Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка норм качества и методик анализа лекарственного препарата, содержащего лизиноприла дигидрат и верапамила гидрохлорид

На правах рукописи

005535559

Бабьяк Анна Валерьевна

РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА И МЕТОДИК АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ЛИЗИНОПРИЛА ДИГИДРАТ И ВЕРАПАМИЛА ГИДРОХЛОРИД

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

24 ОКТ 2013

Пятигорск 2013

005535559

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Компанцева Евгения Владимировна, доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Кодониди Иван Панайотович, доктор фармацевтических наук, доцент, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, доцент кафедры органической химии

Дроздова Ирина Леонидовна, доктор фармацевтических наук, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, профессор кафедры фармакогнозии и ботаники

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России

Защита состоится «06» ноября 2013 года в 10— часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института — филиала ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «04» октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Коновалов Д.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) представляют собой не только медицинскую, но и социальную проблему. Смертность от ССЗ занимает 1 место по числу умерших среди населения. В числе основных заболеваний сердечно-сосудистой системы (ССС) остается артериальная гипертензия (АГ). Ее лечение является длительным и иногда пожизненным процессом, причина которого заключается в различной этиологии гипертензии. В значительной степени эту проблему можно решить путем внедрения и применения комбинированного лечения или создания комбинированных препаратов.

В настоящее время одной из популярных групп антигипертензивных препаратов являются препараты группы ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (и-АПФ). По данным исследования назначений гипотензивных препаратов у больных АГ предпочтение при выборе препарата из группы и-АПФ отдают лизиноприлу. Это объясняется тем, что лизиноприл является препаратом длительного действия, не влияющим на функциональное состояние печени. Однако применение лизинопрнла, как и другая монотерапия, является неэффективным при тяжелой АГ, у 70-80% больных с мягкой формой АГ, а также у больных с сопутствующими заболеваниями. При лечении лизиноприлом активность ренин-ангиотензиновой системы снижается только на 60-80% и лишь на начальной стадии лечения, а затем возрастает, т.к. со временем в организме вновь повышается уровень ангиотензина II за счёт компенсаторной активации альтернативных путей его образования. Избежать такого эффекта возможно путём создания комбинированного препарата, содержащего дополнительно к и-АПФ препарат из группы антагонистов кальция (АК), например - верапамил. Верапамил помимо гипотензивного эффекта, обладает выраженным антиаритмическим и антиатерогенным действием. Комбинация лизиноприла с верапамилом будет воздействовать на разные звенья патогенеза АГ, усиливая таким образом гипотензивный эффект. Помимо этого, за счет особенностей препаратов, комбинация является предпочтительной для лечения АГ у пациентов с метаболическим синдромом, ожирением, сахарным диабетом, ишемической болезнью сердца, почечной недостаточностью. Поэтому создание комбинированной лекарственной формы (ЛФ), содержащей лизиноприл и

верапамил, позволило бы в значительной степени повысить эффективность лечения АГ и вместе с этим качества жизни больных.

Для решения этого вопроса необходимо изучить фармакологическую активность комбинации, возможность физической и химической совместимости препаратов, разработать способы анализа веществ при совместном присутствии, провести валидацию методик анализа. Решение этого вопроса позволит обеспечить медицинскую практику и больных новым эффективным лекарственным средством. Таким образом, разработка лекарственного препарата (ЛП), содержащего лизиноприл и верапамил, является актуальной темой для фармацевтической науки и практики.

Степень разработанности темы. Комбинированные ЛП находят все большее применение в медицинской практике. Подбор комбинированных ЛФ проводится в основном по фармакологическому принципу, главным фактором которого является усиление, улучшение и пролонгирование эффекта. За рубежом и в РФ уже имеется несколько комбинированных антигипертензивных ЛП комбинации и-АПФ с АК, выпускаемые в виде таблеток и капсул. Препарат «Тарка» содержит верапамила гидрохлорид в сочетании с трандолаприлом, «Гиприл А» и «Экватор» -лизиноприла дигидрат с амлодипином. Препарата, содержащего композицию верапамила гидрохлорида с лизиноприла дигидратом, на фармацевтическом рынке России и за рубежом не производят. Фармакологических и иных исследований данной комбинации не проводилось.

В литературе и нормативных документах (НД) содержатся данные об анализе верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата в субстанции и монопрепаратах этих субстанций, лекарственных средствах, биологических жидкостях и объектах, однако нет сведений о методиках исследования при совместном присутствии исследуемых веществ, их взаимном влиянии с химической точки зрения и возможных продуктах деструкции.

Учитывая характеристики предлагаемых для разработки препарата веществ с фармакологической точки зрения и преимущества их совместного использования, а также отсутствия импортных и отечественных аналогов считаем актуальным разработку и анализ данной комбинации лекарственных веществ.

Цель исследования заключается в обосновании и разработки состава и норм качества лекарственного препарата, содержащего верапамила гидрохлорид и лизиноприла дигидрат.

