Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методов контроля качества новых пролонгированных глазных капель с глутатионом, карнозином и таурином

005009266

На правах рукописи

Халикова Мария Альбертовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА НОВЫХ ПРОЛОНГИРОВАННЫХ ГЛАЗНЫХ КАПЕЛЬ С ГЛУТАТИОНОМ, КАРНОЗИНОМ И ТАУРИНОМ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.04.01 - технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 0ЕЗ

Курск-2011

005009266

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научные руководители:

Доктор фармацевтических наук Доктор фармацевтических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Доктор фармацевтических наук

Новиков Олег Олегович Жилякова Елена Теодоровна

Шорманов Владимир Камбулатович Гузев Константин Сергеевич

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «^С&уРГИА^ 2012 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.039.63 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан £¿5*» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы. В настоящее время катаракта остается главной причиной приобретенной слепоты в мире и, несмотря на успехи ее устранения с помощью хирургических методов, приоритетным направлением в предупреждении катаракты является использование лекарственных и лечебно-профилактических средств.

На современном фармацевтическом рынке существует ряд лекарственных препаратов которые в своем составе содержат метаболические действующие компоненты (Соколова, 2008). Однако большинство антикатарактальных препаратов являются однокомпонентными непролонгированными, и это противоречит современным подходам к проведению комбинированной фармакотерапии заболеваний. Современные подходы предполагают сочетание нескольких лекарственных веществ в одной лекарственной форме с целью оптимизации терапии многофакторных патологий, к которым относится катаракта, а так же возможной синергичности фармакологического эффекта.

В настоящем ассортименте лекарственных средств практически полностью отсутствуют антикатарактальные препараты пролонгированного действия, что вызывает необходимость многократного применения уже существующих лекарственных препаратов, что удлиняет курс лечения, а также не решает проблем, связанных с низкой биодоступностью глазных капель. Исходя из этого, разработка конкурентоспособных многокомпонентных препаратов пролонгированного действия для предупреждения и лечения катаракты является задачей своевременной и актуальной, а низкую биодоступность глазных капель возможно изменить введением в состав полимеров-загустителей, что позволит увеличить длительность контакта со слизистой глаза и обеспечить равномерное высвобождение активных компонентов (Sultana, 2006).

Достижениями современной науки показана возможность и эффективность применения в качестве антикатарактальных веществ, проявляющих антиоксидантную активность (Лумпова, 2007). К таким веществам относятся глутатион восстановленный (глутатион, GSH), карнозин и таурин, которые были предложены в качестве действующих компонентов разрабатываемого препарата.

Глутатион обладает широкой терапевтической активностью, высокой антиоксидантной способностью и обеспечивает увеличение прозрачности хрусталика, подверженного катарактогенезу (Zhang, 2008). Поддерживать глутатион в терапевтически активной восстановленной форме способен дипептид карнозин, который обладает собственным антикатарактальным эффектом (Болдырев, 2007). Применение третьего активного компонента - сульфоаминокислоты таурина - обусловлено его благотворным влиянием на метаболический обмен в тканях глаза.

Такое сочетание действующих компонентов позволит реализовать многофакторную терапию катаракты и, по возможности, добиться синергичности фармакологического эффекта, а также расширить ассортимент антикатарактальных препаратов, представленных на российском фармацевтическом рынке.

Однако обеспечение и контроль качества такого многокомпонентного препарата осложняется тем, что в состав входят вещества аминокислотной природы, имеющие схожее химическое строение и химические свойства. Таким образом, разработка методов контроля качества новых пролонгированных глазных капель с глутатионом, карнозином и таурином является актуальной задачей современной фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методов контроля качества новых пролонгированных глазных капель с глутатионом, карнозином и таурином.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Выбрать и обосновать действующие компоненты разрабатываемого препарата, учитывая их химические, физико-химические и фармакологические свойства.

2. Выбрать и обосновать использование вспомогательных веществ, разработать состав пролонгированного препарата.

3. Разработать технологический процесс производства глазных капель с учетом особенностей физико-химических свойств входящих в состав компонентов и требований ОМР.

4. Разработать методы контроля качества пролонгированных глазных капель с глутатионом восстановленным, карнозином и таурином.

5. Провести валидацию разработанной методики качественного и количественного определения глутатиона восстановлено, карнозина и таурина в препарате.

6. Разработать нормы качества для многокомпонентных пролонгированных глазных капель и составить проекты нормативной документации.

7. Провести исследование токсичности и специфической фармакологической активности разработанных глазных капель.

Научная новизна исследования. Теоретически обоснована возможность и актуальность разработки многокомпонентного пролонгированного антикатарактального препарата с глутатионом восстановленным, карнозином и таурином.

Впервые проведено исследование и оптимизация технологических свойств вспомогательных веществ, применяемых в качестве загустителей глазных капель. Установлены режимы микродиспергирования и тип деформирующих воздействий, позволяющие оптимизировать технологические характеристики гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ) и гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ).

Впервые исследовано влияние процесса микродиспергирования ГЭЦ и ГПМЦ на физико-химические показатели их растворов. Выявлена способность процесса микродиспергирования увеличивать кинематическую вязкость растворов указанных полимеров.

Впервые исследована зависимость кинетических характеристик процесса высвобождения глутатиона из модельных смесей глазных капель от типа, концентрации и режима механообработки полимера-загустителя.

Впервые разработан технологический процесс производства препарата, учитывающий особенности входящих в состав компонентов. Предложена технологическая и аппаратурная схемы процесса производства препарата, в соответствии с требованиями ОМР.

Впервые разработаны методы контроля качества пролонгированных глазных капель, содержащих глутатион восстановленный, карнозин и таурин с целью оценки правильности разработанной технологии, определения норм качества препарата и исследования его стабильности в процессе производства и хранения, установления сроков годности.

Впервые изучена токсичность и антикатарактальная активность глазных капель «Таурикам». Экспериментально показана их терапевтическая активность и отсутствие токсического действия.

Новизна основного фрагмента исследования подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение № 2404768 «Глазные капли».

