Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методик анализа и стандартизация Пефарминатм, проявляющего гипотензивное действие

На правах рукописи

НЕПОГОДИНА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПЕФАРМИНА®, ПРОЯВЛЯЮЩЕГО ГИПОТЕНЗИВНОЕ

ДЕЙСТВИЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

- 1 ДЕК 2011

Пермь-2011

005004638

Работа выполнена к Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Пермь)

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Чекрышкина Людмила Александровна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «20» декабря 2011 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России по адресу: 614990 г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д. 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «<?» ноября 2011 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru «//» ноября 2011 г.

Автореферат разослан ноября 2011 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01,

Ярыгина Татьяна Ивановна

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

кандидат фармацевтических наук

Ванькова Нина Алексеевна

филиал ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ «Пермское

НПО «Биомед»

кандидат фармацевтических наук, доцент

И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Согласно Постановлению Правительства Российской Федерации № 91 от 17 февраля 2011 г. О Федеральной целевой программе «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», одной из основных задач фармацевтической и медицинской науки до 2020 г. является вывод на рынок инновационной продукции, выпускаемой отечественной фармацевтической и медицинской промышленностью.

Заболевания сердечно-сосудистой системы и, в первую очередь, гипертоническая болезнь представляют собой серьезную медико-биологическую проблему, которая является одной из основных причин первичного выхода на инвалидность и смертности. По сравнению с 60-ми годами в настоящее время количество случаев выявления артериальной гипертензии среди взрослого населения России возросло с 5-6 % до 40-45 %, что говорит о необходимости расширения ассортимента группы гипотензивных средств, используемых при различных патологиях сердечно-сосудистой системы. Применяемые в отечественной медицинской практике гипотензивные препараты - эналаприл, лизиноприл, бетаксолол, нифедипин и т.д., являющиеся в большинстве импортными брендами либо российскими дженериками, проявляют различные побочные эффекты. Исходя из этого, поиск новых эффективных и безопасных лекарственных средств для лечения гипертонической болезни является актуальной проблемой.

С этой точки зрения, интерес представляет синтезированное на кафедре органической химии Пермской государственной фармацевтической академии (проф. Панцуркин В.И., асп. Семеновых Е.В, 2001 г.) новое биологически-активное вещество (БАВ) — Ы-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорид, с условным названием Пефармин1Ч. Исследование его биологической активности (проф. Сыропятов Б.Я.) показало, что степень снижения артериального давления в опытах на кошках в дозе 5 мг/кг составила 40,7 % при продолжительности действия 660 мин., в сравнении с тем же эффектом у папаверина, пропранолола и бендазола (3, 60 и 150 мин. соответственно). Соединение умеренно токсично, обладает также выраженным противомикробным действием (проф. Одегова Т.Ф.).

Результаты проведенных предварительных исследований дают основание для его углубленного фармакологического и химико-фармацевтического изучения с целью создания лекарственной формы и рекомендации его к медицинскому применению.

Цель и задачи. На основе комплекса физических, физико-химических и химических методов разработать методики оценки качества субстанции, которые могут быть использованы для ее стандартизации, оценки стабильности и последующем использовании на различных стадиях контроля.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- проанализировать и обобщить данные литературы, касающиеся фармакологического действия гипотензивных средств и способов оценки качества лекарственных средств из группы солей органических азотсодержащих оснований;

- изучить физические, физико-химические и химические свойства исследуемого БАВ, на основе чего разработать способы установления подлинности;

- изумить кислотно-основные характеристики КАП и разработать методику его количественного определения;

- исследовать хроматографические параметры вещества, предложить на основе тонкослойной (ТСХ), высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) и газожидкостной (ГЖХ) хроматографии методики определения его подлинности и испытания на содержание возможных примесей;

- обосновать нормы качества, на основе которых разработать проект фармакопейной статьи (ФСП), исследовать стабильность БАВ, установить сроки годности;

- осуществить прогноз затрат на производство лекарственных форм (ЛФ) (инъекционной и таблетированной) исследуемого БАВ.

Научная новизна. Проведено химико-фармацевтическое исследование нового БАВ как необходимого этапа доклинического изучения его в качестве потенциального ЛС. С этой целью установлены физические константы, УФ и ИК спектрофотометрические параметры исследуемого вещества; разработаны методики анализа и нормы качества; методами ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ разработаны способы обнаружения возможных примесей в субстанции, установлены стабильность и срок годности исследуемого вещества.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований установлены нормы качества исследуемого соединения, разработан проект ФСП. Способы оценки качества, введенные в ФСП, с положительной оценкой апробированы на предприятии ЗАО «Медисорб» (г. Пермь). В соответствии с этим Пефармин™ внесен в бизнес-план развития производства на период до 2020 года

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе ГБОУ ВПО ПГФА на ФДПО (сертификационный цикл СЦз «Фармацевтическая химия и фармакогнозия»).

Работа поддержана гршггом по проекту "Инновационное внедрение - школа успеха молодёжи" некоммерческой организации Союз Инновационно-Технологических центров России.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России. Номер государственной регистрации 01.9.50.007417.

Апробация работы. Результаты и основные положения диссертационной работы обсувдались на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств», Пермь, 2007; областной конференции «Фармация и общественное здоровье», Екатеринбург, 2008; Российской научно-практической конференции ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» «Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения», Пермь, 2008; IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л. Чижевского», Москва, 2008; Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» Пермь, 2009; X Московской международной конференции инноваций и инвестиций

«Инновационные материалы и технологии I! химической и фармацевтической отраслях промышленности», 9-10 сентября 2010 г., Москва.

