Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изолирование, обнаружение и определение некоторых ксенобиотиков в лекарственном растительном сырье и объектах животного происхождения

а н П ч14'1 :

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ. ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ.И.М. СЕЧЕНОВА

на правах рукописи

УДК.340.67:633.51:547.49.6.2(043.3)

ЗАШУТДИНОВ ХИКМАТУЛЛА СУННАТОЕИЧ

ИЗОЛИРОВАНИЕ, ОБНАРУЖЕНИЕ И 01ШЕДЕЛЕКИЕ НЕКОТОРЫХ КСЕНОБИОТИКОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ И ОБЪЕКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

15.00.02-фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степсяш доктора фармацевтических наук

Москва-1992

/ (■

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Научые консультанты: доктор фармацевтических наук, профессор В.А. Попков профессор Л.Т. Икраиов Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук.профессор

А.З. Книжник доктор фармацевтических наук.профессор

A.C. Квач

доктор химических наук .профессор

B.В. Кузнецов Ведущая организация:

Научно- исследовательский институт фармации

Защита состоится "_"_1992 года в_часов на за(

дании специализированного Совета (Д 074.05.06)при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова ( г.Москва, Суворский бульвар,13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской мед цинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: Москва, Зубовская пл., дом.1.

Дата рассылки: "_10_"_октября_1992 г. Ученый секретарь специализированного Совета Д.74.05.06

кандидат фармацевтических наук.доцент Н.П. Садчико;

Сглзл ) - з -

общая" хАр/лтер'/сг;^ г, работы

Актуальность теш

Решение проблемы повышения урозкайкссти лекарственных растительных культур предусматривает внедрение высокоурожайных и устойчивых сортов, осуществления системы мер борьбы с сорняками, вредителям. и болезнями растений.

Для решения этой проблемы б настоящее время широко используют пестициды. Рост использования пестицидов и нарушение технологии их применения наносят непоправимый ущерб окружающей средз. Нарушение экологического равновесия прямо.-или косвенно влияет на $шу,юлогкческоэ состояние человека. Экологическая чистота лекарственных средств,производимых из растительного сырья, является актуальным вопросом фармацевтической практики, т.к. использование больным загрязненных пестицидами лекарственных препаратов монет нанести непоправимей ушерб его здоровью.

Несмотря на это, экологические аспекты в 'фармацевтической деятельности, связанной с производством и применением

лекарственных средств на основе растений, а также анализ экологической чистоты в регионах, где пестицида применяются избыточно,как правило не учитиваются. Одной из причин этого является отсутствие законодательных актов, регламентирующих и гарантирующих " экологическую чистоту лекарственных растений' и средств,производимых на их основе. 3 своп очередь,отсутствие требований в НТД по оценке качества лекарственных растений и продуктов их переработки на наличие пестицидов отрицательно влияет на разработку и усовершенствование методов анализа пестицидов в таких объектах. Особую актуальность данной области исследований придает практически полное отсутствие систематизированных или иных требований о чистоте лекарственных средств отечественного производства в отношении пестицидов. Не случайно, что в вопросах, решаемых во

многих странах относительно применения пестицидов, одним из важнейш является правовой аспект. Созданы специальные государственш учреждения, в обязанности которых входит строжайший контроль : номенклатурой и правильностью применения пестицидов в стране.

Не менее важной стороной проблемы является разработка методик х] мико-токсикологического исследования на наличие пестицидов в различи биологических объектах (растительного и животного происхождения). Цель и задачи исследования.Целью работы является теоретическое и практическое обоснование контроля качества лекарственных растений н наличие пестицидов и анализ судебно-химических объектов разработанны ми комплексными методами анализа, включающее совокупность решаемы принципов, подходов, проблем, задач, используемых методов и исследуе мых объектов химико - токсикологического анализа.

Для решения сформулированной цели исследования необходимо был выполнить следующие задачи:

-Изучить тенденции развития данной области исследований, уст новить и обосновать потребность в методиках химико - токсикологиче когоанализа пестицидов в лекарственном растительном сырье и объектах животного происхождения с учетом экологической загрязненности окружа идей среда и непрекращающимся их применением в различных отраслях на родного хозяйства страны;

- Разработать и усовершенствовать методы анализа пестицидов и продуктов их превращения с помощью современных физико-химических мв тодов ( ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ-МС, УФ-,ИК-спектрометрия, атомно-абсорбционна спектрофотометрия и т.д.) и применить эти методы для химико - токси кологического исследования;

-Разработать и усовершенствовать метода выделения пестицидов иа лекарственного растительного сырья и объектов судебно-химического ис

следования;

-Изучить закономерности кинетики деструкции пестицидов в объектах растительного и животного происхождения, рассчитать.поправочные коэффициенты ( Кд ) для каздого пестицида, позволяющие пересчитывать полученные результаты на истинное количество пестицида (с учетом влияния потерь в процессе очистки,экстракции, хранения объекта и т.д.).

- Примененить поправочные коэффициенты при изучении распределения пестицидов во внутренних органах отравленных животных и доказать при- -годность этих коэффициентов при судебио - химической экспертизе для определения истинного количества пестицида во всех органах зивотных.

„Научная новизна. Результаты выполненных исследований позволили сформулировать и обосновать положения, определяющие применение комплексного анализа пестицидов для контроля качества лекарственных растений и продуктов их переработки, приемлемость и приоритетность этих методов при химико-токсикологическом анализе биообъектов (кровь, моча, печень, почки и др.). .

На основании изучения лекарственного растительного сырья, используемого в фармацевтической практике, обоснована потребность в проведении химико- токсикологических исследований на наличие пестицидов в указанных объектах и включение их в НТД с последующим введением этого требования в Фармокопейные статьи и т.д.

Предложено значительное расширение области практического прго/э-нения физико-химических инструментальных методов анализа (ГЖХ, ВЭХХ, ГХ-МС, УФ-, ИК-спектроскопия, атомно-абсорбционная спектрометрия) для целей химико-токсикологического .анализа пестицидов в лекарственном растительном объекте и объекте животного происхождения( при судеб-но-химических экспертизах). Разработан комплекс методов для анализа и выделения 6 пестицидов и предположительных их продуктов деструкции(метаболитов после доказательства с помощью методов ГХ-МС и ИК-спектро-

метрии) в лекарственном растительном сырье и продуктах его перераСот ки, а также в судебно-химических объектах животного происхождения ( кровь, моча, печень, по^ки, желудочно-кишечный тракт и др.).Предаю жены рациональные схемы химико-токсикологических исследований.

Изучены закономерности кинетики деструкции пестицидов ( ТМТД ТХФМ, Линдан.Толуин, Этоксилин) в растительном сырье и судебно-хими ческих объектах (печень,почки и др.).С приминением этих закономерно тей теоретически рас^итаны поправочные коэффициенты ( Кп), которы позволяют определить истинное количество пестицидов в объектах поел конечного времени хранения объекта ( с учетом потерь при экстракции очистке, хранении и т. д.).

Практическая значимость работы

Рекамендованы разработанные поправочные коэффициенты (Кп),позво яющие перерасчитывать полученные результаты судебно-химической экспе тизы на истинное количество пестицида, которые дают возможность орие тировочно оценить количество поступивщих в организм ядохимикатов.

Полученные результаты внедрены на всесоюзном уровне(в виде мето дической рекомендации),а также в отдельных ВУЗах,республиканских областных бюро судмедэкспертизы:

- "Методическая рекомендация по определению трихлорфенолята мед при исследовании трупного материала", Ташкент, 1987 г,

-"Методические рекомендации по анализу тетраметилтиурамдисульфи да из биологического объекта", Ташкент, 1991 г,

- Учебная разработка "Свойства,токсичность.применение тетрамети тиурамдисульфида и трихлорфенолята меди и их анализ в различных объе тах", Ташкент, 1991 г.

