Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Разработка модели TDP43-протеинопатии и ее использование для изучения механизма действия нейропротекторных препаратов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологически активных веществ РАН и Федеральное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН

На правах рукописи 0420135635Z у У

Хританкова Инна Владимировна

Разработка модели ТОР43-протеинопатии и ее использование для изучения механизма действия нейропротекторных препаратов

14.03.03 - патологическая физиология 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор медицинских наук

Нинкина H.H.

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Бачурин С.О.

Москва-2013

Оглавление

Список сокращений.............................................................................................4

Введение...............................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы...............................................................................11

1.1. Роль ДНК/РНК-связывающего белка ТЭР-43 в патогенезе фронто-темпоральной дегенерации...............................................................................11

1.2. Системы контролируемой деградации белков - потенциальные мишени для разработки патофизиологической терапии...............................14

1.3. Регуляторные механизмы аутофагии..................................................19

1.4. Роль аутофагии в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний........................................................................................................23

1.5. Разработка методов патофизиологической терапии НДЗ, основанной на фармакологической регуляции аутофагии............................25

1.6. Димебон и его производные................................................................36

Глава 2. Методы и материалы..........................................................................41

2.1. Соединения............................................................................................41

2.2 Клеточные культуры...............................................................................42

2.3 Микроскопический и иммуно-цитохимический анализ...................45

2.4 Методы, использованные для получения генетических конструкций.

47

2.5 Анализ белков..........................................................................................49

2.6 Анализ экспрессии генов......................................................................52

3 Результаты и обсуждение..............................................................................55

3.1 Моделирование ТВР43 протеинопатии в культуре клеток нейробластомы человека...................................................................................55

3.2. Влияние Димебона и его производных на прогрессию протеинопатии в клеточных культурах...........................................................72

3.3. Исследование молекулярно-клеточного механизма ингибирующего

действия Димебона............................................................................................88

Заключение.........................................................................................................98

Выводы.............................................................................................................100

Список литературы..........................................................................................101

Список работ, опубликованных по теме диссертации................................119

Список сокращений

АРР белок-предшественник ß-амилоида

DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

DAT мембранный транспортер дофамина

GAPDH глицеральдегид 3-фосфат-дегидрогеназа

GFAP глиальный фибриллярный кислый белок

GFP зеленый флуоресцентный белок (англ. green fluorescent protein)

mTOR англ. mammalian target of rapamycin

PB S фосфатный буфер

PLP протеолипидный белок

TDP43 transactivation-responsive DNA-binding protein-43

БА болезнь Альцгеймера

БАС боковой амиотрофический склероз

БДН болезни двигательного нейрона

БП болезнь Паркинсона

ГФКБ глиальный фибриллярный кислый белок

дт дикий тип

ИФАВРАН Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН

кДа килодальтон

МРТ митохондриальная проницаемость (от англ.- mitochondrial permeability transition)

МСА множественная системная атрофия

ндз нейродегенеративные заболевания

НС нервная система

ПЦР полимеразная цепная реакция

цнс Центральная нервная система

СОД1 супероксиддисмутаза 1

тг тирозингидроксилаза

УПС убиквитин-протеасомная система

ФТД-У фронтотемпоральная дегенерация с убиквитин-положительными включениями

ФТЛД фронтотемпоральная дегенерация

хг хорея Гентингтона

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение

Актуальность темы. Постоянный рост числа нейродегенеративных заболеваний (НДЗ), связанный с увеличением продолжительности жизни в развитых странах, является серьезной проблемой. Различного рода деменции составляют основную группу НДЗ в категории старшего возраста [5]. Ожидается, что в ближайшие 30 лет их количество удвоится [132]. Эффективного лечения для подавляющего большинства заболеваний на сегодняшний день не разработано, и все используемые на данный момент подходы к лечению НДЗ относятся исключительно к симптоматическим [3]. Деменции неизлечимы и неизбежно прогрессируют, в результате чего качество жизни как самих больных, так и членов их семьи, на которых часто ложится основная нагрузка по уходу, со временем ухудшается [1].

Фронтотемпоральная лобная дегенерация (ФТЛД) является третьей по распространенности формой возрастных нейродегенеративных заболеваний после болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона [4]. Перед современной биомедицинской наукой поставлена актуальная задача необходимости разработки методов ее ранней диагностики и эффективного лечения. Создание адекватных модельных систем для изучения молекулярных механизмов развития ФТЛД и воспроизведения наиболее важных аспектов патогенеза данного заболевания обеспечит существенный прогресс в данном направлении и позволит проводить направленный поиск соединений для создания патофизиологической терапии ФТЛД.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание адекватной клеточной модели ТЭР43 -протеинопатии, пригодной для отбора нейропротекторных препаратов, необходимых при разработке методов патогенетической терапии нейродегенеративных заболеваний, основным

молекулярно-патологическим звеном которых является агрегация белка ТБР43.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать экспрессионные плазмиды, кодирующие патогенные формы белка ТБР43 человека, способные формировать ТБР43-реактивные включения в клеточных культурах.

