Автореферат и диссертация по медицине (14.01.15) на тему:ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ КОСТНОГО КОЛЛАГЕНА ИМПРЕГНИРОВАННОГО СУЛЬФАТИРОВАННЫМИ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНАМИ НА РЕГЕНЕРАЦИЮ КОСТНОЙ ТКАНИ (экспериментально-клиническое исследован

На правах рукописи

005001289

Васильев Максим Геннадьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ КОСТНОГО КОЛЛАГЕНА ИМПРЕГНИРОВАННОГО СУЛЬФАТИРОВАННЫМИ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНАМИ НА РЕГЕНЕРАЦИЮ КОСТНОЙ ТКАНИ

(экспериментально-клиническое исследование)

14.01.15 - Травматология и ортопедия 14.01.24 - Трансплантология и искусственные органы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О НОЯ 2011

Москва - 2011

005001289

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Центральном научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. Н.Н.Приорова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Снетков Андрей Игоревич доктор медицинских наук Лекишвили Михаил Васильевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Кожевников Олег Всеволодович доктор медицинских наук Темнов Андрей Александрович Ведущее учреждение: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится «_»_2011 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.112.01. при Федеральном государственном бюджетном учреждении Центральном научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. Н.Н.Приорова по адресу: 127299, Москва, ул. Приорова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ЦИТО им. H.H. Приорова».

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

Михайлова JI.K.

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Разработка новых пластических материалов для проведения реконструктивных хирургических операций в травматологии и ортопедии, эффективных для получения желаемого результата лечения, остается актуальной до настоящего времени. Актуальность рассматриваемой темы имеет общепризнанный характер, что отразилось во многих публикациях, дискуссиях и оценках новых биокомпозиционных материалов, способных активно влиять на течение костной регенерации (Снетков А.И. с соавт. 2001; Миронов С.П. 2007; Baas J. etal. 2008;GreinerS.H. etal. 2008; Савельев В.И. с соавт. 2009; GaoY.etal. 2009).

Многолетний опыт травматологии и ортопедии показал, что биологические материалы часто являются решающим фактором достижения положительного результата лечения патологии костной системы. Известно, что уровень современной медицины и сопредельных научных направлений позволяют создавать костнопластические материалы, которые по своим свойствам не уступают аутотканям, т.н. «золотому стандарту», используемых в настоящее время для замещения дефектов костной ткани у больных с костной патологией. Основным из требований к материалам является способность обеспечения надежности опорной и/или структурообразующей функции в поврежденной области ткани. Материалы должны обладать остеоиндуктивностью, то есть способностью побуждения остеобластов и других мезенхимальных клеток к формированию костной ткани. Также должны обладать свойствами биосовместимости, то есть быть биодеградируемыми и не вызывать у реципиента воспалительных, иммунологических реакций. Последнее качество обычно достигается в процессе изготовления материала за счет снижения его антигенности. Совокупность этих свойств позволяет подобным имплантатам параллельно с опорной (остеокондуктивной) функцией, обеспечивать биоинтеграцию, т.е. врастание клеток и сосудов в структуры имплантированного материала.

Многолетняя история экспериментальных исследований явилась обоснованием включения гликозаминогликанов в состав биокомпозиционных материалов. В экспериментах они показали положительное влияние на регенерацию костной, хрящевой, нервной и других тканей (Омельяненко Н.П. с соавт. 2009). Сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) участвуют практически во всех процессах обмена соединительной ткани в первую очередь в формировании коллагеновых и эластиновых волокон (Панасюк А.Ф. с соавт. 2000). В последнее время эти положения нашли свое подтверждение по итогам исследования процессов регенерации костной ткани (Pieper J.S. et. al. 2000; Омельяненко Н.П. с соавт. 2009). Как показано в экспериментальных и клинических исследованиях сГАГ снижают активность протеолитических ферментов, регулируют синтез медиаторов воспаления за счет маскировки антигенных детерминант, предотвращают ano птоз клеток.

Экзогенное введение сГАГ в эксперименте показало положительное влияние на регенерацию поврежденных тканей суставного хряща.

Некоторые исследования говорят о том, что сГАГ играют важную роль в процессе отложения кальция в созревающей костной ткани, действуя как активные хелаторы ионов кальция, обеспечивающие накопление в ткани кальция до концентрации, достаточно высокой для минерализации.

Отсутствие или недостаток сГАГ приводит к нарушению процесса ко-стеобразования.

В связи с этим представляется обоснованным изучение сГАГ как компонента остеопластических материалов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное изучение влияния пластических материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликоза-миногликанами на процесс регенерации костной ткани с использованием

различных экспериментальных моделей и внедрение данного вида материалов в клиническую практику.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Оценить влияние сГАГ на пролиферацию культур стромальных клеток костного мозга.

2. Изучить влияние сГАГ на свойства имплантатов на модели гетерото-пической имплантации.

3. Сравнить интенсивность и характер замещения имплантатов на основе костного коллагена с сГАГ и без них.

4. Разработать и внедрить в клиническую практику биокомпозиционный материал на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ.

5. Оценить результаты применения разработанного биокомпозиционного материала в клинике.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В рамках проведенного экспериментально-клинического исследования выявлено, что сГАГ не влияют на пролиферацию стромальных клеток костного мозга.

На моделях гетеротопической и ортотопической имплантации доказано, что сГАГ в составе биокомпозиционных материалов стимулируют развитие более выраженной сосудистой сети, препятствуют резорбции коллагена, входящего в состав имплантированных образцов, увеличивают образование хрящевой ткани и способствуют заживлению костной раны через энхон-дральный тип костеобразования, что доказывает целесообразность включения сГАГ в состав остеопластических биокомпозиционных материалов.

Разработан и внедрен в клиническую практику новый биокомпозиционный материал на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ.

Показана эффективность клинического применения имплантатов на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ при замещении пострезекционных дефектов костной ткани.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработан и внедрен в клиническую практику биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген и сГАГ.

Определен спектр показаний к применению имплантата «Остеоматрикс» у пациентов с доброкачественными опухолями, опухолеподобными и прочими заболеваниями костей. «Остеоматрикс» может быть использован при небольших дефектах костной ткани в ненагружаемых отделах скелета. При более обширных поражениях может быть использован в сочетании с другими костнопластическими материалами, металлоостеосинтезом.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Введение сГАГ в состав биокомпозиционных костнопластических материалов улучшает их биосовместисмость, повышает остеокондуктивные свойства и, возможно, обладают остеоиндуктивными свойствами, что доказано на различных экспериментальных моделях;

- Материал «Остеоматрикс», включающий в себя сГАГ, может быть использован в травматологии и ортопедии при замещении небольших, а в сочетании с другими материалами значительных пострезекционных дефектов костной ткани.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Биокомпозиционный материал нового поколения на основе аллогенных тканей «Остеоматрикс», включающий костный коллаген, сГАГ и гидрокси-апатит внедрен в работу отделения костной патологии ФГУ ЦИТО им. Н.Н.Приорова, Московской областной детской ортопедохирургической

больницы восстановительного лечения, ДГКБ №13 им. Н.Ф.Филатова г. Москвы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы исследования доложены на Симпозиуме «Биоимплантология на пороге XXI века», Москва, 2001;3rd, 4th, 5th,World Congress on Tissue Banking (Boston, 2002), (Rio de Janeiro, 2005), (Kuala Lumpur, 2008);II Всероссийском Симпозиуме (Самара, 2004); 13th, 18th, Congress of the European Association of Tissue Banking (Prague, 2004), (Cracow, 2009); 5th Congress of Baltic Association (Kaunas, 2005); 3 Международном Конгрессе (Москва, 2006);III Всероссийском Симпозиуме (Москва, 2007); Всероссийской конференции (Самара, 2008); Научно-практической конференции (Москва, 2008); XIV Международной конференции челюстно-лицевых хирургов (Санкт-Петербург, 2009); IV Всероссийском Симпозиуме (Санкт-Петербург, 2010);

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 22 работы. В том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получено 7 патентов на изобретения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 46 работ из отечественных и 100 работ из зарубежных источников, приложения. Иллюстрирована 71 рисунком, 4 таблицами, 4 диаграммами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Влияние сГАГ на пролиферацию стромальных клеток костного мозга шуггао (МТТ-тест).