Практическая значимость работы. Разработана технология многокомпонентных пролонгированных антикатарактальных глазных капель, содержащих глутатион восстановленный, карнозин и таурин. Проведена наработка препарата в условиях производства на предприятии ЗАО «Аквион» (акт внедрения предложения от 15.09.2011). Разработан лабораторный регламент и проект ФСП «Таурикам, глазные капли».

Разработанные методики включены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии (акт внедрения № У-4101 от 11.10.2011 г.), кафедры фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения (акт внедрения № У-4100 от 11.10.2011г.) ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», кафедры фармацевтической технологии (акт внедрения № 202/1 от 02.11.2011 г.), кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии (акт внедрения № 202/2 от 02.11.2011 г.) ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» в рамках научного направления «Разработка методологических подходов к анализу природных и синтетических биологически активных соединений в объектах различного происхождения. Изучение фармакологических аспектов использования данных биологически активных соединений». Номер государственной регистрации темы диссертационного исследования 01201178461.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуждались на Международной научно-практической конференции «Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения» (г. Белгород, 2009), Всероссийской школе-семинаре «Современные наукоемкие лечебные и фармацевтические технологии для офтальмологии для молодых ученых» (г. Белгород, 2009), Международной научно-практической конференции «Фитодизайн в современных условиях» (г. Белгород, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2010), научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной фармации и фармацевтического образования» (г. Белгород, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (г.Курск, 2011), 6-ой международной конференции Nordic Separation Science Society (Латвия, г. Рига, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты разработки и обоснования состава многокомпонентных пролонгированных глазных капель с глутатионом восстановленным, карнозином и таурином;

- результаты исследования и оптимизации технологических свойств гидроксиэтилцеллюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы;

- результаты исследования влияния процесса микроструктурирования полимеров на физико-химические показатели их растворов и кинетику процесса высвобождения глутатиона восстановленного;

- результаты разработки технологического процесса производства глазных капель с учетом физико-химических особенностей входящих в состав компонентов и требований GMP;

- методики контроля качества разработанных пролонгированных глазных капель с глутатионом, карнозином и таурином;

- результаты валидации методики качественного и количественного определения глутатиона восстановленного, карнозина и таурина в модельных смесях глазных капель;

- нормы качества разработанных глазных капель.

Публикации по работе. По материалам диссертационного исследования опубликовано 16 научных работ, из них 1 патент Российской Федерации, 5 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 30 таблиц, состоит из введения, 5 глав, общих выводов, списка литературы, включающего 161 источник, в т.ч. 107 работ зарубежных авторов, приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Характеристика глутатиона, карнозина и таурина как действующих веществ антикатарактальных глазных капель (обзор литературы)

На основании литературного обзора охарактеризована проблема катаракты, этиология, возможные пути профилактики и лечения. Изучен и проанализирован материал по глазным каплям пролонгированного действия.

Охарактеризован процесс механообработки полимеров-загустителей как способ оптимизации технологического процесса получения пролонгированных глазных капель.

Дана характеристика физико-химическим свойствам и биологической роли глутатиона, карнозина и таурина. Кроме того, рассмотрен спектр современных методов анализа указанных веществ.

Проведенный литературный обзор определил цели и задачи диссертационного исследования, подтвердив актуальность разработки пролонгированных глазных капель с глутатионом, карнозином и таурином для профилактики и лечения катаракты.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Объекты диссертационного исследования представлены в таблице 1. При реализации аналитических методов использованы растворители и реактивы марок «хч» и «чда».

Получение микроструктурированных образцов ГПМЦ и ГЭЦ проводили в условиях ударно-истирающего и истирающе-раздавливающего деформационного воздействия в шаровой вибрационной мельнице MJI-1 и вибрационной дисковой мельнице Retsch RS-200 в различных временных режимах. Таблица 1. Объекты исследования__

Вещество нд Субстанция СО (стандартный образец)

Действующие вещества

Глутатион восстановленный SH о / н /'nh2 н S EPh 04/2005:1670 AppliChem BioChemica (Германия) Sigma Aldrich (Япония)

Карнозин H,N-(CH,)-CO-NH-CH-CH;-| | СООН N^^NH USPh 25, ВФС 422659-95 Wirud Co. Limited (Китай) Sigma Aldrich (Швейцария)

Таурин H2N-CH2-CH2-S03H ФСП 42-8367-07 Экохим-Инновации (Россия) Sigma Aldrich (Япония)

Декстран низкомолекулярный EPh 5.0 01/2005:0999 Pharmacosmos (Дания) -

Продолжение таблицы 1

Вспомогательные вещества

Гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ) Eph 5.0 01/2005:0336 Sigma Aldrich Chemistry -

Гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ) Eph 5.0 01/2005:0348. Acros Organics, (Бельгия) -

Поливинилпирролидон (ПВП) EPh 5.0 Povidone 01/2005:0685, ФС 42-3678-98 Merck (Германия) -

Поливиниловый спирт (ПВС) EPh 5.0. 01/2005:1961, ФС 42-2299-85 Merck (Германия) -

Натрий карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ) ФС 42-11281-00 Fluka (Швейцария) -

Бензалкония хлорид (БАХ) ФС 42-0131-04 Fluka, (Дания) Fluka, CN C1206C

Методы исследования и инструментарий, примененные в рамках выполнения технологических работ диссертационного исследования, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Технологические методы исследования, примененные в диссертационной работе

Метод исследования Определяемый параметр Инструментарий

Микроскопия Форма и размер частиц Растровый электронно-ионный сканирующий микроскоп Quanta 200 3D

Фракционирование Гранулометрический (фракционный) состав Лазерный анализатор размеров частиц «Analysette 22 NanoTec»

Определение текучести Сыпучесть и угол естественного откоса Прибор для определения сыпучести ВП12А с установленным угломером

Определение насыпной плотности Максимальная насыпная плотность Прибор для определения насыпного объема модели 545Р-АК-3

Анализ по показателю «цветность» проводили в соответствии с ГФ XII ОФС 420050-07 «Степень окраски жидкостей».