2. Воспроизвести в цитоплазме культививируемых клеток образование ТБР43-реактивных структур, аналогичных патогистологическим включениям, обнаруживаемым у больных с ФТЛД и БАС.

3. Применить разработанную клеточную модель для отбора соединений, способных ингибировать процессы формирования ТОР43-реактивных включений - основного патофизиологического фактора ТОР43-протеинопатий.

4. Исследовать действие Димебона (гамма-карболинового соединения) на компоненты метаболических путей, вовлеченых в регуляцию аутофагосомной системы с целью разработки на основе гамма-карболинов патогенетической терапии ТОР43-протеинопатий.

Научная новизна работы. В основе многих распространенных НДЗ лежит нарушение метаболизма и функции определенных белков, обладающих повышенной склонностью к агрегации [6; 9]. Патологическая агрегация конформационно-нестабильных белков и накопление токсичных продуктов белковой агрегации приводит к дисфункции пораженных нейрональных и глиальных клеток и, в конечном итоге, к их гибели [9]. Недавно было показано, что в патогенезе целого ряда протеинопатий, в частности, некоторых форм ФТЛД, критическую роль играет нарушение

нормального метаболизма и функции ДНК/РНК-связывающего белка ТЭР43, сопровождающееся образованием характерных цитоплазматических включений [133].

В представленном диссертационном исследовании проведены работы по созданию оригинальных модельных систем, воспроизводящих основные элементы молекулярного патогенеза ТЭР43 протеинопатии в клеточных культурах. Создана панель оригинальных экспрессионных плазмид для исследования способности различных форм белка ТОР43 человека к образованию цитоплазматических включений, сходных с патогистологическими включениями, обнаруживаемыми у больных с наследственными формами ФТЛД и БАС. Проведенный сравнительный анализ патогенных свойств различных мутантных форм белка ТЭР43 человека позволил получить новые данные о роли различных доменных последовательностей молекулы ТЭР43 в механизме формирования цитоплазматических депозитов. Впервые была получена агрессивная мутантная форма белка ТБР43 (Т5), способная образовывать патогенные включения амилоидного типа и установлено, что для получения агрегатов амилоидного типа необходимо одновременное нарушение белковой структуры (удаление или мутации) двух областей молекулы: РНК-связывающего домена и сигнала ядерной локализации. Созданная на основе аберантной Т5 формы оригинальная клеточная модель ТБР43-протеинопатии была впервые адаптирована для изучения и тестирования нейропротекторных препаратов, способных ингибировать прогрессию ТОР43-протеинопатии. Впервые показано, что соединения группы гамма-карболинов (Димебон и два его новых производных БР-203 и БР-213) способны эффективно подавлять формирование цитоплазматических включений амилоидного типа, сформированных укороченной патогенной формой Т5. Получены новые данные, указывающие на возможный механизм ингибирующего прогрессию протеинопатии эффекта Димебона. Впервые

показано, что Димебон способен активировать аутофагосомную систему, осуществляющую удаление продуктов поздних стадий каскада белковой агрегации, регулируя экспрессию генов atg5 и atgl6. При этом Димебон стимулирует фосфорилирование ЕБ1К1/2 и р38 киназ, которые вовлечены в механизм регуляции аутофагосомной системы, что является первым указанием на непосредственные киназные пути, регулируемые гамма-карболинами при коррекции протеинопатий.

Теоритическая и практическая значимость работы.

Прогрессирующим характером течения ФТЛД обусловлен неизбежный переход в тяжелые формы деменции, при которых больные нуждаются в постоянном уходе [11]. Поэтому замедление нейродегенеративного процесса, лежащего в основе патогенеза ФТЛД, или даже его стабилизация могут иметь большое значение для практической медицины, отодвигая терминальную стадию заболевания и сокращая период тяжелой инвалидности больных. Коррекция метаболизма и катаболизма потенциально амилоидогенных белков является одним из основных подходов для разработки новых методов эффективной терапии протеинопатий [2]. Предполагается, что ингибирование формирования или удаление уже сформировавшихся агрегатов ТБР43 может способствовать если не предотвращению, то, по крайней мере, существенному замедлению развития патологии. Создание препаратов, действие которых будет направленно на ключевые молекулярные мишени в патогенезе ТЭР43 протеинопатий, позволит разработать эффективные методы лечения данного типа деменций [8]. Созданная в ходе выполнения диссертационной работы клеточная модель, воспроизводящая ключевое звено молекулярного патогенеза ТЭР43 протеинопатий, позволит оптимизировать разработку инновационных лекарственных препаратов патофизиологической терапии форм фронтотемпоральной деменции с нарушенным метаболизмом ТЭР43. В этой

связи полученные в ходе выполнения диссертационной работы данные, показавшие, что гамма-карболины могут непосредственно действовать на процессы накопления патологических включений, образуемых наиболее патогенной формой белка ТОР43, открывают новое направление в биомедицинской химии по оптимизации соединений этого класса для нужд патофизиологической терапии ТОР43 протеинопатий, что имеет большое теоретическое и практическое значение. Созданная же клеточная модель является простой и удобной для отбора разрабатываемых инновационных лекарственных препаратов с целью формирования группы лидерных соединений для дальнейшего их тестирования на животных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Модифицирована структура белка ТЭР43 и получена его патогенная форма с высокими агрегационными свойствами, формирующая цитоплазматические депозиты, аналогичные патогистологическим включениям, обнаруживаемых у больных с ФТЛД и БАС.

