Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии



На правах рукописи

Литвин Лолиана Стефановна

Разработка модели экспериментальной 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии.

О

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2007 год

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научный руководитель: кандидат медицинских наук М.Р, Хаитов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Л.В. Лусс

доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «АУ 2007 г в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.017 01 в Государственном научном центре Институте иммунологии Федерального медико-биологического агентства по адресу 115478, г Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2 Факс (495)117-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства

Автореферат разослан «.// г

Ученый секретарь ¿^^-¿^С

диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [G1NA, 2006] По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн человек [Княжеская Н П , 2002] В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (lgE-зависимая и не lgE-зависимая) и не аллергическую формы бронхиальной астмы [Johansson, 2002] В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие бронхиальной астмы связано с lgE-опосредованными (атопическими) механизмами [Bukantz et al ,1993] Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [Реагсе et al ,1999]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для контроля воспалительного процесса при БА Несмотря на широкое применение различных фармакологических препаратов для терапии БА, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [Княжеская Н П , 2002] В связи с этим актуальность проблемы бронхиальной астмы для научных и клинических исследований очевидна

На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах, лежащих в основе того или иного заболевания, получены с использованием экспериментальных моделей на животных, адекватных различным заболеваниям человека Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом доклинического изучения безопасности и эффективности новых лечебных препаратов

К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, существуют протоколы воспроизведения моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [Epstein et al, 2004, Adkinson et al, 2003] Боль-

шинство протоколов индукции модели экспериментальной igE-зависимой бронхиальной астмы (ЭБА) предполагают применение адъювантов Преимущественное использование мышей для моделирования БА связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания Мыши могут быть сенсибилизированы к различным аллергенам и развивать аллерген - индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность Существуют определенные сходства между параметрами модели бронхиальной астмы у мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [Воусе et а!, 2005]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке в России и использовании для доклинических исследований адекватной модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей Поэтому, разработка ЗБА является актуальной и перспективной в нашей стране

Разработка модели IgE-зависимой бронхиальной астмы на мышах позволит в дальнейшем изучать, механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов, перспективных для лечения и профилактики заболевания

Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ) [Mailing et al, 2004] В настоящее время разрабатываются, и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [Гущин И С ,1998]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей-адъювантов [Бабахин А А, 2004, Петров Р В , 2001, Horner et al, 2001]

Очевидно, что для доклинического изучения свойств новых аллерговак-цин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей Проведение доклинических исследований новых форм лечебных аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ поможет всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течения 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможности ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ Задачи исследования:

1 Разработать схему моделирования ЭБА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта,

2 Изучить динамику накопления аллерген-специфических 1дЕ- и 1дв- антител в ходе моделирования ЭБА,

3 Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАП) и периферической крови у мышей с ЭБА,

4 Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА,

5 Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА,

6 Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА,

7 Провести сравнительную экспериментальную АСИТ (ЭАСИТ) немоди-фицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с иммуномодулятором полиоксидонием на модели ЭБА,

8 Изучить динамику накопления аллерген-специфических 1дЕ- и 1дЭ- антител в ходе и по завершении ЭАСИТ,

9 Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ,

10 Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ,

11 Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ,

12. Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ Научная новизна:

Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель экспериментальной lgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта

Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина

Впервые на модели lgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей, проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном

Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном

Практическая значимость: Практическая значимость настоящего исследования заключается в разработке краткосрочной модели lgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей, которая позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения lgE-зависимых аллергических заболеваний, в частности, атопической бронхиальной астмы

Экспериментальная модель lgE-зависимой бронхиальной астмы, может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания

Апробация работы: Результаты исследований докладывались на конкурсе научных работ молодых специалистов Института иммунологии 2005 года *, на ежегодном съезде Американской Академии Аллергологии, Астмы и Иммунологии (Сан Диего, США, 23-27февраля 2007г.), на XXVI конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (Готеборг, Швеция, 9-13 июня 2007г), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 27-29 июня 2007г)

*научная работа заняла Н-е - место

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 работ Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами, 43 рисунками и фотографиями Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Список литературы включает 154 источника (15 отечественных, 139 зарубежных)

Материалы и методы исследований Собственные экспериментальные данные получены на 250 мышах линии ВА1.В/С и мышах гибридах (СВА х С57В1_/6)Р1, обоих полов, весом 18-20г Животные поступали из питомника «Столбовая» ГУНЦБМТ РАМН Для постановки реакции пассивной кожной анафилаксии использовали беспородных белых крыс-самцов весом 250-300г, полученных из питомника РОНЦ РАМН Вся работа с животными проводилась в соответствии с «Положением об этическом отношении к лабораторным животным», согласно приказу директора ГНЦ Институт иммунологии от 07 07 2003 и приказа МЗ РФ от 19 06 2003 №267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации»

Для индукции ЭБА, проведения ЭАСИТ, а также проведения диагностических манипуляций использовали следующие методы введения аллергенов и препаратов внутрибрюшинное (в/б), интраназальное (и/н), аэрозольное, подкожное (п/к), внутривенное (в/в) Проведение иммунизации проводилось с соблюдением правил асептики и антисептики 1.1. Схема краткосрочной модели ЭБА