-Отдельные методики анализа используются в Главном бюро Судебно медицинской экспертизы при МЗ СССР,1987г,Республиканском бюро судебн -медицинской экспертизы Узбекистана ( от1991г), Каракалпакии ( акт с

25.04Л986Г), Наманганском областном бюро судебно-медицинской экспертизы (акт N10 от2 9.09.1988Г), Ферганском областном бюро судебно-медицинской экспертизы( акт от22.05Л986г),Сырдарькнском областном бюро судебно-медицинской экспертизы( акт от 19.03ЛЭ86г)„ Положения, выдвигаемые на защиту.

На защиту выносятся:

- Обоснование потребности в методике химико-токсикологического анализа пестицидов в лекарственном растительном сырье и объектах животного происховдения с учетом экологической загрязненности окружающей среды (за счет продолжающегося применения пестицидов в различных отраслях народного хозяйства страны);

-результаты разработки и усовершенствование анализа пестицидов и продуктов их превращения с помощью современных фпзико - химических методов ( ГЖХ, ВЭЮС.ГХ-МС, УФ-,ИК-спектрометрия, атомно-абсорбцконная спектрофотометрия и т.д. ) и применение этих методов для химико-токсикологического исследования;

- результаты разработки и усовершенствование методов выделения пестицидов из лекарственного растительного сырья и объектов судебно-химического исследования;

-результаты изучения закономерности кинетики деструкции пестицидов в объектах растительного и животного происховдения и расчет с ее помощью коэффициентов поправки для каждого пестицида, позволяющий осуществить новый методологический подход для пересчета полученных результатов на истинное количество пестицида (с учетом влияния потерь в процессе очистки,экстракции, хранения объекта);

- методологический подход с применением поправочного коэффициента при изучении распределения пестицидов во внутренних органах отравленных животных при судобно-химичоской экспертизе для определения истинного количества пестицида во £сех органах животных

Апробация работы. Отдельные положения диссертационной работ] представлялись и обсуждались на семинарах, совещаниях, конференциях съездах и симпозиумах различного уровня:

-на международном научном симпозиуме "Экологические аспекты ; фармации"(Москва,1990 г.),

- на П и Ш съездах фармацевтов Узбекистана (1982,1987 гг.),

- на Ш съезде фармацевтов Туркменистана(1989 г.),

- на научно-практической конференции " Повышение качества ле карственного обеспечения населения и учреждений здравоохранения рес публики" (Узбекистан,Ургенч,1990 г.),

- на конференции "Состояние и перспективы развития фармации Сибири и на Дальнем Востоке"(Томск,1991 г.),

- на I Съезде молодых ученых-медиков и врачей Узбекистана(Андижан, 1991 г.),

- на Ш научной конференции молодых ученых и специалистов Таш кентского Фармацевтического института (Ташкент,1990 г).

- на конференции "Актуальные вопросы фармацевтической науки практики"(Курск,1991г.),

- на расширенных заседаниях бюро Главной судебно-медицинской эк спертизы Минздрава Узбекистана и научного общества судебных хими ков(Ташкент,1985,1986,1990 гг.).

За фрагмент работы в 1988г.присуждалась премия I степени Академ наук Узбекистана.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 27 работы, том числе 3 методических рекомендации.

Объем и структура диссертации.Диссертационная работа состоит и введения и 5 глав, общих выводов, литературы, приложений. Работа изложена на .... страницах машинописного текста, содержит .... таблиц, .....рисунков. Список литературы представлен., источниками

из которых ---- иностранных авторов.

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРОБЛЕМЫ, ВЫБОР ОБЪЕКТОВ И МЕТОДИКИ АНАЛИЗА Изучение литературных данных за последние 20 дет и их анализ свидетельствует о том, что имеется .ряд работ.посвященых экологическому анализу лекарственных растений. Изучив "Экологическую карту Узбекистана", мы установили, что регион загрязнен большим количеством пестицидов. Несмотря на это, экологические вопросы в фармации,связанные с производством и применением лекарственных средств на основе растений, а также анализ экологической чистоты в регионе находятся в бедственном положении. Причиной этого является отсутствие законодательных актов, регламентирующих и гарантирующих экологическую чистоту лекарственных растений и средств,производимых на их основе. В данной карте дается "пестицидная загрязненность" (или эколого-токсикологичесхэя), использование пестицидов в районах, детоксикация пестицидов, обоснованное планирование поставок пестицидов для различных зон,оценка эффективности и последствий применения пестицидов, составление объективных прогнозов и разработка профилактических мероприятий. В этой карте имеется информация для каждого ■ конкретного пестицида, включающая сведения о физико- химических свойствах, параметрах токсичности в остром и хроническом эксперименте, гигиенические нормативы и данные гигиенических исследований. В карте составлен прогнозный этап ( заключение), состоящий из следкщих данных:

а) общая масса применяемых пестицидов; б)% опасной,малоопасной и неопасной зоны; в) % применяемых ХОС, ФОС и других групп соединений; г)% инсектицидов,фунгицидов, дефолиантов, гербицидов и других пестицидов, применяемых в данной зоне; д)установление удельной значимости путей поступления остаточных количеств пестицидов в организм человека с учетом особенности применения указанных препаратов в различных районах е) установлена наиболее неблагоприятных для здоровья населения сочета-

ний препаратов различных химических классов; ж) определение критерие) оценки и разработка методов отбора территорий с повышенным риско! воздействия пестицида на здоровье человека; з) составление долгосрочных (перспективных) прогнозных схем и составление рекомендации по снижению возможного отрицательного последствия загрязнений остаткам] пестицидов.

Установлено, что в регионах, где заготавливаются основнт количества"лекарственного растительного сырья при культивировали лекарственных растений, окружающая среда загрязнена пестицидами (ТМТ, линдан, ТХФМ, толуин, тиодан.каторан, каратэ и другие), а их использование продолжается.

Эти обстоятельства создают необходимость глубокого изучения следующих пестицидов: ТМТД, ТХФМ, линдана, фентиурама, толуина, этоксил-ина в химико-токсикологическим и экологическом направлении,так как д< сих пор отсутствуют методики,позволяющие проводить химико-токсиколоп ческий анализ экологической чистоты лекарственных растений и в объектах животного происхождения. В связи с этим разработка и применена методик, анализа пестицидов (современные физико-химические методы анализа) для контроля качества лекарственных растений и продуктов их переработки приемлемость и приоритет этих методов при химико-токсикол« гическом'анализе биообъектов (кровь, моча, печень, почки и др.) являются весьма актуальными.

При выполнении исследований на наличие пестицидов требуется методологический, целенаправленный экологический подход, а также законодательные НТД, обеспечивающие экологическую чистоту лекарственное растительного сырья и продуктов его переработки. В этом аспекте необходимо целенаправленное обследование лекарственных растений,произрастающих в Узбекистане (где избыточно применяются пестициды) для определения реальных количеств пестицидов. Эти исследования требуют зна-

чительного расширения области практического применения физико-хшичес-ких инструментальных методов анализа ( ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ-МС, УФ-, ЯК-спектроскопия, атомно-абсорбционная спектрометрия) для целей химико-токсикологического анализа пестицидов в лекарственном растительном объекте и объекте животного происхождения ( при судебно - химических экспертизах).

I. РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК АНАЛИЗА ПЕСТИЦИДОВ

В главе рассмотрены литературные данные и экспериментальные результаты разработанных в соответствии с современными аспектами и тенденциями реакций осаждения, окрашивания, микрокристаллоскопии и современных инструментальных методов анализа изучаемых пестицидов.

1.1 Обнаружение пестицидов

Микрокристаллоскопические и цветные реакции. Экспериментально изучено отношение изучаемых пестицидов к 50 общоосадочнши рэактивам и реактивам, дающим окрашивание, широко используемым отечестзеннши и зарубежны™ авторами в анализе токсикологически важных веществ.Результаты этого исследования показали, что из изучаемых пестицидов только ТМТД И ТХ'Ш дьют характерные микрокристаллоскопические лли цветное реакции, остальные изученные пестициды не образует характерных продуктов реакции. Раствор ТМТД дает характерные кристаллические осадки с реакти вом йодмонохлорида, с этанольнш раствором йодмонохлорида,с этанолъным раствором ртути дийодида, меди нитрата, с 1%-ним водным раствором меда хлорида и 1%-ным водным раствором нитрата серебра.