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 13 статей, в том числе в изданиях Перечня ВАК - 4, и 2 тезисов докладов.

Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автором выполнены исследования по установлению физических, физико-химических и химических свойств Пефармина1';1 па основе которых выполнены реакции подлинности, разработаны методики количественного определения и оценки чистоты, изучена стабильность и установлены сроки годности субстанции, систематизированы полученные результаты, составлен проект ФСП.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературы, главы, характеризующей объекты и методы исследования, 5 глав, содержащих результаты экспериментальных исследований, выводов, списка литературы, включающего 233 наименования, приложения. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, включает 37 таблиц, 1 схему, 18 рисунков и 30 страниц приложения.

Положения, выдвигаемые на защиту.

- Результаты использования комплекса физических, физико-химических и химических методов для подтверждения подлинности Пефармина ™

- Способы контроля качества исследуемого БАВ (испытание на подлинность, методики ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ исследований доброкачественности, методики количественной оценки).

- Результаты исследования стабильности и установления срока годности субстанции.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава представляет собой анализ литературных данных, касающихся характеристики современных гипотензивных средств, и свидетельствует о том, что на Российском фармацевтическом рынке недостаточно эффективных и безопасных лекарственных средств этой фармакологической группы. Поэтому создание нового отечественного безопасного лекарственного средства этого типа является актуальным.

Обзор способов контроля качества лекарственных средств из группы органических оснований и их солей свидетельствует о том, что в практике фармацевтического и, в частности, фармакопейного анализа накоплен достаточно большой арсенал методов: физических, химических и физико-химических, позволяющих надежно и объективно оценивать их качество.

Во второй главе приведены материалы и методы, используемые при проведении экспериментальных исследований, представлена схема получения по авторской методике (проф. Панцуркин В.И., асп. Семеновых Е.В.) М-2-(2'-метилфенокеи)-этилморфолина гидрохлорида.

Третья глава посвящена изучению физических свойств лабораторных образцов Пефармина ! нормированию показателей в соответствии с ОФС 42-0074-07 определяющих доброкачественность соединения, исследованию УФ, ИК, ЯМР 'Н, хроматомасс- спектров, термических характеристик субстанции с помощью

дериватографических исследований, разработке ряда цветных реакций, основанных на свойствах функциональных групп структуры соединения.

С,3Н19Ж)2 • НС1 М.м. 257,12

Ы-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорид (Пефармин ™), полученный в лабораторных условиях, представляет собой белый или белый с бежевым оттенком мелкокристаллический порошок без запаха.

Результаты исследования физико-химических свойств Пефармина™, проведенные на 11 полученных автором сериях БАВ, представлены в табл. 1. Водные растворы БАВ прозрачные и бесцветные или их окраска не превышает таковую эталона ВУ6. Потеря в массе при высушивании находится в пределах 0,5 %, а исследование гигроскопичности показало, что испытуемое вещество влагу не поглощает. Субстанция Пефармина™ по содержанию сульфатной золы и тяжелых металлов удовлетворяет требованиям ГФ XII.

Таблица 1

Результаты исследования физико-химических свойств Пефармина14

Показатель Результат

Растворимость в: воде очищенной метаноле, хлороформе спирте 96 %, ДМФА ацетоне этилацетате гексане 1 г растворяется в 1 мл (OJ1P) 100 мг растворяется в 1 мл (JIP) 100 мг растворяется в 3 мл (Р) 10 мг растворяется в 10 мл (МР) 10 мг растворяется в 100 мл (ОМР) 10 мг не растворяется в 100 мл (ПНР)

Температура плавления (п = 11) от 196 °С до 201 °С (с разложением)

рН 1 % водных растворов (п = 11) от 4,25 до 6,11

В целях всестороннего изучения свойств М-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида были получены и проанализированы его УФ , ИК, ЯМР *Н и хроматомасс-спектры, исследована возможность использования полученных данных для разработки методик оценки качества.

УФ спектры поглощения растворов Пефармина™ снимали в области 210-300 нм в воде очищенной, спирте 96 %, хлористоводородной кислоте 0,01 М и хлороформе в концентрации растворов анализируемого вещества 0,01 % (рис. 1). Во всех растворителях спектр вещества характеризуется широкой полосой поглощения малой интенсивности при 268 ± 1 нм, что связано с п —> я переходами и является предпочтительной для выбора аналитической длины волны, и интенсивной полосой поглощения при 215 нм (кроме раствора в хлороформе), что относится ки-и переходам. Оба максимума являются идентификационными для ароматических углеводородов.

Удельный показатель Пефармина™ в воде очищенной при Х.=268 нм находится в интервале от 49 до 54. Данная фотометрическая характеристика может быть

использовапа для установления подлинности и при последующей разработке методики спектрофотометрического определения Пефармина™.

Совокупность всех полос поглощения, образующих ИК спектр Пефармина'™, определяет его индивидуальность, что может использоваться для достоверной идентификации субстанции (рис. 2).

Спектр ЯМР 'Н подтверждает структуру исследуемого соединения и может быть использован для отличия от спектров близких по химической структуре веществ.