В пяти независимых экспериментах для моделирования ЭБА использовали мышей самок линии ВА1_В/с весом 18-20 гр Мыши были разделены на 3 группы (п=5) экспериментальная, контроль сенсибилизации, биологический контроль В качестве модельного аллергена использовали овальбумин (ОА, вщта) Моделирование ЭБА осуществляли путем в/б введений ОА (1 Омкг на мышь) в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) Курс в/б введений ОА составлял, 7 дней (одна инъекция в день) Через неделю мышам вводили и/н по 50 мкп ОА (концентрация ОА 10 мг/мл, доза 500 мкг/мышь), ежедневно в течение 8 дней

Мышей из группы контроль сенсибилизации, сенсибилизировали по схеме опытных групп Через неделю мышам вводили и/н по 50 мкл физиологического раствора, ежедневно в течение 8 дней Животным из группы биологического контроля в аналогичных условиях опыта в том же объеме вводили физиологический раствор Кровь от мышей всех групп забирали из ретроор-битального синуса на 8, 14 и 24 день от начала сенсибилизации Пуловые и индивидуальные сыворотки хранили в холодильнике при -50 °С до использования

Уровни гомоцитотропных анти-ОА 1дЕ антител (анти-ОА ГЦА) в пуловых сыворотках крови и суммарных анти-ОА 1дв антител (АТ) в индивидуальных и пуловых сыворотках определяли методами пассивной кожной анафилаксии и иммуноферментного анализа Пневмографию у мышей вышеуказанных групп осуществляли через 24 часа после завершения и/н аппликаций аллергена Забор легких для гистологического исследования, бронхо-альвеолярного ла-важа (БАЛ), получение мазков крови в каждой группе мышей проводили через 48 часов после завершения и/н введений ОА 1.2.Схема ЭАСИТ на модели ЭБА

В двух независимых экспериментах, для оценки эффективности ЭАСИТ на модели ЭБА, проводилась гипосенсибилизация нативным аллергеном (ОА), модифицированным сукцинилированием ОА (сОА) и сОА в комплексе с иммуномодулятором полиоксидонием (ПО) ЭАСИТ проводили в интервале между периодом сенсибилизации (в/б ОА) и серией и/н аппликаций ОА Мыши, сенсибилизированные по схеме ЭБА, были разделены на 5 групп (п=10) Животные 1 гр (контроль ЭБА) получали 16 п/к инъекций физиологического раствора Экспериментальные животные 2 гр получали 16 п/к инъекций раствора ОА в возрастающих дозах с 50 мкг/кг до 5x104 мкг/кг, мыши 3 гр получали 7 п/к инъекций сОА в интервале доз от 6x103 мкг/кг до 5x104 мкг/кг, мыши 4 гр получали 5 п/к инъекций сОА в интервале доз от 6x103 мкг/кг до 5x104 мкг/кг, причем три из них в виде комплекса сОА с иммуномодулятором полиоксидонием, однократная доза ПО 5x103 мкг/кг Мыши 5 гр (контроль адъюванта), получали п/к ПО, доза и количество инъекций как в группе 4 После ЭАСИТ мыши всех групп были подвергнуты серии и/н аппликаций ОА по схеме ЭБА

1.3. Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА)

Анти-ОА ГЦА в пуловых сыворотках крови определяли с помощью реакции ПКА ПКА воспроизводили описанным ранее методом [Ovary, 1977]

1.4. Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ

Исследование уровней аллерген-специфических IgG-AT в сыворотках крови мышей проводили с использованием стандартного протокола, разработанного Sigma Учет цветной ферментативной реакции производили с помощью спектрофотометра «Titertek Multiskan Plus» (Labsystems, Finland) 1 5 Оценка системной анафилаксии

Мышей BALB/c сенсибилизировали по схеме воспроизведения модели ЭБА, через 24 часа после последней и/н аппликации OA мышам вводили в/в OA в различных дозах (0,25мг/кг, 0,625 мг/кг,1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 25 мг/кг) Оценку выраженности системной анафилаксии у мышей BALB/c с ЭБА проводили с использованием бальной методики, предложенной [Rupa и Mine, 2006]

Шкала оценки симптомов анафилаксии у мышей в баллах: 0 - нет симптомов,1 - почесывание и отечность мордочки, легкий шок, включая замедленность движений, 2 - диарея, набухание рта, парез глаз, 3 - одышка, проблемы с дыханием,4 - тремор и конвульсии, 5 - смерть

1.6.Исследование клеточного состава периферической крови Приготовление мазков крови, их фиксация и окраска осуществлялась с

использованием техники подробно описанной в методическом руководстве [Кисели Д , 1962] Мазки окрашивали азуром и эозином по Романовскому, подсчитывали процентное соотношение клеток Клетки определяли и дифференцировали на мононуклеары (лимфоциты, моноциты), нейтрофилы и эозино-филы по стандартным морфологическим критериям. Подсчитывали 100 клеток в каждом микропрепарате Разрешение микроскопа 100 х1 5 х10

1.7. Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей

После умерщвления эфиром, выделяли трахею, в средней трети трахеи делали разрез, через который вводили металлическую канюлю с тупым концом, фиксируя канюлю лигатурой С помощью одноразового шприца, присоединенного к канюле, в легкие вводили среду RPMI с добавлением 10% эм-