Анализ растворов по показателю «прозрачность и степень мутности» проводили по стандартной методике в соответствии с ГФ XII ОФС 42-0051-07 «Прозрачность и степень мутности».

Определение рН растворов проводили потенциометрическим методом в соответствии с ГФ XII ОФС 42-0048-07 «Ионометрия».

Определение плотности растворов проводили с помощью пикнометров в соответствии с ГФ XII ОФС 42-0037-07 «Плотность».

Измерение кинематической вязкости и расчет динамической вязкости исследуемых растворов проводили в соответствии с ГФ XII ОФС 42-0038-07 «Вязкость».

Стерильность глазных капель определяли согласно ГФ XII ОФС 42-0066-07 «Стерильность».

Осмолярность модельных смесей глазных капель определяли криоскопическим методом на миллиосмометре термоэлектрическом МТ-5, согласно методике ГФ XII ОФС 42-0047-07 «Осмолярность».

В ходе реализации спектрофотометрического определения веществ использовали спектрофотометр СФ-56 (ЛОМО-Спектр, Россия). Хромагографирование в тонком слое сорбента проводили с использованием полуавтоматического устройства для нанесения проб 1лпота1 5, автоматической камеры для элюирования, визуалайзера хроматограмм (Сагг^, Швейцария).

Статистическую обработку полученных в ходе исследования данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента при доверительной вероятности 0,95 в соответствии с требованиями ГФ XII.

Метод обращенно-фазовой ВЭЖХ для разделения, идентификации и количественного определения глутатиона, карнозина и таурина проводили на хроматографической системе Shimadzu LC-20 Prominence (Kyoto, Япония), снабженной насосом LC-20AD, дегазатором DGU-20 А5, термостатом СТО-20А, диодно-матричным детектором - SPD-M20A, автодозатором - SIL-20AC. В ходе данного метода использовали аналитическую колонку Supelco Ascentis Express С18 100x4,6 мм с зернистостью сорбента 2,7 мкм. Валидацию разработанной методики количественного определения указанных веществ в препарате проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».

Изучение токсичности глазных капель проводили на обоеполых белых лабораторных мышах и нелинейных крысах. Исследование специфической антикатарактальной активности препарата проводили на молодняке беспородных белых крыс с моделированной селенитовой катарактой, путем подкожной инъекции натрия селенита (Merck, Германия), растворенного в 0,9 % растворе натрия хлорида, в дозе 30 нмоль/г массы тела.

Глава 3. Разработка состава многокомпонентных глазных капель

С целью оптимизации пути решения поставленных задач разработана концепция исследования, включающая 4 основных этапа: I. Маркетинговый анализ российского фармацевтического рынка антикатарактальных препаратов (АКП). II. Разработка состава, обоснование действующих и вспомогательных компонентов препарата. III. Разработка методов контроля качества действующих компонентов препарата. IV. Изучение токсичности и специфической активности глазных капель.

В рамках I этапа проведен контент-анализ официальных данных по АКП, определены основные параметры российского фармацевтического рынка АКП, проведено ранжирование ассортимента указанной группы препаратов по показателям: фармакологическая группа, группа в соответствии с АТХ-классификацией, действующее вещество, производитель, лекарственная форма. На основании полученных данных сформирован макроконтур российского рынка АКП. Полученные результаты позволили установить, что доминирующую часть препаратов исследуемой группы представляют монокомпонентные препараты таурина и являются непролонгированными. Сложившаяся ситуация требует проведения активной работы в рамках расширения ассортимента лекарственных препаратов для предупреждения и лечения катаракты и может быть решена при разработке конкурентоспособных препаратов пролонгированного действия, что подтверждает актуальность проводимой диссертационной работы.

II этап работы посвящен разработке состава, обоснованию действующих и вспомогательных компонентов препарата. В рамках данного этапа проведено исследование антиоксидантной активности (АОА) глутатиона, карнозина и таурина методом ингибирования радикала DPPH, которое устанавливали спектрофотометрически. По полученным результатам строили калибровочные кривые ингибирования радикала растворами глутатиона, карнозина, таурина и кислоты аскорбиновой. Последнюю использовали в качестве модельного антиоксиданта. АОА выражали с помощью показателя IC50, который показывает, какое количество анализируемого вещества необходимо для ингибирования 50% радикала. Значение показателя 1С50 определяли по калибровочным кривым. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты исследования процесса ингибирования радикала DPPH

Анализируемое вещество Концентрация, мг/мл %inh IC50, мг/мл Дх, р = 0,95

Глутатион восстановленный 0,0105 0,1046 0,1500 0,2000 5,340 50,695 80,265 100,000 0,098 ± 0,002 0,0018 1,93

Карнозин 0,0100 0,1003 0,5000 1,0030 0,605 1,201 1,400 2,456 30,128 ±0,005 0,0059 0,48

Кислота аскорбиновая 0,0102 0,0500 0,1020 0,1250 3,696 56,012 98,896 100,000 0,055 ±0,001 0,0015 2,76

Установлено, что глутатион обладает АОА сопоставимой с таковой кислоты аскорбиновой, использованной в качестве модельного антиоксиданта. Карнозин проявляет низкую активность в условиях in vitro. Таурин не показал антиоксидантной активности в условиях in vitro, в связи с чем, не представлен в таблице 3.

В рамках выбора и обоснования полимера-загустителя глазных капель исследованы физико-химические свойства растворов полимеров, широко применяемых в технологии офтальмологических лекарственных форм, в том числе косвенный показатель пролонгированное™ - вязкость. Растворы 3% ПВС, 10% декстрана, 0,1% и 0,2% ГЭЦ, 0,3% и 0,4% ГПМЦ были выбраны как оптимальные по показателям вязкость и рН. С указанными полимерами были наработаны модельные смеси глазных капель, составы которых представлены в таблице 4.