Рис. 1. УФ спектр Пефармина™ в различных растворителях (С = 0,01 %)

3500 УХО 2500 2000 1500 <000 500

Рис. 2. ИК спектр М-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида

В хроматомасс-спсктре присутствует пик молекулярного иона, соответствующий 221.1 а.е.м., равный массе основания. Интенсивный пик m/z = 100,1 обусловлен фрагментом метиленморфолинового остатка. Серия малоинтенсивных пиков свидетельствуют о распаде молекулы с образованием фрагментов СНзСбН.тО (m/z = 107), СПзС6П5-0-СИ2 (m/z - 121), о^Л-снгсн2 (m/z = 141,1). Как следует из данных масс-спектра, молекула БАВ распадается, в основном, по связи -СП2-СН2-. В соответствии с этим, можно предположить, что подобные фрагменты могут образовываться при нарушении условий хранения вещества и препаратов на его основе.

Дифференциально-термический анализ в сочетании с термогравиметрией вещества показывает наличие узкого пика при 194,2 °С, который обусловлен эндотермическим эффектом плавления, и слабым широким сигналом при 275 °С. Очевидно, он связан с эндотермическим процессом деструкции вещества, причем образующиеся фрагменты подвергаются окислению кислородом воздуха, о чем свидетельствует повышение температуры образца. После плавления наблюдается потеря его массы, которая при температуре ~ 300 °С составляет около 5 %от первоначальной.

Для идентификации 1^-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида использовали реакции подлинности, обусловленные свойствами функциональных групп в структуре соединения: третичного атома азота морфолинового цикла, кислорода простой эфирной группы и фенильного радикала (табл. 2). Определена чувствительность каждой реакции. Поскольку с кислотой пикриновой БАВ дает кристаллический осадок, ее выполняли также в микрокристаллоскопическом варианте: в поле зрения микроскопа наблюдали пучки желтых игольчатых кристаллов. С точки зрения доступности реактивов и специфичности реакции в ФСП рекомендуем включить реакцию с серной кислотой концентрированной.

Таблица 2

Пределы обнаружения и эффекты реакций Пефармина™

№ п/п Реагент Эффект реакции Предел обнаружения, мг

1 Бушарда-Вагнера Аморфный коричневый осадок 0,025

2 Драгендорфа Аморфный оранжевый осадок 0,05

3 Зоненштейна Аморфный белый осадок 0,01

4 Пикриновой к-ты р-р Желтый кристаллический осадок 0,0125

5 Марки Красное окрашивание 0,036

6 Серная к-та конц. Розовое окрашивание, переходящее в красное 0,036

7 Азотная к-та конц. Зелено-синее окрашивание 0,5

8 Серебра нитрат р-р Белый творожистый осадок 5

В четвертой главе изложены результаты изучения кислотно-основных свойств Пефармина™, разработки и валидации методик количественного определения исследуемого БАВ методом ацидиметрического титрования в среде протогенных растворителей (уксусного ангидрида, ртути окисной ацетата) и экстракционного титрования.

Одним из важных физико-химических параметров, характеризующих кислотно-основные свойства соединения, является константа ионизации. Константа

диссоциации определена для исследуемого вещества как основания (концентрация 0,001 М) потепциометрическим методом. Рассчитанные по результатам титрования значения рКа в водном и спиртовом растворах составили 5,12 и 6,08 соответственно, что позволяет сделать вывод о слабых основных свойствах исследуемого вещества.

Ацидиметрическое титрование в среде уксусного ангидрида. Комбинации нротогснных растворителей подбирали исходя из рКа Пефармина ™ и рекомендуемых условий для титрования известных лекарственных веществ. Нами проведено титрование потенциометрическим методом в следующих условиях: муравьиная кислота - уксусный ангидрид (1:10, 2:10), уксусная кислота ледяная - ртути окисной ацетата раствор (10:5, 15:5, 10:3, 15:3), уксусная кислота ледяная - уксусный ангидрид (10:10). Навеску БАВ титровали 0,1 М раствора кислоты хлорной в кислоте уксусной ледяной до появления скачков ЭДС. Во всех смесях видны четкие скачки потенциала. График зависимости АЕ/АУ от объема титранта (рис. 3) показывает, что смесь 1 мл муравьиной кислоты и 10 мл уксусного ангидрида дает более выраженный скачок потенциала в точке эквивалентности. Таким образом, данную смесь использовали в дальнейшем для разработки методики количественного определения, используя в качестве индикатора кристаллический фиолетовый.

объем титранта, мл

-1 мл НСОН : 10 мл(СН3С0>20

-2 мл НСОН: 10 мл (СН3СО)20

-ЮылСНзСООН: 10 мл (СН3С0)20

Рис. 3. Кривые титрования исследуемого БАВ 0,1 М хлорной кислоты раствором

По разрабатываемой методике осуществляли количественный анализ исследуемого БАВ. Для фактической оценки пригодности предлагаемой аналитической методики проведена валидация по показателям: линейность результатов, воспроизводимость, точность и прецизионность в аналитической области методики.

