное исследование барьерной функции коллагенновой мембраны «Остеопласт», при заживлении костных дефектов / С.Ю. Иванов, А.А. Мураев, А.Б. Зайцев, Н.Ф.Ямуркова, С.А.Мигура, И.Е. Янцен // Современные технологии медицины.-2011.-№3.-С. 35-38
Подписано в печать 11.07.2011 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,0. Заказ № 246. Тираж 100 экз.
Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40
Оглавление диссертации Рябова, Валентина Михайловна :: 2011 :: Нижний Новгород
Список сокращений.
Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Механизмы формирования скелета: прямой и непрямой остеогенез
1.2. Репаративный остеогенез.
1.3. Роль микроциркуляторного русла в процессе остеогенеза.
1.4. Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС).
1.5. Направления в разработке костезамещающих материалов.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Методика получения биокомпозиционного костезамещающего материала, содержащего ФРЭС.
2.1.1. Получение ФРЭС.
2.1.2. Исследование методик конъюгации ФРЭС и недеминерализованного коллагена.
2.1.3. Оценка эффективности конъюгации недеминерализованного коллагена с ФРЭС.
2.1.4. Оценка токсичности недеминерализованного коллагена содержащего ФРЭС.
2.2. Культивирование клеточных линий и определение биологической активности ФРЭС в разработанном материале.
2.3. Методика экспериментальных исследований биосовместимости материала, насыщенного ФРЭС, у животных.
2.4. Методика экспериментальных исследований разработанного материала, насыщенного ФРЭС на регенерацию костной ткани.
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований.
3.1. Результаты оценки эффективности конъюгации недеминерализованного коллагена с ФРЭС.
3.2. Результаты оценки токсичности разработанного материала in vitro.
3.3 Результаты влияния костного коллагена, насыщенного ФРЭС, на культуру клеток.
3.4. Экспериментальные исследования биосовместимости материала на основе костного коллагена, насыщенного ФРЭС и его влияния на ангиогенез
3.5. Экспериментальные исследования влияния материала на основе костного недеминерализованного коллагена, насыщенного ФРЭС, на процесс заживления костных дефектов.
Введение диссертации по теме "Стоматология", Рябова, Валентина Михайловна, автореферат
Состояние вопроса
В практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для заполнения; дефектов, возникающих после удаления зубов, опухолей и опухолеподобных образований, с целью предотвращения возможных осложнений, а также для ускорения: регенерации костной ткани используются различные биогенные и синтетические материалы (Бслозеров М.Н., 2003; Папин A.M., 2004; Ленина С.А. и др., 2004; Иванов С.Ю., 2004).
В настоящее время ведется поиск и разработка новых биологических и синтетических агентов, добавление которых в имплантируемый? костезамещающий материал будет способствовать улучшению' микроциркуляции- в области операции; ускорению прорастания, сосудов и репаративной регенерации; костной, ткани; в; месте дефекта (Германов B.F. и др., 2006; Кирилова H.A. и др., 2007; Володина Д.Н. и др., 2008; Трунин Д.Л. и др., 2008). . .
Ранее; было показано;. что насыщение остеопластических биокомпозиционных; материалов незаменимой аминокислотой L-аргинип, являющейся донором оксида озота NO, стимулирует неоангиогенез в зоне реконструкции (Зефиров: A.JI;, 2001; Каменский A.A., 2002; Смешко Н.В., 2009). ' ,
Большой интерес представляют исследования иностранных авторов; посвященные биологической роли фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС, от англ. vascular endothelial growth factor - VEGF) в регенерации костной ткани (Gerber Н.Р;, 1999; Zfelzer Е., 2002; Maes С., 2004).
Доказано, что ФРЭС может синергично взаимодействовать; с остеогенными протеинами, такими как ВМР4, стимулируя костеобразование и заживление кости увеличивая мобилизацию клеток, пролонгируя их жизнеспособность и индуцируя ангиогенез (Deckers М.М. и др., 2002). Также было показано, что активность ФРЭС важна для ВМР2-индуцированного костеобразования. ФРЭС увеличивает ВМР2-индуцированное костеобразование и регенерацию за счет стимулирования ангиогенеза. Взаимодействие ФРЭС, ВМР2 и ВМР4 имеет различные, пока еще не до конца изученные молекулярные механизмы (Рег^:Н., 2005).
Таким: образом, перспективными является; создание новых комбинированных костезамещающих материалов, обладающих наряду с остеин ду ктивны м и и остеокондуктивными свойствами; способностью индуцировать ангиогенез. . . ; .
Цель исследования
Провести;шуЫго ипп-угуо¡исследования!нового биокомпозиционного; материала- содержащего фактор1 роста эндотелия, сосудов для оценки; его эффективности при замещении костных дефектов.
Задачи исследования:
Г. Разработка методики получения» биокомпозиционного костезамещающего материала на основе костного недеминерализованного коллагена, насыщенного факторомфоста эндотелия сосудов;
2., Исследование влияния нового биокомпозиционного материала• насыщенного фактором роста эндотелия сосудов, на культуру клеток;
3. Изучение в- эксперименте на животных биосовместимости разработанного материала.
4: Исследование влияния разработанного материала на регенерацию костной ткани в эксперименте на животных.
Научная; новизна?
В результате проведенных работ получен новый биокомпозиционный материала, содержащий активный фактор роста эндотелия сосудов.
Впервые разработан нетоксичный костезамещающий материал' на основе костного,недеминерализованного коллагена в композиции с фактором, роста; эндотелия* сосудов, , который, обладает остеоиндуктивными, остеокондуктивными свойствами и свойствами индуктора неоангиогенеза.