Для фотометрической оценки пролиферации и гибели клеток в культуре стромальных клеток костного мозга использовали МТТ-тест. Этот метод основан на том, что диметилтиазолил дифенил тетразолий бромид (МТТ) восстанавливается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатде-гидрогеназы до водонерастворимого темноокрашенного формазана. Форма-зан элюируют из клеток с помощью органических сольвентов. После этого, оптическая плотность элюата регистрируется при помощи спектрофотометра. Определено, что оптическая плотность элюатов формазана при длине волны 570 нм (максимум поглощения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце. Исследование проведено в группе клинической генетики лаборатории соединительной ткани ЦИТО. Заведующий проф. Омельяненко Н.П.

В эксперименте клетки высевали в лунки с плотностью 50 тысяч клеток в каждую лунку. Через 24 часа в лунки вносили раствор сГАГ с таким расчетом, чтобы получить 3 серии. 1 серия с концентрацией сГАГ в культуральной среде 50 мкг/мл, 2 серия с концентрацией 250 мкг/мл, 3 серия с концентрацией 500 мкг/мл. В контрольной группе в культуральную среду раствор сГАГ не добавляли. Инкубировали клетки в течение 72 часов. Затем в лунки вносили МТТ и инкубировали в присутствии МТТ в течение еще 3-х часов. Формазан элюировали с помощью ДМСО в течение 30 мин при 37°С и проводили измерение оптической плотности элюата на планшетном фотометре при длине волны 570 нм.

Оптические плотности образцов полученных в разных опытных сериях статистически не отличаются от контроля, что указывает на то, что, растворы сГАГ данных концентраций не влияют на пролиферацию стромальных клеток костного мозга.

Таблица 1. Результаты МТТ теста: оптическая плотность образцов.

Контроль (клетки без сГАГ) Концентрация сГАГ в культуре СККМ барана

50 мкг/мл 250 мкг/мл 500 мкг/мл

1. 1,028 0,9529 0,8391 0,9662

2. 1,029 0,9451 0,8387 0,9679

3. 1,027 0,9448 0,8406 0,9652

4. 1,026 0,9554 0,8329 0,9657

5. 1,026 0,9534 0,8367 0,9711

М±т 1,027*0,001 0,9503±0,005 0,8376±0,003 0,9762±0,0023

Р=3,04^=8,69 для а=0,05)

влияние СГАГ на морфологию культур стромальных клеток костного мозга и пролиферацию клеток.

Исследование влияния сульфатированных гликозаминогликанов на пролиферативный рост клеточных культур проводили на культуре стромаль-ных клеток костного мозга барана. Культура стромальных клеток костного мозга - остеогенные клетки-предшественники. Культуру вьфащивали стандартным методом в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки теленка Эксплантационная плотность клеток культур во всех образцах составляла 5x105. Сульфатированные гликозаминогликаны получили в соответствии с патентом РФ № 2162331. Были приготовлены рабочие растворы сГАГ трех концентраций: 500 мкг/мл, 2500 мкг/мл и 5000 мкг/мл.

Проводили 3 серии исследований сГАГ в клеточных культурах. В культуральные флаконы с клеточной культурой с 10 мл ростовой среды добавляли сГАГ с конечной концентрацией (с учетом количества среды) 50 мкг/мл - 1 серия опытов, 250 мкг/мл - 2 серия, 500 мкг/мл - 3 серия. Каждая серия опытов включала по 4 флакона клеточных культур. В контрольной группе во флаконы с клеточной культурой раствор сГАГ не добавляли. Культивирование проводили в течение 7 дней.

Клетки из 3 флаконов из каждой серии опытов на 7 день культивирования снимали трипсином и подсчитывали количество клеток во флаконе в ка-

мере Горяева. По одному флакону клеточных культур из каждой серии опытов на 7 день культивирования фиксировали и окрашивали по методу Гимза-Романовскому для морфологического исследования клеточных культур.

Клетки в клеточных культурах, включая контроль и опытные серии, имели правильный ориентированный рост, стандартную вытянутую верете-новидную форму. Хорошо контрастировались ядра с ядрышками. В цитоплазме отсутствовала цитотоксическая зернистость. Картина была характерной для стандартной культуры стромальных клеток костного мозга.

При подсчете количества клеток в камере Горяева статистически достоверно не выявили разницы между исследуемыми экспериментальными сериями и контролем.

Таблица 2. Влияние растворов сГАГ разной концентрации на пролиферацию _ стромальных клеток костного мозга барана._

Контроль (без сГАГ) Концентрация ГАГ в культуре СККМ барана

50 мкг/мл 250 мкг/мл 500 мкг/мл

3,88 хЮ6 3,77 хЮ6 3,77 x10й 3,80x10"

3,80 хЮ6 3,78 хЮ6 3,80 хЮ6 3,82x106

3,85 хЮ6 3,80х106 3,79x10" 3,82 хЮ6

М±ш 3,84±0,04 3,78±0,02 3,79±0,02 3,81±0,01

Р=3,36 (Ркр=8,85для а=0,05)

В результате проведенного исследования растворов сГАГ на культурах стромальных клеток костного мозга можно сделать следующие выводы:

Во-первых, растворы сГАГ данных концентраций, полученные по используемой технологии не токсичны.

Во-вторых, данные растворы сГАГ не стимулируют пролиферацию стромальных клеток костного мозга.

Исследование свойств костного коллагена импрегнированного

сульфатированнымигликозаминогликанамина модели гетеротопической имплантации.

Для исследования влияния сульфатированных гликозаминогликанов на свойства имплантатов используя модель гетеротопической имплантации, были изготовлены блоки костного коллагена, полученного из губчатого слоя костной ткани размером 3x3x1 мм, и насыщены сГАГ дозой 700 мкг/см3. Контролем служили аналогичные образцы костного коллагена без насыщения сГАГ. Эксперимент проведен на базе отделения экспериментальной травматологии ЦИТО. Заведующий Шальнев А. Н.

Исследование проводили на 20 половозрелых крысах породы «Вистар» весом 150-200 граммов. Под тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно из расчета 6 мг на 100 г веса) в стерильных условиях животным делали кожные разрезы по срединной линии живота, затем делали надрез фасции слева и справа от срединной линии и в образовавшиеся карманы помещали исследуемые образцы. Каждому животному был имплантирован один экспериментальный образец и один контрольный. Раны послойно ушивали наглухо. Выводили животных из эксперимента через 1 месяц. Фрагменты тканей с имплантированными блоками вырезали, фиксировали в формалине. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином. Гистологические препараты изготовлены в патологоанатомическом отделении ЦИТО. Заведующий проф. Еременко Г.Н.

При гистологическом исследовании в опытной и контрольной группах имплантированный материала находился на различных стадиях резорбции, в большинстве случаев больший объем образцов сохранен, часть трабекул расслоена, в каждом препарате обнаруживаются гигантские многоядерные клетки, осуществляющие резорбцию костного матрикса. Межтрабекулярные пространства имплантата заполнены различной по степени «зрелости» соединительной тканью. Опытные образцы отличаются от контроля наличием большого количества кровеносных сосудов. Большинство периферийных участ-

ков имплантата окружены тонкой соединительнотканной капсулой, которая без четкой границы переходит в поперечнополосатую мускулатуру реципи-ентного ложа. В большинстве случаев на поверхности трабекул отсутствуют какие-либо остеогенные клеточные элементы, однако в одном случае в опытной группе имеются участки, в которых трабекулы покрыты плотным слоем клеток, по своей морфологии напоминающие остеобласты. А именно: клетки близко расположены друг к другу, имеют прямоугольную форму, и под ними находится оксифильная прослойка, похожая наостеоид.