- Для установления линейной зависимости осуществляли статистическую обработку выборки, полученной в результате количественного анализа навесок на семи уровнях концентрации (в диапазоне 70 - 130 % от количества исследуемого вещества, принятого за 100 % - 0,15 г). Уравнение линейной регрессии имеет вид: у = 39.04 х + 0.017, а установленное значение коэффициента линейной корреляции (г = 0,9999) подтверждает строгую линейность рассматриваемой зависимости. Результаты свидетельствуют, что свободный член статистически незначим: 1а= 0,017 / 0,009 = 1,83, что меньше (та6 (95 %, 5) = 2,57 и свидетельствует об отсутствии систематической ошибки,

поэтому можно говорить о правильности методики. Следовательно, уравнение линейной регрессии имеет вид: у = 39.04 х.

- Оценка сходимости результатов осуществлялась путем статистической обработки выборок, полученных в ходе количественного анализа исследуемого вещества в модельных пробах на трех уровнях концентрации в пределах рекомендуемой аналитической области методики (80, 100, 120 % от количества вещества, принятого за 100 % - 0,15 г) (табл. 3). Полученные значения относительного стандартного отклонения отражают удовлетворительную сходимость результатов в аналитической области.

Таблица 3

Метрологические характеристики сходимости результатов (п = 7)

Уровень содержания БАВ, % •V 5 Sx м £,%

80 99,86 0,089 0,034 0,083 0,08

100 99,79 0,068 0,026 0,063 0,06

120 99,72 0,092 0,035 0,086 0,08

- Оценка воспроизводимости осуществлялась путем статистической обработки результатов на трех образцах субстанции по предлагаемой методике (табл. 4). Полученные значения относительной ошибки свидетельствуют о высокой воспроизводимости результатов. Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получать воспроизводимые результаты.

Таблица 4

Метрологические характеристики воспроизводимости результатов (п = 7)

Серия X 5 5 Дх ё, %

150308 99,62 0,069 0,026 0,064 0,06

190408 99,74 0,070 0,027 0,065 0,06

031008 99,79 0,068 0,026 0,063 0,06

Испытания внутри- и межлабораторной воспроизводимости валидируемой методики, проведенные в лабораториях кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО и РИЦ «Фарматест» ПГФА, указывают на соответствие полученных результатов параллельных экспериментов.

В ФСП на I [ефармип14 методика включена в раздел «Количественное определение».

Нами также разработана методика ацидиметрического титрования БАВ в среде ртути окисной ацетата раствора.

Валидацию проводили теми же методами, что и в случае титрования в среде уксусного ангидрида по показателям: линейность результатов, воспроизводимость и точность в аналитической области методики. И так же осуществляли количественный анализ исследуемого БАВ.

- Линейность. Уравнение линейной регрессии имеет вид: у = 38,59 х + 0,0076, а установленное значение коэффициента линейной корреляции (г = 0,9999) подтверждает строгую линейность рассматриваемой зависимости. Результаты свидетельствуют, что свободный член статистически незначим: 1а= 0,0076 / 0,0053

= 1,45, что меньше (95%,5) = 2,57. Следовательно, уравнение линейной регрессии имеет вид: у = 38,59 х. - Сходимость результатов (табл. 5). Полученные данные отражают удовлетворительную сходимость результатов в аналитическом области.

Таблица 5

Метрологические характеристики сходимости результатов (п - 7)

Уровень содержания БАВ, % ■V 5 5х Дх £,%

80 99,64 0,109 0,041 0,101 0,10

100 99,56 0,135 0,051 0,125 0,13

120 99,61 0,167 0,063 0,155 0,16

- Воспроизводимость (табл. 6). Полученные значения относительной ошибки отражают высокую воспроизводимость результатов. Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получать воспроизводимые результаты.

Таблица 6

Метрологические характеристики воспроизводимости результатов (п = 7)

Серия X 5 5* Ах с, %

150308 99,56 0,138 0,052 0,133 0,13

190408 99,49 0,096 0,036 0,089 0,09

031008 99,70 0,130 0,049 0,121 0,12

Экстракционное титрование. Одним из вариантов титриметрического метода является экстракционное титрование с применением в качестве стандартного раствора натрия додецилсульфата (натрия лаурилсульфата). Способ позволяет проводить количественное определение органических азотсодержащих оснований или их солей в присутствии продуктов разложения, вспомогательных веществ лекарственных форм. Важнейшими условиями, определяющими количественную экстракцию образующегося в результате взаимодействия вещества с натрия лаурилсульфатом (ЛСН) ионного ассоциата, являются рН водной фазы, соотношение водной и органической фаз, выбор индикатора. При изучении влияния этих факторов опыты ставили таким образом, чтобы изменялся только один из них при постоянном значении всех остальных. Найденное в опыте процентное содержание вещества служило критерием оценки экстракции.

Для установления оптимальной кислотности водной фазы готовили хлористоводородную кислоту семи концентраций: 0,01 М, 0,02 М, 0,025 М, 0,05 М, 0,1 М, 0,25 М, 0,5 М. На основании проведённых исследований сделан вывод о том, что взаимодействие вещества с ЛСН и количественная экстракция образующихся при этом продуктов идёт при рН 1,87-2,30, что соответствует 0,025 М раствору хлористоводородной кислоты, которую использовали в дальнейшем для создания кислотности среды.

Установление оптимального соотношения водной и органической (хлороформ) фаз титрования проводили используя соотношения: 2:1, 1:1, 1:1,5, 1:2. Оптимальными из них, как установил эксперимент, являются 1:1,5 и 1:2. С целью экономии

экстрагента возможно применение методики титрования при соотношении фаз 1:1,5, как и поступали в дальнейших исследованиях.