Для достижения поставленной цели определены задачи исследования:

1. С помощью фармакологических исследований выбрать оптимальные дозировки верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата для включения в состав ЛП.

2. Изучить влияние различных вспомогательных веществ на скорость высвобождения верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата из предлагаемой ЛФ.

3. Обосновать технологию получения комбинированного ЛП пролонгированного действия.

4. Разработать методики качественного и количественного анализа ингредиентов предлагаемого препарата.

5. С помощью методов компьютерного моделирования провести прогнозирование возможных путей разложения лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида и разработать методики определения исследуемых веществ в присутствии продуктов их деструкции.

6. Определить стабильность ингредиентов при их совместном присутствии и установить сроки годности разрабатываемого препарата.

7. Разработать проект ФСП.

Научная новизна. Показана возможность создания оригинального комбинированного отечественного препарата антигипертензивного действия, содержащего верапамила гидрохлорид и лизиноприла дигидрат. Впервые проведены предварительные фармакологические исследования и на их основе разработан состав ЛФ, включая дозировки действующих и количество вспомогательных веществ. Для оптимальной композиции выбрана ЛФ - капсула, в состав которой входят гранулы лизиноприла и таблетки верапамила продленного действия. Впервые в технологическом процессе создания таблеток верапамила применен принцип использования разного давления прессования для создания различной скорости высвобождения действующего вещества из матричной таблетки.

С целью прогнозирования продуктов деструкции лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорвда использованы методы компьютерного моделирования. С помощью программы AMI и термодинамических расчетов показаны основные направления разложения исследуемых веществ и образование продуктов их деструкции. Впервые проведены исследования для подтверждения данных компьютерного моделирования с помощью масс-спектрометрического анализа.

Определены условия качественного и количественного анализа лизиноприла дигидрата в гранулах и верапамила гидрохлорида в таблетках, а также при их совместном присутствии методами СФМ, ВЭЖХ. Проведена валидационная оценка разработанных методик анализа веществ. С помощью метода ТСХ изучена стабильность ЛП и установлен срок его годности.

По результатам исследования получен приоритет на патент № 2012152699 «Пролонгированная фармацевтическая композиция гипотензивного действия и способ ее изготовления».

Теоретическая значимость исследования. В результате проведенных фармакологических исследований на сгрессорной модели гипертонии у крыс было установлено, что комбинация лизиноприла дигидрата с верапамила гидрохлоридом обладает выраженным синергизмом действия. Следовательно, композиция является перспективной для дальнейших исследований и разработки ЛП. Показано использование методов компьютерного моделирования для прогнозирования возможных путей деструкции лекарственных веществ и подтверждение полученных результатов данными масс-спектрометрического анализа.

Практическая значимость исследования. В ходе работы обоснован состав и технология получения комбинированного гипотензивного средства, содержащего лизиноприла дигидрат и верапамила гидрохлорид. Предложены методики качественного и количественного анализа препарата, которые использованы при разработке НД. Методики анализа препарата апробированы в «Республиканском центре контроля качества и сертификации лекарственных средств» Республики Северная Осетия-Алания.

Методология и методы исследования. В работе использованы классические технологические подходы в разработке составов гранул лизиноприла дигидрата и таблеток верапамила гидрохлорвда, заключенных в твердую желатиновую капсулу.

Длительность действия препарата обусловлена использованием технологического приема, заключающегося в применении разного значения давления прессования для получения 4 таблеток верапамила. Изучение фармакологической активности проведено в соответствии с методологией классической фармакологии. Разработка норм качества препарата проводилась поэтапно с использованием физико-химических методов анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты предварительного фармакологического исследования композиции верапамила гидрохлорида с лизиноприла дигидратом.

2. Результаты технологической разработки ЛП, содержащего верапамила гидрохлорид и лизиноприла дигидрат.

3. Методики качественного и количественного анализа ингредиентов.

4. Способы прогнозирования и экспериментального определения продуктов деструкции верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата.

Степень достоверности и апробации результатов. В работе в ходе анализа препарата были использованы физико-химические методы анализа. Все экспериментальные данные были статистически обработаны и являются достоверными. Скрининговые фармакологические исследования были проведены на достаточно большой выборке животных.

Фрагменты диссертационного исследования были доложены на 67-ой, 68-ой межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, Пятигорская ГФА, 2012 г., ПМФИ -филиал ВолгГМУ, 2013 г.); Ш-ей международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (г.Владикавказ, СОГУ им. К Л. Хетагурова, 2012 г.); конкурсе научных работ молодых ученых по специальности «Провизор», в рамках XIX Российского национального конгресса «Человек и Лекарство» (г. Москва, РАГС, апрель 2012 г.); региональной научно-практической конференции "Инновационные идеи молодежи Северного Кавказа - развитию экономики России" (г. Ставрополь, Ставропольская государственная медицинская академия, 2012 г.).