В представленных образцах (как опытных, так и контрольных) выраженных признаков остеогенеза нет, однако в одном из опытных образцов имеются признаки начинающегося процесса костеобразования и во всех - предпосылки к нему - развитая сосудистая сеть;

Состояние опытных образцов отличается от состояния контрольных большей сохранностью структур имплантата, состоянием межтрабеку-лярной соединительной ткани (менее зрелая, более «нежная»), макро-фагальным характером инфильтрата, который, однако, гораздо менее интенсивно резорбирует костный матрикс.

Исследование свойств костного коллагена цмпрегнированного

сульфатированными гликозаминогликанами на модели ортотопической имплантации.

Экспериментальное исследование проведено на половозрелых кроликах породы «Шиншилла» возрастом 1 год, весом около 3,0 кг на модели сегментарной резекции лучевой кости правой передней конечности.

В эксперименте были использованы 2 группы по 10 кроликов в каждой, у животных опытной группы в сегментарный дефект лучевой кости размером 10 мм имплантировали блоки костного коллагена импрегнированные сульфа-тированными гликозаминогликанами. В контрольной группе животных дефект заполнялся аналогичными по размеру блоками костного коллагена без сульфатированных гликозаминогликанов. Наркоз осуществляли внутримы-

шечным введением 2,5 мл 10% раствора кетамина, 1 мл седуксена и 10 мг гентамицина. Местную анестезию проводили раствором 0,5% новокаина в объеме 2,0 мл. В ходе операции после обработки операционного поля раствором йода производили разрез кожи по проекции лучевой кости правого предплечья. После обнажения средней трети лучевой кости с помощь электрической пилы производили сегментарную резекцию в средней трети диа-физа на протяжении 1 см. Имплантируемый материал помещали в дефект, полностью его восполняя. Затем, отдельными кетгутовыми швами из местных тканей (мышцы, сухожилия и фасции средней трети предплечья) создавали футляр, удерживающий имплантат в области костного дефекта. Операция заканчивалась послойным ушиванием раны отдельными кетгутовыми швами наглухо. Рентгенологическая картина в обеих группах была одинаковой.

Рентгенологический контроль осуществляли на серийном рентгеновском аппарате 12П6 через 2 недели, 1, 2 и 3 месяца после имплантации. Морфологические исследования были сделаны на сроках: 1 и 3 месяца эксперимента. В течение всего послеоперационного периода проводили ежедневный визуальный контроль области операции и общего состояния кроликов. Полученные препараты исследовали морфологически с использованием световой микроскопии и морфометрии.

На рентгенологических снимках в опытной и контрольной группах на 14 день после операции виден дефект лучевой кости с четкими ровными контурами. Мягкие ткани в области локтевой кости уплотнены. К 30 суткам и в опытной и в контрольной группах в области дефекта лучевой кости рентгенологически определяется образование облаковидной костной мозоли. На 60 сутки в области дефекта определяется плотная костная мозоль, заполняющая почти весь объем дефекта. На 90 сутки выявлено полное восстановление костной структуры и костномозгового канала кости кролика как в опытной, так и в контрольной группах.

Гистологическое исследование препаратов опытной группы кроликов через 1 месяц эксперимента показало, что в полости раны кости наблюдалось развитие трех типов тканей: пролиферирующей хрящевой ткани в виде зачатков и незрелой губчатой кости с хрящевыми сердцевинами. Лакуны такой кости были заполнены рыхлой соединительной тканью, остеобластами и, остеокластами, а также в ложе раны в окружении имплантатов наблюдалась картина развития фиброзной ткани (грубоволокнистая соединительная ткань). Ближе к поверхности вокруг имплантатов (отдельных их фрагментов) наблюдалось наличие губчатой сравнительно зрелой кости.

В ряде образцов дефекты лучевой кости были заполнены незрелой костной тканью, сохраняющей в себе очаги хрящевой ткани. В немногочисленных областях незрелой кости обнаруживалось большое количество остеобластов и умеренное число остеокластов. Незрелая костная структура была окружена грубоволокнистой остеогенной соединительной тканью.

В опытной группе через 1 месяц в гистологических препаратах не дне дефекта наблюдали покрытое непрерывной линией базофильной незрелой костной ткани более раннего происхождения. Следующий слой незрелой, более поздней, оксифильной неокости плавно переходил от ранней кости к поверхности дефекта. Такая костная масса была окружена остеогенной волокнистой тканью, сходной с надкостницей. Наряду с костным незрелым мат-риксом происходило развитие хрящевой ткани в виде отдельных отстоящих друг от друга зачатков. Вокруг последних, как раз, и формировалась молодая незрелая кость с сочными, округлыми остеоцитами. Поздняя незрелая кость имела остеоциты округло-элипсоидной формы и они были более гиперхром-ные.

Через 3 месяца в области дефектов кости у кроликов контрольной группы наблюдали формирование очагов хрящевой ткани и по направлению к поверхности раны развитие молодой незрелой костной ткани. Оставшиеся фрагменты имплантатов были инкапсулированы плотной соединительной тканью. Внутри этой капсулы, помимо фрагментов образца, в большом коли-

честве присутствовали лейкоциты. При этом отсутствовали признаки гнойных выделений. В то же время, в глубине наблюдалось развитие фиброзной ткани.

Изучая гистологическую картину образцов на 3 месяце эксперимента опытной группы отмечено, что полость дефекта кости была заполнена массой незрелой костной ткани. Часть ее имела более незрелую структуру (позднее развитие), другая часть - более зрелую (раннее развитие). Отличие обоих типов незрелого матрикса заключалось в количестве и форме остеоцитов. Наличие остеоидной ткани, окаймляющей лакуны в виде круговой зоны или между пластами незрелой кости, указывало на процесс перестройки имплантированного материла. В ряде случаев на гистологических срезах выявлена динамика морфологического изменения хрящевой ткани: развивающийся хрящ - пролиферирующий - созревающий, последний затем замещался костным матриксом. Губчатая незрелая кость становилась более массивной за счет утолщения костных балок и аппозиционного роста со стороны лакун. Сами лакуны в губчатой кости заполнялись костными клетками и волокнистыми структурами. Через три месяца после имплантации в костный дефект материала, губчатая кость становилась более компактной по сравнению с таковой через один месяц.

Таким образом, восстановление костной ткани происходило через стадию энхондрального окостенения на фоне повышенной функциональной, активности костных клеток.

Данные морфометрии гистологических препаратов представлены в таблицах. В связи с тем, что объем выборки недостаточен для того, чтобы сделать вывод о нормальности распределения сравниваемых признаков в генеральной совокупности, для статистического анализа полученных данных использовали непараметрический критерий - и-критерий Манна-Уитни.

Таблица 3. Гистоморфометрические показатели заживления костного дефек-_та через 1 месяц после операции.

№ образца Масса ткани (%) Толщина трабе-кул (мм)

Хрящевая ткань Костная ткань

Опытная группа

1 7,3 46,4 0,09

2 42,7 24,5 0,085

3 13,0 66,4 0,10

4 8,6 67,0 0,088

5 10,8 75,4 0,085

Контрольная группа

6 7,4 56,2 0,083

7 6,6 30,8 0,081

8 9,8 42,3 0,085

9 6,7 67,0 0,09

10 8,4 55,6 0,09

иэмп= 4 (иКр= 4 для Р<0,05) иЭм„= 9,5 (иКр= 4 для р<0,05) иЭмп= 8 (иКр= 4 для р<0,05)

При сравнении опытной и контрольной групп по количеству хрящевой ткани в гистологических препаратах через 1 месяц после операции с использованием и-критерия выявили, что Т (сумма рангов) опытной группы равно 36, а Т контрольной группы равно 19, и-критерий равен 4, критическое значение и-критерия при р<0,05 равно 4. Следовательно, количество хрящевой ткани в опытных образцах достоверно больше, чем в контрольных (р<0,05). Аналогичное сравнение количества новообразованной костной ткани через 1 месяц после операции показало, что достоверной разницы между опытной и контрольной группами нет (Юмп= 9,5 (1Жр= 4 для р<0,05)).