Таблица 4. Составы модельных смесей препарата

Компонент Состав, г/л

1 2 3 4 5 6 7

Глутатион 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Карнозин 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

Таурин 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

ПВС 30,0

Декстран 100,0

ГЭЦ 1,0

2,0

ГПМЦ 3,0

4,0

БАХ 0,1 ОД 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Вода для инъекций До 1л До 1л До 1л До 1л До 1л До 1л До 1л

Характе] эистика

Вязкость, сСт 2,730 8,113 6,308 4,574 10,312 7,127 10,649

рН 6,70 6,53 7,24 7,53 7,35 6,87 7,15

Осмолярность, мОсм/л 256,3 256,3 256,3 256,3 256,3 256,3 256,3

Прозрачность и степень мутности Прозрач ный Соотв. эталону 11 Прозрач ный Прозра чный Прозра чный Прозра чный Прозра чный

Цветность Бесцветный Бесцветный Соотв. эталону Y3 Бесцветный Бесцветный Бесцветный Бесцветный

В качестве консерванта был выбран БАХ, что обусловлено его преимуществами. Наработанные модельные смеси проанализированы по показателям: органолептические свойства, вязкость, осмолярность, рН. Установлено, что модельные смеси с ЛВС и декстраном обладают неудовлетворительными органолептическими свойствами, в связи с чем, для дальнейшей работы были определены составы с ГЭЦ и ГПМЦ (№4-7).

На следующей стадии были исследованы и оптимизированы технологические характеристики указанных полимеров. Оптимизацию проводили путем микродиспергирования в условиях ударно-истирающей и истирающе-раздавливающей деформации (таблица 5).

Таблица 5. Оптимизированные технологические характеристики полимеров

Примечание: Ке - коэффициент элонгации; а - угол естественного откоса, насыпная плотность, кг/м3

ртах - максимальная

Установлено, что для ГЭЦ оптимизация технологических характеристик происходит при режиме 15-ти минут диспергирования в дисковой мельнице (ГЭЦ 15 118), а в случае ГПМЦ при диспергировании в течение 5-ти минут в шаровой мельнице (ГПМЦ 5МЛ). Замечено, что при микродиспергировании размер частиц меняется незначительно, в то время как отмечено изменение формы частиц полимеров, их удлинение, о чем свидетельствует коэффициент элонгации (исходное значение Ке для ГЭЦ 1,5, для ГПМЦ 1,34) (таблица 5).

Поскольку процесс механообработки способен влиять не только на технологические свойства веществ, были исследованы физико-химические свойства растворов ГЭЦ и ГПМЦ в различных концентрациях.

Установлено, что процесс микродиспергирования в указанных режимах способствует увеличению кинематической вязкости растворов ГЭЦ в среднем на 10%, увеличение кинематической вязкости растворов ГПМЦ происходит на 6% (рисунки 1-2). Наблюдаемый эффект дает возможность увеличения вязкости лекарственной формы и

предположительно улучшить биофармацевтические свойства препарата без увеличения

концентрации используемого полимера-загустителя.

13

-ГЭЦО.1% КЗ

-ГПМЦ0,3%М1

-ГПМЦ0,4%М1

время механообработки, мин

Рис. 1. Влияние процесса микродиспергирования на кинематическую вязкость ГЭЦ

время механообработки, мин

Рис. 2. Влияние процесса микродиспергирования на кинематическую вязкость ГПМЦ

Исследование зависимости кинетических характеристик высвобождения глутатиона восстановленного от используемого полимера-загустителя, его концентрации и режима механообработки проводили посредством диализа по методике Крувчинского. Поскольку глутатион является самой крупной молекулой и обладает наибольшей антиоксидантной активностью среди используемых действующих веществ в разрабатываемом препарате, было принято решение исследовать процесс высвобождения из растворов полимеров на примере его молекулы (рисунок 3).

0,000

без полимера • ГЭЦ0Д% - ГЭЦО,2% ГПМЦ 0,3% ГПМЦ 0,4%

100 150 200

время диализа, мин

300

Рис. 3. Высвобождение глутатиона восстановленного из модельных смесей глазных капель без полимера и содержащих полимер-загуститель

Установлено, что наиболее равномерное высвобождение глутатиона ' восстановленного происходит из модельной смеси, содержащей 0,2% ГЭЦ, при этом наблюдается поддержание высвободившегося количества вещества более ' продолжительное время, по сравнению с другими модельными смесями, отсутствует

резкое колебание концентраций, что является благоприятным фактором при разработке пролонгированных лекарственных форм.

Таким образом, оптимальной модельной смесью является смесь № 5, которой было дано рабочее наименование «Таурикам».

Следующим этапом работы явилась разработка технологического процесса производства препарата «Таурикам». Предложена технологическая схема производства (рисунок 4), разработан лабораторный регламент производства.

Приготовление раствора проводили в помещении класса С массо-объемным способом в реакторе вместимостью 2,0 л, снабженном мешалкой якорного типа. Первой стадией технологического процесса явилась стадия набухания ГЭЦ, для чего предварительно отвешенную микродиспергированную в течение 15-ти минут в дисковой мельнице (Я^зсЬ 115-200) ГЭЦ посредством питателя переносили в реактор, добавляли 80% воды для инъекций, перемешивали 20 минут и оставляли для набухания на 12 часов.

БАХ растворяли отдельно в промежуточной емкости в небольшом количестве воды ввиду высокой гигроскопичности данного соединения, получая таким образом концентрат.

По истечении времени набухания ГЭЦ, в ее раствор количественно переносили навески карнозина и таурина, перемешивали с помощью мешалки 10 минут. После полного растворения внесенных соединений, в раствор добавляли полученный концентрат БАХ и перемешивали еще 5 минут. В последнюю очередь добавляли навеску глутатиона восстановленного, вследствие его легкоокисляемости и перемешивали 5 минут, после чего объем раствора доводили до необходимого уровня водой для инъекций. После окончания процедуры приготовления раствора «Таурикам», отбирали пробу для контроля полупродукта по показателям: внешний вид, цветность, количественное содержание глутатиона, карнозина, таурина, БАХ.