Впервые в эксперименте показано, что использование бйоматериала, насыщенного фактором роста эндотелия сосудов, для замещения костных дефектов увеличивает число кровеносных сосудов в регенерате на единицу площади соединительной ткани в 4. раза, а площадь сосудистого русла в 8 раз.
Практическая значимость
Экспериментальными исследованиями обоснована и; подтверждена эффективность использования: костезамещающего материала на основе недеминерализованного коллагена^, насыщенного • фактором роста эндотелия, сосудов- для заполнения костных,дефектов; возникающие при хирургических вмешательствах в челгастно-л ицевой области.
Публикации;
Результаты работы опубликованы в 4 печатных работах, из них 3 — в журналах рецензируемых ВАК РФ: ' ,
Положения, выносимые на защиту
1. Улучшение остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств биокомпозиционного материала; материал; на, основе недеминерализованного коллагена может быть достигнуто за счет включения в. его состав фактора; роста эндотелия сосудов.
2. Предложенный материал, улучшает регенерацию костной ткани и формирование сосудистого русла ш у/уо.
Апробация работы;
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на X Всероссийская конференция «Новые технологии в стоматологии- и имплантологии» доклад - «Современные биокомпозиционные материалы для направленной регенерации костной ткани» (27.05.2010, г. Саратов), на межкафедральном; заседании, а также на проблемной; комиссии, НижГМА (29.04.2011).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из введения и следующих глав: обзора литературы, материала и методов исследования, заключения, выводов. Указатель литературы включает 244 источника, из них отечественных 45, зарубежных 199. Диссертация иллюстрирована 47 рисунками, содержит 19 таблиц.
Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка нового биокомпозиционного материала, содержащего фактор роста эндотелия сосудов, для замещения костных дефектов (экспериментальное исследование)"
Выводы
1. Получен новый биокомпозиционный материал для замещения костных дефектов на основе недеминерализованного костного коллагена, насыщенного ФРЭС, обладающий остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами и свойствами индукции неоангиогенеза.
2. Материал на основе костного недеминерализованного коллагена и ФРЭС обладает способностью индуцировать эндотелиальные клетки человека.
3. Экспериментально доказано, что материал на основе костного недеминерализованного коллагена и ФРЭС является биосовместимым и хорошо интегрирует в окружающие ткани при имплантации.
4. Материал на основе недеминерализованного коллагена и ФРЭС способен более эффективно индуцировать регенерацию костной ткани, по сравнению с немодифицированным коллагеновым матриксом, преимущественно за счет формирования кровеносного русла в зоне регенерации
Практические рекомендации
1. Для изучения эффективности репаративного остеогенеза наиболее информативной является экспериментальная модель с подсадкой изучаемых материалов в искусственно воспроизведенный костный дефект, а при изучении токсических свойств и биосовместимости - подсадка исследуемых препаратов под кожу и внутримышечно у экспериментальных животных.
2. При разработке новых биоматериалов для замещения костных дефектов целесообразно включать в их состав ФРЭС, как фактор оптимизации процессов репаративного остеогенеза.
3. Исследуемый костный недеминерализованный коллаген, насыщенный ФРЭС хорошо пропитывается кровью, плотно фиксируется в ране и обеспечивает сохранение её объема в течение всего срока резорбции, может быть рекомендован для дальнейшего внедрения в практическое здравоохранение.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Рябова, Валентина Михайловна
1. Абдуллаев Ш.Ю., Архипова М.Х. Использование новых биологически совместимых материалов при восстановлении дефектов челюсти // Стоматология; -1999. №3. - С. 37-38.
2. Базикян Э.А., Смбатян Б.С. Восстановление костной ткани методом пересадки костных блоков // Клиническая стоматология. —М>. -2008. -№4;-с.28-зз. • ■ . . . ■ '
3. Белозеров М.Н. Оценка осгеопластических свойств различных биокомпозиционных материалов для заполнения дефектов челюстей. Дис. . канд. мед. наук. — М., 2004., 146 с:
4. Белоус A.M., Малахов В.А. Клеточные механизмы сосудистой патологии (обзор литературы) // Журн. АМН Украины. — 1998. 4, №4. -С. 581-596.
5. Берлянд A.C. и др. Физико- химические и биологические свойства гидроксиапатита фирмы «Поликом». Новое в стоматологии. Специальный выпуск.- 1992.-N 3.-С.9-1 Г.
6. Ботабаев Б.К. Влияние остеоиндукторов на репарацию костной ткани при старении // Успехи геронтологии. -2007. Т. 20. -№ 4. -С. 106-108.
7. Воложин А.И., Попов В.К., Краснов А.П. и др. Физико- механические и морфологические характеристики новых композитов* на основе сверхвысокомолекулярного полиэтилена и гидроксиапатита.- «Новое в стоматологии», 1999.-N 8.- С.35-43.
8. Ганонг В.Ф. Физиология человека: Учебник. — Львов: БаК, 2002. С. 784.
9. Германов В.Г., Кавалерский Г.М., Чернашина З.А., Семенов В.А. Костно-пластическая хирургия: от костного трансплантата до современных биокомпозиционных материалов// Медицинская помощь. -М., -2006,- №4. С.16-18.
10. Григорьян A.C., Пулатова H.A., Воложин А.И., Истранов Л.П. Динамика заживления костных дефектов при имплантации в нихкомплексов коллагена и гидроксиапатита (эксперементально-морфологическое исследование// Стоматологи . М., -1996,- №5. - С. 13-16.