и-критерий, полученный при сравнении количества хрящевой ткани в препаратах на 3 месяц после операции, равен 6 (иКр= 4 для р<0,05). При сравнении опытной и контрольной групп по количеству новообразованной костной ткани - иЭмл= 12 (иКр= 4 для р<0,05), что также говорит о том, что различия в этих группах не достоверны.

Таблица 4. Гистоморфометрические показатели заживления костного дефек-

та через 3 месяца после операции.

№ образца Масса ткани (%) Толщина трабе-кул (мм)

Хрящевая ткань Костная ткань

Опытная группа

1 7,8 67,2 0,12

2 7.4 78,1 0,15

3 20,0 52,0 0,12

4 6.4 34.0 0,14

5 8,1 45,1 0,12

Контрольная группа

6 7,7 63,1 0,13

7 8,4 75,6 0,12

8 5.1 52,4 0,13

9 6,3 37,4 0,14

10 5,9 42,6 0,12

иЭмп= 6 (UKp= 4 для р<0,05) иЭмп= 12 (UKp= 4 для р<0,05) иэ„п= 12,5 (UKp= 4 для р<0,05)

Таким образом, достоверно установлено, что исследованный материал на основе костного коллагена насыщенного сульфатированными гликозаминогликанами стимулирует образование хрящевой ткани и способствует заживлению костной раны через энхондральный тип ко-стеобразования.

Оценка внедрения костнопластических материалов на основе костного коллагена нмпрегш1рованного сульфатированными гликозаминогликанами в клиническую практику.

Для клинического применения тканевым банком ЦИТО им. H.H. Приорова совместно с фирмой «Конектбиофарм» был разработан биокомпозиционный материал на основе аллогенной костной ткани. Разработанный костнопластический материал получил коммерческое название «Остеоматрикс».

Анализ эффективности нового материала «Остеоматрикс» был проведен на основе результатов лечения 54 больных с костной патологией. Пациенты находились на лечение в клинике детской и взрослой костной патоло-

гии ЦИТО им. H.H. Приорова, Московской областной детской ортопедохи-рургической больницы восстановительного лечения и ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы. Возраст больных составил от 2 до 73 лет. Локализация поражений и их нозологическая форма имели достаточно широкий диапазон. «Остеоматрикс» использовали в виде блоков. После выполнения резекции патологического очага, образовавшиеся дефекты заполняли пластическим материалом. При дефектах большего размера вместе с «Остеоматриксом» использовали «Перфоост» или кортикальные замороженные аллоимпланта-ты, «Коллапан». 33 пациента были прооперированы с использованием только материала «Остеоматрикс», у остальных «Остеоматрикс» использовался в сочетании с другими материалами.

о Количество больных пролеченных с использованием "Остеоматрикса"

п Количество больных пролеченных с использованием "Остеоматрикса" в сочетании с другими материалами

Диаграмма 1. Соотношение больных, пролеченных с использованием «Остеоматрикса» изолированно и в сочетании с другими пластическими материалами и металлоостеосинтезом.

Подавляющее число пациентов, вошедших в исследование, получили хирургическое лечение по поводу костных опухолей и опухолеподобных заболеваний - 50 человек.

о Доброкачественные опухоли В Опухолеподобные заболевания о Прочие заболевания

Диаграмма 2. Соотношение нозологий костной патологии, при которых использовался биокомпозиционный материал «Остеоматрикс».

Из 54 пациентов, вошедших в группу наблюдения, у 9 пациентов диагностирована гигантоклеточная опухоль, у 7 - солитарная киста, у 7 - хондрома, у 5 - аневризмальная киста, у 5 - метафизарный фиброзный дефект, у 4 - фиброзная дисплазия, у 4 - энхондрома, у 3 - остеоидная остеома, в 2 случаях - ложный сустав, и по одному случаю эозинофильная гранулема, остеохондрома, хондроматоз, несросшийся перелом, неврогенная опухоль, грыжа межпозвонкового диска, внутрикостная липома.

Обследование пациентов проводился с использованием клинических, рентгенологических, компьютерно-томографических методов исследования.

Клинический осмотр больных и рентгенологический контроль области пластики проводили до и после хирургического вмешательства и через 3, и 610 месяцев. Реабилитацию осуществляли по общепринятой схеме в зависимости от локализации и объема оперативного вмешательства.

□ Остеохондрома

□ Аневризмальная киста

■ Остеоидная остеома

□ Ложный сустав

вСолитарнаякиста

□ Эозинофильная гранулема

■ Грыжа диска

■ Хондрома

@ Несросшийся перелом

□ Гигантокпеточная опухоль

□ Неврогенная опухоль

□ Фиброзная дисплазия

□ Энхондрома

□ Метафизариый фиброзный дефект ■ Внутрикостная липома

в Хондроматоз

Диаграмма 3. Распределение больных по нозологиям.

В раннем послеоперационном периоде в случаях использования «Остеоматрикса» нагноений отмечено не было. Во всех случаях раны зажили в обычные физиологические сроки. Инфекционных осложнений на протяжении раннего периода наблюдения выявлено не было.

Анализ рентгенограмм показал, что через 6-10 месяцев места, куда помещался «Остеоматрикс», по плотности рентгенологического изображения еще отличались от окружающей костной ткани.

«Остеоматрикс» применяли при сравнительно небольших костных дефектах и, как правило, в ненагружаемых отделах скелета. Общее число положительных результатов в случаях использования «Остеоматрикса» отдель-

но или в комбинации с другими остеопластическими материалами составило 89%.

Однако стоит отметить, что почти все случаи осложнений связаны с рецидивом основного заболевания, а не с применением в ходе лечения остео-пластических материалов. Относительно неудовлетворительным результатом применения «Остеоматрикса» в сочетании с «Перфоостом» можно признать один случай. Пациенту 2 года по поводу аневризмальной кисты проксимального отдела левой большеберцовой кости была проведена краевая резекция с удалением патологического очага и замещением костного дефекта «Остео-матриксом в сочетании с «Перфоостом». Через 7 лет после операции рентгенологически была отмечена неоднородность костных структур в области операции, а еще через 2 года произошел перелом левой большеберцовой кости в области операции. Таким образом, использование биокомпозиционного материала «Остеоматрикс» способствовало полному восстановлению целостности кости у 48 больных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современная травматология и ортопедия остро нуждается в костнопластических материалах, способствующих восстановлению целостности костной ткани. В связи с этим, поиск новых и совершенствование уже существующих пластических материалов для замещения дефектов костей остается одной из актуальных проблем в современной травматологии и ортопедии. Материалы, используемые для пластики дефектов кости, должны не только заполнять объем дефекта, но и активно влиять на регенерацию костной ткани создавая оптимальные условия для быстрого и полноценного замещения дефекта собственной костью. В связи с этим, определенный интерес представляют сульфатированные гликозаминогликаны, как компонент костного матрикса участвующий в регуляции процессов костеобразования. В соединительной ткани они входят в состав протеогликановых комплексов и являются одним из основных компонентов межклеточного вещества. В связи с

вышеизложенным, мы провели исследование целесообразности введения сульфатированных гликозаминогликанов в состав остеопластических материалов. Для этого исследовали влияние гликозаминогликанов на пролиферацию клеток in vitro на культурах стромальных клеток костного мозга барана с использованием МТТ-теста, изучения морфологии клеточных культур и подсчета количества клеток, влияние сульфатированных гликозаминогликанов на свойства имплантатов на модели гегеротопической и ортото-пической имплантации.