бриональной телячьей сыворотки (t°= 37°), в объеме 0,5 мл Шприцем отсасывали введенную в легкие жидкость, и переносили в отдельные стерильные пробирки («Eppendorf») Процедуру проводили дважды Общий объем полученного лаважа составлял 1мл. БАЛ от каждого животного, собранный в отдельные пробирки, центрифугировали при 150 g в течение 10 минут После центрифугирования осадок ресуспендировали. Общее количество клеток БАЛ подсчитывал ось в камере Горяева Для дифференцировки клеток БАЛ, готовили мазки на предметном стекле Мазки фиксировали в метаноле, окрашивали азуром и эозином по Романовскому и подсчитывали процентное соотношение клеток [Tanaka et аГ, 2002] Оценка клеточного состава БАЛ в препаратах производилась с использованием иммерсионной микроскопии Клетки определяли и дифференцировали на мононукпеары (лимфоциты, макрофаги), нейтрофилы и эозинофилы по стандартным морфологическим критериям Подсчитывали 200 клеток в каждом микропрепарате Разрешение микроскопа 100x1 5x10

1.8. Гистологическое исследование легких

Для гистологического анализа легкие фиксировали в 10% формалине Обезвоживание и проводку образцов, заливку в парафин проводили ручным способом Микротомирование парафиновых блоков для получения срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли с помощью ротационного микротома Reichert Jung Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, заключали в пихтовый бальзам под покровные стекла для получения постоянных микропрепаратов. Микроскопический анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе Opton с разрешением 40x1,5x10.

1.9. Пневмография

Оценка состояния дыхательной функции мышей с ЭБА и контрольных групп проводилась с использованием пневмотахометрической установки, любезно предоставленной нам отделом токсикологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения Система регистрации сигналов основана на использовании акустического датчика (микрофона), помещенного в специальную камеру Датчик находился в контакте с телом животного в области проекции его брюшной стенки. Получаемый электрический сигнал уси-

ливался и подавался на самописец Датчиком являлся элекретный микрофон, обладающий достаточно высокой чувствительностью, его диапазон часто включал низкочастотную область, что обеспечивало регистрацию низкочастотных вибраций, характерных для работы дыхательной системы Пневмо-граммы регистрировали на бумажном носителе полиграфа, который подавался с постоянной скоростью (10мм/с) Подача бумажного носителя полиграфа с определенной скоростью до воздействий на мышь и после, позволяла сравнивать временные процессы регистрируемой пневмограммы в реальном масштабе Амплитуду и продолжительность дыхательных актов на пневмограмме оценивали с помощью метода усреднения значений за период анализа (60 сек) При этом для анализа выбирался интервал, в котором частота повторяемости амплитудного значения была не менее 95% О характере влияния на дыхательную функцию судили по отношению значений показателей до воздействия (А) к их значениям после воздействия (Б), выраженному в процентах. При этом за 100% принимались данные исходных измерений. Также производили оценку величины бронхоспазма (ВБ) для каждого животного в группе и среднее значение ВБ для группы ВБ = 100%- Ак0неч%. где Аконвч%-среднее значение амплитуды дыхательных актов выраженное в % Пневмограммы регистрировали до и после внутривенного введение возрастающих доз (50-100-200 мкг/кг) неспецифического раздражителя метахолина 1.10. Методы статистической обработки

Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М), стандартную ошибку среднего (±SEM) и стандартное отклонение среднего (±SD) в программе Microsoft Excel Для сравнения групп использовался дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису Для проведения последующего попарного сравнения групп, применялся U-критерий Манна-Уитни в программе Statistica 6,0 (Stat Soft Inc, США) Значения р<0,05 принимались как статистически значимые

Статистическую обработку результатов ПКА проводили согласно критериям Fox, 1976

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На этапах предварительной работы по разработке модели ЭБА были подобраны схема сенсибилизации и доставки аллергена в дыхательные пути мышей без использования адъюванта, а также выбрана линия мышей для моделирования ЭБА

1) Выбрана двухстадийная схема доставки аллергена сенсибилизация - путем внутрибрюшинных введений ОА, провокационные введения аллергена -путем интраназальных аппликаций Сравнение однократного и многократного в/б введения ОА без применения адъюванта позволило сделать вывод о целесообразности использования многократных введений ОА в связи с выраженным сенсибилизирующим эффектом Применение только интраназальных или ингаляционных введений ОА, без предварительных внутрибрюшинных введений ОА не приводили к стойкому 1дЕ ответу При применении ин-траназальной доставки аллергена уровни анти-ОА 1дЕ-АТ достоверно не отличались от уровней анти-ОА 1дЕ-АТ полученных при ингаляционном введении аллергена У мышей подвергнутых интраназальным аппликациям ОА, развивалось выраженное брадипноэ (р<0,05) на введение ацетилхолина по сравнению с мышами, получавшими ОА ингаляционно

2) При моделировании ЭБА у мышей ВАЬВ/с наблюдалась более четкая картина аллергического воспаления в дыхательных путях, а также высокий уровень анти-ОА 1дЕ-АТ после интраназальных аппликаций ОА по сравнению с вышеуказанными показателями для мышей (СВА х С57В1_)Р1 В связи с этим был сделан вывод о предпочтительном использовании мышей линии ВАЬВ/с для моделирования ЭБА

Характеристика модели 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей линии ВА1.В/С

При морфологическом исследовании ткани легких мышей с ЭБА определялись перибронхиальные и периваскулярные клеточные инфильтраты, содержащие эозинофилы, лимфоциты, макрофаги и единичные нейтрофилы Наблюдалась деструкция и десквамация бронхиального эпителия, наличие слизистых пробок в просветах бронхов Определялось утолщение стенок аль-

веол и появление в их просветах эозинофилов и активированных макрофагов (рис.1).