По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 научных статей, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Фармакологические исследования комбинации лизинопркла дигидрага с верапамила гидрохлоридом Согласно литературным данным комбинация и-АПФ и АК является рациональной, т.е. характеризуется синергизмом (или аддитивностью) антигипертензивного действия и в то же время хорошей переносимостью. Нами были проведены скрининговые фармакологические исследования с целью анализа доза-зависимого гипотензивного действия комбинации верапамила с лизиноприлом и определения оптимальной дозировки этих веществ в композиции. Исследования проводились под руководством профессора Тюренкова И.Н., совместно с профессором Перфиловой В.Н. на базе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ.

Экспериментально установлено, что курсовое введение комбинации лизиноприла с верапамилом в соотношении 2,5/0,5, 5/1 и 10/2 мг/кг с использованием стрессорной модели гипертонии вызывает стойкое снижение артериального давления (АД) по сравнению с контрольной группой (таблица 1).

Таблица 1 — Результаты изменения АД стрессированных животных контрольной и опытных групп

Исследуемые показатели Контрольная группа Опытные группы, получавшие комбинацию верапамил/лизиноприл, мг/мл

2,5/0,5 5/1 10/2

АД исходное, мм.рт.ст 107 106 110 117

АД через 2 недели после стрессирования, мм.рт.ст 121 100,6 84,6 80,7

Изменение АД относительно показателей контрольной группы, % 16,8 зод 33,3

Как следует из таблицы 1, значительное снижение АД (30,1% и 33,3%) наблюдали в группах стрессированных животных, получавших комбинацию верапамил/лизиноприл в соотношении 5/1 и 10/2 мг/кг в сравнении с контрольной группой стрессированных животных.

Динамика изменения показателей АД у контрольной и опытных групп стрессированных животных представлена на рисунке 1.

1-прирост АД контрольной группы;

2, 3,4 - прирост АД опытной группы, получавшей комбинацию 2,5/0,5, 5/1, 10/2 мг/кг Рисунок 1 - Динамика изменения АД стрессированных животных, получавших

комбинации верапамил/'лизиноприл

Как следует из представленных результатов, необходимому условию снижения АД (на 20% согласно руководству по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ под редакцией В.П. Фисенко) удовлетворяют композиции верапамила с лизиноприлом в соотношении 5/1 и 10/2 мг/кг. Для дальнейшего изучения и работа была выбрана композиция, содержащая верапамил/лизиноприл в соотношении 5/1 мг/кг. Это связано с тем, что степень снижения АД у животных опытных групп, получавших комбинации веществ 5/1 и 10/2 отличается незначительно, однако меньшая дозировка позволит снизить выраженность побочных эффектов и обеспечить лучшую переносимость композиции.

Для подтверждения аддитивности эффекта данной комбинации, были сформированы контрольная и 2 опытных группы животных, получавших препараты-сравнения верапамил и лизиноприл по отдельности, в дозировке 5 мг/кг и 1 мг/кг, соответственно. Результаты эксперимента показали, что лизиноприл в дозировке 1 мг/кг снижает давление на 17,5%, верапамил - на 3,8% относительно контрольной группы.

Полученные результаты свидетельствуют о потенцировании действия препаратов при их совместном введении, что делает комбинацию верапамил/лизиноприл перспективной для дальнейшего исследования и разработки ЛП.

Учитывая результаты скрининговых фармакологических исследований и необходимость разработки препарата с кратностью приема 1 раз в сутки, представилось оптимальной разработка лекарственного средства с замедленным

высвобождением действующих веществ. Так как лизиноприла дигидрат относится к препаратам длительного действия (до 24 ч), следовательно, именно для верапамила гидрохлорида (длительность действия 6-8 ч) необходимо было разработать технологические условия, позволяющие веществам оказывать гипотензивный эффект совместно. Кроме того, замедленное увеличение концентрации АК при использовании пролонгированных ЛФ приводит к медленному нарастанию вазодилатирующего эффекта.

Известно, что значение максимальной концентрации АК после приема однократной дозы ретардированной формы препарата в 1,5-2 раза меньше, чем после приема простой формы, поэтому для сохранения соотношения веществ 1/5 в состав ЛФ принято вводить дозировку 1/10. Т.е. в разрабатываемом препарате содержание лизиноприла дигидрага— 10 мг, а верапамила гидрохлорида - 100 мг.

2 Технологическое обоснование состава лекарственной формы Разработку лекарственного препарата продленного действия проводили на базе кафедры технологии лекарств при консультации доктора фармацевтических наук Шевченко А.М. Фармацевтическую композицию лизиноприла дигидрата с верапамила гидрохлоридом предложено выпускать в капсулах, содержащих гранулы лизиноприла и таблетки верапамила продленного действия. Учитывая фармакокинетику ЛП, первоначальный гипотензивный эффект будет обеспечиваться за счет относительно быстрого высвобождения лизиноприла из гранул, а длительность эффекта - за счет постепенного высвобождения верапамила из таблеток и потенцирования его действия с лизиноприлом.