На основании полученных и проанализированных экспериментальных данных можно утверждать, что сульфатированные гликозаминогликаны напрямую не влияют на пролиферацию стромальных клеток, но, возможно, стимулируют костеобразование через активацию факторов роста или создают оптимальное окружение для роста и созревания костной ткани.

Анализ результатов клинического использования материала «Остео-матрикс» на основе коллагена аллогенного происхождения импрегнирован-ного сульфатированными гликозаминогликанами показал, что данный материал отвечает всем требованиям, предъявляемым к костнопластическим материалам, предназначенным для замещения пострезекционных дефектов в травматологии и ортопедии.

ВЫВОДЫ

1. Растворы сульфатированных гликозаминогликанов в концентрации 50 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл не влияют на пролиферацию стромальных клеток костного мозга in vitro.

2. При гетеротопической имплантации образцы, содержащие сульфатированные гликозаминогликаны дозой 700 мкг/см3, стимулируют развитие более выраженной сосудистой сети по сравнению с контрольными образцами и, возможно, индуцируют гетеротопическое костеобразование.

3. Сульфатированные гликозаминогликаны дозой 700 мкг/смЗ препятствуют резорбции коллагена, входящего в состав имплантированных образцов.

4. При ортотопической имплантации образцы, содержащие сульфатированные гликозаминогликаны дозой 700 мкг/смЗ, достоверно увеличивают образование хрящевой ткани и способствуют заживлению костной раны через энхондральный тип костеобразования, что указывает на выраженные остеокондуктивные свойства материала.

5. Разработан биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» на основе костного коллагена аллогенного происхождения импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами, отвечающий всем требованиям, предъявляемым к костнопластическому материалу, предназначенному для его использования в реконструктивной хирургии.

6. Биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» обладает выраженными остеокондуктивными и, возможно, обладает остеоиндуктивными свойствами, что способствовало полному восстановлению целостности кости у 48 больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» может быть использован при лечении гигантоклеточной опухоли, солитарной кисты, аневриз-мальной кисты, метафизарного фиброзного дефекта и ряда других заболеваний для замещения небольших пострезекционных костных дефектов. Для замещения дефектов большего размера «Остеоматрикс» может быть использован вместе с другими остеопластическими материалами и в сочетании с метаппоостеосинтезом.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А.Ф.Панасюк, С.Ю.Иванов, М.В.Лекишвили, Е.ВЛарионов, Д.А.Саващук, М.Г.Васильев. Новые биокомпозиционные материалы -«Биоматрикс» и «Алломатрикс-Имплант» для замещения костных дефек-

тов// Тез. симп.: «Биоимплантология на пороге XXI века».- М., 2001 - С. 96-97.

2. М.ВЛекишвили, А.Ю.Михайлов, М.Г.Васильев. Способ изготовления имплантата из губчатой костной ткани: Патент РФ на изобретение №2172104 Опубл 20.08.2001 Бюл. № 20.

3. М.ВЛекишвили, И.А.Касымов, М.Г.Васильев. Способ приготовления препарата из пуповины и костного матрикса для стимуляции остеогенеза: Патент РФ на изобретение №2172174 Опубл 20.08.2001. Бюл. № 20.

4. M.G.Vasiliev, A.F.Panasyuk, E.V.Larionov, M.V.Lekishvili. Application of biocompositional material «Osteomatrix» in CITO clinics// Mat. Third World Congress on Tissue Banking and 26th Annual Meeting AATB - Boston, Massachusetts, USA, 2002,- P. 112.

5. M.G.Vasiliev, A.F.Panasyuk, E.V.Larionov, M.V.Lekishvili. Biocompositional material «Osteomatrix». Characteristic and clinical application// Mat. 11th International Conference on Tissue Banking and EATB Annual Meeting.- Bratislava, Slovak Republic, 2002.- P. 102.

6. М.ВЛекишвили, А.В.Балберкин, М.Г.Васильев, А.Ф.Колондаев, A.JI. Баранецкий, Ю.В.Буклемишев. Первый опыт применения в клинике костной патологии биокомпозиционного материала «Остеомат-рикс»// Вестн. травматол. ортопед.- 2002.- № 4.- С. 80-84.

7. А.И.Снетков, М.ВЛекишвили, М.Г.Васильев. Биокомпозиционный материал для замещения костных дефектов: Патент РФ на изобретение №2197974 Опубл. 10.02.2003 Бюл. № 4.

8. М.Г.Васильев. Экспериментальные исследования биоматериалов «Ал-ломатрикс-имплант» и «Остеоматрикс»// Тез. II Всероссийского Симпозиума с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» и конф. «Теория и практика клеточных биотехнологий».- Самара, 2004 - С. 16-17.

9. А.Ф.Панасюк, М.ВЛекишвили, Е.В.Ларионов, М.Г.Васильев. Биоматериалы для восстановления костных дефектов на основе костных аллокол-лагена, гидроксиапатита и сульфатированных гликозаминогликанов// Тез. II Всероссийского Симпозиума с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии».- Самара, 2004.- С. 43-44.

10.M.V.Lekishvili, S.A.Asnina, M.G.Vasiliev, A.V.Balberkin, N.V.Shishkova, Yu.V.Buklemeshev. New biocompositional materials in Russian orthopaedy and maxillofacial surgery// Mat. 13th International Congress of the European Association of Tissue Banking - Prague, Czech Republic, 2004 - P. 137.

11 .M.Lekishvili, L.Semyonova, M.Vasiliev. Application of biological materials for endoprosthesis and revision endoprosthesis of pelvis joints// Mat. 4th World Congress on Tissue Banking - Rio de Janeiro, Brazil, 2005.- P. 64.

12.S.A.Asnina, N.V.Shishkova, M.Lekishvili, M.G.Vasiliev, S.V.Gouravlov. New biocompositional materials in orthopaedy and maxillofacial surgery//

Mat. 5th Congress of Baltic Association for maxillofacial and plastic surgery-Kaunas, Lithuania, 2005 - P. 5.

13.M.Г.Васильев, А.И.Снетков, В.Е.Цуканов, Н.И.Тарасов, В.И.Тарасов, Л.А.Семенова, М.ВЛекишвили. Экспериментально-клиническое обоснование использования биокомпозициониого материала «Остсо-матрикс» в лечение детей и подростков с костной патологией// Детская хирургия.- 2006.-№ 2.- С. 44-49.

14.М.В.Лекишвили, М.Г.Васильев, Е.Д.Горбунова, О.Б.Баракина, А.С. Панкратов. Способ получения костного аллотрансплантата для замещения дефектов костей черепа. Патент РФ на изобретение № 2279281 Опубл. 10.07.2006 Бюл. № 19.

15.М.Г.Васильев, М.В.Лекишвили. Клиническая оценка биокомпозиционного материала «Остеоматрикс»// Тез. 3-го Международного конгресса « Современные технологии в травматологии и ортопедии».- М., 2006 - Ч. 2,-С. 431.

16.М.Г.Васильев. Применение биоматериала «Остеоматрикс» для лечения патологий костной ткани// Мат. III Всероссийского симпозиума с международным участием: «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии».- М., 2007 - С. 117-118.

17. М.В.Лекишвили, В.В.Зайцев, М.Г.Васильев. Разработка и применение костно-пластических материалов в травматологии и ортопедии// Вестн. травматол. ортопед.- 2009.- № 1.- С. 82-85.

18.М.ВЛекишвили, М.Г.Васильев, О.Ю.Баракина, Н.С.Гаврюшенко, А.Ю. Рябов, Ю.Б.Юрасова, А.С.Паикратов. Механические свойства аллогенной костной ткани свода черепа после деминерализации, лиофилизацни и радиационной стерилизации// Технологии живых систем.- 2009.- Т. 6, № 3.- С. 38-43.