11. Григорьян A.C., Воложин А.И., Агапов B.C., Белозёров М.Н., Дробышев А.Ю. Остеопластическая'эффективность различных форм гидроксиапатита по данным* эксперементально-морфологического исследования // Стоматология. 2000. - № 3. - С. 4-8.
12. Григорьянц Л.А., Безруков B.Ml, Зуев В.П., Панкратов A.C. Остеорепарация в полостных костных дефектах под воздействием гидроксиапатита ультравысокой' дисперсности // 4 Российский национальный конгресс "Человек и лекарство"-М. -1997.- С. 36>
13. Гришко О.П. Разработка и исследование составов лекарственных препаратов на основе гидроксиапатита // Автореф. дис. канд. фарм. наук.-М. 1994.-20с.
14. Дмитриева J1.A., Труханова Ю.Р., Ревазова З.Э:,Зюзина Т.В. Оптимизаторы репаративного остеогенеза на этапах реконструктивных вмешательств на пародонте // Пародонтология. -2005.- №2. -С. 56-59.
15. Дробышев А.Ю.Эксперементальное обоснование и практическое' применение отечественных биокомпозиционных материалов при. костно-восстановительных операциях на челюстях // Дисс. на соис. уч. степ. док. мед. наук., М. -2001-, 237с.
16. Зефиров А.Л., Халиуллина P.P., Анучин A.A., Яковлев A.B. Влияние эндогенного оксида азота на функцию нервно-мышечного 'синапса // росс, физиол. журн. им. И.М*. Сеченова. -2001. №4. - С. 499-506.
17. Иванов С.Ю., Бизяев А.Ф., Ломакин* М.В., Панин A.M. Клинические результаты использования различных костнопластических материалов при синус-лифтинге // Ж. Новое в стоматологии: -1999. № 5. - С. 5153.
18. Иванов С.Ю., Риллер Л.И., А.Ф.Бизяев и др. Новое поколение биокомпозиционных материалов для замещения дефектов костной ткани // Ж. Новое в стоматологии. -1999: № 5. - С. 47-50.
19. Иванов С.Ю., Панин A.M., Володина Д.Н., Разработка биоматериалов для остеопластики на основе коллагена костной ткани. // Клиническая стоматология.-2005 №4.- С. 108-111.
20. Иванов С.Ю., Панин A.M., Кузнецов Г.В. Изучение свойств остеопластических материалов «Биоматрикс» и «Алломатрикс
21. Имплант» в эксперименте // Материал V Международнойконференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов // Санкт-Петербург. -2002. -С. 66
22. Истрапов Л.П. Коллаген и его применение в медицине // М.: Медицина,1976.- С. 228
23. Кирилова H.A., Фомичев Н.Г., Подорожная В.Т., Трубников В.И. Новые виды, материалов для костной пластики в свете современных представлений) о костных трансплантатах // Хирургия позвоночника. -2007. -№2. -С.66-70.
24. Кирилова H.A., Подорожная В.Т., Легостаева Е.В., Шаркеев Ю.П., Уваркин П.В., Аронов A.B. Костнопластические биоматериалы и их физико-механические свойства // Хирургия позвоночника. -2010. -№ 1. -С. 81-87.
25. Кузнецов С.Л., Мушкамбаров H.H. Гистология, цитология и эмбриология. -М, ООО «МИА», -2007.- С.163-175
26. Курдюмов С.Г. Гидроксиапол и колапол: применение в стоматологической хирургической практике.//Военно-медицинский журнал., -1997-,№6, С. 48-49.
27. Лекишвили М.В., Касымов И.А., Юрасова Ю.Б.,Васильев М.Г., Панкратов А.С Аллопластика как метод восстановления костной ткани // Технологии живых систем. -2006. Т.З. -№ 2. —С.3-8.
28. Леонтьев В.К., Воложин А.И., Андреев Ю.Н., Курдюмов С.Г., Агапов B.C., Воложина С.А., Пулатова Н.А, Алимирзоев Ф.А. Применение новых препаратов гидроксиапола и колапола - в клинике // Стоматология. - 1995. -№5. -С. 69-71.
29. Ревазова З.Э., Катаева Т.А. Клиническое применение биоматериала «Остеопласт-К» в лечении деструктивных форм периодонтита // Эндодонтия Today. -2007. -№ 1. -С. 25-26.
30. Смешко Н.В. Разработка биокомпозиционного материала, содержащего L- аргинин, для замещения костных дефектов при хирургическихстоматологических вмешательствах. Дис.канд. мед. наук. —М.,2009., 127с.
31. Тер-Асатуров Г.П., Рябов А.Ю., Лекишвили М.В., Юрасова Ю.Б. Экспериментальная сравнительная оценка некоторых биоматериалов, используемых в российской челюстно-лицевой хирургии // Российский стоматологический журнал. -2009. -№ 4. —С. 11-12.
32. Трофимов В.В., Клименов В.А., Казимировская В.Б., Мансурова Л.А. Исследование биологической совместимости гидроксиапатита // М. — 1996. -№5. — С. 20-22.
33. Трунин Д.А., Волова Л.Т., Беззубов А.Е., Кириллова В.П., Белозерцева Е.А. Особенности регенерации костной ткани при использовании различных остеопластических материалов в эксперименте // Стоматология. -2008. Т.87. -№ 5. -С. 4-8.
34. Хэм А., Кормак Д. Гистология. -М.: Мир, 1983. -Т.З. -С. 163-273.
35. Шамсудинов А.Х. Сравнительная биохимическая и морфологическаяоценка свойств деминерализованного в различных растворах костного матрикса и его применение для костной пластики: Дисс. канд. мед. наук.- М., 1984,- 180С.