Выявленные морфологические изменения в ткани легких и структуре бронхов у мышей с ЭБА свидетельствовали о развитии аллергического воспаления.

Гистопогическая картина ткани легких и бронхов мышей ВАЬВ/с в норме: представлена на рис.2.

Рис.1 Перибронхиэльная и перизаску-лярная клеточная инфильтрация у мышей ВА1_В/с с ЭБА. Х160. Краситель гематоксилин-эозин.

Рис.2 Нормальная структурная организация бронхов и ткани легких мышей ВА1-В/с. Х160, Краситель гематоксилин-эозин.

Показано, что через 48 часов после последнего и/н введения ОА из бронхоальвеолярного тракта вымывалось а 1,5 раза больше клеток у мышей с ЭБА, чем у контрольных животных (при аллергическом воспалении 1,3 ± 0,02 х 105, у контрольных животных 1,1 ± 0,03 х10 5). Увеличение общей клеточности определялось увеличением абсолютного количества эозинофилов, лимфоцитов и эпителиальных клеток, (табл.1). Соотношение клеток в БАЛ изменялось, определялось значимое увеличение числа эозинофилоа в лаважной жидкости, полученной от мышей с ЭБА. Достоверно увеличивалось, как относительное (р < 0,001), так и абсолютное (р < 0,02) количество эозинофилов.

Повышение в БАЛ эозинофилов народу с лимфоцитами и эпителиальными клетками является важным признаком, свидетельствующим о развитии аллергического воспаления в дыхательных путях мышей с ЭБА

В этот же период наблюдалось достоверное увеличение относительного количества эозинофилов в периферической крови у мышей с ЭБА в сравнении с контрольными группами. Процент эозинофилов в лейкоцитарной формуле возрастал в 2 раза (табл.2) Повышение количества эозинофилов в периферической крови мышей после завершения интраназальных аппликаций ОА являлось дополнительным признаком, характеризующим развитие аллергический ответа у модельных животных

Анализ пневмограмм, полученных от мышей с ЭБА, после введения возрастающих доз метахолина (50,100,200мкг/кг) выявил достоверное увеличение реактивности бронхов Введение пороговой дозы метахолина 50 мкг/ кг приводило к существенному изменению ЧД, увеличению на 50% продолжительности и 26% уменьшению амплитуды дыхательных актов Эти показатели достоверно отличались (р<0,01) от показателей контрольных групп мышей Последующее последовательное введение возрастающих доз метахолина приводило к нарастанию изменений в показателях ЧД, продолжительности и амплитуды дыхательных актов Эти изменения были дозозависимыми и существенным образом отличались от значений вышеуказанных показателей для контрольных групп Такой характер реакции бронхиального тракта на введение метахолина в возрастающих дозах свидетельствовал о неспецифической гиперреактивности бронхов (рис. 3)

Табл.1 Абсолютные и относительные показатели клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа <%) у мышей различных групп при моделировании ЭБА (М±вР)_

Группы Общая клеточ-ность, 105 Альвеолярные макрофаги Эпителиальные клетки Лимфоциты Эозинофилы Нейтрофилы

Биологический контроль % 1,1 ± 0,03 0,9 ± 0,02 0,1 ± 0,01 0,1 ±0,01 0 0

78,4 ±0,93 8,20± 1,39 12,02 ± 0,66 0,5 ± 0,39 0,9 ± 0,46

Контроль сенсибилизации % 1,1 ±0,03 1,0 ±0,01 0,1 ±0,0 0,1 ± 0,0 0 0

81,6 ±1,8 8 ±1,7 10,2 ±1,0 0 0,2 ± 0,2

Модель ЭБА % 1,8 ± 0,02* ** 1 ± 0,01 0,2 ± 0,01 * ** 0,4 ± 0,0 * ** 0,2 ± 0,01 * ** 0

81,6 ±1,8 12,8 ±1,9 20,8 ±1,24*" 9,4 ± 1,6*** 0,3 ± 0,12

#р <0,001 относительно биологического контроля *р <0,02 относительно биологического контроля

**р<0,001 относительно контроля сенсибилизации **р<0,03 относительно контроля сенсибилизации

Представлены результаты четырех независимых экспериментов

Табл. 2. Клеточный состав периферической крови мышей В/ШЗ/с различных групп при моделировании ЭБА (М±5Р)_'___

Группы (п=5) Эозинофилы, % Лимфоциты, % Нейтрофилы, % Моноциты, %

Биологический контроль 3,3 ±0,49 71,33 ±0,84 22,77 ±0,8 2,67 ±0,33

Контроль сенсибилизации 3,4 ±0,4 76,1 ± 0,8 17,6 ±0,99 2,9 ±0,3

Модель ЭБА 7 ± 0,7* ** 70 ±2,1 20 ±2,09 2 ±0,2

*р <0,05 относительно биологического контроля **р<0,05 относительно контроля сенсибилизации Представлены результаты четырех независимых экспериментов