19.М.ВЛекишвили, В.Н.Меркулов, М.Г.Васильев, А.И.Дорохин. Способ получения костного аллоимплантата с высокими механическими свойствами. Патент РФ на изобретение № 2343934 Опубл. 20.01.2009 Бюл. № 2.

20.М.В.Лекишвили, М.Г.Васильев, А.Ю.Рябов, И.В.Штрипова. Способ получения коллагеновых имплантатов. Патент РФ на изобретение № 2360690 Опубл 20.08.2010. Бюл. №19.

21.М.Г.Васильев. Влияние сульфатированных гликозаминогликанов на заживление дефектов костной ткани// Мат. IV Всероссийского симпозиума с международным участием: «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии».- СПб., 2010 - С. 39-40.

22.М.ВЛекишвили, М.Г.Васильев, А.Ю.Рябов, А.Г.Хамидов. Способ изготовления аллоимплантата на основе хрящевой ткани. Патент РФ на изобретение № 2411923 Опубл. 20.02.2011 Бюл. № 5.

Список СОКРАЩЕНИЙ.

ДМЕМ (DMEM) - Dulbecco's Modified Eagle's Medium ДМСО - Диметилсульфоксид

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетразолий бромид сГАГ - сульфатированные гликозаминогликаны

Подписано в печать: 19.10.11

Объем: 1 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-к, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

Актуальность работы. Разработка новых биопластических материалов для проведения реконструктивных хирургических операций в травматологии и ортопедии, эффективных для получения желаемого результата лечения, остаются актуальными до настоящего времени. Актуальность рассматриваемой темы имеет общепризнанный характер, которая отражается во многих публикациях, дискуссиях, разработках и оценках новых биокомпозиционных материалов, способных активно влиять на течение костной регенерации (Снетков А.И. с соавт. 2001; Миронов С.П. 2007; Baas J. et al. 2008; Greiner S.H. et al. 2008; Савельев В.И. с соавт. 2009; Gao Y. et al. 2009).

Многолетний опыт травматологии и ортопедии показал, что биологические материалы часто являются решающим фактором достижения положительного результата лечения патологии костной системы. Известно, что уровень современной медицины и сопредельных научных направлений позволяют создавать костнопластические материалы, которые по своим свойствам не уступают аутотканям, т.н. «золотому стандарту», используемых до настоящего времени для замещения дефектов костной ткани у больных с костной патологией (Langer R. et al. 1993; Spector M. 1999). При этом одним из серьезных требований к материалам является способность обеспечения надежности опорной и/или структурообразующей функции в поврежденной области ткани или органа (Yannas I.V. et. al. 1984; Reddi A.H. et. al. 1987; Reddi A.H. 1998). Во-вторых, наличие у материала остеоидуктивности, то есть способности побуждения остеобластов и других мезенхимальных клеток к формированию кости. И, в-третьих, обладать свойствами биосовместимости, то есть быть биодеградируемыми и не вызывать у реципиента воспалительных и иммунологических реакций. Последнее качество обычно достигается в процессе изготовления материала за счет снижения его антигенных составляющих (Bruck S.D. et al. 1989; Vacanti С.A. et al. 1992; Friess W. 1998). Совокупность этих свойств позволяет подобным имплантатам параллельно с опорной (остеокондуктивной) функцией, обеспечивать биоинтеграцию, т.е. 4 врастание клеток и сосудов в структуры имплантированного материала (Thomson R.C. et. al. 1998).

Считается, что наиболее подходящими для трансплантации и последующей биоинтеграции являются аутоткани, чье использование полностью исключает иммунологические реакции после заполнения ими тканевых дефектов (Enneking W.F. et. al. 1980; Reddi A.H. 1985; Summers B.N. et al. 1989; Goldberg V.M. 2000). Однако их получение возможно только непосредственно в процессе оперативного вмешательства, где количество тканей ограничено, особенно у детей, а процедура их забора сопровождается рядом негативных последствий, как в процессе забора, так и после него. Все это существенно ограничивает широкое применение аутотканей (Bos G.D. et. al. 1983; Horowitz M.C. et al. 1991, 1993). Таким образом, задача создания биокомпозиционных материалов, применение которых может обеспечить формирование и восстановление кости в местах ее повреждения с одновременным снижением трудовых и финансовых затрат процесса устранения костных повреждений у больных с костной патологией во многом остается открытой.

Композиция материала может включать в себя несколько составляющих. Как один из вариантов, этими составляющими могут стать гликозами-ногликаны (ГАГ), которые являются компонентом костного матрикса регулирующие репаративные процессы. Известно, что полисахариды, входящие в состав протеогликанов, линейные полимеры, построенные из дисахаридных субъединиц, образованные уроновыми кислотами (глюкуроновой, галактуро-новой и идуроновой), N-ацетилгексозаминами (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин) и нейтральными сахаридами (галактозой, маннозой и ксилозой) называются гликозаминогликанами (Стейси М. с соавт. 1965). Обоснованием включения ГАГ в состав биокомпозиционных материалов является многолетняя история экспериментальных исследований, которая показала положительное влияние гликозаминогликанов на регенерацию костной, хрящевой, нервной и других тканей (Гамалея Н.Ф. 1946; Richterich R. et al. 1958; Слуцкий Л.И. 1969; Касавина Б.С. с соавт. 1970; Серов В.В. с соавт. 5

1981; Kalbhen D.A. et al. 1990; Glade M.J. 1990; Bassleer С. et al. 1992; Омель-яненко Н.П. с соавт. 2009). Известно, что зрелая костная ткань содержит в основном сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) — хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматансульфат и кератансульфат. Они представляют собой линейные полисахаридные полимеры, в физиологических состояниях представленные в виде комплексов с белками. Костный матрикс зрелой кости содержит коллагены, неколлагеновые белки, гликопротеиды и протеогликаны, в состав последних и входят сГАГ (Панасюк А.Ф. с соавт. 2000). Биосинтез протеогликанов в костной ткани осуществляется активиро-ваными остеобластами и в незначительной степени зрелыми остеоцитами (Juliano R. et al. 1993; Wendel M. et al. 1998). Сульфатированные ГАГ участвуют практически во всех процессах обмена соединительной ткани в первую очередь в формировании коллагеновых и эластиновых волокон (Панасюк А.Ф. с соавт. 2000). Очевидно, что роль сГАГ в регуляции остеогенеза достаточно значительная (Burger М. et al. 1962). В последнее время эти положения нашли свое подтверждение по итогам исследования процессов регенерации костной ткани (Pieper J.S. et. al. 2000; Омельяненко Н.П. с соавт. 2009).

Для выполнения опорной функции биокомпозиционного материала может быть использован искусственный или натуральный гидроксиапатит (ГА). В настоящее время для замещения костных дефектов в травматологии и ортопедии активно используются различные формы гидроксиапатита, отличающиеся по форме, величине частиц, пор и т.д. (Jarcho М. et al. 1977; Klein С.Р. et al. 1983; Parsons J. et al. 1988; Ripamonti U. et al. 1992; Воложин А.И. с соавт. 1993; Friess W. 1998). В этой связи логично использовать природный ГА, который входит в состав костной ткани наряду с коллагеном. Последний при этом сохраняет свою архитектонику. К основным достоинствам коллагена - как пластического биоматериала следует отнести его низкую токсичность и антигенность, высокую механическую прочность и устойчивость к тканевым протеазам (Истранов Л.П. 1976). Известно, что коллаген и ГА взятые по отдельности обладают в основном лишь остеокондуктивными свойст6 вами (Parsons J. et al. 1988; Mehlisch D.R. 1989). При объединении этих соединений в комплекс, они способны оказывать определенный остеоиндук-тивный эффект, хотя имеющиеся в литературе данные по этому вопросу достаточно противоречивы. И, наконец, если в данном комплексе будут присутствовать ещё и сГАГ, то такая композиция может иметь дополнительные ос-теоиндуктивные свойства.