С целью выбора индикатора были приготовлены растворы из 0,1 % спиртовых растворов диметилового желтого и метиленового синего в объемных соотношениях 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 и 5:1, соответственно, а также использован основной индикатор раствор диметилового желтого. Состав исследуемых индикаторов практически не влияет результаты количественного определения вещества и при определенном навыке возможно титрование с любым из перечисленных составов индикатора. Однако использование при титровании смешанного индикатора 3:1 позволяет наиболее четко фиксировать точку эквивалентности, оба цвета являются дополняющими друг друга.

Валидацию проводили теми же методами, что и в случае ацидиметрического титрования по показателям: линейность, воспроизводимость и точность результатов.

- Линейность. Уравнение линейной регрессии имеет вид: у = 261,18 х + 0,0181, а установленное значение коэффициента линейной корреляции (г = 0,9999) подтверждает строгую линейность рассматриваемой зависимости. Результаты свидетельствуют, что свободный член статистически незначим: 1а= 0,4463 / 0,0407 = 0,45, что меньше 1та6 (95 %, 5) = 2,57. Следовательно, уравнение линейной регрессии имеет вид: у = 261,18 х.

- Изучение сходимости показало (табл. 7), что полученные значения относительного стандартного отклонения отражают удовлетворительную сходимость результатов в аналитической области.

Таблица 7

Метрологические характеристики сходимости результатов (п = 7)

Уровень содержания БАВ, % X 5 5х № ё, %

80 99,82 0,243 0,089 0,218 0,22

100 99,73 0,188 0,071 0,174 0,17

120 99,73 0,222 0,084 0,206 0,21

- Полученные значения относительной ошибки отражают высокую воспроизводимость результатов. Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получать воспроизводимые результаты (табл. 8).

Таблица 8

Метрологические характеристики воспроизводимости результатов (п = 7)

Серия .г 5 5х Дх г, %

161207 99,65 0,161 0,061 0,149 0,15

150308 99,73 0,181 0,068 0,167 0,17

190408 99,65 0,204 0,077 0,189 0,19

Пятая глава посвящена исследованию Пефармина1^ хроматографическими методами. В ней представлены экспериментальные исследования по установлению оптимальных условий определения посторонних примесей в субстанции исследуемого БАВ методами ТСХ и ВЭЖХ, разработке методики определения содержания остаточного органического растворителя (толуола) на основе ГЖХ.

Хроматсм-рафия в тонком слое сорбента. Для проведения эксперимента нами использованы хроматографическис пластинки двух типов: Силуфол УФ-254 и Сорбфил 11TCX-11-А-УФ размером 5 х 12 см.

С цслыо поиска подвижной фазы, обеспечивающей эффективное разделение основного вещества и возможных иримессй, нами исследовано 28 систем растворителей, описанных в литературе при анализе азотсодержащих ортнических оснований и их солей. Хроматографирование проводили с помощью общепринятых для ТСХ операций, нанося на линию старта 0,01 мл (100 мкг) и 0,02 мл (200 мкг) 1 % спиртового раствора анализируемого вещества.

Обнаружение вещества и его возможной примеси, в качестве которой предположительно может быть полупродукт синтеза - безазотистое соединение, проводили следующими способами:

облучением пластинки в УФ свете (наблюдается фиолетовое свечение анализируемого вещества и белая флуоресценция примеси), что являегся наиболее приоритетным способом детектирования, т.к. не требуется затрат на реактивы;

обработкой парами йода (коричневые пятна примеси и анализируемого вещества);

- опрыскиванием модифицированным реактивом Драгендорфа (ярко-оранжевые пятна анализируемого вещества).

В 5 системах растворителей на хроматограммах наблюдали два четких пятна; основного вещества и примеси, но наиболее оптимальной подвижной фазой является система, содержащая следующие растворители: этилацетат:метанол:аммиака раствор 25 % (17:6:5). В этом случае Rf анализируемого вещества (0,73) и примеси (0,15) значительно отличаются друг от друга, пятна четко видны и хорошо проявляются цветореагентами.

В выбранных оптимальных условиях проанализировано 11 серий вещества. В качестве стандартного образца вещества свидетеля (СОВС) использовали основное вещество, ориентируясь на площадь пятна с содержанием 0,5 мкг. Проведенный анализ показал, что площадь пятна примеси во всех исследованных сериях не превышает площади пятна СОВС. Поэтому нормировано содержание примеси не более 0,5 %, что и введено в проект ФСП.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Исследование Пефарминаi проводили на жидкостном хроматографе «Shimadzu LC Prominence», оборудованном колонкой из нержавеющей стали размером 25 см х 4,6 мм и диодноматричным детектором. Экспериментально установлены следующие условия хроматографирования: сорбент обращеннофазный (Discovery® С 18) с размером зерен 5 мкм, подвижная фаза: ацетонитрил - фосфатный буферный раствор (рН 3) с добавлением 0,0005 М ионпарного реагента октилсульфоната натрия, скорость потока элюента - 1,5 мл/мин, температура колонки - 35 "С, спектрофотометрический детектор с аналитической длинной волны 210 им. В указанных условиях время удерживания основного компонента составило 3,70 мин, примеси - 9,07 мин (рис. 4). Нормировано содержание примеси - не более ■ 0,5 %, суммы всех неидентифицированных примесей не более 1,0 % (табл. 9).