Рекомендованы условия выполнения цветных реакции для ТХФМ с реактивом диэтилдитиокарбаматом спинца и нитратом серебра. Изучен*' кристаллооптические константы, чувствительность, специфичность и да аналитические показатели рекомендованных реакций.

Обнаружение методом хроматографии в тонком слое силикагеля. Для разделения и идентификации пестицидов методом ТСХ в настоящее врем

предложено большое количество методик. В ряде методик, описании: литературе, авторами недостаточно глубоко расмотрены их особенс применительно к использованию биологических объектов.

Хроматографические^пластинки размером 9X13 см с закреплеь слоем силикагеля КСК готовили известным способом. Хроматографирова? производили восходящим методом в стандартных хроматографических каме pax после насыщения их в течение 30 мин.

В качестве подвижной фазы при хроматографии в тонком слое сорбента был испытан ряд систем растворителей. Наиболее подходяще причастном обнаружении ТМТД оказалось смесь: толуол- н-гексан- ацетс (проявитель бромфеноловнй реактив, Rí=o,56), для ТХФМ - смесь бензс хлороформ 9:1(проявитель 0,5%-ный родамин С, Rf=0,43), для толуина этоксилина- смесь бензол- ацетон- этанол 5:4:2(проявитель О,OIS раствор дифенилкарбазон в хлороформе, Rf=0,50 и 0,54,соответственно) для линдана- смесь н- гексан- толуол- ацетон 2:2:1(проявитель реак'м аммиакат серебра, для обнаружения фентиурама наиболее оптимально является смесь н-гексан-толуол- ацетон 2:2:1 (проявитель - реактив аммиакат серебра в комбинации с бромфеноловым реактивом, Rf=o,6 и О,4,соответственно, но каждому реактиву).

Метод ТСХ использован нами с целью очистки, разделения и идентк фикации пестицидов, выделенных из растительного и трупного материги При этом рекомендованные условия ТСХ позволяют осуществить'достаточную степень очистки от балластных веществ.После этой очистки пестицр могут быть анализированы методами спектрофотометрии.ГЖХ, ВЗЖХ, ГХ-МС т.д.Элюирование пестицидов из сорбента можно производить этанолом,щ: годность которого экспериментально доказана.

В главе Ш рассмотрено также применение УФ-, ИК-спектральных ха рактеристик, т.к. в литературе такие характеристики недостаточно описаны. Для обнаружения изучаемых пестицидов, а также некоторы

продуктов взаимодействия с реактивами, были сняты спектральные характеристики в УФ-, МК- и видимой области спектра. При этом ТМТД образует с 1%-ным раствором меди хлорида окрашенный продукт зеленого цвета, который максимально абсорбирует свет при длине волны 3S0 нм(Е1

=241,3). Этаноловый раствор ТХЗМ имеет максимум абсорбции при длине 1 ж

волны 292 нм(Ej£=161,8). Фентиурам в этих условиях также дает максимум абсорбции, так как он является комплексным препаратом вышеуказанных пестицидов.. Линдан, толуин и этокоилин не обладают поглощением в УФ-области спектра.Метод позволяет обнаружить ТМТД при наличии его в количествах более 5 мкг/мл и ТХФМ- более 10 мкг/мл.

Обнаружение изучаемых пестицидов методом ИК- спектрометрия ранее не било разработано для химико- токсикологических последогний. В связи с этим нами были сняты ИК-спектри пестицидов в таблетках с бромидом калия на приборе " ив- Ю" в области волновых. чисел 40С0- 400 см"-1'. При этом ТМТД (в диске с бромидом калия) имеет ряд интенсивных полос при 1405 -570 cm~Í а ТХФМ имеет интенсивные полосы при 1605-730 см-^. Соэкстрактивные вещества, переходящие в вытяжки из биологического материала, мешают обнаружению ТМТД и Тл'ТМ с помощью РЖ- спектрометрии. В связи с этим идентификация ТМТД и Тл® методом ИК- спектрометрии рекомендуется только для технических препаратов..

Одним из существенных недостатков этого метода, несмотря на его специфичность, является недостаточная ( применительно к исследованию биологических объектов) чувствительность и использование дорогостоящего оборудования. Для идентификации пестицидов методом ИК~ спектрометрии необходимо не менее ?, мг анализируемого вещества, практически свободного от соэкстрактинннх веществ биологического объекта.

В случае остаточных количеств пестицидов и лекирственном растительном сырье ( 10 г анализируемого объекта ) такое количественное содержание маловероятно. Поэтому этот метод более пригоден для ана-

- 1-1 -

лиза вещества в технических препаратах.

Обнаружение пестицидов методом газо- жидкостной хроматографии

Анализ и обобщение данных литературы о методах определения мик роколичесть пестицидов толуина,этоксилина,трихлор^кнолята меди позво ляет придти к заключению, что вопросы анализа этих вещест: практически не освещены. В литературе не найдено данных о методах, используемых для экологического контроля за их содержанием в лекарст венно-растительном сырье , объектах окружающей среды и объектах суде' но- химической экспертизы.

В своих исследованиях анализа мы использовали газовые хроматогр фи отечественного производства " Цвет 100","Газохром 1109 ".оснащенн различными детекторами. В анализе пестицидов используют такие детекторы, как ГЩ, ДЭЗ, ДТИ (термоионный детектор) и др. Мы отдали пред почтение детектору постоянной рекомбинации скорости (ДПР - одна из модификации детектора электронного захвата) ввиду высокой чувствительности и специфичности по отношению к атомам галогена.

Значительная роль в оптимизации процесса хроматографироьани хлорсодержатих пестицидов принадлежит правильному выбору неподвижно жидкой фазы (НЖФ).Как показано нами в обзоре литературы при определе ние хлорорганических пестицидов используются колонки с неподвижными Фазами,отличающимися по полярности.Такое многообразие можно объяснит различиям в физике- химических свойствах препаратов и объектов ана лиза, в выборе условий определения, в тиле детекторов и т.д.

С целья выбора оптимальных условий разделения изучаемых пестици дов были определены алнационные характеристики при использовании н подвижных фаз : неполярная БЕ-ЗО и полярная ХЕ- 60.

Хроматографическое разделение вели в стеклянных колонках длиной 100 см, диаметром 3,0 см, которые имеют форму спирали;В качестве неподвижной фазы были использованы готовые силиконовые эластомеры типа

БЕ-зо, ХЕ-бо, нзнесешш о на инертный носитель Хроматон и-АИ-БМОБ в количестве 5%. Газ-носитель азот марки особой чистоты 40 ил/мин,шкала 5.10 .скорость бумаги 650 та/час, температура колонки 156°С, температура испаритолья 220°С, температура детектора 240°С.

ДЭЗ и ДПР оказались в 10-50 раз более чувствительными к хлорорга-ническим пестицидам, чем к азотсодержащим пестидоз. Учитывая высокую чувствительность,мы в дальнейшем использовали ДПР.

Для оценки эффективности разделения изучаемых пестицидов на колонках различной полярности использовали объективные критерии разделения, применяемые в хроматографии:число теоретических тарелок ( N ) и критерий разделения (Ю. При исспользованни фазы ХЕ-60 пики получаются несколько размытым, что затрудняет количественные расчеты.Удовлетворительнее разделение обеспечивается на среднеполярной неподвижной фазе эе - зо хлорсодержащих ядохимикатов, что является более оптимальным для изучаемых пестицидов.

Наш было определены качественного характеристики, такие как абсолютное время удерживания, исправленное время удеркизанпд и относительное время удерживания толуина (^тн=1,40) и его метаболитов, ТХ'Ш (^тн=1,95) после превращение его на ТХФ (метаболит), зтоксилина г07Н=1,37). '

Обнаружение пестицидов методом жидкостной хроматографии высокого

давления

Больше возмежости имеет метод ВЭЖХ при определении количеств лекарственных препаратов в фармации, а также при анализе следовых количеств пестицидов в окружающей среде.

Учитывая его большие возможности,мы разработали методику высоко-оф^ктивней жидкостной хроматографии дли анализа толуша, тХФМ.этокси-лина и продуктов их деструкции..