Взяв за основу три основных компонента - костный коллаген и ГА, полученные из костной ткани животных (телята и свиньи), а также выделенные сГАГ (Панасюк с соавт. 2000; Панасюк А.Ф. с соавт. 2004) фирма «Конек-тбиофарм» разработала биокомпозиционный материал, который был представлен на рынок медицинских услуг. Продолжением этого направления стала совместная разработка «Конектбиофарма» с тканевым банком ЦИТО им. H.H. Приорова биокомпозиционного материала на основе аллогенных тканей (Снетков А.И. с соавт. 2001).

Настоящая экспериментально-клиническая работа посвящена оценке свойств биокомпозиционного материала нового поколения на основе алло-генного костного коллагена импрегнированного сГАГ, предназначенного для клинического использования в травматологии и ортопедии.

Цель исследования.

Экспериментальное изучение влияния пластических материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликоза-миногликанами на процесс регенерации костной ткани с использованием различных экспериментальных моделей и внедрение данного вида материалов в клиническую практику.

Задачи исследования.

1. Оценить влияние сГАГ на пролиферацию культур стромальных клеток костного мозга.

2. Изучить влияние сГАГ на свойства имплантатов на модели гетерото-пической имплантации.

3. Сравнить интенсивность и характер замещения имплантатов на основе костного коллагена с сГАГ и без них.

4. Разработать и внедрить в клиническую практику биокомпозиционный материал на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ.

5. Оценить результаты применения разработанного биокомпозиционного материала в клинике.

Научная новизна.

1. Проведено исследование влияния сГАГ на пролиферацию культуры стромальных клеток костного мозга.

2. На экспериментальных моделях гетеротопической и ортотопической имплантации показана целесообразность включения сГАГ в состав остеопла-стических биокомпозиционных материалов.

3. Разработан и внедрен в клиническую практику новый биокомпозиционный материал на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ.

4. Показана эффективность клинического применения имплантатов на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ при замещении пострезекционных дефектов костной ткани.

Практическая значимость.

1. Дана экспериментальная оценка влияния сГАГ на процессы регенерации костной ткани.

2. Доказана целесообразность введения сульфатированных гликозами-ногликанов в состав остеопластических биокомпозиционных материалов

3. Разработан и внедрен в клиническую практику биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген и сГАГ.

Внедрение результатов работы.

Биокомпозиционный материал на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген, сГАГ и гидроксиапатит внедрен в работу отделений косной патологии ФГУ ЦИТО им. Н.Н.Приорова, Московской областной детской ортопедохирургической больницы восстановительного лечения, ДГКБ №13 им. Н.Ф.Филатова г. Москвы.

Апробация работы.

Материалы исследования доложены на:

- Симпозиуме «Биоимплантология на пороге XXI века», Москва, 2001;

- Third World Congress on Tissue Banking and 26th Annual Meeting AATB, Boston, 2002;

- 11th International Conference on Tissue Banking and EATB Annual Meeting, Bratislava, 2002;

- II Всероссийском Симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии», Самара, 2004;

- 13th International Congress of the European Association of Tissue Banking, Prague, 2004;

- 4th World Congress on Tissue Banking, Rio de Janeiro, 2005;

- 5th Congress of Baltic Association for maxillofacial and plastic surgery, Kaunas, 2005;

- 3 Международном Конгрессе «Современные технологии в травматологии и ортопедии», Москва, 2006;

- III Всероссийском Симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Москва, 2007;

- IV Всероссийском Симпозиуме с международным участием: «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Санкт-Петербург, 2010;

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 22 работы. В том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получено 7 патентов на изобретения.

Объем и структура.

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 46 работ из отечественных и 100 работ из зарубежных источников, приложения. Иллюстрирована 71 рисунками, 4 таблицами, 4 диаграммами.

выводы

1. Растворы сульфатированных гликозаминогликанов в концентрации 50 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл не влияют на пролиферацию стромальных клеток костного мозга in vitro.

2. При гетеротопической имплантации образцы, содержащие сульфатироо ванные гликозаминогликаны дозой 700 мкг/см , стимулируют развитие более выраженной сосудистой сети по сравнению с контрольными образцами и, возможно, индуцируют гетеротопическое костеобразование.

3. Сульфатированные гликозаминогликаны дозой 700 мкг/смЗ препятствуют резорбции коллагена, входящего в состав имплантированных образцов.

4. При ортотопической имплантации образцы, содержащие сульфатированные гликозаминогликаны дозой 700 мкг/смЗ, достоверно увеличивают образование хрящевой ткани и способствуют заживлению костной раны через энхондральный тип костеобразования, что указывает на выраженные остеокондуктивные свойства материала.

5. Применение биокомпозиционного материала «Остеоматрикс» разработанного на основе костного коллагена аллогенного происхождения им-прегнированного сульфатированными гликозаминогликанами позволило добиться положительных результатов лечения у пострезекционными дефектами костей в подавляющем (89%) числе случаев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Современная травматология и ортопедия остро нуждается в костнопластических материалах, способствующих восстановлению целостности костной ткани при любых ситуациях, будь то травма или хроническое заболевание, ведущие к повреждению костной системы. Драматизм каждой конкретной ситуации, где существует необходимость в костнопластических материалах, может быть представлен или несрощенным переломом или значительным дефектом кости, вызванный онкологическим заболеванием, а также другими ситуациями, где для восстановления костной ткани нужны «импланта-ты». Выбор оптимально удобного материала с точки зрения хирурга для возмещения костного дефекта всегда представляет для последнего определенные трудности. Известно, что современные костнопластические материалы должны быть безопасными, где возможность переноса инфекций материалом полностью исключена. Они должны обеспечивать опорную и структурообразующую функцию в области поврежденной костной ткани, обладать остео-индуктивностью и биологической совместимостью, быть биодеградируемы-ми и не вызывать у реципиентов воспалительных и иммунологических реакций. К сожалению, большинство используемых в России материалов в реконструктивной хирургии не отвечают в полной мере всем вышеперечисленным требованиям.

Известно, что в процессе остеогенеза принимают активное участие основные компоненты межклеточного матрикса такие, как протеогликаны, гли-копротеины и коллаген, а также костные морфогенетические белки и факторы роста. Протеогликаны представляют собой белки, в состав которых входят сложные полисахариды, главным образом сульфатированные гликозами-ногликаны (сГАГ). В кости сГАГ представлены хондроитин-, дерматан- и ке-ратансульфатами, именно они и определяют основные функциональные характеристики костных протеогликанов. В ряде работ было показано, что сГАГ способны модулировать обмен клеток соединительной ткани и влиять на их дифференцировку (Серов В.В., Шехтер А.Б. 1981; Панасюк А.Ф. с со

96 авт. 2000). В научной литературе существуют единичные сообщения о влиянии сГАГ на репарацию костной ткани (Burger М. et al. 1962) при этом их роль в процессах её восстановления остается недостаточно изученной. Учитывая теоретическую обоснованность включения сГАГ в биокомпозиционные материалы и хорошие результаты использования подобных материалов в челюстно-лицевой хирургии, мы были вправе ожидать от «Остеоматрикса» подобных результатов в травматологии и ортопедии. В данной работе были рассмотрены возможность, эффективность и целесообразность использования сульфатированных гликозаминогликанов в составе биокомпозиционного материала, предназначенного для полноценного (органотипического) восстановления поврежденной опорной костной ткани. С этой целью были сделаны предварительные экспериментальные исследования.

Для исследования свойств сульфатированных гликозаминогликанов, выделенных в соответствие с патентом РФ № 2162331, в клеточных культурах стромальных клеток костного мозга мы использовали культуры стро-мальных клеток костного мозга с эксплантационной плотностью 5x105 ядерных клеток костного мозга по 4 флакона в каждой серии.