г

350 300 ■ 250 200 -150 100 -50 0

50

200

100

Доза метахолнна мкг/ кг *р< 0,01 относительно контроля сенсибилизации **р< 0,01 относительно нктактных —О—ЭБА —Ж— кошроль сенсибилизации —О— ищдагные

Рис. 3. Изменение продолжительности дыхательных актов в % к фону, принятому за 100% по результатам пневмограмм мышей контрольных групп и с ЭБА после введения метахолина (М ± ЭО)

По результатам ПКА анти-ОА ГЦА определялись только у мышей с ЭБА после интраназальных аппликаций аллергена (на 24 день после начала сенсибилизации) Средний титр анти-ОА ГЦА от пяти независимых экспериментов равнялся 1 128 Наличие вышеуказанных антител свидетельствовало о развитии аллергического процесса в дыхательных путях мышей при моделировании ЭБА (рис.4)

7

I

е-!

£

2 -1 Н

14дн

24дн

- биологический контроль

Сроки заборов крови | начало в/б введений | начало интраназальных введений

ЭБА - -Ж- контроль сенсибилизации —с

Рис 4.Уровни анти»ОА ¡^-антител в пудовых сыворотках мышей ВАЬВ/с (ЭБА) выявленные методом ПКА

Введение мышам ОА приводило к повышению суммарных аллерген-специфических IgG-AT Уровень суммарных анти-ОА IgG-AT постепенно нарастал в ходе моделирования ЭБА, и достигал своего максимального значения после и/н аппликаций ОА

Значительный уровень сенсибилизации в ходе моделирования ЭБА подтверждался развитием системной анафилаксии на в/в введение различных доз ОА через 24 часа после завершения и/н аппликаций аллергена Максимальная выраженность реакции анафилаксии определялась на введение ОА в дозе 2,5 мг/кг, 60% животных погибло от развившегося анафилактического шока Реакция оценивалась по бальной шкале предложенной Rupa и Mine (рис.5)

Дозы ОА для внутривенного введения

■ биологический контроль —О— контроль специфичности реакции

—А— сенсибилизированные ВА1В/с ( ОА-инАудированная ЭБА)

Рис 5 Выраженность анафилаксии (в баллах) у мышей ВАЬВ/с через час после внутривенного введения различных доз ОА

Необходимо отметить, что при введении мышам с моделью 1дЕ-зависимой БА аллергена тимофеевки в тех же дозах, развитие системной анафилаксии не выявлялось Этот факт свидетельствовал о специфичности реакции в организме мышей с моделью 1дЕ-зависимой БА Отсутствие симптомов анафилаксии на внутривенное введение ОА в различных дозах определялось также у мышей относящиеся к группе биологического контроля, получавших в/б и и/н физиологический раствор

Оценка эффективности ЭАСИТ на модели ЭБА. Для оценки возможности применения модели ЭБА для доклинических исследований проводилась ЭАСИТ немодифицированным аллергеном (ОА), модифицированным сукци-нилированием (сОА) и комплексом модифицированного аллергена с иммуно-модулятором полиоксидонием (сОА-ПО)

Сравнительная оценка результатов анализа морфологии легких мышей экспериментальных групп, привела к выводу

1 В контрольных группах 1 (п/к физиологический раствор) и 5 ( п/к ПО), определялись отчетливые морфологические признаки ЭБА перибронхиаль-ные и периваскулярные клеточные инфильтраты, содержащие эозинофилы, лимфоциты, макрофаги и единичные нейтрофилы, усиление процесса деск-вамации эпителия в просвет бронхов, наличие слизистых пробок в просветах бронхов, а также утолщение стенок альвеол и появление в их просветах эози-нофилов и активированных макрофагов

2 ЭАСИТ в группах 2 (п/к ОА), 3 (п/к сОА) и 4 (п/к сОА в комплексе с ПО), приводила к выраженному снижению манифестации ЭБА, что определялось снижением степени деструктивных процессов в эпителии бронхиального дерева, уменьшением вероятности развития и степени распространенности аллергического воспаления в бронхах и бронхиолах По выраженности лечебного эффекта группы расположились в следующем порядке 4гр>3гр>2гр

Наиболее выраженное уменьшение признаков аллергического воспаления было выявлено у мышей, подвергнутых ЭАСИТ комплексом модифицированного ОА и ПО

Оценка относительных показателей клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа в группах, подвергшихся ЭАСИТ, свидетельствовала в пользу достоверного снижения относительного числа эозинофилов Наиболее выраженное снижение достигалось в случае ЭАСИТ модифицированным аллергеном и иммуномодулятором полиоксидонием (р<0,01) Достоверное снижение общей клеточности БАП в группах 2,3,4 определялось за счет снижения абсолютного количества эозинофилов и эпителиальных клеток, в сравнении с контрольными группами 1 и 5 В группе 4 также определялось достоверное снижение абсолютных показателей лимфоцитов Существенных изменений в

абсолютном количестве макрофагов выявлено не было

Таким образом, установлено достоверное снижение количества эозино-филов, эпителиальных клеток в БАЛ у мышей, подвергнутых ЭАСИТ в сравнении с контролем Наиболее выраженное снижение клеток аллергического воспаления достигалось в случае ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и полиоксидония (табл.3)