36. Ярошкевич A.Bi, Осипян З.М., Кражан С.М. и др. Особенности остеоиндуктивного процесса при его стимуляции посредством введения гидроксиапатита // В сб.: Актуальные вопросы медицины. -Ставрополь. -1996. С. 9-10.
37. Ярошкевич А.В., Осипян З.М., Иванов И.В'. и др. Зависимость интенсивности остеогенеза от степени интеграции имплантируемого гидроксиапатита' // В сб.: Актуальные вопросы медицины. -Ставрополь. 1996. -С. И-12.
38. Aharinejad S, Marks SC Jr, Bock P, Mason-Savas A, MacKay CA, Larson EK, Jackson ME, Luftensteiner M, Wiesbauer E (1995) CSF-1 treatment promotes angiogenesis in the metaphysis of osteopetrotic (toothless, tl) rats. Bone 16: 315-324.
39. Alagiakrishnan K., Juby A, Hanley D; Tymchak W, Sclater A (2003) Role of vascular factors in osteoporosis. J. Gerontol A Biol Sci Med Sci 58: 362366.
40. Alini M, Carey D, Hirata S, Grynpas MD, Pidoux I, Poole AR (1994)
41. Cellular and matrix changes before and at the time of calcification» in the growth plate studied in vitro: arrest of type X collagen synthesis and net loss of collagen when calcification is initiated. J Bone Miner Res 9: 10771087.
42. Antonov E.N, Bagratashvili VN, Whitaker MJ, Barry JJA, Shakesheff KM, Konovalov AN, Popov VK, Howdle SM (2005) Three-dimensionalbioactive and biodegradable scaffolds fabricated by surface-selective laser sintering. Advanced Materials 17: 327-330.
43. Aspenberg P., Thorngren K.G., Lohmander L.S.( 1991) Dose dependent stimulation of bone induction by basic fibroblast growth factor in rats. Acta Orthop Scand 62: 481-484
44. Barnes GL, Kostenuik PJ, Gerstenfeld* LC, Einhorn TA (1999) Growth factor regulation of fracture repair. J Bone Miner Res 14: 1805-1815.
45. Baron J>, Klein KO, Yanovski JA, Novosad JA, Bacher JD, Bolander ME, Cutler GB Jr (1994).Induction of growth plate cartilage ossification by basic fibroblast growth factor. Endocrinology 135:, 2790-2793.
46. Bauer TW, Muschler GF (2000) Bone graft materials. An overview of the basic science. Clin Orthop Relat Res 371': 10-27.
47. Bergers G, Brekken R, McMahon G, VuTH, Itoh T, Tamaki K, Tanzawa K, Thorpe P, Itohara S, Werb Z, Hanahan D (2000) Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nat Cell'Biol 2: 73744.
48. Bilezekian JP, Raisz LG, Rodan GA (eds). Academic Press, SanDiego. pp.3.24. Marotti G, Zallone AZ (1980) »Changes in the vascular network during the formation of Haversian systems. Acta Anat (Basel) 106: 84-100.
49. Bluteau G, Julien M, Magne D, Mallein-Gerin F, Weiss P, Daculsi G, Guicheux J (2007) VEGF and VEGF receptors are differentially expressed in chondrocytes. Bone 40: 568-576.
50. Bordenave L, Georges A, Bareille R, Conrad'V, Villars F, Amedee J (2002)
51. Human bone marrow endothelial cells: a new identified source of B-typeinatriuretic peptide. Peptides 23: 935-940.
52. Bostrom MP, Asnis P (1998) Transforming growth factor beta in fracture repair. Clin Orthop Relat Res 355S: S124-S131.
53. Boyne P.J. (1979) Transplantation, implantation and grafts. Dent Clin North Am 15: 433-453.
54. Brandi M.L., Collin-Osdoby P (2006) Vascular biology and the skeleton. J Bone Miner Res 21: 183-192.
55. Brandi M.L., Crescioli G, Tanini A, Frediani U, Agnusdei D, Gennari C (1993) Bone endothelial cells as, estrogen targets. Calcif Tissue Int 53: 312317.
56. Brown R. et al( 1997) Strategies for cell engineering in tissue repair. Wound Rep Req., 5; 212.
57. Bruck, S.D., Mueller E.P. (1989) Reference standards for implantable materials: problems and needs. Med. Prog. Technol. 15: 5-20.
58. Bruder S.( 1998) The effect Implants Loaded Auotologous Mesenchimal' Stem Cells on the Healing of Canine Segmental Bone Defects. J. Bone Joint Surg. 80: 985-96.
59. Bucay N, Sarosi T, Dunstan CR, Morony S, Tarpley J, Capparelli C, Scully S, Tan- HL, Xu W, Lacey DL, Boyle WJ, Simonet WS (1998) osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterialf calcification. Genes Dev 12: 1260-1268.
60. Burkus J.K., Ganey TM, Ogden JA (1993) Development of the cartilage canals and the secondary center of ossification in the distal chondroepiphysis of the prenatal'human femur. Yale J Biol Med 66: 193202.
61. Carano R.A., Filvaroff EH (2003) Angiogenesis and bone repair. Drug Discov Today 8: 980-989.
62. Carlevaro M.F., Cermelli S, Cancedda R, Descalzi CF (2000) Vascular endothelial growth factor (VEGF) in cartilage neovascularization andchondrocyte differentiation: auto-paracrine role during endochondral bone formation. J Cell Sei 113: 59-69.
63. Carmeliet P (2003) Angiogenesis in health and disease. Nat Med 9: 653-660.
64. Carmeliet P, Collen D (2000) Molecular basis of angiogenesis. Role of VEGF and VE-cadherin. Ann N Y Acad Sei 902: 249-262.