Проводили 3 серии исследований сГАГ в клеточных культурах. В культуральные флаконы с клеточной культурой с 10 мл ростовой среды добавляли сГАГ с конечной концентрацией (с учетом количества среды) 50 мкг/мл - 1 серия опытов, 250 мкг/мл — 2 серия, 500 мкг/мл — 3 серия. Каждая серия опытов включала по 4 флакона клеточных культур. В контрольной группе во флаконы с клеточной культурой раствор сГАГ не добавляли. Культивирование проводили в течение 7 дней.

Клетки из 3 флаконов из каждой серии опытов на 7 день культивирования снимали трипсином и подсчитывали количество клеток во флаконе в камере Горяева. По одному флакону клеточных культур из каждой серии опытов на 7 день культивирования фиксировали и окрашивали по методу Гимза-Романовскому для морфологического исследования клеточных культур.

Одновременно была проведена оценка возможной цитотоксичности растворов сульфатированных гликозаминогликанов и пролиферативной активности образцов. Для фотометрической оценки пролиферации и гибели клеток в культуре использовали МТТ-тест. МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетразолий бромид) восстанавливается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатдегидрогеназы до водонерастворимого тем-ноокрашенного формазана. Формазан был элюирован из клеток с помощью ДМСО. Определено, что оптическая плотность элюатов при длине волны 570 нм (максимум поглощения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце.

Результаты проведенных исследований с использованием культураль-ных сред показали отсутствие какого-либо стимулирующего влияния растворов сГАГ на скорость деления стромальных клеток костного мозга барана не зависимо от концентрации растворов сульфатированных гликозаминогликанов (50 мкг/мл, 250 мкг/мл и 500 мкг/мл). Между тем, очевидно, что сульфа-тированные гликозаминогликаны, выделенные в соответствие с патентом РФ № 2162331, не обладают цитотоксичностью, что, в свою очередь, не препятствует их использованию в клинической практике.

Образование или отсутствие элементов костной ткани в области помещения какого-либо материала в мягкие ткани является общепризнанным тестом на выявление остеоиндуктивных свойств исследуемых материалов — это, так называемая модель гетеропической имплантации. Для оценки эффекта остеоиндуктивности исследуемого материала 20 половозрелым крысам породы «Вистар» внутримышечно поместили коллагеновые блоки с сГАГ, коно центрацией 700 мкг/см . Блоки состояли из костного коллагена, полученного из губчатого слоя аллогенной костной ткани размером 3x3 мм. Контролем служили аналогичные образцы костного коллагена без сГАГ. Срок эксперимента составил 1 месяц.

Исследования гистологических препаратов показали, что в области помещения опытных образцах достоверных признаков остеогенеза обнаружено

98 не было. Однако в некоторых образцах имелись участки, в которых трабеку-лы были покрыты плотным слоем клеток, по своей морфологии напоминающие остеобласты. Состояние опытных образцов отличалось от контрольных большей сохранностью структур костного коллагена, состоянием межтрабе-кулярной соединительной ткани - менее зрелая, более «нежная», макрофа-гальным характером инфильтрата, который, однако, гораздо менее интенсивно резорбирует костный коллаген.

Для исследования влияния материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на регенерацию костной ткани был проведен эксперимент на модели ортотопической имплантации. В качестве экспериментальных животных использовали половозрелых кроликов породы «Шиншилла». Были сформированы 2 группы эксперимента по 10 кроликов, у животных опытной группы в сегментарный дефект лучевой кости имплантировали блоки, импрегнированные сГАГ дозой 700 мкг/см , а в контрольной группе дефект заполняли аналогичным материалом только без сГАГ. Рентгенологические сроки наблюдения составили 2 недели, 1, 2 и 3 месяца. Оценку эксперимента провели по данным рентгенологического и морфологического исследований.

Визуальный анализ рентгенологических снимков не выявил каких-либо явных отличий и особенностей на стадиях восстановления костных дефектов с помощью материалов или импрегнированных сГАГ или без таковых. Сроки восстановления целостности лучевых костей в обеих группах эксперимента были схожими.

Гистоморфометрические исследования ткани в области дефекта показали, что костный коллаген, при ортотопической имплантации в костную ткань лабораторным животным вызывает умеренно выраженный остеогенез, проявляющийся в формирование костной, хрящевой или фиброзной ткани. Насыщение костного коллагена сульфатированными гликозаминогликанами достоверно стимулирует образование хрящевой ткани. Анализируя полученные результаты данного морфологического исследования, было сделано

99 предположение, что сГАГ непосредственно не индуцируют остеогенез, но создают оптимальную среду для пролиферации и дифференцировки остео-генных клеток и усиливают действие имеющихся факторов роста.

Анализ результатов исследования гетеропического остеогенеза созвучен с анализом ортотопического эксперимента — сульфатированные гликоза-миногликаны создают некоторые дополнительные благоприятные условия для регенерации костной ткани.

Для клинического использования был разработан биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген, сГАГ и гидроксиапатит. Клиническая оценка эффективности разработанного материала «Остеоматрикс» в травматологии и ортопедии была проведена, основываясь на результатах лечения 54 больных с различной костной патологией. Подавляющее число пациентов, вошедших в исследование, получили хирургическое лечение по поводу костных опухолей и опухо-леподобных заболеваний. Контроль восстановления костной ткани пациентов осуществляли клиническими, рентгенологическими и компьютерно-томографическими методами лучевой диагностики. Части больным имплантировали только «Остеоматрикс», другие получили исследуемый материал вместе или с ДКИ «Перфоост», изготовленными по технологии ЦИТО (Ле-кишвили М.В. 2005) или с аллоимплантатами из кортикального слоя донорских костей, изготовленными с использованием паров формалина и хранящихся при отрицательных температурах (Парфентьева В.Ф. с соавт. 1969). Также в отдельных случаях комбинацию «Остеоматриксу» составил биокомпозиционный препарат на основе синтетического гидроксиапатита «Колла-пан».

Средние сроки восстановления целостности кости небольших дефектов при изолированном использовании «Остеоматрикса» составили от 4 месяцев до 11 месяцев (Лекишвили М.В. с соавт. 2002; Васильев М.Г. с соавт. 2006), в то время когда средние сроки восстановления кости при опухолеподобных заболеваниях после пластики дефектов ДКИ «Перфоост» составили 6-13

100 месяцев (Касымов И.А. 2000, Тарасов Н.И. с соавт. 2002). При массивной пластике ДКИ очагов фиброзной дисплазии полная перестройка аллоимплантатов проходила от 16 месяцев и более. Когда с «Остеоматриксом» использовали замороженные кортикальные аллоимплантаты, сроки регенерации костной ткани были 30 месяцев и более (Снетков А.И. с соавт. 2003).

Анализируя результаты хирургического лечения с использованием различных костнопластических и иных материалов необходимо отметить, что отдельно «Остеоматрикс» применялся при сравнительно небольших костных дефектах (до 12 см ) и, как правило, в ненагружаемых отделах скелета. В нашем наблюдении общее число положительных результатов хирургического лечения с использованием «Остеоматрикса» составило 89%. Однако стоит отметить, что почти все случаи осложнений связаны с рецидивом основного заболевания, а не с применением в ходе лечения остеопластических материалов. Неудовлетворительным результатом применения «Остеоматрикса» в сочетании с «Перфоостом» можно признать один случай. В тех случаях, когда в ходе хирургического лечения кроме «Остематрикса» требовался дополнительный материал или дополнительное проведение металлоостеосинтеза вероятность удовлетворительного результата лечения снижалась. Это были больные, как правило, с наиболее тяжелыми и обширными поражениями костных структур.

Несомненно, новый материал имеет право быть допущен к использованию в клинической практике у больных с костной патологией, он не токсичен, удобен при заполнении костных дефектов, в конечном счете, способствует формированию новых тканей реципиента.

Результаты комплексных исследований в эксперименте in vivo и in vitro, сравнительный анализ использования нового костнопластического материала «Остеоматрикс» при выполнении в клинике реконструктивных операций с другими костнопластическими материалами и позволили сделать несколько выводов.