Табл 3 Абсолютные и относительные показатели клеточного состава БАЛ (%) у мышей различных групп после ЭАСИТ (М±ЭО)

№ груп пы Общая кле-точность, 105 Альвеолярные макрофаги Эпителиальные клетки Лимфоциты Эозинофи-лы Ней-трофи-лы

1гр % 2,0 ± 0,03 1,0 ±0,02 44,2 ± 6,46 0,2 ±0,0 14,4 ± 4,22 0,5 ± 0,01 25,8 ± 3,54 0,3 ±0,01 15,3 ± 1,81 0 0

2гр % 1,2 ±0,02* 0,7 ± 0,02 68,7 ± 5,08*** 0,1 ±0Ш 9,2 ± 3,04 0,4 ±0,01 28,7 ±8,18 0» 2,2 ± 0,68* 0 0

Згр % 1,3 ± 0,02й 0,7 ±0,01 52,2 ± 3,75 0,1 ± 0,0* 8,6 ± 2,44 0,5 ± 0,01 36,5 ± 3,36 0я 4,10 ±1,56* 0 0

4гр % 1,1 ±0,01* 0,8 ± 0,01 67,9 ± 3,69*** 0,1*0,01"** 6,8 ± 1,5 0,3 ±0,0**** 24 ± 4,34 0** 0,9* 0 0

5гр % 1,8 ±0,01 0,8 ±0,01 48,32 ± 2,1 0,5 ± 0,08 11,78 ±2,66 0,6 ±0,01 30,3 ± 6,01 0,2 ± 0,01ш 9,2 ± 3,31*** 0 0

*р< 0,001 относительно гр1 #р< 0,001 относительно гр1 ####р<0,001 относительно гр1 **р< 0,01 относительно гр1 **р<0,0001 относительно гр1 шр< 0,0001 относительно гр1 ***р<0,005 относительно гр1

В группах подвергнутых ЭАСИТ также наблюдалось достоверно более низкое содержание эозинофилов в периферической крови (табл. 4)

Табл 4 Клеточный состав периферической крови (%) у мышей различных групп после ЭАСИТ (М±ЗР)___

№ группы Моноциты Лимфоциты Эозинофилы Нейтрофилы

1гр 3,0 ±1,0 69,6 ±8,65 11,4 ±3,65 16 ± 5,79

2гр 2,0 ±0,0 75,0 ± 7,25 6,0 ± 2,24* 17,0 ±6,40

Згр 3,0 ±0,0 72,4 ± 3,78 6,4 ±2,21** 18,2 ±3,27

4гр 4,0 ± 1,0 71,4 ±2,88 4,0 ±1,0*** 20,6 ± 1,52

5гр 3,0 ±0,71 71,2 ± 2,39 6,2 ± 0,84**** 19,6 ± 2,41

*р< 0,02 относительно 1гр **р<0,03 относительно 1гр

***р<0,002 относительно 1 гр ****р< 0,01 относительно 1 гр

Оценка дыхательной функции мышей подвергнутых ЭАСИТ позволила сделать вывод об отсутствии достоверных различий в показателях продолжительности и амплитуды дыхательных актов на введение возрастающих доз метахолина в сравнении с интактными мышами, что свидетельствовало о

19

нормальной реактивности бронхов у мышей подвергнутых ЭАСИТ. Такая реакция бронхов на воздействие неспецифического раздражителя, каким является метахолин, свидетельствовала о положительном эффекте ЭАСИТ Положительный эффект ЭАСИТ отражался также в снижении выраженности бронхоспазма на введение возрастающих доз метахолина в сравнении с контрольными группами мышей (табл.5)

Табл.5. Выраженность бронхоспазма у мышей BALB/c на введение метахолина в возрастающих дозах после провокационных введений овальбумина (М ± SEM)

Доза метахолина, мкг/кг Величина бронхоспазма, %

1гр 2гр Згр 4гр 5гр

50 51,8±4,1 13,4±5,4* 8,24± 1,6* 12,75±5,3* 53±8,6

100 42 ± 5,0 11 ±3,2** 11,9 ±5,9** 7,26 ±2,4** 43± 11,3

200 45 ± 4,6 16,6 ± 11*** 28 ± 3,2 *** 24 ± 4,4*** 56 ± 3,9

*р< 0,01 относительно гр1 **р< 0,01 относительно гр1

***р< 0,04 относительно гр 1

Напротив, у мышей из групп контроля (гр 1 и 5) наблюдалось достоверное увеличение продолжительности и уменьшение амплитуды дыхательных актов в сравнении с аналогичными показателями для интактных и подвергнутых ЭАСИТ мышей Это свидетельствовало в пользу развившейся неспецифической гиперреактивности бронхов, характерной для бронхиальной астмы (рис. 6)

250

О.