65. Chang P.C., Liu BY, Liu CM, Chou HH, Ho MH, Liu HC, Wang DM, Hou LT (2007) Bone tissue engineering with novel rhBMP2-PLLA composite scaffolds. J Biomed Mater Res A 81: 771-780.
66. Chen W.J., Jingushi S, Aoyama I, Anzai J, Hirata G, Tamura M, Iwamoto Y (2004) Effects of FGF-2 on metaphyseal fracture repair in rabbit tibiae. J Bone Miner Metab 22: 303-309.
67. Cheung C (2005) The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg 22: 631-641.
68. Childs S.G. (2005) Osteonecrosis: death of bone cells. Orthop Nurs 24: 295301.
69. Chu T.M., Warden SJ, Turner CH, Stewart RL (2007) Segmental bonefregeneration using a load-bearing biodegradable carrier of bone morphogenetic protein-2. Biomaterials 28: 459-467.
70. Chu T.W., Wang ZG, Zhu PF, Jiao WC, Wen JL, Gong SG (2002) (Effect of vascular endothelial growth factor in fracture healing). Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai, Ke Za Zhi 16: 75-78.
71. Clarke et al., 2007; Clarke SA, Hoskins NL, Jordan GR, Marsh DR (2007) Healing of an ulnar defect using a proprietary TCP bone graft substitute, JAX, in association with autologous osteogenic cells and growth factors. Bone 40: 939-947.
72. Clemens T.L. (1996) Vasoactive Agents and Bone metabolism. In: Principles of Bone Biology. Bilezekian JP, Raisz LG, Rodan GA (eds). Academic Press, San Diego.pp. 597-605.
73. Colnot C, Romero DM, Huang S, Helms JA (2005) Mechanisms of action of demineralized bone matrix; in the repair, of cortical: bone defects. Clin Orthop Relat Res 435:69-78. ■ ;
74. Colton C.K. (1995) Implantable biohybrid artificial- organs. Cell Transplant 4:415-436. ''■■
75. Coultas L., Chawengsaksophak K, Rossant J (2005) Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature 438: 937-945.
76. Domaschke HC, Gelinsky M1^ Burmeister B, Fleig RI, Hankevlv Reinstorf A, ' Pompe W, Rosen-Wolff A (2006) In vitro ossificatiöns and' remodeling of mineralized collagen Iscaffolds. Tissue Eng 12: 949-958.
77. Effect on Endothelial Gelli Morphogenesis-Biomacromolecules 2008; 9; 2929-293 6, ' .'/ \'-.y,:95. . Drivdahl R.H:, Howard G.A., Baylink D;J.(;l982) Extracts of bone contain a potent regulator of bone fonnation: Biochim Biophys Acta 714:26-33.
78. Ennett et. al., 2006; Ennett AB, Kaigier D, Mooney .DJ (2006) Temporally regulated delivery of VEGF in vitro and in vivo. X Biomed Mater Res A 79::176.184.' ' ' : ',
79. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J (2003) The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 9: 669-676.
80. Findlay D.M., Haynes DR (2005) Mechanisms of bone loss in rheumatoid arthritis. Mod Rheumatol 15: 232-240.• v 90
81. Geiger.F., C. Eckhardt, H. Bertram, T. Hennig;.W. Richter, H.G: Simank., Stimulation of bone formation by transfer of ph VEGF in! a gene activated1 matrix. European Cells and Materials Vol. 7. Suppl. 1, 2004 (page 29).
82. Gerber et al., 1999 Gerber IIP, Vu Til, Ryan AM, Kowalski J, Werb Z, FeiTara N (1999) VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nat Med 5: 623-628.
83. Globus R.K., Patterson-Buckendahl P, Gospodarowicz D (1988) Regulation of bovine bone cell proliferation by fibroblast growth factor and transforming growth factor beta. Endocrinology 123: 98-105.
84. Glowacki J (1998) Angiogenesis in fracture repair. Clin Orthop Relat Res 355S: S82-S89.
85. Glimcher M.J.(1987) The nature of the mineral component of bone and the mechanism of calcification. Instr Course Lect 36:49-69.
86. Grellier ef al., 2009 Grellier M, Ferreira-Tojais N, Bourget C, Bareille R, Guillemot F, Amedee J (2009) Role of vascular endothelial growth factor in the communication between human osteoprogenitors and endothelial cells. J Cell Biochem 106: 390-398.
87. Goldberg V.M., Stevenson S., Shaffer J.W.(1991) Biology of Autografts and Allografts. In Friedlaender GE and Goldberg VM (eds): Bone and Cartilage Allografts. Park Ridge, IL, American Academy of Orthopaedic Surgeons, 311.
88. Haigh J.J; Gerber HP, Ferrara N, Wagner EF (2000) Conditional^ inactivation of VEGF-A in areas of collagen2al expression results in embryonic lethality in the heterozygous state. Development 127: 14451453.
89. Hall A.P., Westwood-FR, Wadsworth PF (2006) Review of the effects of anti-angiogenic compounds on the epiphyseal growth plate. Toxicol Pathol 34: 131-147.
90. Haller A (1763) Experimentorum; de ossiem formatione. 2: 400 Francisci Grasset.
91. Hayek A, Culler FL, Beattie GM, Lopez AD, Cuevas P, Baird A (1987) An in vivo model for study of the angiogenic effects of basic fibroblast growth factor. Biochem Biophys Res Commun 147: 876-880.
92. Horner A, Bishop NJ, Bord S, Beeton C, Kelsall AW, Coleman N, Compston JE (1999) Immunolocalisation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human neonatal growth plate cartilage. J/Anat 194: 519524.