1100 1000 «с 800 "00 600 500 400 500 200

100 I \

100

■200 ...................... . ___________________

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 ",aí

Рис. 4. ВЭЖХ хроматограмма раствора Пефармина™(С = 1 мг/мл, п = 3)

Таблица 9

Результаты определения примесей в лабораторных образцах Пефармина™ методом

ВЭЖХ

Серия Площади пиков примесей в испытуемом растворе Площадь пика БАВ в растворе сравнения

151007 ил (8,41 мин.)- 123673 ^ вещества 498767

150308 г уд. (5,72 мин.) - 110630 1 Уд. (8,64 мин.) - 98760 с =500115 ^ вещества ->\> у у 1

031009 Цд (8,32 мин.) - 118260 ^ вещества 520891

161109 1 уд. (8,40 мин.) - 87554 ^ вещества 511434

290110 Цд. (5,70 мин.)-62288 1 уд. (8,41 мин.)-118827 с = 5ГН0И вещества у а

Определение остаточного органического растворителя методом газожидкостной хроматографии. Для очистки Пефарминана последней стадии синтеза используется толуол, который, согласно ОФС 42-0057-07, относится ко 2 классу (негенотоксичный растворитель), его предельно допустимое содержание в лекарственном средстве составляет 890 ррш. Исследование проводили на хроматографе «Кристалл 2000 М», оснащенным капиллярной колонкой производства фирмы HP-FFAP (Free Fatty Acide Phase) 50 м x 0,32 мм; ввод пробы осуществляли с помощью дозатора равновесного пара (производство СКБ «Хроматек»), Время удерживания толуола в подобранных условиях (дозатор равновесного пара, нагретый до температуры 80 °С; температура испарителя 160 °С; детектора 200 °С; газ-носитель - азот; время испарения 16,0 мин) составило 5,9 мин. Полученные результаты (табл. 10) позволяют сделать заключение, что во всех исследуемых образцах Пефармина1М содержание толуола не превышало значения регламентированного ОФС - 890 ррш.

Таблица 10

Содержание остаточного растворителя (толуола) в лабораторных образцах

Пефармина14

Серия Содержание растворителя, ррт Серия Содержание растворителя, ррт

151007 8,9 080409 7,7

150308 7,4 290110 9,1

В главе шестой изложен эксперимент и приведены результаты изучения стабильности исследуемого вещества, установлению срока его годности методом «ускоренного старения» и хранения в естественных условиях.

С учетом разработанных методик и в соответствии с рекомендациями ГФ XII изучена стабильность субстанции Пефармина™ изотермическим методом «ускоренного старения». Эксперимент проводили в соответствии с требованиями действующей инструкции И 42-2-82 при температуре 60 °С. Термостатированию подвергали пять образцов субстанции БАВ, помещенных в банки из светозащитного стекла с навинчивающейся крышкой, снабженной прокладкой из пищевой резины (аналог предполагаемой заводской упаковки). Контроль качества испытуемых образцов проводили через промежутки времени, эквивалентные 6 мес. хранения при обычных условиях (11,5 сут.), по показателям: описание, подлинность (ИК спектроскопия, химические пробы), температура плавления, посторонние примеси (методом ТСХ), количественное содержание. При этом идентификацию, определение органических примесей и установление количественного содержания вещества в субстанции осуществляли по разработанным нами методикам (табл. 11).

Результаты эксперимента показали, что субстанция анализируемого вещества остается стабильной в течение 115 сут. Экспериментального хранения (соответствует 5,5 лет). Температура хранения, позволяющая обеспечить установленный срок годности, 19-29 °С. тм

Изучена стабильность образцов 3 опытных серий Пефармина при хранении в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре в банках оранжевого стекла по ОСТ 64-2-71-80 с навинчивающимися пластмассовыми крышками по ОСТ 64-2-87-81. Проведенные исследования позволили сделать вывод о стабильности нового БАВ в течение периода времени не менее 3 лет, что согласуется с данными экспериментального хранения при повышенных температурах.

Таблица 11

Нормы качества субстанции Пефармина1И, контролируемые при исследовании стабильности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях

Показатели Методы Нормы Методом «ускоренного старения» В естественных условиях

1 2 3 4 5

Описание Орган олепти-ческий белый или белый с бежевым оттенком мелкокристаллический порошок соответствует соответствует

Подлинность ИК спектроскопия ИК спектр субстанции, снятый в виде тонкой пленки вещества, в области от 4000 до 400 см"1 по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра соответствует соответствует

Продолжение таблицы 11

1 2 3 4 5

Химические пробы С П280,1 конц -розовое окрашивание при стоянии переходящее в красное соответствует соответствует

Температура плавления ГФ XII ОФС 42-0034-07 196-201 °С (плавится с разложением) 196 -201 "С 196 -198 "С

Посторонние примеси тех Не более 0,5 % Не превышало 0,5 % Не превышало 0,5 %

Количественное содержание Ацидиметри- ческое титрование Не менее 99,0 % 99,53 - 99, 86 99,65-99,75

В главе седьмой приведены расчеты себестоимости и цены таблеток и раствора для инъекций, содержащих Пефармин™ , выполненные исходя из стоимости сырья и затрат на производство.

В результате расчета показано, что стоимость производства 100 г Пефармина™при выходе 44,7 % составляет 1549,60.руб. При расчете себестоимости таблеток за основу взята средняя дозировка распространенных на фармацевтическом рынке гипотензивных лекарственных средств - 10 мг, средний вес одной таблетки 0,3 г, при этом себестоимость 1 упаковки составила 10,20 руб.