В

о

50

100

200

Дозы метахолина, мкг/кг —о— гр 1 ЭАСИТ плацебо (физ р-р) —О— гр 2 ЭАСИТ ОА

—й—грЗ ЭАСИТсОА

В ходе проведения ЭАСИТ в группах 2, 3, 4 определялось достоверное повышение анти-ОА 1дЕ-АТ с последующим его снижением после провокационных интраназальных аппликаций ОА Выявлено, что снижение анти-ОА 1дЕ-АТ достигалось меньшим количеством инъекций комплекса модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном (рис.7)

Сроки заборов крови | Начало ЭАСИТ

♦ гр 1 контроль ЭАСИТ —гр 2 ЭАСИТ ОА —О- гр 3 ЭАСИТ оОА - Д- гр 4 ЭАСИТ сОА-ПО —Ж— гр 5 контроль ПО

Рис.7. Уровни анти-ОА 1&Е антител в пуловых сыворотках мышей ВАЬВ/с в течение ЭАСИТ ОА, сОА, сОА-ПО и после интраназальных введений ОА в сравнение с контролем (ПКА)

В ходе проведения ЭАСИТ в группах 2,3,4 определялось постепенное нарастание анти-ОА 1дС-АТ, которые оставались на максимальном уровне во всех трех группах после интраназальных аппликаций овальбумина Выявлено, что повышение аллерген-специфических 1дО-АТ достигалось меньшим количеством инъекций комплекса модифицированного аллергена и полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном (рис.8)

Сравнительная оценка выраженности системной анафилаксии у мышей ВАЬВ/с после ЭАСИТ на модели ЭБА привела к выводу, что во всех группах мышей, получавших ЭАСИТ, определялось достоверное снижение интенсивности развития анафилаксии в сравнении с контрольными группами мышей Полученные результаты, свидетельствовали о выраженном гипосенсибилизи-

рующем эффекте ЭАСИТ ОА, сОА и сОА-ПО. (рис.9). Необходимо отметить, что значительный уровень гипосенсибилизации достигался меньшим количеством инъекций сукцшилированного овальбумина в комплексе с иммуномо-дулятором полиоксидонием.

1.40 1Д0

1,оо

х

1

| 0,0 0,40 0,20

14дн

ЭОдн

Г

-гр.1 кмпро.ть ЭАСЯТ ■

Сроки дабория кропя I Нячйло ЭАСИТ

■ Гр2 ЭАСИТ О А —О- гр.Э ЭАСИТ сОА гр.4 ЭАСИТ сОА-ТТО ■

Г г яаттроль ПО

Рнс. 8, Уровни аши-ОА ^О антител в индивидуальных сыворотках мышей ВЛЬВ/с в течение ЭАСИТ ОА, сОЛ. сОА-ПО и после лнтраназальных введений ОА в сравнение с контролем (ПКА).

3,5

£ 2,5

А

I 2

I

а

I ! %

5 ш

контроль; ЭАСИТ' фиэ.р-р

ЭАСИТ ОА ЗАСЙТсОА ЭАСИТсОА-ПО

Экспериментальные группы мышей В интенсивность системной анафялаксии через 30 минут после внутривенного введения ОА

козггроль адьюванта (ПО)

нннш ианоСГЕ системной анафкяаксии через час после нн>триВ4ннсго »падения ОА

Рис. 9. Выраженность системной анафилаксии (в баллах) у мышей ВАЬВ/с, >"■ -'.л

ЭАСИТ после внутривенного введения ОА в дозе 0,625 мг/кг.

Можно заключить, что гипосенсибилизация с применением комплекса модифицированного аллергена и полиоксидония, достигалась в меньшие сроки, более выражено и при меньшей антигенной нагрузке. Представляется, что данный подход может быть использован для безопасной и эффективной АСИТ в клинической практике

Выводы

1 Разработана краткосрочная модель 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей линии ВАЬВ/с без использования адъюванта

2 Установлено достоверное увеличение количества эозинофилов в брон-хо-альвеолярном лаваже, периферической крови и в перибронхиальной ткани легких у мышей с ЭБА, характеризующее развитие аллергического воспаления в легких

3 Уровень аллерген-специфических 1дЕ-антител существенно повышался после интраназальных провокаций аллергеном Значительный уровень сенсибилизации при моделировании ЭБА подтверждался развитием системной анафилаксии на введение аллергена

4. С помощью пневмографии установлено, что у мышей с ЭБА развивалась неспецифическая бронхиальная гиперреактивность

5. Показано преимущество ЭАСИТ на модели ЭБА модифицированным аллергеном в комплексе с иммуномодулятором полиоксидонием по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифициро-ванным аллергеном

6 Установлено, что высокий уровень аллерген-специфических ¡дв-антител и снижение уровня аллерген-специфических 1дЕ-антител может быть достигнут меньшим количеством инъекций комплекса модифицированного аллергена и полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или не модифицированным аллергеном

7. Установлено, что у мышей, подвергнутых ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и полиоксидония, определялось наиболее выраженное снижение признаков аллергического воспаления в легких.

8 Установлено, что значительный уровень гипосенсибилизации после ЭАСИТ, подтвержденный снижением развития системной анафилаксии

на введение модельного аллергена, наблюдался во всех группах мышей, подвергнутых ЭАСИТ 9 Полученная модель ЭБА на мышах, может быть использована в доклинических исследованиях при оценке эффективности препаратов для профилактики и лечения бронхиальной астмы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Khaitov M R , Litvin L S , Babakhin A A, Stecenco О N , Voronkova L N , Ivanova A S , Barsegyan G G. The evaluation of various schemes of ovalbumin administration in murine bronchial asthma modeling Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2005, suppl 1, p 80.