93. Horton W.A. (1990) The biology of bone growth. Growth Genet Horm 6: 13.
94. Hou L.T., Liu CM, Liu BY, Chang PC, Chen MH, Ho MH, Jehng SM, Liu HC (2007) Tissue engineering bone formation in novel recombinant human bone morphogenic protein 2-atelocollagen composite scaffolds. J Periodontol 78: 335-343.
95. Huang et al., 2005; Huang YC, ICaigler D, Rice KG, Krebsbach PH, Mooney DJ (2005) Combined angiogenic and osteogenic factor delivery enhances bone marrow stromal cell-driven bone regeneration. J Bone Miner Res 20: 848-857.
96. Huang Y.C., Kaigler D, Rice KG, Krebsbach PH, Mooney DJ (2005) Combined angiogenic and osteogenic factor delivery enhances bone marrow stromal cell-driven bone regeneration. J Bone Miner Res 20: 848-857.
97. Huang Y.C., Simmons C, Kaigler D, Rice KG, Mooney DJ (2005) Bone regeneration in a rat, cranial defect with delivery of PEI-condensed plasmid DNA encoding for bone morphogenetic protein-4 (BMP-4). Gene Ther 12: 418-426.
98. Hunter J (1794) Treatise on the Blood, Inflammation and' Gunshot Wounds. Eds George Nicol. London. Hunziker EB (1994) Mechanism of longitudinal bone growth and its regulation by growth plate chondrocytes. Microsc Res Tech 28: 505-519.
99. Hench L. Bioceramics // S.Amer. Ceram Soc. 1998.Vol.81, №7. P.17051728.
100. Imhof B.A., Dunon D (1997) Basic mechanism of leukocyte migration. Horm Metab Res 29: 614-621.
101. Inui K., Maeda M, Sano A, Fujioka K, Yutani Y, Sakawa A, Yamano Y, Kato Y, Koike T (1998) Local application of basic fibroblast growth factorminipellet induces the healing of segmental bony defects in rabbits. Calcif Tissue Int 63: 490-495.
102. Ivkovic S., Yoon BS, Popoff SN, Safadi FF, Libuda DE, Stephenson RC, Daluiski A, Lyons KM (2003) Connective tissue growth factor coordinates
103. Jain R.K. (2003) Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med 9: 685i693.
104. Jansen J.A., Vehof JW, Ruhe PQ, Kroeze-Deutman H, Kuboki Y, Takita H, Hedberg EL, Mikos AG (2005) Growth factor-loaded scaffolds for bone engineering. J Control Release 101: 127-136.i
105. Jeon O., Song SJ, Kang SW, Putnam AJ, Kim BS (2007) Enhancement of ectopic bone formation by bone morphogenetic protein-2 released from a heparinconjugatedpoly(L-lactic-co-glycolic acid) scaffold. Biomaterials 28: 2763-2771.
106. Johnell O (1997) The socioeconomic burden of fractures: today and in the 21st century. Am J Med 103:20S-25S.
107. Kaigler D., Wang Z, Horger K, Mooney DJ, Krebsbach PH (2006a) VEGF scaffolds enhance angiogenesis and bone regeneration in irradiated osseous defects. J Bone
108. Kaigler et al., 2006 Kaigler D, Wang Z, Horger K, Mooney DJ, Krebsbach PH (2006) VEGF scaffolds enhance angiogenesis and bone regeneration in irradiated osseous defects. J Bone Miner Res 21: 735-744.
109. Kanczler J.M., Oreffo R.O.C. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. — European Cells and Materials Vol.15 2008 (pages 100-114).
110. Kanczler J.M., Millar TM, Bodamyali T, Blake DR,Stevens CR (2003) Xanthine oxidase mediates cytokineinduced, but not hormone-induced bone resorption. Free Radic Res 37: 179-187.
111. Jarcho M. Tissue cellular; and; subcellular, events at a bone-ceramic hydroxilapatite interface.J.Bioeng. ( 1977) 1;79.
112. KawaguchiiH-,.Kurokawa T, Hanada K, Hiyama Y, Tamura M, Ogata E, . . Matsumoto T (1994) Stimulation of fracture repair by recombinant humanbasic: fibroblast growth factor in normal. and streptozotocin-diabetic rats. ' Endocrinology 135: 774-781.
113. Kempen et al;, 2009 Kempcn DH, Eu L, Heijink A, Hefferan TE, Greemers EB; MaranvAv;YaszemskivMJtDhert WJA (2009>Effect oftlocahsequential; VEGF and BMP-2 delivery on ectopic and orthotopic bone regeneration; Biomaterials 30: 2816- 2825. '-. •
114. Koenigl U., Guenther A., Kreft O et al Modulation of VEGF Release from Functionalized:Bbne: Graft MaterialiEuropean Cells and^Materials Vol: 14. Suppl. 1,2007 (page 71). • .
115. Koike. N., Fukumura D, Gralla O, Au P, Schechner JS^ Jain. RK2004)Tissue engineering: creation: of long-lasting blood vessels. Nature 428: 138-139. ■
116. Komatsu and Hadjiargyrou, 2004; Komatsu DE, Hadjiargyrou; M (2004) Activation of the transcription: factor HIF-1 and its- target genes, VEGF, HO-l, iNOS, during fracture repair. Bone 34: 680-688.
117. Lu Q, Ganesan K, Simionescu DT, Vyavahare NR (2004) Novel porous aortic elastin and collagen scaffolds for tissue engineering; Biomaterials; 25: 5227-5237.
118. Lubiatowski P., Kruczynski J, Gradys A, Trzeciak T, Jaroszewski J (2006) Articular cartilage repair by means of biodegradable scaffolds. Transplant Proc 38: 320-322.