Полученный раствор «Таурикам» стерилизовали методом фильтрования при помощи вакуума и фильтра типа «Миллипор» с фильтрующим материалом из полипропилена с диаметром пор 0,22 мкм, при этом использовали префильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Фильтрование проводили в асептических условиях в емкость-барботер для чистого раствора.

Важным этапом технологического процесса производства глазных капель «Таурикам» является барботирование приготовленного раствора стерильным инертным газом (аргон, азот). Важность данной стадии объясняется легкоокисляемостью входящего в состав глутатиона восстановленного.

Метод барботирования раствора стерильным инертным газом позволяет вытеснить растворенный кислород и нивелировать тем самым возможность процесса окисления глутатиона в готовом препарате в период хранения. После проведения процесса барботирования в течение 15 минут, раствор, не содержащий механические включения, незамедлительно передают на стадию ТП 4 - Наполнение и укупорка флаконов.

Каждый наполненный флакон незамедлительно вручную укупоривают резиновой пробкой. После отбора образцов для микробиологического контроля, флаконы передают на стадию ТП 4.2 - Укупорка флаконов алюминиевыми колпачками. От упакованной продукции отбирают среднюю пробу на анализ по проекту фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Рис.4. Технологическая схема производства препарата «Таурикам»

Глава 4. Аналитическое обеспечение действующих веществ препарата

Действующие вещества разрабатываемых глазных капель являются соединениями аминокислотной природы, соответственно, имеют схожую химическую структуру и химические свойства, что затрудняет процесс их идентификации при совместном

присутствии в лекарственной форме, а процесс количественного определения предполагает разработку оптимальных условий их хроматографического разделения.

На следующем этапе работы для возможности исследования стабильности препарата при хранении и обоснования разработанного технологического процесса производства глазных капель «Таурикам» был реализован комплекс исследований, направленный на разработку аналитического обеспечения входящих в состав препарата компонентов и проекта ФСП.

В качестве методов идентификации глутатиона, карнозина и таурина в модельных смесях препарата предложены цветные реакции. Для глутататиона были выбраны растворы нингидрина, натрия нитропруссида, 1-фтор-2,4-динитробензола (ДНФБ), реактивы Фоля, Бенедикта и Эльмана. Для карнозина предложены реакции взаимодействия с реактивами Паули и Драгендорфа, растворами ванилина, висмута нитрата, свинца ацетата, железа хлорида. Для открытия таурина использованы реакции с натрия нитропруссидом и щелочным раствором нингидрина.

Для идентификации исследуемых соединений был разработан метод хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ). Скрининговые исследования показали, что наиболее оптимальными условиями ТСХ разделения действующих компонентов препарата является использование в качестве элюента смеси спирт : вода (1:1, об.), а в качестве сорбента целлюлозы (ВЭТСХ пластины PEI 1.05730.0001) (рисунок 5).

Рис. 5. Хроматограмма водных растворов СО таурина (1), СО глутатиона (2), СО карнозина (3) и препарата «Таурикам» (4)

Полученная хроматограмма, представленная на рисунке 5, показывает, что зоны адсорбции, окраска и интенсивность пятен исследуемых веществ в модельной смеси совпадают с таковыми СО глутатиона 0,87), карнозина 0,33) и таурина 0,78).

Для количественного определения глутатиона в модельной смеси разработан метод спектрофотометрического определения с предварительной дериватизацией реактивом Эльмана. В ходе данного взаимодействия образуется 2-нитро-5-тиобензойная кислота, придающая раствору ярко-желтое окрашивание и обладающая характерным максимумом поглощения при длине волны 412 нм (рисунок 6).

1.0 о.а 0.6 0.4 0.2 0.0

. I . I . I . I . I , I . I . I . I . I . I I

380 400 420 440 460 4S0

Дкяна I

Рис.6. Спектр поглощения 2-нитро-5-тиобензойной кислоты Метрологические характеристики методики представлены в таблице 6. Таблица 6. Метрологические характеристики методики спектрофотометрического

Определяемое вещество п Хер S2 Sx Р t(p,f) Лх 6,%

Глугатион восстановленный 6 0,249 1,547x10"5 0,0016 0,95 2,57 0,0041 1,653

Полученные результаты показывают, что относительная погрешность результатов измерений не превышает ± 1,653% при шести повторностях и доверительной вероятности 0,95, что позволяет применять разработанную методику для количественного определения глутатиона восстановленного в глазных каплях сложного состава. Данная методика была использована в работе при изучении процесса высвобождения глутатиона из растворов модельных смесей препарата.

Как наиболее точный и специфичный способ идентификации и количественного определения выбран метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с градиентным элюированием и предколоночной дериватизацией компонентов смеси ДНФБ.

Результаты, удовлетворяющие поставленным задачам по разделению исследуемых веществ, были получены с применением аналитической колонки - Supelco Ascentis Express С18 100x4,6 мм, 2,7 мкм в режиме термостатирования при 30°С. Детекцию проводили спектрофотометрически при длине волны 375 нм. Объем вводимой пробы составил 5 мкл. Подвижная фаза А - 0,3% раствор триэтиламина в ацетонитриле (доведенный до рН 2,5 уксусной кислотой); подвижная фаза В - 0,3% водный раствор триэтиламина (доведенный до рН 2,5 уксусной кислотой). Программа бинарного градиента: 0,01-2,00 мин 85% фазы В, 2,01-3,00 мин 65% фазы В, 3,01-10,00 мин 60% фазы В, 10,01-12,01 мин 85% фазы В. Скорость потока 0,8 мл/мин.

Полученная в ходе эксперимента хроматограмма ДНФ-производного модельной смеси препарата представлена на рисунке 7.

Исходя из данных рисунка 7, для свободного реагента ДНФБ характерно наличие четырех пиков со временами удерживания 6,2 мин, 6,8 мин, 7,2 мин и 8,9 мин. Производному таурина соответствует пик со временем удерживания 4,6 мин. Производное глутатиона имеет пик со временем удерживания 9,4 мин и производное карнозина характеризуется наличием трех пиков со временами удерживания 4,2 мин, 5,9 мин, 7,7 мин, что объясняется его химической структурой.

|—

n ®

3 s

А

■Л4

Рис. 7. Хроматограмма ДНФ-производного модельной смеси глазных капель

Пригодность использованной хроматографической системы для разделения и анализа исследуемых веществ подтверждали рассчитанными характеристиками, представленными в таблице 7.