Себестоимость инъекционной формы рассчитывали, исходя из имеющихся в настоящее время на фармацевтическом рынке подобных лекарственных препаратов. За основу нами взят Энап Р в дозировке 1,25 мг/мл (ампулы по 5 мл, в коробке 5 штук). При этом себестоимость упаковки аналогичной лекарственной формы Пефармина™ составила 23,80 руб.

Результаты исследований показывают, что цена Пефармина1м конкурентоспособна в пределах цен других производителей. Так, упаковка его раствора для инъекций в дозе 1,25 мг/мл (ампулы по 5 мл в коробке № 5) ориентировочно будет стоить 84,90 руб. в сравнении с Энапом Р 280,00 руб., а таблетки 10 мг № 20 - 30,60 руб., по сравнению с эиалаприлом от 28,00 до 83,00 руб.

Более того, есть запас финансовой прочности в случае, если возрастут затраты на производство таблеток и растворов для инъекций, так как исследуемое БАВ для предприятия новое.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате химико-фармацевтических исследований субстанции ПефарминаТч1 М-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида нормированы показатели, характеризующие подлинность и доброкачественность нового соединения: внешний вид, растворимость, содержание летучих веществ и воды, сульфатной золы и тяжелых металлов, рН, прозрачность и цветность 1% водного раствора. Исходя из основных структурных элементов исследуемого вещества, предложены реакции подлинности с реактивами Бушарда-Вагнера, Драгендорфа, Зоненштейна и Марки, пикриновой кислотой, серной и азотной кислотами концентрированными и раствором серебра нитрата, из числа которых в ФСП рекомендованы реакции с серной кислотой концентрированной и раствором серебра нитрата.

2. Исследованы спектральные характеристики БАВ в УФ и ИК областях. В проект ФСП включены: удельный показатель поглощения (А^, при X = 268 ± 1 нм от 49 до 54) и как индивидуальная характеристика вещества его ИК спектр. У всех синтезированных серий структура вещества подтверждена методами Н1 »MP и хроматомасс-спектроскопии. Методом дериватографии определены термические характеристики: температура плавления (плавится с разложением) и начала деструкции.

3. Методом потенциометрического титрования Пефармина™ в водной и спиртовой средах установлены значения рКа, равные 5,12 и 6,08 соответственно, что дает основание рекомендовать для его количественного определения метод титрования в среде протогенного растворителя. Разработаны и валидированы методики количественного определения методом ацидиметрического титрования в неводной среде в двух растворителях -уксусном ангидриде и ртути окисной ацетате. В качестве альтернативного предложен метод экстракционного титрования натрия лаурилсульфатом.

4. Определены оптимальные условия разделения основного вещества и его специфической примеси методом ТСХ и ВЭЖХ. Установлены предельное содержание единичной примеси - не более 0,5 % и сумма всех неидентифицируемых содержание, которых не должно превышать 1,0 %.

5. Разработана методика ГЖХ количественного определения остаточного органического растворителя толуола. Его содержание, найденное при анализе И серий, находится в интервале от 7,0 до 9,5 ррт, что не превышает установленного ГФ XII количества.

6. Методом «ускоренного старения» изучена стабильность исследуемого вещества, установлен срок годности субстанции 5 лет, при температуре хранения 19 - 29 °С. Определен срок годности Пефармина™в естественных условиях в течение 3 лет (срок экспериментального наблюдения), что согласуется с результатами экспериментального хранения при повышенных температурах.

7. Исходя из стоимости сырья и затрат на производство, рассчитана себестоимость и цена лекарственных форм Пефармина™. Установлено, что цена таблеток и раствора для инъекций Пефармина*'4 является конкурентноспособной по сравнению с ценами других гипотензивных средств, поэтому их производство экономически целесообразно.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Тонкослойная хроматография в исследовании чистоты БАВ, обладающего гипотензивным действием / Е.А. Непогодина, JI.A. Чекрышкина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, научно-практический журнал. - Пермь, 2007. -№ 2. - С. 173-175.

2. Способ очистки и свойства БАВ из группы производных арилоксиэтанаминов / Е.А. Непогодина, JI.A. Чекрышкина, Е.В. Семеновых // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств: Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА (27-28 ноября 2007 г., Пермь). - Пермь, 2007. - С. 195-197.

3. Количественное определение соли органического основания методом экстракционного титрования / Е.А. Нспогодина, JI.A. Чекрышкина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, научно-практический журнал. - Пермь, 2008. - № 4. - С. 193-194.

4. Способы идентификации БАВ, проявляющего гипотензивное действие / Е.А. Непогодина, J1.A. Чекрышкина // Фармация и общественное здоровье: Материалы областной конференции (19 февраля 2008 г., Екатеринбург). -Екатеринбург, 2008. - С. 229-230.

5. Количественное определение БАВ методом ацидиметрического титрования в иеводной среде / Е.А. Непогодина, J1.A. Чекрышкина // Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения: Материалы Российской научно-практической конференции ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь). - Пермь, 2008. - С. 325-328.

6. Спектральные характеристики БАВ, производного арилоксиэтанамина / Е.А. Непогодина, J1.A. Чекрышкина // Вестник Российского университета дружбы народов, серия медицина. - Москва, 2008. - № 7. - С. 472-475.