В ходе исследований был установлен состав гранул лизиноприла дигидрата (в пересчете на одну капсулу): лизиноприла дигидрата 10 мг, кальция фосфата двузамещенного 85 мг, Plasdone К-30 5 мг. И состав таблеток верапамила гидрохлорида продленного действия (в пересчете на 1 таблетку): верапамила гидрохлорида 25 мг, натрия альгината 50 мг, микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) 15 мг, магния стеарата 0,6 мг, Plasdone К-90 7,5 мг.

С целью получения оптимального пролонгированного эффекта таблеток верапамила использовали технологический прием, заключающийся в получении 4 модельных таблеток, содержащих по 25 мг вещества, каждая из которых получена с использованием разного давления прессования 25,50, 75 и 100 МН/м2. Такой подход

обеспечил равномерное высвобождение верапамила из таблеток во времени. Кроме того, сравнительный анализ по высвобождению вещества из таблеток прототипа «Тарка» и разработанных таблеток показал, что используемый технологический прием способствует более длительному высвобождению вещества из ЛФ.

Оценку качества разработанных капсул проводили в соответствии с требованиями ОФС. Согласно полученным результатам исследуемая ЛФ по показателям: однородность массы дозированных лекарственных форм, однородность дозирования, степень сыпучести, распадаемость отвечает требованиям НД.

3 Качественный и количественный анализ лекарственного препарата, содержащего лизиноприла дигидрат и верапамила гидрохлорид

Особенностью разрабатываемой ЛФ является то, что при вскрытии капсулы гранулы лизиноприла легко отделяются от таблеток верапамила. Это позволило проводить количественное определение действующих веществ в разных навесках. Для определения количественного содержания лизиноприла дигидрата использовали модифицированную нами методику СФМ по реакции с раствором нингидрина в присутствии натрия карбоната (1=565 нм) и ВЭЖХ.

Условия проведения анализа лизиноприла дигидрата в гранулах методом ВЭЖХ представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Условия проведения методики ВЭЖХ для определения содержания

лизиноприла дигидрата

Программное обеспечение Gabi Star

Колонка Luna 5u Cíe (250x4,6 мм)

Размер частиц сорбента 5 мкм

Подвижная фаза (ПФ) ацетонитрил - фосфатный буферный раствор (рН=2,2) (75:15)

Скорость потока элюента 0,8 мл/мин

Объем вводимой пробы 20 мкл

Режим Изократическое элюирование

Детектирование 215 нм

Марка прибора Agilent 1260 Infinity

При использовании спектрофотометрического анализа лизиноприла дигидрата в тесте «Растворение», где средой для растворения являлась 0,1 М кислота хлористоводородная, выявлена необходимость пересчета количества вещества

натрия карбоната на количество 0,1 М кислоты хлористоводородной для ее нейтрализации и обеспечения оптимального значения рН среды.

Для СФМ методики и ВЭЖХ устанавливали валндность по показателям: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (таблица 3).

Таблица 3 - Результаты валидационной оценки анализа лизиноприла дигидрата в капсулах методом ВЭЖХ (1) и СФМ (2)

Наименование показателя Оптимальное значение (НД) Результат определения

Специфичность Однородность пика (1); спектр вещества должен иметь выраженный максимум при 565 нм (2) Пик определяемого вещества четко отделяется от пиков вспомогательных веществ (1); спектр вещества имеет выраженный максимум при 565 нм после реакции с нингидрином, вспомогательные вещества с реактивом не взаимодействуют (2)

Аналитическая область Результаты должны иметь приемлемый уровень правильности и повторяемости Методики применимы в интервале от 80 до 120 % от номинального значения содержания вещества в модельных гранулах

Линейность ( г) 0,99 0,999(1) 0,995 (2)

Правильность (критерий Стьюдента) <2,57 1,1 (1) 1,41 (2)

Повторяемость (ЯБО) <3% 1%(1) 1,83% (2)

Таким образом, разработанные методики определения лизиноприла дигидрата в препарате отвечают требованиям НД по валидации и могут использоваться для анализа вещества в присутствии вспомогательных веществ гранул.

Для количественного определения верапамнла гидрохлорида в таблетках были также разработаны методики определения с использованием ВЭЖХ и СФМ 278 нм).

Условия ВЭЖХ определения верапамила гидрохлорида представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Условия проведения методики ВЭЖХ для определения содержания

верапамила гидрохлорида

Программное обеспечение Gabi Star

Колонка Luna 5u Cis (250x4,6 мм)

Размер частиц сорбента 5 мкм

ПФ фосфатный буферный раствор (рН=3,0) - ацетошприл -изопропанол (30:35:35)

Скорость потока элюента 0,8 мл/м1Ш

Объем вводимой пробы 20 мкл

Режим Изокрагическое элюирование

Детектирование 278 нм

Марка прибора Agilent 1260 Infinity

Для включения методики определения содержания верапамила гидрохлорида методом ВЭЖХ в проект НД устанавливали ее валидность по показателям: специфичность, аналитическая область, линейность, правильность, повторяемость. Результаты определения специфичности методики представлены на рисунке 2.