Аналит tR S N НЕТР Rs Tf Wo.05

Глутатион 9,4 140045,9 58706 2,56 2,95 1,20 0,1964

4,2 2373236,4 30688 4,91 - 1,48 0,1183

Карнозин 5,9 235975,8 40466 3,71 11,63 1,31 0,1441

7,7 1347092,9 L 48882 3,08 3,49 1,20 0,1751

Таурин 4,6 11371079,1 46645 3,26 4,12 1,43 0,1180

Согласно данным таблицы 7, разрешение пиков исследуемых веществ (Rs) и коэффициент асимметрии пиков (Tf) соответствуют требованиям, предъявляемым Европейской фармакопеей 5.0. Число теоретических тарелок (N) и значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (НЕТР) показали высокую эффективность использованной аналитической колонки. Полученные результаты говорят о пригодности хроматографической системы для разделения и анализа глутатиона, карнозина и таурина.

Концентрации веществ были рассчитаны по величине площадей пиков их ДНФ-производных с учетом полученных хроматограмм ДНФ-производных стандартных образцов исследуемых веществ. Полученные результаты и результаты их статистической обработки представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты количественного определения глутатиона восстановленного, карнозина и таурина в препарате методом ВЭЖХ

Определяемое вещество Определено (Хер, мг/мл) S2 S Дх, р = 0,95 £,%

Глутатион Хер = 2,48 0,0006 0,024 0,025 1,02

Карнозин Хер = 19,98 0,041 0,203 0,213 1,07

Таурин Хер = 19,99 0,027 0,166 0,174 0,87

Как видно из таблицы 8, относительная ошибка опыта не превышает ± 5%, для глутатиона относительное стандартное отклонение составляет 1,02% при определенной в опыте | концентрации 2,48±0,025 мг/мл; для карнозина 1,07% при концентрации 19,98±0,213 мг/мл; для таурина 0,87% при найденной концентрации 19,99±0,174 мг/мл.

В качестве доказательства отсутствия систематической ошибки, был реализован опыт с добавками СО исследуемых веществ. Установлено, что относительная ошибка опыта с добавками СО глутатиона, карнозина и таурина не превышает ошибки единичного определения и имеет отклонение как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения, что указывает на отсутствие систематической ошибки опыта.

Валидация разработанной методики была проведена по показателям правильность, сходимость, специфичность, линейность и диапазон применения.

При определении правильности методики концентрация веществ была рассчитана по площадям пиков их ДНФ-производных, относительно площадей пиков ДНФ-производных стандартных образцов. Точность разработанной методики укладывается в диапазон значений 100±10%, при этом относительно стандартное отклонение не превышает 5%, что означает, что методика по показателю правильность корректна.

Сходимость изучали по величинам площадей пиков и временам удерживания, выполняя семь определений для образцов исследуемого офтальмологического препарата с содержанием анализируемого вещества, близким к номинальной концентрации. Разработанная методика обладает достаточной сходимостью, при этом относительная ошибка среднего результата не более 1%. Установлено, что методика корректна по показатель прецизионность (сходимость).

Специфичность разработанной методики подтверждали совпадением пиков по временам удерживания определяемых веществ на хроматограмме модельной смеси препарата с соответствующими пиками на хроматограммах СО определяемых веществ с точностью до 0,1%. Установлено, что разработанная методика является корректной по показателю специфичность.

Линейность разработанной методики исследовали в диапазоне концентраций от 70% до 120% по отношению к номинальному значению. Установлено, что требования к параметрам линейной зависимости выполняются по принятым критериям преемственности (г>|0,99236|), то есть методика является корректной по данному показателю.

Комплекс проведенных исследований позволил разработать методы контроля качества и показатели норм качества препарата, включенные в проект ФСП «Таурикам, глазные капли» (таблица 9).

Для определения стабильности и срока годности препарата, наработанные серии глазных капель хранили в различных температурных режимах. По результатам определения соответствия препарата разработанным нормам качества, был определен срок годности 24 месяца при соблюдении температурного режима хранения 4°С.

Полученные результаты подтверждают возможность использования разработанной технологии производства и формы выпуска препарата «Таурикам».

Таблица 9. Показатели норм качества препарата «Таурикам»

Показатели Методы Нормы

Описание Визуальный Прозрачная бесцветная жидкость

Подлинность

Глутатион, карнозин и таурин Метод ВЭЖХ (методика раздела «Количественное определение») На хроматограммах, полученных при количественном определении времена удерживания пиков ДНФ-производных глутатиона, карнозина и таурина должны совпадать с временами удерживания пиков ДНФ-производных глутатиона, карнозина и таурина, соответственно, на хроматограмме растворов сравнения глутатиона, карнозина и таурина

Продолжение таблицы 9

Глугатион, карнозин и таурин Метод ТСХ На хроматограмме испытуемого раствора препарата, полученной при определении 2-аминоэтанола, после проявления пластинки раствором нингидрина, основные пятна должны находиться на уровне основных пятен на хроматограммах раствора сравнения глутатиона, раствора сравнения таурина, раствора сравнения карнозина

Бензалкония хлорид Качественная реакция Качественная реакция с раствором аммония рейнеката

гэц Вискозиметрия Вязкость препарата должна соответствовать требованию раздела «Вязкость»

Прозрачность ОФС 42-0051-51 (ГФ XII, ч. 1, с. 98) Препарат должен быть прозрачным