119. Madeddu P (2005) Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration. Exp Physiol 90:315-326.
120. Marks S.C., Hermey DC (1996) The: Structure: and Development of Bone.1.: Principles of Bone Biology.
121. Masudä S; Vascular; endothelials growths factor enhances vascularisation in microporous smalltcalibretpolyurethane grafts^ ASAI0 J, 43:530-34^1997;
122. Miner Res 21: 735-744. Kaigier D, Krebsbach PH, Wang Z, West ER, Horger K, Mooney DJ (2006b). Transplanted endothelial cells enhance orthotopic bone regeneration. J Dent Res 85: 633- 637.
123. Miller E., Gay S, Collagen structure and function in wound healing: biochemical and clinical aspects. Cohen K, Editor, Saunders, Philadelphia 1992 ; p 130.
124. Montero A., Okada Y, Tomita M, Ito M, Tsurukami H, Nalcamura T, Doetschman T, Coffin JD, Hurley MM (2000) Disruption of the fibroblast growth factor-2 gene results in decreased bone mass and bone formation. J Clin Invest 105: 1085-1093.
125. Montesano R., Vassalli JD, Baird A, Guillemin R, Orci L (1986) Basic fibroblast growth factor induces angiogenesis in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 7297-7301.
126. Montesano R., Vassalli JD,N Baird A, Guillemin R, Orci L (1986) Basic fibroblast growth factor induces angiogenesis in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 7297-7301».
127. Moses M.A., Sudhalter J, Langer R (1990) Identification of an inhibitor of neovascularization from cartilage. Science 248: 1408-1410.
128. Murphy et al., 2004' Murphy WL, Simmons CA, Kaigler D, Mooney DJ (2004) Bone regeneration viaa mineral' substrate and1 induced» angiogenesis. J Dent Res 83: 204-210.
129. Murphy W.L., Peters MC, Kohn DH, Mooney DJ (2000) Sustained release of vascular endothelial growth factor from mineralized poly(lactide-co-glycolide) scaffolds for tissue engineering. Biomaterials 21: 2521-2527.
130. Nagai H., Aolci M (2002) Inhibition of growth plate angiogenesis andendochondral ossification with diminished expression of MMP-13 in hypertrophic chondrocytes in FGF-2-treated rats. J Bone Miner Metab 20: 142-147.
131. Nakagawa M., Kaneda T, Arakawa T, Morita S, Sato T, Yomada T, Hanada K, Kumegawa M, Hakeda Y (2000) Vascular endothelial growth factor (VEGF) directly enhances osteoclastic bone resorption and survival of mature osteoclasts. FEBS Lett 473: 161-164.
132. Nakamura T;, Hanada, K, Tamura M, SHibanushi T, Nigi H, Tagawa M,
133. Greffo R.G., Triffitt JT (1999) Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics. Bone 25(2suppl): 5S-9Si !
134. Orth M.W. (1999) The regulatiomof growth plate cartilage turnover. J Anim Sci 77 Suppl 2: 183-189. ; .188; Parfitt AM (2000) The mechanism of coupling: a role for the vasculature. Bone 26: 319-323.
135. Patel et al., 2008 Patel ZS, Ueda II, Yamamoto M,.Tabata Y, Mikos AG (2008) In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm ' Res 25: 2370- 2378.
136. Parsons J.( 1988) Bioceramics: Materials Characteristics Versus. Ann. N Y Acad. Sciences v.523 Jun.10. p.l90.0steoconductive Composite Grouts for Ortopedic Use.
137. Peng H., Usas A, Olshanski A, Ho AM, Gearhart B, Cooper GM, Huard J (2005) VEGF improves, whereas sFltl inhibits, BMP2-induced bone formation and bone healing through modulation of angiogenesis. J Bone Miner Res 20: 2017-2027.
138. Peng H., Wright V, Usas A, Gearhart B, Shen HC, Cummins J, Huard J (2002) Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell-expressed VEGF and bone morphogenetic protein-4. J Clin Invest 110: 751-759.
139. Pufe T., Petersen W, Tillmann B, Mentlein R (2001) The splice variants VEGF121 and VEGF 189 of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor are expressed in osteoarthritic cartilage. Arthritis Rheum 44:1082-1088.
140. Pun S., Dearden RL, Ratkus AM, Liang H, Wronski TJ (2001) Decreased bone anabolic effect of basic fibroblast growth factor at fatty marrow sites in ovariectomized rats. Bone 28: 220-226.
141. Reddi A.H., Weintroub S., Muthukumaran N. (1987) Biological principles of bone induction. Orthop ClinN Amer 18:207-212.
142. Reddi A.H.( 1998) Role of morphogenetic proteins in skeletal tissue engineering and regeneration. Nat Biotechnol. Mar; 16 (3):247-52.
143. Risau W., Drexler H, Mironov V, Smits A, Siegbahn A, Funa K, Heldin CH (1992) Platelet-derived growth factor is angiogenic in vivo. Growth Factors 7: 261-266.
144. Ripamonti U., Reddi A.H.(1992) Growth and morphogenetic factors in boneinduction:role of!osteogenin andi related bone morphogenetic proteins in craniofacial and periodontal bone repair. Grit Rev Oral Biol Med 3 : 1-14.
145. Rhinelander F.W. (1974) Tibial blood supply in relation to fracture healing. Glin Orthop Relat Res-105: 34-81.
146. Rodan S.B., Wesolowski G, Thomas KA, Yoon K, Rodan GA. (1989) Effects; of acidic and basic fibroblast growth: factors; on osteoblastic cells. Connect Tissue Res 20: 283-288.
147. Rosier R.N., O'Keefe RJ, Hicks DG (1998) The potential; role of transforming growth factor beta in fracture healings, Clin; Orthop;»Relat Res 355S:. S294-S300.
148. Rossanf J^ HowardyE (2002) Signaling pathways:inf vasculardevelopment. Annu Rev Cell Dev Biol 18: 541 -573. ' .
149. Ryan A.M., Eppler DB, Hagler KE, Bmner RH, Thomford PJ, Hall RL,, Shopp* GM, O'Neill CA p999)s Breclinicali safety evaluation of rhuMAbVEGF; ans antiangiogenichiimanizedimonoclonaliantibody. Toxicolt Pathol^27:78-86: . '
150. Sachlos E., Czernuszka JT (2003):Making tissue• engineering scaffolds^work. Review: the applications of solid freeform fabrication technology to: the production of tissue engineering, scaffolds. Eur Cell Mater 5: 29-39.
151. Ryan A.M., Eppler DB, Hagler KE, Bruner RH; Thomford PJ, Hall RL, Shopp GM, O'Neill CAv (1999) Preclinical safety evaluation? of rhuMAbVEGF, an atitiangiogenic humanized monoclonal antibody. Toxicol Pathol 27: 78-86.
152. Saijo M., Kitazawa R, Naltajima M, Kurosaka M, Maeda S, Kitazawa S (2003) Heparanase mRNA expression during fracture repair in mice. Histochem Cell Biol 120: 493-503.
153. Storkebaum E:, Carmeliet P(2004)VEGF:a critical player in; neurodegeneration. J Clin Invest 113: 14-18: ■
154. Street et al., 2002 Street J; Bao M, deGuzman L, Bunting S, Peale FV, Jr.,
155. Street J., Winter D, Wang JH, Wakai A, McGuinness A, Redmond HP (2000) Is human fracture hematoma inherently angiogenic? Clin Orthop Relat Res 378: 224-237.
156. Streeten E.A., Brandi ML (1990) Biology of bone endothelial cells. Bone Miner 10: 85-94.
157. Streeten E.A., Ornberg R, Curcio F, Sakaguchi K, Marx S, Aurbach GD, Brandi ML (1989) Cloned endothelial cells from fetal bovine bone. Proc Natl Acad Sci U S A 86: 916-920.
158. Sugiyama T., KoharaH, Noda M, Nagasawa T (2006) Maintenance of thehematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling inibone marrow stromal cell niches. Immunity 25: 977-988.
159. Taichman R.S., Cooper C, Keller ET, Pienta KJ, Taichman NS, McCauley LK (2002) Use of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4' pathway in prostate cancer metastasis to bone. Cancer Res 62: 1832-1837.
160. Tammela T., Enholm B, Alitalo K, Paavonen K (2005) The biology of vascular endothelial growth factors. Cardiovasc Res 65: 550-563.
161. Tatsuyama K., Maezawa Y, Baba H, Imamura Y, Fukuda M> (2000)'1 '
162. Expression of various growth factors for cell proliferation* and cytodifferentiation< during fracture repair of bone. Eur J Histochem 44: 269278.
163. Traeta J (1963) The role of the vessels in osteogenesis. Journal of Bone and Joint Surgery Series A 45B: 402-418.
164. Thomson R.C., Yaszemski M.J., Powers J.M., Milcos A.G. (1998). Hydroxyapatite fiber reinforced poly(a-hydroxy ester) foams for bone regeneration. Biomaterials 19:1935-1943.
165. Urist M.R.(1965) Bone formation by autoinduction. Science 150:893-899.
166. Urist M.R., DeLange R.J., Finerman G.A.M. (1983) Bone celldifferentiation and growth factors. Science 220:680-686.
167. Vu T.Hi, Shipley JM, Bergers G, Berger JE, Helms JA, Hanahan D, Shapiro SD, Senior RM, Werb Z (1998) MMP-9/gelatinase B is a key regulator of. growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes. Gcll 93:411-422. ■■■
168. Wedge S.R., Ogilvie DJ, Dukes M, Kendrew J, Chester R, Jackson JA, Boffey SJ, Valentine PJ, Curwen JO, Musgrove HL, Graham GA, Hughes GD, Thomas AP, Stokes ES, Curry B, Richmond Gil, Wadsworth PF,
169. Bigley AL, Hennequin LF (2002) ZD6474 inhibits vascular endothelial growth factor signaling, angiogenesis, and tumor growth following oral administration. Cancer Res 62: 4645-4655.
170. Wernike et al., 2010 Wernike E, Hofstettcr W, Liu Y, Wu G, Sebald HJ, Wismeijer D; Hunziker EB^ Siebenrock KA, Klenke FM (2010) Long-term cell'rmediated protein release from calcium phosphate ceramics. J Biomed Mater Res A 92: 463-474, \ : ' !
171. Yao Z., Lafage-Proust MH, Plouet J, Bloomfield S, Alexandre C, Vico L2004) Increase of both angiogenesis and bone mass in response to exercise / depends on VEGF. J Bone Miner Res 19: 1471-1480.
172. Yannas I.V., Hansbrough J., Ehrlich N.(1984) What criteria should be used for designing artificial skin replacements and how well do the current grafting materials meet these.criteria?' Ji,Trauma 24;,29.
173. Zelzer E., McLean W, Ng YS, Fukai N, Reginato AM, Lovejoy S, D'Amore PA, Olsen BR (2002) Skeletal defects in VEGF(120/120) mice reveal multiple roles for VEGF in skeletogenesis. Development 129: 1893-1904.