"I —"■

со'оо 01*00 02*00 03*00 04*00 05*00

1 - хромаггограмма плацебо-смеси; 2 - хроматограмма таблеток верапамила гидрохлорида Рисунок 2 - Хроматограммы таблеток верапамила гидрохлорида и плацебо-

смеси

Как следует из хроматограммы таблеток верапамила помимо пика основного вещества с 1я=3'29 мин зафиксирован пик с ^=2'20 мин. В ходе эксперимента было установлено, что дополнительный пик дает Р1а5с1опе К-90, который в отличие от остальных вспомогательных веществ растворим в метаноле.

Результаты вапидационной оценки ВЭЖХ определения верапамила гидрохлорида в модельной смеси таблеточной массы представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты валидационной оценки ВЭЖХ методики определения

верапамила гидрохлорида

Наименование показателя Оптимальное значение (НД) Результат определения Соответствие требованиям ВД

Специфичность Однородность пика Пик определяемого вещества четко отделяется от пиков вспомогательных веществ +

Аналитическая область Результаты должны иметь приемлемый уровень правильности и повторяемости Методика применима в интервале от 80 до 120 % от номинального значения содержания вещества в модельных таблетках +

Линейность (г) 0,999 +

Правильность (критерий Стьюдента) <2,57 0,82 +

Повторяемость (ШЮ) <3% 1,63% +

Как следует из полученных данных разработанная методика количественного определения содержания верапамила гидрохлорида в ЛП методом ВЭЖХ валидна по показателям: специфичность, аналитическая область, линейность, правильность,

повторяемость.

В качестве альтернативного метода определения верапамила гидрохлорида при проведении теста «Растворение» нами был использован метод СФМ. Анализ проводили при длине волны 278 нм согласно данным НД 42-231-03 и НД 42-1181207. Относительная ошибка методики составила ±2%.

Для дальнейших исследований и перспективы создания других ЛФ, содержащих верапамила гидрохлорид и лизиноприла дигидрат, нами была рассмотрена возможность одновременного определения веществ методом ВЭЖХ.

Средние величины хроматографических характеристик пиков лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида по результатам анализа 5 хроматограмм представлены в таблице 6.

Согласно данным таблицы 6 установлено, что оптимальные результаты хроматографического определения лизиноприла дигидрата с верапамила гидрохлоридом получаются при использовании ПФ 1. В данных условиях время выхода лизиноприла дигидрата составляет 2,7 мин, верапамила гидрохлорида - 17,1 мин, для пиков обоих веществ фактор асимметрии не превышает 2,5.

Таблица 6 - Хроматографические характеристики лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида при совместном определении методом ВЭЖХ

Хроматографические параметры ПФ 1 ПФ2

Лизиноприла дигидрат Верапамила гидрохлорид Лизиноприла дигидрат Верапамила гидрохлорид

Время выхода, мин 2,7 17,1 6,6 21,8

Площадь пика, тАи-в 34,127 352,534 34,007 348,519

Высота пика, тАи 301,545 742,319 145,933 801,289

Фактор асимметрии 2,10 2,33 3,08 3,38

Для предлагаемой методики были установлены валидационные параметры и определено, что предложенная методика валидна по показателям линейность, правильность, прецизионность.

Разработанные условия ВЭЖХ анализа позволяют использовать данные методики для качественного анализа лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида в ЛП.

4 Исследование стабильности и сроков годности В ходе работы по определению стабильности и сроков годности препарата нами проведены комплексные исследования по прогнозированию процессов деструкции помощью программы НурегСЬеш, метода ЮЛ1 и экспериментальному определению посторонних примесей - продуктов деструкции верапамила и лизиноприла. Исходя из строения молекул исследуемых веществ, наличия функциональных групп теоретически предположили возможные направления процесса деструкции. После этого в программе НурегСЬеш вычислялись значения энтальпий (ДН) и энтропий (ДБ) образования соединений, необходимых для расчета энергии Гиббса реакций.

Согласно рассчитанным значениям энергии Гиббса реакций (ДО), оказалось, что легче поддается воздействию и разрушается лизиноприла дигидрат (при этом температурный режим мало влияет на исход процесса деструкции). Теоретически возможные направления разложения вещества связаны с гидролизом по третичной аминогруппе (рисунок 3, схема 1) и циклизации по входящему в состав молекулы фрагменту аминокислоты лизин (рисунок 3, схема 2):

о

соон Ч,

й (CIip< nh2

Lisinopril

Схема реакции 1 (AG = -12,86)

н2о-

(Н2С)2-

СООН госл1

"ft (С1Щ4 Hjj

о

HN—Ч^

СООН -gj''

А.

(СНЛ

VNH,

VO

- Л_/ .