Цветность ОФС 42-0050-07 (ГФ XII, ч. 1, с. 93) Препарат должен быть бесцветным

рн ОФС 42-0048-07 (ГФ РФ XII, 4.1, с. 89) От 7,0 до 8,0

Осмолярность ОФС 42-0048-07 (ГФ РФ XII, ч. 1, с. 78) От 239 до 376 мОсм/л

Механические включения РДИ 42-504-00 Препарат должен соответствовать требованиям РДИ 42-504-00 «Инструкция по контролю на механические включения глазных капель»

Вязкость ОФС 42-0038-07 (ГФ XII, ч. 1,с.41) От 10 до12 сСт

Номинальный объем ГФ XI, вып. 2, с. 140 Объем наполнения одного флакона должен быть от 4,6 до 5,4 мл. Средний объем содержания 10 флаконов должен быть от 4,9 мл до 5,1 мл

Посторонние примеси Метод ТСХ Не более 0,1% 2-аминоэтанола

Стерильность ОФС 42-0066-07 (ГФ XII, ч. 1, с. 150) Препарат должен быть стерильным

Количественное содержание

Глутатион Метод ВЭЖХ От 0,00225 г до 0,00275 г в 1 мл препарата

Карнозин Метод ВЭЖХ От 0,018 г до 0,022 г в 1 мл препарата

Таурин Метод ВЭЖХ От 0,018 г до 0,022 г в 1 мл препарата

Бензалкония хлорид Метод 2-х фазового титрования От 0,000085 г до 0,000115 г в 1 мл препарата

Упаковка Флакон темного стекла с крышкой капельницей в стерильной вакуумной упаковке в картонной пачке.

Маркировка На этикетке флакона указывают предприятие-изготовитель, его товарный знак, адрес и телефон, торговое и международное непатентованное название препарата на русском языке, лекарственную форму препарата, концентрацию в процентах, количество препарата в миллилитрах, условия хранения, номер серии, срок годности, «Применять по назначению врача».

Срок годности 24 месяца

Глава 5. Исследование токсичности и специфической активности глазных капель

«Таурикам»

В рамках определения токсичности и специфической активности препарата, установлено, что глазные капли «Таурикам» относятся к малотоксичным препаратам, не проявляющим негативного влияния на жизненноважные функции организма.

Фармакологическую активность глазных капель «Таурикам» изучали на молодняке крыс с применением модели селенитовой катаракты. В качестве препаратов сравнения использовали глазные капли «Тауфон» (4%-ный раствор таурина) и глазные капли «Карнофон ЛОНГ» (раствор 2% карнозина и 2% таурина). Препараты вводили субконъюнктивально 3 раза в день по 1 капле в каждый глаз, начиная со дня подкожной инъекции селенита натрия.

Рис. 8. Степень поражения хрусталика в экспериментальных группах 1 - контрольная группа животных, не получавших лечение; 2 - группа, получавшая препарат

сравнения «Тауфон»; 3 - группа, получавшая препарат сравнения «Карнофон-ЛОНГ»;

4, 5, 6 - животные из группы, получавшей препарат «Таурикам».

Исходя из данных, представленных на рисунке 8, применение глазных капель «Таурикам» позволяет получить наиболее выраженный терапевтический эффект, при этом степень помутнения хрусталика ниже, чем при применении препаратов сравнения «Тауфон» и «Карнофон ЛОНГ» на 41,6% и 22,5% соответственно.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведены исследования по выбору и обоснованию действующих компонентов разрабатываемого препарата, в рамках которых изучена антиоксидантная активность глутатиона восстановленного, карнозина и таурина. Установлено, что сопоставимой с кислотой аскорбиновой АОА обладает только глутатион восстановленный, показатель 1С50 которого составляет 0,09В ± 0,002. Карнозин показал очень низкую АОА, 1С50 равен 30,128 ± 0,005. Также, по результатам проведенного эксперимента, был сделан вывод об отсутствии проявляемой таурином АОА в условиях in vitro.

2. Проведен выбор и обоснование вспомогательных компонентов разрабатываемого пролонгированного препарата, в связи с чем, были исследованы и оптимизированы технологические показатели образцов полимеров-загустителей и физико-химические характеристики их растворов. Определено, что оптимизация технологических

характеристик ГЭЦ достигается с применением микродиспергирования в дисковой мельнице, для ГПМЦ оптимальным является микродиспергирование в шаровой мельнице.

3. Исследовано влияние полимеров-загустителей, их концентрации и режима механообработки на скорость высвобождения глутатиона восстановленного из модельных смесей глазных капель. Установлено, что наиболее равномерное высвобождение глутатиона происходит из раствора механообработанной ГЭЦ с концентрацией 0,2%, при этом наблюдается поддержание высвободившегося количества вещества более продолжительное время, по сравнению с другими модельными смесями и отсутствие резкого колебания концентраций.

4. Разработан технологический процесс производства препарата, учитывающий особенности входящих в состав легкоокисляемых компонентов, что позволило составить и апробировать проект технологического регламента производства глазных капель «Таурикам». Предложена технологическая и аппаратурная схемы процесса производства препарата.

5. Разработаны методики идентификации глутатиона восстановленного, карнозина и таурина с помощью цветных реакций, хроматографии в тонком слое целлюлозы при использовании в качестве элюента смеси спирт:вода (1:1, об.), обращено-фазовой ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ДНФБ со спектрофотометрическим детектированием при длине волны 375 нм.

6. Разработана методика количественного определения глутатиона восстановленного спектрофотометрическим методом с предварительной стадией дериватизации реактивом Эльмана и методика количественного определения глутатиона восстановленного, карнозина и таурина в модельных смесях препарата методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ДНФБ. Исследованы показатели пригодности хроматографической системы, позволившие установить оптимальные условия хроматографического разделения и анализа исследуемых веществ: применение аналитической колонки Supelco Ascentis Express С18 100x4,6 мм, 2,7 мкм, в режиме термостатирования при 30°С, мобильной фазы А - 0,3% раствор триэтиламина в ацетонитриле (доведенный до рН 2,5 уксусной кислотой) и фазы В - 0,3% водный раствор триэтиламина (доведенный до рН 2,5 уксусной кислотой), градиентное элюирование. По результатам проведенной валидации, разработанная методика является корректной по показателям: прецизионность (сходимость), правильность (точность), специфичность, линейность и диапазон применения.

7. Разработаны показатели норм качества препарата, определен срок годности (24 месяца), разработан и апробирован проект фармакопейной статьи предприятия на глазные капли «Таурикам», включающий следующие показатели качества: описание, подлинность, прозрачность, цветность, рН, осмолярность, механические включения, номинальный объем, посторонние примеси, стерильность, количественное определение, упаковка, маркировка.

8. Изучение токсикологических характеристик и фармакологической активности глазных капель «Таурикам» показало его хорошую переносимость, безвредность, терапевтическую активность и, как следствие, возможность его применения в качестве метаболического, регенерирующего, антикатарактального средства. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение глазных капель «Таурикам» позволяет получить наиболее выраженный терапевтический эффект, при этом степень помутнения хрусталика ниже, чем при применении препаратов сравнения «Тауфон» и «Карнофон-ЛОНГ» на 41,6% и 22,5% соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Халикова, М.А. Перспективы применения глутатиона в офтальмологии / М.А. Халикова, Е.Т. Жилякова, О.О. Новиков // Современные наукоемкие лечебные и фармацевтические технологии для офтальмологии : сб. материалов Всерос. школы-семинара для молодых ученых (Белгород, 28 сент. - 1 окт. 2009 г.) - Белгород : ПОЛИТЕРРА, 2009. - С.150-155.

2. Целесообразность применения природных антиоксидантов для профилактики и лечения катаракты / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, Е.Т. Жилякова, О.О. Новиков // Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения : материалы междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 10-летаю образования Ботанич. сада БелГУ - Белгород, 2009. - С. 472-473.

3. Изучение физико-химических свойств пролонгаторов для глазных лекарственных форм / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, М.Ю. Новикова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 3. - С. 132-135.

4. Разработка состава и технологии антикатарактальных глазных капель с антиоксидантами / М.А. Халикова, Д.А. Фадеева, О.О. Новиков, Е.Т. Жилякова // Ползуновский альманах. - 2009 - Т. 2, № 3. - С. 81-83.

5. Халикова, М.А. Формирование макроконтура российского рынка антикатарактальных препаратов / М.А. Халикова, Е.Т. Жилякова, О.О. Новиков // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009. - С. 344-346.

6. Исследование технологических характеристик микродиспергированного декстрана / М.А. Халикова, М.Г. Ковалева, Е.Т. Жилякова, О.О. Новиков // Инновации в медицине : материалы Второй междунар. дистанц. науч. конф. КГМУ, Центр.-Чернозем, науч. центр РАМН, Общерос. общест. организация «Рос. Союз молодых ученых» - Курск, 2009.-С. 194-198.

7. Фадеева, Д.А. Определение антиоксидантной активности веществ аминокислотной природы / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики : сб. науч. тр. / Сев.-Осет. гос. ун-т им. К.Л. Хетгаурова. -Владикавказ: Изд-во СОГУ, 2010. - С. 301-303.

8. Разработка методики идентификации карнозина с использованием метода тонкослойной хроматографии / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, О.О. Новиков, Е.Т Жилякова // Фитодизайн в современных условиях : материалы междунар. науч.-практ. конф. (Белгород, 14-17 июня 2010 г.) / под ред. В.К. Тохтарь,

B.Н. Сорокопудова. - Белгород: Изд-во БелГУ, 2010. - С. 428^431.

9. Токсикологические исследования новых антикатарактальных капель / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, М.В. Покровский [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - №10 (81), вып. 10. - С. 93-96.

10. Применение метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения смеси и идентификации таурйна, карнозина и глутатиона / М.А. Халикова, Д.А. Фадеева, A.A. Зинченко [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - №22 (93), вып. 12. -

C. 157-160.

11. Глазные капли: пат. 2404768 Рос. Федерация: МПК7 А61К31/4172, А61К38/07, А61К47/40, А61Р27/02 / Новиков О.О., Жилякова Е.Т, Фадеева Д.А., Халикова М.А., Покровский М.В., Писарев Д.И.; заявители и патентообладатели Федеральное агентство по науке и инновациям, Общество с ограниченной ответственностью "Асклепий". - № 2009113845/28, заявл. 28.10.2009; опубл. 27.11.2010. - Бюл. №33.

12. Определение антиоксидантной активности некоторых веществ аминокислотной, пептидной и полифенольной природы in vitro / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, Т.С. Полухина [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. -2010. - № 4 (99), вып. 13/2. - С. 178-182.

13. Изучение технологических показателей полимера, используемого в качестве пролонгатора офтальмологических форм / М.А. Халикова, Е.Т. Жилякова, М.Г. Ковалева [и др.] // Фитодизайн в современных условиях : материалы междунар. науч.-практ. конф. (Белгород, 14-17 июня 2010 г.) / под ред. В.К. Тохтарь, В.Н. Сорокопудова. - Белгород : Изд-во БелГУ, 2010. - 436 с.

14. Development and validation of HPLC method for determination of taurine, carnosine, glutathione in eye drops / M. A. Khalikova, D. Satinsky, P. Solich [et al.] // Nordic Separation Science Society : program and abstract book (Latvia, Riga, 24-27 august 2011) / Latvian Institute of Organic Syntesis. - Riga: LIOS, 2011. - P. 68.

15. Разработка методики идентификации таурина, карнозина и глутатиона методом тонкослойной хроматографии / М.А. Халикова, Д.А. Фадеева, Е.Т. Жилякова, О.О. Новиков // Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм : материалы Всерос. науч.-практич. конф. с междунар. участием (Курск, 27 апр. 2011 г.) / КГМУ. - Курск, 2011. - С. 393-397.

16. Фадеева Д.А. Применение титриметрических методов анализа для количественного определения карнозина / Д.А. Фадеева, В.И. Кочкаров, М.А. Халикова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. -№2 (125).-С. 170-174.

Подписано в печать 26.12.2011. Times New Roman. Формат 60^84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 389. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован ИПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85