7. Хроматографические методы в исследовании БАС / J1.A. Чекрышкина, Е.А. Непогодина, Ю.Н. Карпенко // Научные труды IX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения A.J1. Чижевского» 27-30 ноября 2008 г., навстречу 10-летию СОМВОЗ, 50-летию РУДН, 50-летаю медицинского факультета - Москва, 2008. - С. 507-508.

8. Валидационная оценка методики количественного определения нового БАВ, проявляющего гипотензивное действие / Е.А. Непогодина, JI.A. Чекрышкина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, научно-практический журнал. - Пермь, 2009. -№ 5. - С. 145-148.

9. Разработка способов идентификации и количественного определения нового БАВ, проявляющего гипотензивную активность / Е.А. Непогодина, Л.А. Чекрышкина // Вестник Российского университета дружбы народов, серия медицина. - Москва, 2009. - № 8. - С. 67-71.

10. Разработка методик количественного определения нового БАВ / Е.А. Непогодина, Л.А. Чекрышкина // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа: Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием (28 сентября - 3 октября 2009 года, г. Пермь, ГОУ ВПО ПГФА Росздрава). - Пермь, 2009. - С. 190-193.

11.Определение сроков годности нового БАВ / Волосникова Е.А., Дозморова Н.В., Непогодина Е.А. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, научно-практический журнал. - Пермь, 2010. - № 6. - С. 158-160.

12. Изучение стабильности нового БАВ, проявляющего гипотензивную активность / Непогодина Е.А., Дозморова Н.В., Чекрышкина Л.А. // X Московский международный салон инноваций и инвестиций «Инновационные материалы и технологии в химической и фармацевтической отраслях промышленности» (7-10 сентября 2010 г.). - Москва, 2010. - № 8. - С. 60-62

13.Определение сроков годности нового БАВ, проявляющего гипотензивную активность / Дозморова Н.В., Непогодина Е.А., Чекрышкина Л.А. // Вестник

Российского университета дружбы народов, серия медицина. - Москва, 2010. -№4.-С. 199-201.

М.Предварительные маркетинговые исследования но перспективам внедрения нового ВДВ, проявляющего гипотензивное действие / Непогодина Е.А., Чекрышкииа JI.A. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, научно-практический журнал. - Пермь, 2011. -№ 7. - С. 41-44.

^.Количественная оценка нового БАВ на основе экстракционного титрования / Непогодина Е.А., Березина Е.С., Чекрышкииа JI.A. // Вестник Уральской медицинской академической науки, тематический выпуск по фармации. -Екатеринбург, 2011. - № 3/1 - С. 70.

Автор выражает благодарность зав. кафедрой органической химии Г1ГФА проф. В.И. Панцуркину за предоставление для исследований нового БАВ - N-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида, зав. кафедрой физиологии с основами анатомии проф. Б.Я. Сыропятову за проведение биологических испытаний, зав. кафедрой микробиологии проф. Т.Ф. Одеговой за проведение микробиологических исследований, зав. лабораторией доц. Ю.Н. Карпенко и руководителю РИЦ «Фарматест» доц. T.J1. Малковой за предоставление хроматограмм ВЭЖХ, научному сотруднику РИЦ «Фарматест» Е.Ю. Ту ми ловим за запись и обработку хроматограмм ГЖХ, зав. кафедрой физики и математики ПГФА доц. М.И. Вахрину за запись спектров ЯМР 'Н, научному сотруднику ИТХ УрО РАН Т.А. Внутских за выполнение дериватографических исследований, старшему научному сотруднику ИТХ УрО РАН A.A. Горбунову за запись ИК и хроматомасс-спектров.

Непогодина Екатерина Александровна (Россия)

Разработка методик анализа и стандартизация Пефармина 1М, проявляющего гипотензивное действие

Проведено химико-фармацевтическое исследование нового биологически-активного вещества М-2-(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида, с условным названием ПефарминТЧ как необходимого этапа доклинического изучения его в качестве потенциального лекарственного средства. С этой целью установлены физические константы, УФ и ИК спектрофотометрические характеристики, разработаны методики анализа субстанции и нормы качества; на основе методов ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ предложены способы обнаружения возможных примесей в субстанции, разработаны и валидированы методики количественного определения, установлены стабильность и срок годности исследуемого вещества, осуществлен прогноз затрат на производство лекарственных форм (инъекционной и таблетированной) нового вещества.

Nepogodina Catherine Aleksandrovna (Russia)

Development of methods of the analysis and standardization Pefarmine™, showing hypotensive action

The chemical-pharmaceutical researches have been carried out for new biologically active substance N-2-(2'-methylphenoxy)-ethylmorpholine hydrochloride, which named Pefarmin"',v necessary stage its preclinical study as a potential medical product is conducted. For this aim the physical constants, UV- and IR-spectrophotometric characteristics were set, methods of analysis of a new substance and quality standards were developed; on the basis of methods TLC, HPLC and GLC ways of detection of possible impurity in a substance are offered, methods of quantitative determination are developed and validated, stability and working life of investigated substance are established, the forecast of expenses for manufacture of medicinal forms (injection and pods) of new substance is carried out.

Подписано в печать 02.11.2011 Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,25 Заказ № 245/2011.

Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел./факс. 8-901-266-59-37, (342) 282-57-92