СООН/-ч

н,о

Lisinopril Схема реакции 2 (AG -- -35,73)

Рисунок 3 — Схемы реакций деструкции лизиноприла дигидрата Для верапамила гидрохлорида оказалось теоретически возможным разложение, связанное с уменьшением углеводородной цепи (рисунок 4, схема 1) и окислением цианогруппы (рисунок 4, схема 2):

HjC-rCHj сн-

н,со

Verapamil Схема реакции 1 (AG = -111,48)

HjC^CHj сн, />СНз

зн2о

Н,СТСН3 сн,

осн3

OCH,

.OCHj

O-ОСНз + NH3*H2O

Verapamil Схема реакции 2 (AG = -15,62)

Рисунок 4 - Схемы реакции деструкции верапамила гидрохлорида Для подтверждения наших предположений относительно возможности образования обозначенных продуктов деструкции исследуемых веществ, провели ТСХ-анализ, предварительно подвергнув вещества воздействию агрессивных факторов.

На основании литературных данных нами были отобраны 12 систем растворителей для анализа и последующего выбора оптимальной системы, позволяющей достоверно определить исследуемые вещества при совместном присутствии и продукты их деструкции. Возможность применения систем растворителей оценивали по величине значения Rf-и коэффициенту разделения а.

Согласно полученным данным оптимальными для обнаружения веществ оказались четыре системы растворителей, у которых коэффициент разделения больше 1.

Были установлены реактивы для обработки хроматограмм и определены пределы обнаружения исследуемых веществ, согласно которым наиболее чувствительным является раствор о-толидина (0,2 мкг). В качестве альтернативного реактива возможно использование УФ-света при 254 нм (5 мкг).

Образование продуктов деструкции исследуемых веществ изучали согласно работе Н.А. Эпштейна (2004 г.): путем термического воздействия (60° и 120°С), действия раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М, раствора натрия гидроксида 0,1 М, раствора пероксида водорода 3% с последующим обнаружением их методом ТСХ. Оптимальной системой для разделения и обнаружения при совместном присутствии исследуемых веществ и продуктов их деструкции явилась система этилацетат - изопропанол - вода - аммиака раствор концентрированный (20:20:25:1) (таблица 7).

Таблица 7 - Результаты определения хроматографической подвижности _исследуемых веществ в различных системах растворителей

Система растворителей Значение Яг

Верапамил Продукты деструкции верапамила Лизиноприл Продукты деструкции лизиноприла

Спирт этиловый - кислоты хлористоводородной раствор 2 н (20:1) 0,50 0,57 0,33 0,21 и 0,3 7

н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода -этилацетат (1:1:1:1) 0,65 0,14 0,44 0,66 и 0,28

Этилацетат — изопропанол — вода — аммиака раствор концентрированный (20:20:25:1) 0,90 0,10 и 0,76 0,61 0,34, 0,50 и 0,75

Ацетон - вода - уксусная кислота -муравьиная кислота (50:15:12:3) 0,85 не обнаружено 0,66 0,84 |

С помощью метода ТСХ также подтвердили, что легче поддается воздействию агрессивных факторов и разрушается лизиноприла дигидрат. Следовательно, при установлении сроков годности ЛП, содержащего оба компонента, ориентироваться в первую очередь необходимо на него. В ходе хроматографического анализа в результате воздействия агрессивных факторов среды нами обнаружено 2 примеси верапамила гидрохлорида и 3 лизиноприла дигидрата.

Метод ТСХ, как экспресс-метод, также был предложен нами как альтернативный вариант для качественного обнаружения исследуемых веществ в препарате. При этом для включения в проект НД нами была выбрана система спирт этиловый - кислоты хлористоводородной раствор 2 н (20:1), как наименее токсичная.

Далее для подтверждения правильности прогнозирования и расчетов с помощью компьютерных технологий нами был проведен анализ продуктов деструкции методом ВЭЖХ в сочетании с масс-спекгрометрией. Для этого в режиме положительной ионизации измеряли масс-спектры и хроматограммы ионного тока исходных и деструктурированных растворов верапамила и лизиноприла. Фрагмент получаемых результатов представлен на рисунке 5.

а) Примесь с М.м.=290,4

б) Примесь с М.м. =290,4

25 Л» «

гИ" 2.0 и: 1.0 0-5 0.0:

290,4

Рисунок 5 - Фрагменты хроматограммы ионного тока (а) и масс-спектра (б) вещества деструкгурированного раствора верапамила гидрохлорида

Нами была проведена сравнительная оценка по обнаружению веществ методом ТСХ, ВЭЖХ-МС и с помощью компьютерных технологий, которая показала совпадение прогноза продуктов разложения лизиноприла с экспериментальными данными. Однако в случае с верапамила гидрохлоридом результаты моделирования продуктов деструкции совпали с результатами ТСХ и ВЭЖХ-МС анализа только для двух из четырех спрогнозированных веществ.

В связи с тем, что легче поддается деструкции лизиноприла дигидрат при определении сроков годности ЛП, содержащего лизиноприла дигидрат и верапамила гидрохлорид, ориентировались на образование продуктов деструкции лизиноприла дигидрата.

С целью определения экспериментального срока годности ЛП, содержащего исследуемые вещества, нами было изучено влияние вспомогательных веществ на стабильность лизиноприла в составе гранул методом «ускоренного старения» согласно Инструкции 42-2-82.

Для изучения процесса деструкции лизиноприла дигидрата образцы гранул (три серии), которые подвергались термическому воздействию, контролировали по показателям: внешний вид, посторонние примеси.

Определение лизиноприла дигидрата и продуктов его деструкции методом тех проводили в разработанных ранее условиях с использованием для детектирования раствора о-толидина. Рассчитанное для нанесения на хроматограмму количество пробы гранул лизиноприла дигидрата (20 мкг) с учетом предела обнаружения (0,2 мкг) и считая, что первоначальный продукт деструкции будет незначительно отличаться по своей структуре от лизиноприла, позволяет достоверно отделить лекарственное вещество от продуктов деструкции.

При анализе гранул лизиноприла дигидрата, подвергнутых термическому воздействию (60°С) согласно методу «ускоренного старения», было обнаружено, что во всех трех сериях исследуемых образцов суммарная площадь и интенсивность пятен посторонних примесей, соответствующих экспериментальному сроку хранения 920 сут. (2,5 года) и более, превышает допустимые 2%. Следовательно, в соответствие с Инструкцией 42-2-82, экспериментальный срок хранения гранул лизиноприла дигидрата и ЛП, содержащего лизиноприла дигидрат и верапамила гвдрохлорид, составляет 2 года.

Дополнительно для полной информации по установлению стабильности и сроков годности препарата нами были проведены исследования таблеток верапамила гидрохлорида методом ВЭЖХ. В ходе анализа методом «ускоренного старения» в аналогичных лизиноприла дигидрату условиях продуктов деструкции вещества обнаружено не было. В результате эксперимента было установлено, что таблетки стабильны в течение 3 лет.

Проведенные исследования позволили предложить следующие нормы качества капсул лизиноприла дигидрата с верапамила гидрохлоридом (таблица 8).

Таблица 8 - Нормы качества капсул лизиноприла дигидрата с верапамила

гидрохлоридом

Критерии стандартизации Методы Нормы качества

Описание Визуальный Твердые желатиновые капсулы с корпусом непрозрачного белого цвета и крышечкой синего цвета (размер 0). Содержимое капсул: гранулы белого цвета лизиноприла дигидрата, 4 таблетки верапамила гидрохлорида высотой 2 мм, диаметром 5 мм светло-коричневого цвета.

Подлинность: 1. лизиноприла дигидрат; ВЭЖХ ГСХ Время удерживания лизиноприла дигидрата должно совпадать с СО. Пятно на хромэтограмме испытуемого раствора должно находиться на уровне пятна СО (Яг 0,43-0,54).

2. верапамила гидрохлорид ВЭЖХ тех Время удерживания верапамила гидрохлорида должно совпадать с СО. Пятно на хроматограмме испытуемого раствора должно находиться на уровне гоггна СО 0,74-0,79).

Однородность массы Взвешивание От 0,389 до 0,453 г

Однородность дозирования: 1. лизиноприла дигидрат, 2. верапамила гидрохлорид СФМ ВЭЖХ Согласно требованиям ОФС 42-0129-09 От 90 до 110% От 82,5 до 107,5%%

Растворение: 1. лизиноприла дигидрат-, 2. верапамила гидрохлорид СФМ УФ-СФМ За 45 мин в раствор должно перейти не менее 75% вещества. В раствор должно перейти вещества: За 1 ч в раствор должно перейти от 7,5 до 23% вещества, За 2 ч-от 24 до 40%, За 4 ч от 45 до 75%, За 8 ч не менее 80%.

Посторонние примеси ГСХ Содержание суммы посторонних примесей не должно превышать 2% от содержания лизиноприла в препарате

Микробиологическая чистота ГФХП Категория 3 А

Количественное определение: 1. лизиноприла дигидрат; 2. верапамила гидрохлорид. вэжх ВЭЖХ От 0,009 до 0,011 г От 0,093 до 0,108 г

Срок хранения 2 года

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе рассмотрена возможность получения и анализа комбинированного

гипотензивного препарата, содержащего лизиноприла дигидрат и верапамила гидрохлорид.

1. Предварительными фармакологическими исследованиями на стрессорной модели гипертонии у крыс подтверждены данные литературного обзора о синергизме гипотензивного действия, входящих в препарат лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида.

2. Разработана технология получения твердых желатиновых капсул, содержащих гранулы лизиноприла дигидрата и таблетки верапамила гидрохлорида. При этом первоначальный гипотензивный эффект обеспечивается за счет относительно быстрого высвобождения лизиноприла из гранул, а длительность эффекта — за счет постепенного высвобождения верапамила из таблеток и потенцирования его действия с лизиноприлом. Проведена сравнительная оценка кинетики высвобождения верапамила из таблеток разрабатываемого препарата и из таблеток продленного действия препарата «Тарка». Показано, что высвобождение верапамила из разрабатываемого препарата происходит медленнее, чем из таблеток прототипа.

3. Разработаны методики идентификации верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата в ЛП методом ТСХ и ВЭЖХ.

4. Для количественного определения лизиноприла дигидрата обоснована возможность использования методов СФМ и ВЭЖХ. Проведена валидационная оценка методик, согласно которой методики соответствуют требованиям НД по показателям: специфичность, линейность, правильность, прецизионность. Показано, что воспроизводимость методики ВЭЖХ выше, чем СФМ. Определение лизиноприла по показателю «Растворение» предложено проводить методом СФМ, т.к. чувствительность спектрофотометрической методики (0,02 мг/мл) по реакции с раствором нингидрина выше, чем в методике ВЭЖХ (0,08 мг/мл).

5. Подобраны условия количественного определения верапамила гидрохлорида в препарате методом ВЭЖХ. В качестве альтернативного метода определения верапамила гидрохлорида предложено использовать метод прямой СФМ. Показано, что предложенные методики валидны.

6. Предложен альтернативный метод определения содержания действующих веществ препарата при совместном присутствии методом ВЭЖХ. Установлено, что методика валидна, относительная ошибка определения ±1,3%.

7. С использованием методов компьютерных технологий показано образование продуктов деструкции верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата. Проведены экспериментальные исследования методами ТСХ и ВЭЖХ-МС, подтвердившими прогнозирование 2 продуктов деструкции лизиноприла дигидрата и 2 из 4-х продуктов деструкции верапамила гидрохлорида.

8. Обоснована возможность использования метода ТСХ при определении стабильности препарата. Методом «ускоренного старения» установлено, что срок годности ЛП составляет 2 года.

Разработаны нормы качества ЛП, содержащего верапамила гидрохлорид и лизиноприла дигидрат, которые могут быть включены в НД.

Полученные в ходе экспериментальной работы результаты, свидетельствующие о потенцировании гипотензивного действия комбинации лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида, могут быть использованы для проведения дальнейших доклинических и клинических фармакологических исследований. Разработанные условия хромато графического анализа при совместном присутствии действующих веществ являются перспективными для дальнейших исследований по разработке других ЛФ, содержащих верапамила гидрохлорид и лизиноприла дигидрат. Проведенные исследования в области прогнозирования продуктов деструкции методами компьютерных технологий и ВЭЖХ-МС анализа представляют определенный научный интерес для дальнейшей дифференциации и анализа посторонних примесей лизиноприла дигидрата и верапамила гидрохлорида.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Анализ доза-зависимого гипотензивного действия комбинации верапамила с лизиноприлом / В.Н. Перфилова, A.B. Бабьяк [и др.] // Вестник ВолгГМУ. -2011.-№4.-С. 27-29.

2. Бабьяк, A.B. Методы анализа верапамила и лизиноприла: Обзор / A.B. Бабьяк, Е.В. Компанцева. - Пятигорск, 2011. - 14 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 21.04.2011, №187-В 2011.

3. Бабьяк, A.B. Валидация методик количественного определения лизиноприла дигидрата в гранулах / A.B. Бабьяк, Е.В. Компанцева // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6; URL: www.science-education .пх/106-7947.

4. Использование метода тонкослойной хроматографии для определения верапамила гидрохлорида, лизиноприла дигидрата и продуктов их деструкции

при совместном присутствии / Е.В. Компанцева, A.B. Бабьяк [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2012. - № 16 (135), вып. 19.-С. 123-127.

. Бабьяк, A.B. Спектрофотометрическое определение лизиноприла дигидрата / A.B. Бабьяк // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб.науч.тр. - Владикавказ, 2012. - С. 150-152.

. Расчет термодинамических характеристик и прогнозирование процессов деструкции верапамила гидрохлорида и лизиноприла дигидрата / A.B. Бабьяк [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.- Пятигорск, 2012.- Вып. 67. - С. 210-213.

. Бабьяк, A.B. Некоторые технологические аспекты разработки и анализа гранул лизиноприла, входящего в состав комплексного гипотензивного препарата / A.B. Бабьяк, А.М. Шевченко, Е.В. Компанцева // II Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых: материалы... - Пенза, 2012.-С.200-204.

8. Бабьяк, A.B. Оптимизация состава и разработка методики анализа гранул лизиноприла, входящих в состав фармацевтической композиции гипотензивного действия / A.B. Бабьяк, A.M. Шевченко, Е.В. Компанцева И Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр,-Пятигорск, 2013,- Вып. 68,- С. 144-146.

. Компанцева, Е.В. Разработка состава и технологии таблеток верапамила с контролируемым высвобождением действующего вещества / Е.В. Компанцева, A.M. Шевченко, A.B. Бабьяк // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2013. - № 3. - С. 17-20.

10. Прогнозирование и экспериментальное определение примесей и продуктов деструкции в фармацевтической композиции гипотензивного действия / Е.В. Компанцева, A.B. Бабьяк [и др.] // Фармация и фармакология. - 2013. - № 1. -С. 18-23.

БАБЬЯК АННА ВАЛЕРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА И МЕТОДИК АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ЛИЗИНОПРИЛА ДИГИДРАТ И ВЕРАПАМИЛА ГИДРОХЛОРИД

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано в печать 03.10.2013 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № //Ы-

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)