2. В клеточной модели ТОР43-протеинопатии нейропротекторный препарат Димебон и два его новых производных способны эффективно ингибировать агрегацию патогенной формы ТЭР43 - важную составляющую патогенеза ФТЛД и БАС.

3. Ингибирующее 'ГОР43-протеинопатию действие Димебона осуществляется через активацию аутофагосомной системы.

4. Гамма-карболины (димебон и его исследованные производные) могут рассматриваться в качестве перспективных соединений для разработки на их основе методов патофизиологической терапии ТБР43-протеинопатий.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях и конгрессах: The EMBO Meeting 2010, September 3-7, 2010, Barcelona, Spain; Ежегодных конференциях «Фундаментальные науки - медицине», Россия, Москва 2010 и 2012; 10th International Conference on Alzheimer's and Parkinson's Diseases 2011, March 6-10, Barcelona, Spain); 8th IBRO World Congress of Neuroscience 2011, July 14-18, Florence, Italy; Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» 2011, 18-22 апреля, Пущино, Россия; Международной конференции «Эффективные инструменты современной науки - 2012», April 27 - May 5, Prague, Czech Republic; XIX Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии - 2013» 10-11 апреля, Санкт-Петербург, Россия.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, соответствующих Перечню ВАК, и 8 тезисов в сборнике материалов докладов научных конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов и материалов, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах и иллюстрирована 25 рисунками, 4 таблицами. Список цитируемой литературы включает 135 наименований.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Роль ДНК/РНК-связывающего белка ТОР-43 в патогенезе фронто-темпоральной дегенерации

Белок ТОР43 является ядерным ДНК/РНК-связывающим белком (Тгапзасйуайоп-гезрош^е БКА-ЫпсНг^ Рго1ет-43) размером 43 кДа, крайне консервативным среди различных видов [116]. Белок ТОР43 имеет характерную доменную структуру, которая приведена на рис. 1.

FUS (TLS) (526 аа.) : 75 кД

(fused in sarcoma / translocated in liposarcoma)

g^ ЩЛ2 точечных мутаций gjg

GR

Zn finger NLS

TDP-43 (414 aa.) : 43 kDa (TAR DNA-binding protein)

NES

N

RRM1

RRM2

GR

NLS

NLS - сигнал ядерной локализации GR - глицин-богатый район RRM - участок узнавания РНК NES - сигнал ядерного экспорта

Рисунок 1 - Доменная структура белков TDP43 и FUS

На N-конце располагается сигнал ядерной локализации, который в мутантных формах белка часто бывает утерян, что нарушает нормальную рабочую локализацию белка. Далее располагаются функционально важные домены распознавания РНК, с которыми связана основная функция данного белка - регуляция процессинга, транспорта и метаболизма РНК. Далее

следует сигнал ядерного экспорта, а затем - богатый глицином участок, который, как полагают, обеспечивает конформационную стабильность белка.

Интересно отметить, что FUS - другой ДНК/РНК связывающий белок, который также вовлечен в патогенез ряда наследственных форм БАС и ФТЛД, имеет сходную доменную структуру, при этом домены расположены в зеркальном отражении (Рис. 1).

Связываясь с целым рядом других ядерных белков, TDP43 образует активные комплексы, необходимые для сплайсинга пре-мРНК и транспорта РНК в цитоплазму [25], стабилизации мРНК [127] и трансляции [127]. В основном связывание TDP43 с другими белками осуществляется через последовательности, расположенные в его С-концевой области.

Недавние иследования показали, что нарушение метаболизма и функции TDP43 ведет к развитию целого ряда распространенных нейродегенеративных заболеваний. Были описаны варианты ФТЛД - третьей по распространенности деменции после Болезни Альцгеймера (БА) и Болезни Паркинсона (БП), характеризующиеся наличием ТОР43-реактивных убиквитинированных патогистологических ядерных и цитоплазматических включений в пораженных отделах нервной системы больных [66]. Neumann с соавторами впервые были обнаружены TDP43-реактивные цитоплазматические включения в аутопсийном материале больных боковым амиотрофическим склерозом [69]. В результате молекулярно-генетических исследований были выявлены мутации в гене TDP43, которые ассоциированы с семейными формами ФТЛД и БАС, наследуемыми по аутосомно доминантному типу. Более того, существенную часть идиопатических форм ФТЛД и БАС составляют случаи с нарушенным метаболизмом TDP43 и с мутациями в гене, кодирующем этот белок [55].

В основе молекулярного патогенеза всех ТОР43-протеинопатий лежит аккумуляция и агрегация белка TDP43 с формированием нерастворимых убиквитинированных включений, в составе которых TDP43 обнаруживается

в гиперфосфорилированном состоянии [32]. Подробный биохимический анализ ТБР43-реактивных включений показал, что в их составе присутствует, в основновном, укороченная форма белка ТВР43 размером 25 кДа, которая о