2 Litvin L S, Khaitov M R., Babakhin A.A, Stecenco О N , Voronkova L N , Ivanova A S Asthma modeling using BALB/c and (CBAxC57BL/6)F1 mice The Proceedings of EAACI2006 Congress, Vienna, p 203-204

3 Литвин Л С , Хаитов M P , Бабахин A A, Стеценко О H , Воронкова Л H , Иванова А С , Барсегян Г Г Разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы Оценка различных способов иммунизации при моделировании экспериментального аллергического ответа Российский Аллергологический журнал, 2005, №1, с 35-42

4 Бабахин А А, Литвин Л С , Хаитов М.Р., Воронкова Л.Н., Стеценко О H , Иванова А.С., Барсегян Г Г Оценка различных способов иммунизации при моделировании атопической бронхиальной астмы у мышей Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (18-22 апреля 2005 г, Москва). M , 2005, с 735-736

5 Литвин Л С , Хаитов M Р , Бабахин А А Модели экспериментальной атопической бронхиальной астмы Патофизиология и экспериментальная терапия, 2006, №3, с 26-28

6. Литвин Л С , Хаитов M Р , Бабахин А А, Стеценко О H , Борзова Н.В, Иванова А С., Барсегян Г.Г Характеристика экспериментальной модели бронхиальной астмы, полученной без использования адъюванта. Аллергология и иммунология, 2007, т.8, №1, с 40

7. Babakhin A A., Litvin LS, Andreev SM, Stecenco ON, Voronkova L.N., Ivanova A S , Khaitov M.R , Barsegyan G G., DuBuske IV, DuBuske L M Allergen-specific immunotherapy using a highly modified allergen and the immunomodulator polyoxidonium in a murine model of allergic asthma Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, v 119, №1, s 59

8 Babakhin AA, Litvin LS, Stecenco ON, Voronkova L N, Borzova NV., Ivanova A S , Barsegyan G G , DuBuske L M , Khaitov M R Development and charactenzation of a short-term asthma model using BALB/c mice. J Allergy, 2007, v 62 (s 83), p.252-253

9 Babakhin A A, Litvin L S, Andreev S.M , Stecenco О N , Voronkova L N , Borzova N V, Ivanova A S , Khaitov M R , Barsegyan G G , DuBuske IV, DuBuske L M. Experimental desensitization using a modified allergen absorbed onto a synthetic Immunomodulator in a murine model of allergic asthma J Allergy, 2007, v 62 (s 83), p 252-253

10 Литвин Л .С., Бабахин A A, Стеценко O.H., Воронкова Л H , Борзова Н.В , Иванова А С , Барсегян Г Г, Хаитов М.Р Характеристика краткосрочной без-адьювантной модели lgE-зависимой бронхиальной астмы (БА) у мышей BALB/c ФИПИС, 2007, т 11, №5, с. 3-9

Подписано в печатьО О? г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ 499 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им НН БлохинаРАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых. Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [49]. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн. человек [7]. В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (IgE-зависимая и не IgE-зависимая) и не аллергическую Б А [71]. В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие БА связано с IgE-опосредованными (атопическими) механизмами [30]. Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [114]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для профилактики и контроля воспалительного процесса при БА. Несмотря на широкое применение различных противоастматических и противоаллергических фармакологических препаратов, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [7].

На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах лежащих в основе того или иного заболевания получены с использованием экспериментальных моделей, адекватных различным заболеваниям человека. Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом в изучении безопасности и эффективности новых лечебных препаратов. К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, уже описаны протоколы индукции моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [17,42]. Большинство протоколов индукции IgE-зависимой бронхиальной астмы предполагает использование адъювантов. Преимущественное использование мышей для моделирования бронхиальной астмы связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания. Мыши могут быть сенсибилизированы к различным видам аллергенов и развивать аллерген-индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность. Существуют определенные сходства между параметрами моделей аллергической бронхиальной астмы мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [25]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке и использовании для доклинических исследований адекватной модели аллергической (^Е-зависимой) бронхиальной астмы у мышей. Поэтому, разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы является актуальной и перспективной в нашей стране.

Разработка модели БА на мышах позволит в дальнейшем изучать механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов перспективных для лечения и профилактики БА.

Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ) [92]. В настоящее время разрабатываются и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов. Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [4]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей - адъювантов [2,10,64].

Очевидно, что для доклинического изучения свойств гипоаллергенных вакцин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей. Проведение доклинических исследований новых форм аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ может всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течение ^Е-зависимой БА.

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможность ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ. Задачи:

1. Разработать схему моделирования 1§Е-зависимой БА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта;

2. Изучить динамику накопления аллерген-специфических 1§Е- и антител в ходе моделирования ЭБА;

3. Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей с ЭБА;

4. Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА;

5. Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА;

6. Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА;

7. Провести сравнительную ЭАСИТ немодифицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с полиоксидонием на модели ЭБА;

8. Изучить динамику накопления аллерген-специфических ^Е- и антител в ходе и позавершении ЭАСИТ;

9. Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ;

10. Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ;

11.Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ;

12.Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ.

Научная новизна работы:

Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель 1§Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта.

Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина.

Впервые на модели 1§Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном.

Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном.

Практическая значимость:

Разработанная краткосрочная модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения ^Е-зависимых заболеваний, в частности атопической бронхиальной астмы.

Экспериментальная модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы также может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания.