Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Разработка биокомпозиционного материала, содержащего L-аргинин, для замещения костных дефектов при хирургических стоматологических вмешательствах

На правах рукописи УДК: 616.314-089.844:615.466

СМЕШКО НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА

□□3485484

РАЗРАБОТКА БИОКОМПОЗИЦИОННОГО МАТЕРИАЛА, СОДЕРЖАЩЕГО Ь-АРГИНИН, ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКИХ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ ВМЕШАТЕЛЬСТВАХ

14.00.21 - «Стоматология» 14.00.25 - «Фармакология, клиническая фармакология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 ДЕК 2009

Москва - 2009

003485484

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава», ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава».

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Иванов Сергей Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ломакин Михаил Васильевич

Ведущая организация: ГОУ «Институт повышения квалификации федерального медико-биологического агентства России»

заседании диссертационного совета Д208.041.07 ^ 1осковский

государственный медико-стоматологический университет Росздрава» (г. Москва, ул. Вучетича, д. 9а).

Почтовый адрес: 127205, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доцент Дашкова О.П.

доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович

Защита состоится «/ ;:>> > !

1

часов на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, для заполнения дефектов, возникающих после удаления зубов, опухолей и опухолеподобных образований, с целью предотвращения возможных осложнений, а также для ускорения регенерации костной ткани используется большое количество биогенных и синтетических материалов.

В последние годы предпочтение отдается отечественным биокомпозиционным материалам, так как они по своим свойствам не уступают зарубежным аналогам, кроме того, стоимость их значительно ниже. Препараты фирмы «Полистом» Гидрогсиопол и Колапол, КоллаАн-JI, фирмы «Интермедапатит» «Остим-ЮО», препараты фирмы «Коннектбиофарм» Биоматрикс, Алломатрикс-имплант, Остеоматрикс, хорошо изучены в эксперименте и клинической практике, широко используются (Белозеров М.Н., 2003, Панин A.M., 2004, Аснина С.А. и соавт., 2004).

ГОУ ВПО МГМСУ разработаны новые остеопластические материалы серии «ОСТЕОПЛАСТ», На основе костного деминерализованного и недеминерализованного коллагена с сульфатированными

гликозаминогликанами (сГАГ).

В настоящее время ведется поиск новых «наполнителей», добавление которых в имплантируемый остеопластический материал, будет способствовать улучшению микроциркуляции в области операции, тем самым оптимизировать процессы регенерации костной ткани в месте дефекта.

Одним из перспективных направлений научных разработок представляется использование препаратов оксида азота (NO), стимулирующих неоангиогенез. К таким препаратам относится L-аргинин, условно незаменимая аминокислота, являющаяся донором азота.

Основные исследования по использованию L-аргинина посвящены лечению гипертонической болезни (Е.Б. Манухина и соавт., 2002, Mitsuyata Н. et al, 1995).

По данным Степанова Ю.М. и соавт. (2005), Ь-аргинин укрепляет иммунную систему, увеличивая активность Т-клеточного иммунитета, улучшает микроциркуляцию в поврежденных тканях.

Учитывая, что любое хирургическое вмешательство приводит к расстройству микроциркуляции и снижению показателей резистентности организма, использование Ь-аргинина в качестве «наполнителя» к биокомпозиционному материалу, может способствовать восстановлению кровотока, следовательно, ускорению регенерации костной ткани в зоне имплантации, а так же нормализации показателей местного иммунитета полости рта.

Поиск препаратов, в качестве «наполнителя» к имеющимся биокомпозиционным материалам, способствующим восстановлению микроциркуляции и ускоряющих регенерацию костной ткани, как в эксперименте, так и в клинике, после операций на челюстных костях, является актуальной темой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Цель исследования.

Разработка биокомпозиционного материала, содержащего Ь-аргинин. Внедрение его в клиническую практику для замещения костных дефектов, а также для профилактики осложнений и ускорения неоангиогенеза в зоне послеоперационного дефекта в челюстных костях. Задачи исследования.

1. Разработать новый биокомпозиционный материал, содержащий Ь-аргинин.

2. Экспериментально изучить влияние нового биокомпозиционного материала в сравнении с известными остеокондуктивными биоматериалами на регенерацию костной ткани.

3. Оценить влияние нового биокомпозиционного материала на послеоперационное заживление раны и регенерацию при заполнении дефектов челюстных костей при хирургических стоматологических вмешательствах.

4. Разработать рекомендации по использованию нового биокомпозиционного материала.

Научная новизна. Впервые в эксперименте и в клинической практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для замещения послеоперационных дефектов челюстных костей, использован биокомпозиционный материал, насыщенный Ь-аргинином. Проведен математический анализ состояния костной ткани на этапах регенерации с использованием цифровой и компьютерной томографии. На основании данных экспериментального исследования разработана методика использования Ь-аргинина для насыщения биокомпозиционного материала.

Практическая значимость. Экспериментальными, лабораторными и клиническими исследованиями научно обоснована и подтверждена эффективность использования биокомпозиционного материала, содержащего Ь-аргинин в практике хирургической стоматологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработан новый биокомпозиционный материал на основе костного коллагена, содержащий Ь-аргинин.

2. Результаты экспериментальных исследований изучения биосовместимости, остеорепарации и микроциркуляции нового биокомпозиционного материала, содержащего Ь-аргинин.

3. Результаты внедрения разработанного биокомпозиционного материала, содержащего Ь-аргинин, в клинику для заполнения костных дефектов при хирургических стоматологических вмешательствах.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, кафедры челюстно-лицевой хирургии и имплантологии ФПКВ Ниж. ГМА для преподавания студентам, интернам, ординаторам, аспирантам и слушателям курсов повышения квалификации. В хирургическое отделение поликлиник на базе Московского государственного медико-стоматологического университета и на базе Нижегородской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Результаты работы доложены на научно-практической конференции стоматологов и челюстно-лицевых хирургов центрального федерального округа Российской Федерации с международным участием «Технологии XXI века в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии», Россия, г. Тверь, 30-31 октября 2008 г.; на IX Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в стоматологии и имплантологии», г. Саратов, июнь 2008 г.; на IV восточно-европейской конференции по имплантологии, Украина, г. Львов, март 2009 г.; на международной конференции "Имплантация в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии", Белоруссия, г. Минск, июнь 2009 г. Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО МГМСУ, фармакологии МГМСУ, фармакологии КГМУ от 24.06.2009 г.

Личный вклад диссертанта в выполнение исследования. Автором лично проведены оперативные вмешательства в эксперименте на животных. Также были обследованы и пролечены 24 пациента с радикулярными кистами челюстей, 25 пациентов с ретенцией и дистопией третьих моляров, выполнено 15 синус-лифтингов и 15 зубосохраняющих операций. Статистически обработаны результаты исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения и следующих глав: обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы включает 168 источников, из них отечественных 83, зарубежных 85. Диссертация иллюстрирована 71 рисунком, микрофотографиями и рентгенограммами, содержит 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ

Материалы и методы исследования. В экспериментальной работе использовали L-аргинин производства Eurobiopharm (МЗ РФ. РУ № 77.99.02.916.Б.000485.08.03). Деминерализованный и недеминерализованный костный коллаген производства ООО « НПК ВИТАФОРМ» г. Москва (Per. Уд. .№ ФС 01262005/1950-05 от 20.07.2005, Сертификат соответствия: РОСС RU. ИМ 18.В 00029). Материал костного коллагена, в виде блоков и крошки, насыщали L-аргинин ом при концентрации 1000 мкг/см3 и высушивали методом лиофилизации. Затем стерилизовали потоком быстрых электронов дозой 1825,0 Мрад. Устойчивость L-аргинина к стерилизующей дозе радиации определяли следующим образом.

Используемые реактивы и посуда:

- натрий хлористый (ГОСТ 4233-77), изотонический раствор - 0,9%: 0,9 г натрия хлорида растворяют в мерной колбе на 100 мл в воде очищенной, доводят до метки водой очищенной, перемешивают;

- 0,1 М раствор натра едкого (ГФ XI, вып. 2, стр.66);

- конические колбы вместимостью 100 мл с притертой пробкой;

- мерные колбы вместимостью 50 мл, 25 мл;

- пипетки мерные на 5 мл, цилиндр мерный на 50 мл;

- сканирующий спектрофотометр «Сагу» Швеция.

Определение концентрации субстанции L-аргинина после стерилизации. Около 0,05 г (точная навеска) пробы субстанции после стерилизации, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 0,1 М раствора едкого натра, перемешивают в течение 5-10 минут до полного растворения образца, доводят объем раствора до метки 0,1 М раствором едкого натра, перемешивают (раствор А).

5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 0,1 М раствором едкого натра, перемешивают (раствор Б).

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 216 нм, используя в качестве раствора сравнения 0,1 М раствор едкого натра.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора (В), приготовленного таким же образом с использованием исходной субстанции Ь-аргинина.

Количественное содержание Ь-аргишша (X, %) в пробе субстанции после стерилизации, в сравнении с исходной субстанцией вычисляют по формуле (1)

0,*а„»5*50*25*100 0,*а„*100

х=--------------------------=-----------------Где,

0п*50*25*а,*5 0„*а,

О] и Эо - оптическая плотность раствора пробы 4 и исходной субстанции соответственно;

а[ и а0 - навески пробы субстанции после стерилизации и исходной субстанции соответственно, г.

Количественное определение Ь-аргишша в костном коллагене после насыщения. 0,5 см3 материала, насыщенного Ь-аргинином, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл изотонического раствора натрия хлорида (0,9% раствор), отмеренного мерной колбой. Колбу закрывают пробкой, содержимое перемешивают в течение 5 минут и оставляют в статическом состоянии при комнатной температуре. Через определенный промежуток времени пипеткой отбирают 5 мл раствора и помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 0,1 М раствором едкого натра, перемешивают (раствор Г).

В коническую колбу с губкой пипеткой добавляют 5 мл изотонического раствора натрия хлорида (0,9% раствор).

Измеряют оптическую плотность полученного раствора Г на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 214 нм, используя в качестве раствора сравнения: 5 мл изотонического раствора

натрия хлорида (0,9% раствор) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят до метки 0,1 М раствором едкого натра, перемешивают.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора В, приготовленного из исходной субстанции L-аргинина: 0,05 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают в течение 5-10 минут до полного растворения образца, доводят объем раствора до метки изотоническим раствором натрия хлорида, перемешивают (раствор А).

5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 0,1 М раствором едкого натра, перемешивают (раствор Б).

Количество L-аргинина (X, г/мл), перешедшего в раствор из губки за определенный промежуток времени, вычисляют по формуле (2): D,*ai*5*50*25 D,*a*

Y = __________________________ = ________________

Do*50*25*l*5 Do

Где D| и D0 - оптическая плотность раствора Г пробы и раствора В исходной

субстанции соответственно;

а0- навеска исходной субстанции, г;

Экспериментальные и морфологические исследования по изучению биосовместимости костного деминерализованного коллагена, насыщенного L-аргинином, у крыс, а так же исследования микроциркуляции после экспериментальных имплантаций деминерализованного коллагена (контроль) и деминерализованного коллагена, насыщенного L-аргинином (опыт), методом лазерной доплеровской флоуметрии проводили на базе кафедры фармакологии Курского государственного медицинского университета (руководитель д.м.н. профессор Покровский В.М.).

Для получения данных микроциркуляции использовалось оборудование производства компании Biopac systems: полиграф MP 100 с модулем лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным датчиком TSD144, регистрация и обработка данных производилась с помощью программы

AcqKnowiedge версии 3.8.1., показатели микроциркуляции имели вид ЛДФ-грамм и выражались в перфузионных единицах (ПЕ).

Морфологическое исследование полученных образцов производили путем оптической микроскопии срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, по Ван-Гизон, по Маллори.

Статистический анализ полученных данных осуществлялся в программе Microsoft Excel 10.0 при помощи средств пакета анализа. Рассчитывались средние значения показателей микроциркуляции, стандартные ошибки. Для оценки достоверности различий в группах использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями; различия между группами считали достоверными при уровне надежности а=0,05.

Второй этап экспериментальных исследований был проведен на базе вивария МГМСУ на кроликах породы Шиншилла (искусственно формировался костный дефект на лучевой кости кролика с помощью физиодиспенсера, с последующей имплантацией костного недеминерализованного коллагена, насыщенного L-аргинином). Морфологические исследования проводили на базе кафедры патологической анатомии Российской медицинской академии последипломного образования под руководством профессора, доктора медицинских наук Г.Г. Автандилова.

Клиническая часть. В период с 2007 по 2009 год в хирургическом отделении стоматологического комплекса МГМСУ, а также на базе НижГМА проведено комплексное обследование и лечение 89 пациентов, с использованием биокомпозиционного материала «Остеопласт», насыщенного L-аргинином. Всеми пациентами была заполнена анкета по информированному согласию на оперативное вмешательство с использованием биоматериалов при заполнении послеоперационных дефектов. Пациенты распределены в группы по типу хирургических вмешательств.

Предоперационное обследование состояло из лабораторного (ОАК, б\х анализ крови, кровь на сахар, ВИЧ, RW, HbS, HCV) и рентгенологического исследований (компьютерная томография, ортопантомография). Перед

операцией больных информировали о характере и объеме хирургического вмешательства. В день оперативного вмешательства внутримышечно назначали препараты: дексаметазон 4 мг, дицинон 250 мг, линкомицин 30%-2,0 мл; обработка ротовой полости раствором хлоргексидина 0,05 %. После оперативного вмешательства назначалась антибактериальная и противовспалительная терапия: амоксиклав 625 мг 2 раза в день 7 дней, кетонал по 1 таблетке 2 раза в день при боли, кларитин по 1 таблетке 1 раз в день, антисептическая обработка ротовой полости.

На ортопантомографию пациент направлялся при первичном обращении, на 7-е сутки после операции, через 1, 3, 6 месяцев и через год после проведения операции.

Основные результаты собственных исследований.

Итак, в ходе экспериментальных исследований нам предстояло решить следующие вопросы:

- возможность насыщения L-аргинином биоматериала, разработанного ранее на основе костного коллагена;

- биосовместимость этого материала;

- его влияние на процессы регенерации костной ткани.

Опыты были проведены в 2 этапа. 1-й этап проводился на базе Курского Медицинского Университета. Для проведения эксперимента использовались 70 крыс линии Wistar обоего пола массой 150-250 г, которые в результате рандомизации по полу и весу были разделены на 7 групп (таблица №1)

Таблица №1. Распределение животных по группам

№ группы Ход эксперимента Количество крыс в группе

1 Интактные крысы с переломами бедра 10

2 Крысы с имплантированным подкожно ГАП 10

3 Крысы с имплантированным внутримышечно ГАП 10

4 Крысы с имплантированным параоссально ГАП на фоне перелома бедра 10

5 Крысы с имплантированным подкожно костным коллагеном, насыщенным Ь-аргинином 10

6 Крысы с имплантированным внутримышечно костным коллагеном, насыщенным Ь-аргинином 10

7 Крысы с имплантированным параоссально костным коллагеном, насыщенным Ь-аргинином, на фоне перелома бедра 10

Всего животных в эксперименте 70

• При этом группы №2, №3, №5, №6 использовались для исследования биосовместимости;

• Группы №1, №4, №7 использовались для изучения влияния материала на регенерацию костных дефектов.

Для более детального изучения процессов остеорепарации был проведен второй этап эксперимента на кроликах породы Шиншилла массой 2,5 - 3 кг в количестве 60 штук (Таблица №2)

Таблица №2. Распределение животных по группам

№ группы Ход эксперимента Количество кроликов в группе

1 Кролики с имплантированным материалом, насыщенным Ь-аргинином, под коньюктиву глаза 15

2 Кролики с имплантированным материалом, насыщенным Ь-аргинином подкожно 15

3 Кролики с имплантированным материалом, насыщенным Ь-аргинином, в дефект лучевой кости 15

4 Кролики с имплантированным ГАП в дефект лучевой кости (контрольная группа) 15

Всего животных в эксперименте 60

• При этом группы №1, №2 использовались для исследования биосовместимости;

• Группа №3, №4 - для изучения влияния материала на регенерацию костных дефектов.

Результаты насыщения Ь-аргинином биоматериала. После насыщения материала Ь-аргинином, его стерилизовали и исследовали количественное содержание Ь-аргинина.

Анализ проведен в двух параллельных определениях, получены результаты:

1) а! = 0,0500г;а0 = 0,0501 г;

Б, = 0,623 ; Эо = 0,644 Х1 = 96,93%

Хср. = 96,9%

2)а1 = 0,0502г;ао = 0,0501г;

Б, = 0,625; Б0= 0,644 Х2 = 96,86%

Где,

и Бо - оптическая плотность раствора пробы 4 и исходной субстанции соответственно;

а! и ао - навески пробы стерильной и исходной субстанции соответственно, г.

Таким образом, Ь- аргинин, входящий в состав материала не изменяет своего количественного состава. Ь- аргинин, входящий в состав костного коллагена, после стерилизации также не изменяет своего состава. Результаты этого исследования показаны в таблице №3.

Таблица №3. Результаты исследования после стерилизации.

1 час 3 часа 6 часов 24 часа

азца Оптич еск. плотно сть Результ ат, г/мл Оптичес к. плотност ь Результа т, г/мл Оптиче ск. плотно сть Результа т, г/мл Оптиче ск. плотно сть Результат, г/мл

>ба 1 0,055 0,0050 0,035 0,0032 0,030 0,0027 0,036 0,0032

>ба 2 0,069 0,0062 0,024 0,0022 0,045 0,0040 0,068 0,0061

>ба 3 0,062 0,0056 0,033 0,0030 0,038 0,0034 0,074 0,0067

Где масса материала пробы 1 = 0,1012г, пробы 2 = 0,0828г, пробы 3 = 0,1647 г.

При расчете по формуле (2) навеска исходной субстанции ао = 0,050 г; оптическая плотность D0 = 0,556.

При проведении анализа для определения количества, перешедшего из материала в раствор, аликвоты, из колбы отбирали через 1 час, 3 часа, 6 часов и 24 часа.

Анализ проб 2 и 3 проведен в двух параллельных определениях. Таким образом, стерилизующая доза не влияет на количественный состав L-аргинина как в стерильной субстанции, так и в материале после его насыщения.

Учитывая, что к материалам контактирующим с кровью пациента предъявляются определенные требования по биосовместимости, не токсичности, эффективности и устойчивости к действию биологических жидкостей, при имплантации в ткани организма нами была проведена серия экспериментов по биосовместимости материалов на основе костного коллагена, насыщенных L-аргинином.

В опытах на животных было изучено:

1. Течение послеоперационного периода под влиянием имплантированного материала;

2. Влияние биоматериала на развитие сосудов при имплантации под кожу и внутримышечно у крыс;

3. Влияние биоматериала на развитие сосудов при имплантации под кожу кроликов;

4. Воздействие биоматериала на окружающие имплантат ткани глаза кроликов.

В первой серии экспериментов изучали влияние костного деминерализованного коллагена, насыщенного L- аргинином на биосовместимость у крыс на базе Курского медицинского Университета.

Результаты этих экспериментов показали, что при имплантации материала в подкожную клетчатку на срок 1 месяц после операции, во всех исследованных препаратах отмечается заполнение межтрабекулярных

пространств имплантата рыхлой волокнистой соединительной тканыо, формирующей капсулу вокруг трабекул. На срок 1 месяц после операции очевидное большинство в популяции клеток составляют фибробласты.

Рис.№1.Участок гистологической картины в подкожной клетчатке крысы через 1 месяц после операции. Соединительнотканная капсула вокруг имплантата. Окраска по Крейбергу.

Таким образом, при имплантации костного деминерализованного коллагена, насыщенного Ь- аргинином в подкожную клетчатку и мышечную ткань крыс отмечается слабая воспалительная реакция вокруг материала,которая заканчивается на сроки 2-3 месяца после операции.

В настоящее время многие исследователи связывают эти реакции с повышением активности N0 синтетазы, фермента содержащегося в клетках, способного активировать неоангиогеиез. Донором клеточного N0, является I.-аргинин, который активирует макрофагальиую активность вокруг имплантата.

(Мопсас1а 5.. Иввэ Е.А. N0 - уазосШа1а1ог. ИдреПуешюп. Ыеи/ I Моё.

1993; 329: 2002-2012).

Импдантаты, на основе костного коллагена насыщенные Ь-аргинином,

региональной микроциркуляции, что способствует ускорению репаративных | процессов и увеличению количества положительных результатов консолидации экспериментальных переломов.

Ув. 200.

введенные внутримышечно и параоссально, увеличивают показатели

" | к: - ' Ж : л

Рис.№2.Гистологическая картина участка локализации имплантата в зоне экспериментального перелома через 1 месяц. Участок хрящевой ткани вокруг имплантата. Прослойка фибробластов между имплантатом и массивом остеоидной ткани. У в. 200. Окраска гематоксилин-эозином.

Рис.№3.Гистологическая картина участка локализации имплантата в зоне экспериментального перелома через 2 месяца. Формирование костной ткани вблизи имплантата. Переход коллагеновых волокон в участок остеоидной ткани. Ув.ЮО. Окраска

по Маллори.

Таким образом, все биоимплантаты, вне зависимости от насыщенности L-аргишшом и места введения, через 4 недели после начала эксперимента подвергались лизированию и, в той или иной степени, замещению соединительной тканью.

Увеличение количества положительных исходов консолидации экспериментальных переломов в группах №4 и №7 (до 100%) по сравнению с группой №1 (70%) можно объяснить с позиций благотворного влияния операции костной пластики на результат сращения экспериментальных

переломов. Однако в ходе эксперимента было обнаружено, что через 4 недели после экспериментального перелома костная мозоль более выражена у животных из группы №7 (крысы с биоимлантатом, насыщенным Ь-аргинином), что является свидетельством ускорения регенерации костной ткани в данной группе крыс.

Измерение уровня микроциркуляции было осуществлено у всех животных из групп №3 и №6 (при имплантации материала в мышцу), у опытных №4, №7 - по месту введения имплантата и в мышце рядом с ним, а в контрольной группе №1 - в мышце и в межфрагментарной зоне перелома.

Полученные данные ЛДФ в виде индивидуальных значений у каждого животного и средних по группам с учетом стандартных ошибок представлены в таблицах №4 и №5.

Таблица №4. Результаты ЛДФ у интактных крыс в группе № 1.

№ № Значение микроциркуляции Значение микроциркуляции

груп- кры- в мышце, 1Ш в зоне перелома, ПЕ

пы сы Индивидуальное Среднее Индивидуальное Среднее

1 508,4 95,8

2 305,8 67,1

3 328,9 66,5

4 241,7 65,3

1 5 665,8 542,6±65,9 135,5 99,6 ±9,4

6 428,4 75,7

7 687,8 120,8

8 653,6 101,3

9 824,5 134,2

10 781,2 133,6

Таблица №5. Результаты ЛДФ у крыс групп №3, №4, №6, №7

№ группы № крысы Значение ЛДФ в месте введения биоимплантата, ПЕ Значение ЛДФ в мышце около введения биоимплантата, ПЕ

Индивидуальное Среднее Индивидуальное Среднее

3 1 304,5 314,6±45,4* 626,2 617,4±47,5

2 156,2 430,9

3 239,8 547,4

4 134,3 520

5 435,1 653,6

6 494,9 807,4

7 501 897,7

8 151,4 424,2

9 432,1 647,6

10 297,2 618,8

1 55,5 184,3

2 108 1014,3

3 62,8 363,7

4 50,6 144

4 5 104,3 94,4±10,8 627,4 561,1±118,2

6 71,4 393,6

7 152,6 1340,2

8 89,1 521,2

9 123,9 670,7

10 126,3 352,1

1 185,7 824,5

2 174,5 791,6

3 441,2 1112,6

4 493,7 1722,2

6 5 328,3 327,8±38,9* 1054,6 1046,3±87*

6 362,5 1072,9

7 328,9 1057,3

8 299,6 994,2

9 173,9 730,5

10 489,4 1102,8

1 90,3 403,4

2 177 1431,1

3 73,2 217,3

4 112,3 484,6

7 5 97,6 117,1±9,7 506,5 728,2±112,5

6 117,2 766,5

7 131,2 846,5

8 134,9 972,2

9 143,4 1022,8

10 93,4 631,6

Примечание: * - р<0,05 в сравнении со значением микроциркуляции в мышце у

интактных крыс;

Анализ результатов лазерной допплеровской флоуметрии показал, что при внутримышечном введении биоимплантатов в группах №3 и №6 наблюдалось достоверное снижение уровня микроциркуляции непосредственно в месте имплантации (в результате замещения биоимплантата соединительной тканью) до 314,6±45,4 ПЕ и 327,8138,9 ПЕ соответственно по сравнению с 542,6+65,9 ПЕ у интактных крыс. Тем не менее в группе №3 происходило увеличение уровня региональной микроциркуляции до показателей 617,4±47,5 ПЕ, а в группе №6 - достоверное повышение микроциркуляции до значения 1046,3±87

ПЕ (р<0,05). В группе №4 не было выявлено статистически значимых отклонений от группы интактных животных. Результаты ЛДФ в группе №7 показали увеличение уровня микроциркуляции как в месте параоссального введения биоимплантата (117,1±9,7 ПЕ по сравнению с 99,6±9,4 ПЕ у интактных крыс), так и в непосредственной близости от места его введения (728,2+112,5 ПЕ по сравнению с 542,6±65,9 ПЕ у интактных крыс), однако достоверность в различиях между группами животных наблюдалась лишь при р<0,2.

Результаты оптической микроскопии гистологических препаратов подтвердили данные, полученные в ходе измерения микроциркуляции, о процессах лизирования биоимплантатов и их замещения соединительной тканью при подкожном и внутримышечном ведении, а также консолидации переломов с участием биоимплантатов при параоссальном их введении.

Подводя итоги эксперимента в целом, мы можем сказать:

1. Биоимплантаты на основе костного коллагена, насыщенные Ь-аргинином, через 4 недели после их подкожного, внутримышечного и параоссального введения подвергаются практически полному лизированию и замещению соединительной тканью, что свидетельствует о их биосовместимости.

2. Биоимплантаты на основе костного коллагена, насыщенные Ь-аргинином, введенные внутримышечно и параоссально, увеличивают показатели региональной микроциркуляции, что способствует ускорению репаративных процессов и увеличению количества положительных результатов консолидации экспериментальных переломов.

3. Разработанный новый биокомпозиционный материал, содержащий Ь-аргинин, обладает выраженными свойствами остеогенеза.

Клиническая часть работы, которая заключалась во внедрении биоматериала, насыщенного Ь-аргинином, в клиническую практику, проходила в хирургическом отделении стоматологического комплекса МГМСУ, а также НижГМА.

Проведено комплексное обследование и лечение 89 пациентов в возрасте от 19 до 64 лет, женщин 45, мужчин 44, с использованием биокомпозиционного материала «Остеопласт» насыщенного Ь-аргинином. Всеми пациентами была заполнена анкета по информированному согласию на оперативное вмешательство и использование биоматериалов при заполнении послеоперационнх дефектов.

По возрасту больные распределились следующим образом: 19 - 25 лет - 18 больных, 26 - 34 лет - 20 больных, 35 - 44 лет - 16 больных, 45 - 54 лет - 18 больных, 55-64 лет - 17 больных.

Также пациенты были распределены по типу хирургических вмешательств. Таблица №6.

Хирургическое вмешательство Количество пациентов Мужчины Женщины

1. Удаление 8-х зубов на нижней челюсти 25 15 10

2. Цистэктомия 24 11 13

3. Синус-лифтинг 15 5 10

4. «Сендвич»-пластика 10 5 5

5.3убосохраняющие операции 15 8 7

Обследование больных проводилось по стандартной схеме, включая жалобы, анамнез, развитие настоящего заболевания, наличие и или отсутствие сопутствующей патологии. Составлялся план лечения для каждого пациента. Особое внимание уделялось жалобам больного в послеоперационном периоде, так как одной из задач нашего исследования являлось определить влияние биокомпозиционного материала на послеоперационное течение.

Поскольку основной задачей нашего исследования являлось изучение регенерации костной ткани при использовании биокомпозиционного материала в определенные сроки, особое внимание уделялось качеству

20

рентгенограмм. Проводилась сравнительная оценка стандартных и цифровых рентгенограмм на этапах лечения.

Все пациенты в послеоперационном периоде чувствовали себя удовлетворительно. Отёк мягких тканей был слабо выражен. Повышенной температуры не наблюдалось. Противовоспалительная и антибактериальная терапия назначалась с целью профилактики возможных осложнений.

Таким образом, оценивая результаты клинического внедрения биокомпозиционного материала, содержащего Ь-аргинин, при хирургических стоматологических вмешательствах, можно сказать, что этот материал не вызывает воспалительных процессов в послеоперационном периоде. Хорошо переносится пациентами, ускоряет регенерацию костной ткани в зоне сформированных дефектов после хирургических вмешательств. А также следует отметить, что впервые в группе пациентов с операциями «сэндвич-пластика», а так же при проведении синус-лифтинга был использован биокомпозиционный материал, содержащий Ь-аргинин, без добавления аутокости, при этом получен планируемый прирост костной ткани.

Биоимплантаты на основе костного коллагена, насыщенные Ь-аргинином, при успешном их внедрении в клиническую практику, позволят уменьшить сроки реабилитации больных с послеоперационными дефектами челюстных костей, сократить общее время нетрудоспособности данной категории больных, а также предотвратить возможные осложнения в ближайшие и отдаленные сроки после оперативного вмешательства за счет оптимизации процессов регенерации костной ткани.

выводы

1. Разработан новый биокомпозиционный материал на основе деминерализованного и не деминерализованного костного коллагена, содержащий Ь-аргинин, с дозой насыщения 1000 мкг/см. куб..

2. Экспериментально доказано, что материал созданный на основе костного коллагена и Ь-аргинина является биосовместимым и хорошо интегрирует в окружающие ткани при имплантации.

3. Анализ гистологических препаратов позволяет сделать заключение о том, что новый биокомпозиционный материал, наряду с остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами, способствует процессам васкуляризации и улучшает микроциркуляцию заживающей костной раны.

4. Биоматериал, содержащий Ь-аргинин, способствует оптимизации регенерации костной ткани при заполнении им костных дефектов при хирургических стоматологических вмешательствах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения репаративных свойств биоматериалов рекомендовано добавлять в них компоненты, стимулирующие неоангиогенез, - Ь-аргинин.

2. При замещении дефектов костной ткани, исследуемый биоматериал насыщенный Ь-аргинином, при рыхлом укладывании хорошо пропитывается кровью, сохраняет форму и фиксацию в ране в течение всего срока регенерации костной ткани.

3. При использовании в хирургической стоматологии для замещения костных дефектов новый биоматериал, «Остеопласт-К», насыщенный Ь-аргинином, обеспечит заживление без воспалительных осложнений в послеоперационном периоде.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Артюшкова Е.Б., Пашков Д.В., Суковатых Б.С., Мясников А.Д., Смешко Н.В., Покровский В.М., Иванов С.Ю., Ахмедзянова И.Н., Дудка В.Т., Артюшкова Е.В. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте. //Кубанский медицинский вестник. Краснодар, 2007 г., с 19 - 22.

2. Аснина С.А., Смешко Н.В. Использование биокомпозиционных материалах при хирургическом лечении периапикальных деструктивных изменений. // «Институт стоматологии», г. Санкт-Петербург, вып.2 (35), июнь 2007 г., с.46-48.

3. Иванов С.Ю., Ларионов Е.В., Смешко Н.В. Экспериментальное изучение влияния аминокислоты L-аргинина, фиксированного на недеменирализованном костном коллагене на заживление костных дефектов. //Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 20-летию стоматологического факультета Саратовского государственного медицинского университета "Новые технологии в стоматологии и имплантологии", - Саратов, 2008, с 49-52.

4. Иванов С.Ю., Ларионов Е.В., Мураев A.A., Смешко Н.В. Современные тенденции в разработке костнопластических биокомпозиционных материалов. //Нижегородский медицинский журнал, вып. 2, №2, 2008 г., с 244-247 (Бюллетень ВАК РФ №4, 2005 г).

5. Аснина С.А., Шишкова Н.В., Смешко Н.В. Использование цифровой рентгенографии для изучения процессов регенерации костной ткани после цистэктомии. //«Институт стоматологии», г. Санкт-Петербург, вып.4 (41), декабрь 2008 г., с. 44-46.

Заказ № 296. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Состояние вопроса.

В практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, для заполнения дефектов, возникающих после удаления зубов, опухолей и опухолеподобных образований, с целью предотвращения возможных осложнений, а также для ускорения регенерации костной ткани используется большое количество биогенных и синтетических материалов.

В последние годы предпочтение отдается отечественным биокомпозиционным материалам, так как они по своим свойствам не уступают зарубежным аналогам, кроме того, стоимость их значительно ниже. Препараты фирмы «Полистом» Гидрогсиопол и Колапол, КоллаАн-JI, фирмы «Интермед апатит», «Остим-ЮО» препараты фирмы «Коннектбиофарм» Биоматрикс, Алломатрикс-имплант, Остеоматрикс, хорошо изучены в эксперименте и клинической практике, широко используются (Белозеров М.Н.,2003, Панин A.M., 2004, Ленина С.А. и соавт.,2004).

ГОУ ВПО МГМСУ разработаны новые остеопластические материалы серии «ОСТЕОПЛАСТ», На основе костного деминерализованного и недеминерализованного коллагена с сульфатированными гликозаминогликанами (сГАГ). Являясь модуляторами соединительной ткани вообще, и костной ткани в частности, сГАГ, при внесении в имплантаты биологического или искусственного происхождения, повышают их биосовместимость и одновременно активируют факторы роста.

В настоящее время ведется поиск новых фармакологических препаратов, добавление которых в имплантируемый остеопластический материал, будет способствовать улучшению микроциркуляции области операции, ускорению прорастания сосудов, а тем самым ускорять регенерацию костной ткани в месте дефекта.

Одним из перспективных направлений научных разработок представляется использование препаратов оксида азота (NO), стимулирующих неоангиогенез. К таким препаратам относится L-аргинин, условно незаменимая аминокислота, являющаяся донором азота.

Основные исследования по использованию L-аргинина посвящены лечению гипертонической болезни (Е.Б. Манухина и соавт., 2002, Mitsuyata H.Etal, 1995).

Экспериментальные исследования, проводимые на кафедре фармакологии Курского медицинского университета, показали, что использование L-аргинина в дозе 200мг/кг, внутрибрюшинно, с 7 по 28 день, улучшали показатели микроциркуляции конечности до уровня интактных животных. По данным Степанова Ю.М. и соавт., 2005г., L-аргинина укрепляет иммунную систему, увеличивая активность Т-клеточного иммунитета, улучшает микроциркуляцию в поврежденных тканях.

Учитывая, что любое хирургическое вмешательство приводит к расстройству микроциркуляции и снижению показателей резистентности организма, использование L-аргинина в качестве наполнителя к биокомпозитному материалу, может способствовать восстановлению кровотока, следовательно, ускорению регенерации костной ткани в зоне имплантации, а так же нормализации показателей местного иммунитета полости рта.

Поиск препаратов, в качестве «наполнителя» к имеющимся биокомпозиционным материалам, способствующим восстановлению микроциркуляции и ускоряющих регенерацию костной ткани, как в эксперименте, так и в клинике, после операций на челюстных костях, является актуальной темой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Цель исследования.

Разработка биокомпозиционного материала, содержащего L-аргинин. Внедрение его в клиническую практику для замещения костных дефектов, а также для профилактики осложнений и ускорения неоангиогенеза в зоне послеоперационного дефекта в челюстных костях.

Задачи исследования.

1. Разработать новый биокомпозиционный материал, содержащий L-аргинин.

2. Экспериментально изучить влияние нового биокомпозиционного материала в сравнении с известными остеокондуктивными биоматериалами на регенерацию костной ткани.

3. Оценить влияние нового биокомпозиционного материала на послеоперационное заживление раны и регенерацию при заполнении дефектов челюстных костей при хирургических стоматологических вмешательствах.

4. Разработать рекомендации по использованию нового биокомпозиционного материала.

Научная новизна.

Впервые в эксперименте и в клинической практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для замещения послеоперационных дефектов челюстных костей, использован биокомпозиционный материал, насыщенный L-аргинином. Проведен математический анализ состояния костной ткани на этапах регенерации с использованием цифровой и компьютерной томографии. На основании данных экспериментального исследования разработана методика использования L-аргинина для насыщения биокомпозиционного материала

Практическая значимость.

Экспериментальными, лабораторными и клиническими исследованиями научно обоснована и подтверждена эффективность использования биокомпозиционного материала, содержащего L-аргинин в практике хирургической стоматологии.

Публикации.

Результаты работы опубликованы в 5 печатных работах, в том числе 4 в журналах, рекомеднованных ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту

I. Разработан новый биокомпозиционный материал на основе деминерализованного коллагена, ГАП, содержащий L-аргинин.

II. Результаты экспериментальных исследований изучения биосовместимости, остеорепарации и микроциркуляции нового биокомпозиционного материала, содержащего L-аргинин.

III. Результаты внедрения разработанного биокомпозиционного материала, содержащего L-аргинин, в клинику для заполнения костных дефектов при хирургических стоматологических вмешательствах.

Апробация работы

Результаты работы доложены на:

1. Научно-практической конференции стоматологов и челюстно-лицевых хирургов Центрального федерального округа Российской Федерации с международным участием «Технологии XXI века в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии». Россия, г. Тверь, 30-31 октября 2008 года

2. IX Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». Саратов июнь 2008 г

3. IV восточно-европейской конференции по имплантологии. Львов март 2009

4. Конференции «Имплантация в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии». Минск июнь 2009

Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО, фармакологии МГМСУ, фармакологии КГМУ от 24.06.2009 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения и следующих глав: обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы включает 168 источников, из них отечественных 83, зарубежных 85. Диссертация иллюстрирована 71 рисунком, микрофотографиями и рентгенограммами, содержит 8 таблиц.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый биокомпозиционный материал на основе деминерализованного и не деминерализованного костного коллагена, содержащий L-аргинин, с дозой насыщения 1000 мкг/см. куб.

2. Экспериментально доказано, что материал созданный на основе костного коллагена и L-аргинина является биосовместимым и хорошо интегрирует в окружающие ткани при имплантации.

3. Анализ гистологических препаратов позволяет сделать заключение о том, что новый биокомпозиционный материал, наряду с остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами, способствует процессам васкуляризации и улучшает микроциркуляцию заживающей костной раны.

4. Биоматериал, содержащий L-аргинин, способствует оптимизации регенерации костной ткани при заполнении им костных дефектов при хирургических стоматологических вмешательствах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения репаративных свойств биоматериалов рекомендовано добавлять в них компоненты, стимулирующие неоангиогенез, - L-аргинин.

2. При замещении дефектов костной ткани, исследуемый биоматериал насыщенный L-аргинином, при рыхлом укладывании хорошо пропитывается кровью, сохраняет форму и фиксацию в ране в течение всего срока регенерации костной ткани.

3. При использовании в хирургической стоматологии для замещения костных дефектов новый биоматериал, «Остеопласт-К», насыщенный L-аргинином, обеспечит заживление без воспалительных осложнений в послеоперационном периоде.

Ill