Исследования проводились на приборе "ЫаиосЬгот 2010" (Венгрия)

с колонкой, заполненной Lichrosorb КР 18 5 mm (Ultropao Column ,IKE 250x4 ги, снабженной УФ- детектором, настроенным на длину волны 23 ш. В качестве подвижной фазы использовали смесь, метанол-ацетонитри вода-ледяная уксусная кислота(46:14:40:0,5), подобранную в предварите ных опытах,скорость элюента 0,7мл/мин. Хроматографический график р гистрировали на самописце "Potentiometrio Reoorder" при скорости диаграммной ленты 30 см/час. Пробу вводили с помощью инжектора, снаб жеиного дозирующей петлей на 20 мкл. В качестве внутреннего стандарт служил пестицид линурон.

Полученные результаты представлены в таблице 1

Таблица 1

Время удерживания изучаемых пестицидов и продуктов их

превращении

Пестицид Время удерживания Относительное время удерж

Толуин 8 мин.35 сек. 0,51

ТХФМ 7 мин.05,сек. 0,43

Э токе;; лин 8 мин.55 сек. 0,53

N-хлорацвтоанилид 6 мин.22 сек. 0,38

N-хлорацетотолувд 5 мин.50 сек. 0,33

N.N-бисэтоксиэтил- 17 мин.30 сек 1,06

анилин

Как видно из данных таблицы I, время удерживания толуина состав ляет 8 минут 35 секунд,внутреннего стандарта 16 минут 27 секунд.Отно сительное время удерживания толуина по отношению ко времени удержива ния линурона составляет 0,51,этоксилина 0,53, а ТХФМ 0,43.

Предел обнаружения методом ВЭЖХ составляет 0,05 мкг препарата пробе.

Газового-хроматографиический-масс спектрометрический метод обнаружения пестицидов

Из литературы известно об использований масо-спектрометрли в сочетании с газокадкостной хроматографией ( ГХ-МС ) для анализа пищевых продуктов, а такли в судебной химии. Методом ГХ-МС можно опроделять остаточные количества хлорсодержащих пестицидов, например, норбернена в следовых концентрациях . В литературе описаны идентификация остаточных количеств лекарственных препаратов в тканях животных с помощью этого метода.Для целей судебной экспертизы предложен быстрый метод анализа сложных смесей,основанный на регистрации упрощенных масс-спектров, получаемых методом химической ионизации.

Таким путем можно определить около 48 лекарственных препаратов, 'вводя биожидкость непосредственно в колонку прибора для газо-жидкост-ной хроматографии-масс-спектрометрии,что позволяет определять лекарственный препарат в моче в концентрации 2 нг/мл с относительннм стандартным отклонением около 5%.Этот современный метод позволяет выявлять различные метаболитические превращения и тем самым способствует большей надежности анализа.

Учитывая такую перспективу, мы поставили задачу разработать методику анализа изучаемых пестицидов, выделенных из растительного и судебно-химического объектов, которая позволит проводить своевременную диагностику интоксикаций (идентификация пестицида) в моче и крови, что поможет предотвратить смертельный исход. С этой точки зрения вопросы разработки чувствительных, специфичных и современных физико-химических методов анализа пестицидов при химико-токсикологическом исследовании являются актуальным. Нами была разработана методика хро-мато-масс-споктрометрического анализа толуина,этоксилина и линдана в биологических жидкостях.

Предварительны^ газохроматографический анализ проводам на приборе Тракор 540, снабженном дотоктором электронного захвата. Во время анализа придерживались следующих условий: разделение толуина и этокси-

лина в'ели на насадочной стеклянной колонке длиной 150 мм с внутрен-

«

ним диаметром 3,0 мм, заполненной неподвижной фазой 3% SE-30 ш Supeiooport. Температуру термостата колонки программировали в диапазс не 150-250°С (5°С/мин). Температуры детектора и испарителя были 250°( и 220°С, соответственно. Газ-носитель - гелий, скорость которого ЗС мл/мин.

Качественную идентификацию толуина проводили по времени удерживания. Предел обнаружения 0,01мкг/мкл.

Газохромато-масс-спектрометрический метод исследования осуществляли на приборе Тракор 800. Для ионизации молекул использовали электронный удар с энергией ионизации 70 эВ, при ускоряющем напряжении 3, кВ. Напряжение на умножителе 1900 в, на линзах 8 и 70 в, температу] источника ионов 180°С.

При анализе толуина методом ГХ-МС наблюдали на хроматограмме (Е один пик, а имеел т/а 91, 106, 120, 18Э, 197, 205, 241(М+).

Молекулярный ион с m/z 241 подтверждает наличие толуина в анал] зируемой пробе. Появление осколочных ионов с m/z 205 обусловлено расщеплением (М-СН^-ОСН^) группы из молекулы толуина, ион m/z 187 указывает на расщепление группы (M-CHg-OCHg).отщепление (M-CH^CHgOCIL группы подтверждается ионами m/z 183.На масс-спектре фиксируется пик молекулярного иона m/z 120, а также осколочных ионов m/z 91 и 106 (Рис I.).

Следующим этапом наших исследований было выделение ядохимикат) из биологических объектов (см.стр...).растительных объектов (см.стр. и обнаружение его рекомендуемой методикой.

Для этого были приготовлены модельные смеси, содержащие 0,20 мг пестицидов в объектах, и по рекомендованным методикам получеш извлечения,где как указано выше, полученный экстракт упаривали до об' ема I мл и анализировали I мкл этого раствора на ГХ-МС.Полученный пга

по времени удерживания совпадает со временем удерживания чистого препа рота.Масс-спектры исследуемого вещества, выделенного из указанных объектов, были идентичны масс-спектрам изучаемых, пестицидов.

Таким образом, предложены условия идентификации пестицидов посла экстракции из биологических жидкостей методами ГЖХ и ГХ-МС, пригодные при химико-токсикологическом анализе.

Идентификация продуктов превращение пестицидов На тонкослойных хроматограммах при исследовании вытяжки после хра-не1шя объектов (• растительной материал, печень, желудок и т.д.) обнаруживались несколько пятен(неизвестные соединения)помимо искомых пестицидов. Сравнивали величину основных продуктов превращения с величинами К! веществ, синтезированных учреждениями-разработчиками,метаболитов (продуктов превращения). При этом обнаружено, что трихлор^энолят меди расщеплялся до трихлор1>знола,толуин расщеплялся до Н-хлорацето-толуида, м-метшшюрацетотолуида. Этоксшшн расщеплялся до М,Ы-,бис 'этоксиэтилашмида) и м-хлорацетоаншшда.

Это предположение подверждено газожидкостиоК хроматографией и газожид1состчшм- масс-спектрометрическим методам анализа.В^-начале вьо-дили в хроматограф стандартные раствори продуктов превращении,а потом вводили извлечения,экстрагированные из объектов растительного и животного происхождения, сохранявшиеся определенное времени ( 5-6 дней). Спектры продуктов превращении из объекта в сравнении с исходным продуктом представлены на рис. 1-2

180

ы-хлораце тотлуид

148

183

и-мбтил,хлораце тотолуид

148

181

197

и_и

148 1 толуин

182

197

243

Т_1

50 100 150 200 250 300 Рис. I. Масс-спектры толуина,к-хлорацетотолуида,ы-метилхлораце-тотолуидина под действием ЭУ.

%

100 50

100

50

100

50

этоксилин

j197

J_

n,n- бис(этокси)этиланилин

18Í?7

241 ,243

169 " N-хлорацетиланилид

241

243 x,_

—i—

300

m/z

50 100 150 200 250 Рис. 2. Масс-спектры этоксилина,м,н-бис(этокси)этиланилина, N-хлорацетиланилида под действием ЭУ.

Как видно из рис.1-2 наблюдаются пики с т/е 183,134,которые отсутствуют у чистого толуина.Что касается ионов с т/е 183 в спектре, то они соответствовали N -хлорацетотолуиду, второй же ион с m/z 134 соответствовал второму продукту деструкции Н-метилацетотолуиду. Эти превращения представлены на схемах рис.3-6.

i

,СН3 О

■И—С- СН2— С1

Н^-СН^-СН3

толуин

СНЭ О

СН2—С1

ы-хлорацето-о-толуид

сн3 й-

о-толуидин

.. 0Н3 о-мотил фонол

н2—СН2—ОСН3

ы-метоксиэтил-о-толуид

он, й-

Шо

о-толуидин

он,

он

о-метшфенол

утилизация

Рис. 3. Предположительная схема разрушение толуина

СНт

n — я - сн2— 01

¿н2—сн2—0сн2 СН3

этоксилин

снп

N -Н

I

сн2—сн2—оон

и-этоксиэтиланилин•

о

СНд"

С1

н-хлорацетанилид

н

(и-конюгаты различных кислот)

утилизация

Рис. 4. Предположительная схема разрушения

этоксилина

CI

CI С

■CI CI

трихлорфенолят меди

I

Cu

,+2

,01

01 (pi-011 трихлорфенол

311

cl<p)-4)h CI

с1/^2он cVCH0

3H

ci(0)-on

CI

П— coon CI (f COOH

oF

ci~ утилизация ci утилизация

Рис. 5. Предпологаемая схема разрушв1шя ТХФМ по Kauf man, Kearney (1ЭТ6)

СН,

сн

— В— Б—8 — й—

СН,

/

СН.

3 -'3

тетраметилтиурамдисульфид

СН-,

N — Б

СН3 .„3

диметиламиновая соль диметилдитокарбаминовая кислота

Б сн, )М-8-н( 3

СНЭ СНЭ

тетраметилтиомочевина

сн,

сн.

N -

сн

3

V'

диметиламин

СН3 Б

— ) N — Я--- /Н-с-Б-глккированиая

сн^ СН3 кислота

димотилдитио конюгировашшй диалкилдитио карбамат карбамат

сн,

сн.

/

Б

N — (] -Э -СН-,

метиловый эфир диметилдатиокарбамат

нсоон формалдегид

БО

-2

4

сульфат

Рис. 6. Предполагаемая схема разрушение ТМТД

по А1с1г1(3^е Мазоз (1978)

С помощью указанных методов определены фрагменты препаратов г лученные в результате электронного удара. На основании этих исслвд: ваний получены' данные о составе фрагментов исследуемых препарате Однако не все обнаруженные фрагменты могут являться метаболитами сс ветствуодих исходных препаратов. Это,повидимому,объясняется тем, чт метаболиты образуются в организме под действием определенных ферме* ных систем. Между тем, фрагментация исследуемых препаратов во многа случаях позволяет предполагать возможный метаболизм и прогнозироват метаболиты исследуемых препаратов, что и было нами доказано с помои метода ГХ-МС.

Полученные результаты дают нам основание сделать заключение расщеплении пестицидов с образованием продуктов деструкции (метабо: тов).

1.2 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ

Известно,что для количественного определения токсикологически важных веществ в лекарственном растительном сырье и при судебно- xi ческом анализе наиболее пригодны физико-химические методы, такие, i фотометрия,газокидкостная хроматография,жидкостная хроматография п] высоких давлениях и ГХ-МС. Из обзора литературы видно,что ■ метода количественного определения изучаемых пестицидов, выделенных из ле карственшх растительных объектов и объектов животного происхождет изучены крайне недостаточно.

В этой связи нами была поставлено задача сравнительного изуче ния некоторых методов количественного определения изучаемых пестищ в отнощении их пригодности, чувствительности,воспроизводимости и щ делов определошя с тем расчетом , чтобы методику нахождения этш .пестицидов рекомендовать для химико- токсикологического анализа о( ектов растительного и животного-происхождение.

Нами били экспериментально установлены оптимальные условия определения ТМТД с реактивом меди(П)хлорида.

Разработанным спектрофотометрическим методом в .среднем опре-ляется 100,15 % ТМТД с относительной ошибкой ±0,39%, предел определения 0,094 мкг/мл. Подчините закону Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в интервале концентрации 5-6 мкг/мл.

Для количественного анализа ТХФМ помимо хроматографического определения (Шейнина Р.И.,1980) рекомендован фотометрический (а также колориметрический) метод,основанный на образовании окрашенного продукта в результате взаимодействия иона меди(П), входящего в состав ТХФМ с диэтилдитиокарбаматом (Атабаев Ш.Т.,1978). Однако, предложенные метода для анализа мало пригодны,т.к. они менее чувствителни и не спецефичны.

Поэтому мы поставили задачу разработать спектрофотометркческий метод количественного определения ТХФМ, пригодный для целей нылего исследования.

Сшзкралышэ характеристики этаиольиого раствор ТХТМ с концонтрп-цией 50 мкг/мл снимали на приборе СФ-16 в УФ-области спектра в интервале длин волн от 230 до 320 им,используя кюветы с рабочей длиной I см. Как уже указывалось,максимум светопоглощения ТХФМ в' этанольном растворе наблюдается при длине волны 292-294 нм.Нами определены так же удельный (161,8) и молярный (7387,8) коэффициенты светопоглощения ТХФМ . в этаноле.

Наименьшее количество ТХФМ,которое можно определять при измерении оптической плотности его этанолышх растворов, составляет 0,0309 мкг/мл.Относительная ошибка методики ± 0,21%.Подчинение закону Бугера- í Ламберта- Бера отмечалось в интервалё концентраций 10 -120 мкг/мл. ■ /

Нами также разработана методика атомно-абсорбционный спектрофюто-метрии (ААС) для определения ТХФМ. Количественное определение меди в

ТХФМ методом ААС проводи.™ при длине волны 324,8 нм с применение! пламеш! воздух-ацетилен,ток лампы с полым катодом 2,5 мА.щель 0,30 1

Для калибровки прибора ААС-3 (ГДР), исходя из зависимости инте: сивности поглощения от концентрации иона меди (П) в растворе ( 0,50 10,00 мкг/мл),строили градуировочный график, по которому определя содержание ТХФМ в этанольном растворе с учетом коэффициента пересче на ион меди (П).Достоверность данного метода количественного опред ления ТХФМ была подтерждена в модельном опыте.Изрезультатов экспери ментальной работы показана возможность использования ААС для опреде ния ТХФМ с корреляцией по водному раствору меди(П) хлорида, а также пригодность разработанной методики для определения ТХФМ, выделенной из трупного материала(печень).Установлено, что метод ААС достаточно чувствителен, позволяет определить следовые количества ТХФМ (по ион меди 0,5мкг/мл). Естественно содержащаяся медь не изолируется из биологического объекта по предложенной методике,что нашло отражение в результатах проведенных контрольных опытов.

Применение производной спектрофотометрии для определение

пестицидов

При изолировании ядов из биологических объектов, наряду с иско мыми веществами, экстрагируется ряд соэкстрактивных веществ (пигмен жиры, белки, продукты их распада и др.). Дополнителыше способы очи ки, например, их экстракция органическими растворителями,-осавдение белков этанолом, хроматография в тонком слое сорбента, колоноч хроматография и др. не дают возможности полностью избавиться от соэкстрактивных примесей.

В связи с этим при количественном определении токсикологически важных веществ возникает так называемый фон, дающий завышенный результат определения. Наиболее характерно влияние фона при использо вании УФ-спектрофотометрии, а также при сочетании методов экстракцк

- 29 - :

I

хроматографии (колоночной и в тонком слое сорбента) и УФ-спектрофо- ; тометрпи.

При разработке новых методик анализа принято вычитать значение оптической плотности холостого опыта из значения оптической плотности основного опыта, что позволяет получите более объективной результат.

Поскольку в нашей работе не удалось полностью исключить влияние фона на результат определений при различных способах очистки вытяжек из биологических объектов, мы попытались разработать методику для уменьшешя этого влияния.

Изучаемые пестициды изолировали из биологических объектов по разработанной методике. Из спектральной характеристики ТМТД и ТХФМ видно, что в области максимумов поглощения изучаемых пестицидов фон проявляет линейную зависимость, что позволило нам использовате производную спектрофотометр;™ для расчета количества ТМТД и ТХФМ, выделенных при судебно-химических исследованиях биологического материала. Одним из вариантов использования ортогональных функций является определение искомых веществ на фоне линейного поглощения примесей или растворителя. В данном случае поглощение фона описывается полиномом первой степени:

П=Ь0+Ъ.,Х а

поглащение определяемых препаратов полиномом второй степени: сп=ао+а1х+а2х2>

где: Ъ0;Ъ.| ;а0;а1;а2- коэффициенты полинома, описывающего спектр фона и определяемого препарата, х-порядковой номер длины волны.

В уравнении, выражающем суммарное поглощение, коэффициент при квадратичном члене будет записс-т только от концентрации определяемого препарата. Для расчета содержания препаратов использовали их стандартна растворы определенной концентрации.

Определение пестицидов методом газо-жидкостной'хроматографии

Количественное определение пестицидов (ТХФМ, толуина, этоксилш и продуктов их деструкция из хроматограмм проводили методом внутр» ного стандарта. Этот метод носит также название метода метки. Он тр< бует точной дозировки, и в этом заключается его главное достоинств« Метод основан на сравнении высот или площадей пиков известного веше ства - метки и определяемого компонента. Угловой коэффициент К тако графика представляет собой константу для данного анализируем' вещества.

Содержание определяемого вещества (%) можно рассчитать по форм

Бх

1х=1тК-100, ГДв

Бт

бт/Бх отношение . площадей пиков, -

1х - содержание определяемого вещества, 1т - содержание стандартного вещества.

Чтобы проводить расчет методом внутреннего стандарта, необхо димо составить ряд искусственных смесей исследуемого вещества с в тректпл стандартом, снять хроматограммы при режиме анализа и мерить соотношение площадей соответствующих пиков, на основании по ченных данных построить калибровочные графики и определить констант Определение пестицидов медодом жидкостной хроматографии высоког

давления

Для разработки методики количественного определение изучаемых пестицидов (ТХ<ТМ,толуин,этоксилин) нам был построен калибровочный график. Для этого приготовили 0,05% раствор пестицида в 100 мл смес ацетонитрила,метанола; воды и уксусной кислоты, взятых в соотноше} 14:46:40:0,5.Из этого раствора были приготовлены ряд растворов раз; ной концентрации (0,04;0,06;0,03;0,Ю;0,12). Каждый образец хромате графировали повторно 5 раз(условия хроматографирования приведены вь

Количественную оценку осуществляли путем добавления внутреннего стандарта линурона (25 мкг на каждую пробу), используя отношения площадей пиков исследуемого вещества и внутреннего стандарта. На основе полученных данных строили калибровочный график зависимости ; отношения площадей пиков исследуемого вещества и внутреннего стандарта; от количества введенного в колонку пестицида. Найденная зависимость в ' изученном диапазоне концентраций является линейной.

РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК ИЗОЛИРОВАНИЯ ПЕСТИЦИДОВ В практике судебно-химической экспертизы и в химико-токсикологическом анализе одной из важнейших операций, предшествующей обнаруке нию и количественному определению токсических веществ, является выделение их из объекта исследования.

О выделении ТМТД, ТХФМ, линдана, фентиурама, толуина и зтоксилина из объектов растительного и животного происхождения имеются весьма ограниченные сведения в имеющейся литературе приводятся методики выделения ТМТД и ТХФМ из объектов растительного происхождения и лишь несколько работ касаются анализа трупного материала (Горбачева H.A., 1963; Мужановский Е.М., 1973).

В связи со сказанным мы сочли необходимым детально изучить вопроси .связанные с выделением ТМТД и ТХ<Ш из трупного материала (ткани и" органы). Целесообразно было учесть физико-химические свойства пестицидов (растворимость, влияние pH среди и др.) и пригодность общих методов изолирования органических ядов по отношению к исследуемым ядохимикатам, и на основе полученных результатов выявим оптимальные экстрагентн и методы изолирования изучаемых пестицидов и объектов растительного и животного происхождения.

ЭКСТРАКЦИЯ ПЕСТИЦИДОВ ИЗ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ Для выбора условий выделения ТХФМ из биологического материала

было необходимо предварительно изучить его экстрагируемость оргаго адскими растворителями из водных растворов, так как условия экстрам Пии ТХФМ до настоящего времени еще не являлись предметом специалью исследований. Для экстракции ТМТД.ТХ5М, толу ищи этоксилина из водны? растворов мы применяли свежеперегнанные органические растворители: хлороформ, диэтиловый эфир, 1,2- дихлорэтан, н-гексан, бензол.

Определенные значения рН среды создавали с помощью.универсалы« буферной смеси Бритона и Робинсона. Среду со значением рН=1 coздaвaJ 0,1н раствором соляной кислоты. Значение рН растворов измеряли на у! версальном иономере ЭВ-74.

Результаты исследований показали, что при рН 6-7 экстрагируется наибольшее количество ТХФМ всеми испытанными растворителями, ТЫТД максимально экстрагируется при рН=2, ь толуин и этоксилин хорошо экстрагируются при рНс9-Ю всеми изученными растворителями (см. рис. 7).

I

» \

% ■ 100 ■

2 4 6 8 10 рН

Рис.7. Зависимости степени экстркцш пестицидов хлороформом из водного раствора при различнихзначениях рН среды д - ТМТД; ^ -ТХФМ; 0 - Толуин; § Этоксилина

На этом этапе работы было также изучено влияние электролитов на экстракцию пестицидов. Полученные результаты показали, что присутствие электролитов не оказывает существенного влияния на их экстракцию.

При изучении кратности экстракция пестицидов мы провели серию экспериментов по методике, приведенной ранее , с тем отличием, что при изучении влияния кратности экстрагирования повторяли его от 2 до 4 раз из водной фазы при указанных условиях. Из результатов экспериментов видно, что максимальная экстракция пестицидов из водного раствора происходит в основном при 3-кратном экстрагировании;4-кратное

экстрагирование оказывает лишь незначительное влияние на степень экс фракции пестицидов. Установлению оптимальных условии экстракции пес тицидов дало возможность применять и глубоко изучить экстракции исы дуемых пестицидов из биожидкостей (кровь, моча,промывные воды желудь и т.д.).

ЭКСТРАКЦИЯ ПЕСТИЦИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ОБЪЕКТА

Для экстрагирования пестицидов из растительного объекта часто г меняют следующие методы:

- гомогенизирование в течение 20 мин. в среде экстрагента щ скорости вращения гомогенизатора 5-6 тыс. об/мин.;

-встряхивание пробы с экстрагентом и настаивание в течение 23 час;

-экстрагирование в аппарате Сокслета в течение 2-4 час. При проведении экспериментов измельченный объект помещали в делительную воронку и проводили извлечение пестицида с растворителем, объем которого занимал около 2/3 делительной воронки.Скорость взбaJ тывания воронки устанавливали в таких пределах, чтобы мелфазное рав? весие достигалось в течение 2-5 мин.после прекращения взбалтывания.I истечении времени экстрагирования органический слой отделяли, а эксч ракцию повторяли еще несколько раз.Все извлечения объединияли и оргг ческий растворитель отгоняли с помощью ротационного испарите Сухой остаток растворяли в небольшом количестве этанола и сначг хроматографировали вначале колонке, а затем в тонком слое сорбе? Элюат упаривали до небольшого объема ( 1-2 мл т.о.) и проводш анализ на наличие изучаемого пестицида по рекомендованным методик! Результаты полученных опытов показали, что в извлечении, полученном растительного объекта, можно идентифицировать пестицид всеми рек( мендованными методиками.

Рекомендованная методика экстракции пестицидов из растительного объекта позволяет выделять пестициды с достаточно высоким выходом. ; Изолирование пестицидов из объектов животного происховдекия Нами были подвергнуты сравнительному изучению четыре метода :

изолирования Стаса-Отто, A.A. Васильевой, В.Ф. Крамаренко и перегон- '

[

ка с водяным паром) с целью выявления оптимального метода примени- | тельно к анализу пестицидов. Объектом исследования служила искусст- ; венная смесь мелко измельченной печени или келудка с содерзкимкмив них \ изучаемыми пестицидами.Результаты опытов по применению методов изоли- : рования перегонкой с водяным паром, изолирования подкисленной водой ( A.A. Васильевой), подкисленным спиртом (Стаса-Отто), водой, подкисленной серной кислотой ( В.Ф. Крамаренко), представлены в таблице 2.

таблица 2

Изолирование пестицидов из биологического объекта различными методами ( к 100 г объекта добавлено 25 мг вещества) !

Изолирование пестицидов различными матодами Изолировано,% (среднее из 5 опытов)

ТМТД тхфм Линдан Тодуин Этоксилин

Стас-Отто 1,20 - _ 4,92 5,26

А.А.Васильевой 3,04 - 3,б0 - -

В.Ф.Крамаренко 4,74 - 6,72 12,60 10,40

перегоки с

водяным паром - 72(тхф) 65.43 11,60 8,24

Рекомендованный 28,00 34,10 65,43 63,80 54,60

Как видно из таблицы,ТЫТД не изолируется методом перегонки с водяным паром и недостаточно изолируется остальными методами, что объясняется его нелстучестью, а тагске малой раствори,гостью в воде. ТХ<Ш в нативной форме не изолируется методом перегонки с водяным паром, продукт деструкции трихлорфенол перегоняется с водяним паром и обнару-хивается некоторым рекомендованными методами анализа(ТСХ, ГЯХ и ВЭЖХ).

Обнаружить медь при этом не удается. ТХГЭД в нативном виде изолируете методом Стаса- Отто около 2%, по методике В.Ф. Крамвренко- около 4% Линдан хорошо изолируются перегонкой с водяным паром.

Если необходимо анализировать ТХФН в нативном виде, то потр( буется разработка методики изолирования настаиванием с такими оргаш чесними растворителями,как и ТМТД, толуин, этоксилин. Линдан после ] регонки с водяным паром обнаруживается и определяется по рекамендо-ванными методиками. Дальнейшая работа было проведена по разработке оптимальных условий выделения ТМТД.ТХФМ, толуина и этоксилин: методом настаивание с органическими растворителями. Эксперлменталы установлено, что для выделения ТМТД целесообразно использовать смес н-гексан-хлорсформ (3:2); для ТХФМ, фентиурама смесь хлороформ-этап (1:1), для толуина и этоксилина смесь хлороформ-ацетона (1:1). Резу, тэты изолирования изучаемых пестицидов рекамендоваными методики пр ставлены в таблице 2.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕСТРУКЦИИ ПЕСТИЦИДОВ ПРИ ХРАНЕНИЕ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ И ХИМККО- ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ОБЪЕКТЕ

В практике судебно-химической экспертизы при отравлении пестиц дами анализ проводят по рекомендованным методикам, которые не по воляют определять все 100$,пестицида,имеющегося в биологическом объ те.Причиной этого является осуществление многочисленных операций пр химико-токсикологическом исследовании (изолирование,экстракция,очис ка,разрушение и др. процессы), в результате которых происходят боль шие потери исследуемого вещества. Следует также учесть, что исследо вания никогда не направлялись на определение начального количества токсического вещества, вызывавшего отравления. В связи со сказанным мы поставили перед собой задачу изучить закономерности деструкции

ядохимиката в различных объектах и, исходя из этой закономерности, разработать коэффициент, позволяющий определить истинное (начальное) количество пестицида в объекте после длительного хранения ( например,-в случае переэкспертизы или выяувденнего опоздания с анализом и т.д..). После установления истинного количества пестицида в объекте мокко теоретически определить его минимальное количество, принятое или введенное в организм, которое достоверно указывает на интоксикацию. Такой подход не был поставлен в основу работы при анализе судебно-хими-ческих объектов. Обычно ограничивались определением ядоеитого вещества только в каком-либо исследуемом органе ( объекте),что не отражало У полЬную картину прошедшего отравления.

Как показали наши исследования, 50 мг ТХФМ, добавленного к 100 г печени, обнаруживался всеми предложенными качественными реакциями в вытяжках из биологического материала, хранившегося в течение 10 суток. Если биологический материал хранился в течении 20 суток , то ТХФМ обнаруживался лишь методом хроматографии в тонком слое сорбента' (определялся в нативном виде). ТМТД сохранялся и обнаруживался в те-чене 5 суток. В этот период ТМТД могло обнаруживать методами ТСХ и спектрофотометрии. Линдан, толуин, этоксилин обнаруживается всеми ре-камендованными методами анализа.

Изучение влияния консерванта на сохраняемость пестицидов в биологическом материале. Изучение проводилось следующим образом: пробы ^ 100 г измельченного биологического объекта,содержащего определенного 17 количество пестицида, заливали этанолом до полного покрытия жидкостью твердых частиц объекта. Смесь биологического материала с изучаемыми пестицидами и этанолом сохраняли при комнатной температуре (+18-20°С) в течение 12 месяцев.

По истечении определенного времени хранения проводили изолиро-

вание пестицида по рекомендованным методиками изолирования. В получ них вытяжках поцле соответствующих методик очистки (в случае необхо мости) обнаруживали и определяли изучаемые пестициды с помощью р работашшх методик.

Расчет поправочного коэффициента (Кд) при определении пестицидо] при длительном хранении в пробах растений и объектах животного

происхождения

Для оптимальных вариантов опыта потери, возникающее при дли

тельном хранении, учитывали с помощью апроксимации графических инте

претаций зависимости C=i(t). Были найдены математические выражени

функции в виде у=Г(х)(таблица 3).Рассчитав изменения у(С) при хране

X(t) дней (табЛ1ща 3-4), можно определить содержание препарата в ан

лизируемой пробе Сист на момент отбора образца для анализа'.

__ 0,-100 , (1) иист- , у

где - Сх- содержание препарата в пробе через X(t) дней посла ото ра, мг/кг

у - изменение концентрации препарата за X дней, найдено таблице 3-6.

Если отнопение 100/у выразить в виде поправочного коэффициент Ид- то выражение (I) примет следующий вид:

°ист =кп'сх (2) Поправочный коэффициент может быть найден из таблицы 4-6.

Таблица 3.

Значение функции у = i(X),& для оптимальных способов хранэние образцов

Сроки хранения образцов, дни ТМТД • ТХФМ ■

биологич. объект расти- • тельный объект биологич. объект растительный объект

с консервацией без консер с консервацией без консер

I 27,12 23,43 '53,43 27,41 33,84 59,88

3 26,87 11,55 53,08 27,28 28,09 59,38

5 26,63 0,32 52,69 27,12 22,38 58,88

10 26,02 - 51,72 26,72 8,08 57,65

30 23,59 - 47,82 25,12 - 52,70

60 19,96 - 41,96 22,72 - 45,27

90 16,31 - 36,11 20,32 - 37,85

180 5,37 - 18,54 13,11 - 15,57

210 1,73 - 12,69 10,71 - 8,15

Таблица 4.

Значение коэф^лцентов пересчета (Кп ), содержание пестицидов в зависимости от сроков сохранения

Сроки хранения образцов, дни ТМТД (Кп) ТХ1М (Кд

биологич. объект растительный объект биологич. объект растительный объект

с консервацией без консер с консервацией без консер

I 3,69 4,26 1,87 3,64 2J29 1,67

3 3,72 8,66 1,88 3,66 3,55 1,68

5 3,75 - 1,89 3,68 4,46 1,70

10 3,84 - 1,93 3,74 12,38 1,73

30 4,23 - 2,09 3,98 - 1,90

60 5,01 - 2,38 4,40 - 2,21

90 6,13 - 2,77 4,92 - 2,64

180 18,62 - 5,39 7,62 - 6,66

210 57,80 - 7,88 9,34 - . 12,27

Применение поправочного коэффициента (Кп) при изучение распределения пестицидов во внутренних органах отравленных животных Для направления на химико - токсикологический анализ внутренш органов на наличие токсикологически важных веществ,являющихся при1 отравления, необходимо зкать ориентировочное распределение ! веществ в органах и тканях организма. Кроме этого вызывает большой трес проверить пригодность разработанного подхода к методике при а] лизе пестицидов в примере отравленных животных,тем более дока: правилность коэффициентов поправки, которые дают возможность найт: истинное количество изучаемого вещества. Такой подход дает бо фундаментальные результаты при химико- токсикологической эксперта Для этого мы провели следующие опыты над животными.

Кроликам в желудок вводили через зонд пестицид в виде суспенз хлопковом масле (ТМТД, ТХФМ, линдан,толуин,этоксшмн) в количества два раза превышающих Ы?50 ( для ТМТД-1,0 г/кг, для ТХФМ-0,2 г/кг, лшдана-0,4 г/кг, толуина 2,5г/кг и этоксшмна 2,5г/кг).После вскр животного (в случае,если не наступал смертельная исход, то жиеотно бивали и вскрывали через 24час) на исследование брали внутренние с ны и ткани, а также рвотные массы, мочу, экскремент и др. Объекты взвешивали, затем исследовали с помощью разработанных нами метода Применение разработанных методик анализа при проведении судеС химической экспертизы органов людей, отравленных фентиурамс Разработанные нами методы обнаружения и определения ТМТД, та и линдана в биологическом материале, апробированные при анализе ве ренких органов отравленных животных, были использованы для ана! экспертных объектов, изъятых из трупов людей, и показали свою приг ность. В приложении приводится в сокращенном виде текст двух акте

N429 и N430-0 о судебно-химическом исследовании доставленных объектов (часть мозга,часть печени, часть сердца, часть легкого, желудок с содержимым, тонкий и толстый кишечник, одна почка). В приводимом приложении к диссертации,показано, что ТХФМ.ТМТД и лин^ан достоверно определялись рекомендованными методами анализа. При этом найденное количество пестицида отражало только содеряаниеего в объекте, что не является истинным содержанием, так как не учитывала потеря пестицида во время анализа, деструкция пестицида в организме, связанная со вре-менем хранения объекта до начала анализа и др. Разработанный нами расчета с учетом коэффициента поправки, основанного на закономерности деструкции пестицидов в различных объектах (биологическом, растительном, с использованием консервантов или без них), достоверно решает все указанные' проблемы и позволяет получить научно обоснованные результаты.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Результаты выполненных исследований позволили скормулироъать и обосновать новые научные положения, определяющие применение комплексного анализа пестицидов для стандартизации и контроля качества лекарственных растений и продуктов их переработки, приемлемость и приоритет этих методов при химико-токсикологическом анализе биообъектов ( кровь, моча, печень, почки и др.).

2. На основании изучения лекарственного растительного сырья ис-

ттп РЪ'ЭУАНЛТО т> ^.отчц/^тпги л^ллилиаца г>

проведении химико-токсикологических исследований на наличие пестицидов в указанных объектах и прикрепить с НТД введением этого требования Фармокапсйный статьи, и т.д.

3. Выложенными исследованиями полонено начало методологически целенаправленным экологическим исследованиям на наличия пестицидов, а

также законодательному формулированию требований на качество лекарственного растительного сырья и продуктов его переработки.

4. Предложено значительное расширение области практического при нения физико-химических инструментальных методов анализа (ГЖХ, ВЭН ГХ-МС, УФ-, «¡{-спектроскопия, атомно-абсорбционная спектрометрия) i целей хкмико-токсикологического анализа пестицидов в лекарствен! растительном объекте и объекте животного происхождения ( при суде но-химических экспертизах).

Ь. Разработан комплекс методов анализа для 6 пестицидов и прод; тов их деструкция ( метаболитов), выделенных из лекарственного рас1 тельного сырья и продуктов его переработки, а также из судебно-хм ческих объектов животного происхождения( кровь, моча, печень, поч: желудочно-кишечный тракт и др.).

6. Проведено сравнительное изучение изолирования 6 пестицидов тодами подкисленной спиртом (Стаса-Отто),подкисленной водой(А.А Ва евой В.Ф. Крамаренко) и перегонкой с водяным паром. Изучена экстра пестицидов растительного объекта и водного раствора с органическим •растворителями.Разработано и усовершенствовано методики выделение TXSM, линдана.фентиурама, толуина и этоксилина из объектов растите ного и :кивотного происхождения(судебно-химические объекты) происхо нив. Составлено схема химико-токсикологического исследования изуча пестицидов.

7.Изучена сохраняемость ТМТД.ТХФМ.линдана, толуина и этоксщ по мере гниения трупного материала, установлено, что многие изучае пестицида под влиянием гнилостных процессов быстро разрушаются, и нативной Форме не выделяется. Поэтому применили этанол как консерь который пролонгирует сохраняемоеть изучаемых пестицидов.

8. Изучены закономерности кинетики деструкции пестицидов вс

изучаемых пестицидов в растительном сырье и судебно-химических объектах (печень, почки и др.). Исходя из этого, научно-обоснованным исследованиями разрешены закономерности кинетики деструкции пестицидов з различных объектах.

9. Впервые использована кинетика деструкции по данной методике, рекомендован коэффициент поправки (Кп), позволягяций пересчитывать полученный результат судебно-химической экспертизы на истинное количество пестицида в объекте после определенного времени хранения объекта (с учетом потерь при экстракции, очистке, учесть влияние хранение, и т.д.). Эти расчеты дают возможность ориентировочно определить колкчес-во введенного ядохимиката, что и доказано при искусственном отравлении подопытных кроликах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Зайнутданов Х.С., Тадаиев М.А., Икрамоз Л.Т.-Новые реакции ■ обнаружения тетраметилтиурамдисульфида для анализа биообъекта'// Материалы второго съезда фармацевтов Узбекистана. Сборник научных трудов. - Ташкент, 1932. - с. 180-182.

2. Зайнутдннов Х.С.,Тадкпев И.А..Икрамов Л.Т. Анализ тетраметилтиурамдисульфида в биологическом объекте //Актуальные вопросы судебко -медицинской экспертизы вещественных доказательств: Сб.научн.тр. -Ташкент; ТашГосШ, 1934 -С.72-76.

3. Зайнутданов X.С.,Икрамов Л.Т.Изучение влияние этанола как консерванта на сохраняемость трихлорфенолята меда в трупном материале// Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств :Сб.научн.тр.-Ташкент,1986. -С.57-61.

4. Зайнутданов Х.С., Икрамов Л.Т.-Экстракция трихлорфенолята меди из водных растворов органическими растворителями // Судебно-медицинская экспертиза. - 1986. - N 2. -. С. 50-51.

5. Зайнутданов Х.С., Шрамов Л.Т.Сравнительное изучение методов изолирования трихлорфенолята меди при судебно- химическом исследовании биологического материала// Суд.мед.эксперт.-1936. - N4.-052-53.

6. Тадаиев М.А., Зайнутдинов Х.С., Икрамов Л.Т.. Чернявская - Микрокристаллоскопические реакции для обнаружения тетраметилтиура дисульфида (ТМТД) // 'Диагностика давности процессов в объек судебно-медицинской экспертизы. Сборник научных трудов. - Кишинев, Штиинца, 1986. - С. 132-134.

V. Зайнутдинов Х.С., Икрамов Л.Т. - Обнаружение трихлорфзнолят меди в биологическом объекте //Современные лабораторные методы иссл дования объектов судебно-медицинской экспертизы. Сборник научных тр дов Ташкент. - 1986. -С 42-46.

8. Зайнутдинов X.С.,Икрамов Л.Т. Методические рекомендации определению трихлорфенолята меди при судебно-химическом исследован трупного материала.-Ташкент,1987. -С I-I2.

9. Зайнутдинов X.С.Сохраняемость трихлорфенолята меди при гн лостном разложении трупного материала//Тез.докладов III Съезда фармацевтов Узбекистана:Сб.научн.тр.-Ташкент,1987.-CI40-I4I.

10. Зайнутдинов X.С.Ориентировочное распределение тетраметилти рамдисульфида(ТМТД) в органах отравленных животных//Тез.доклодов III съезда фармацевтов Узбекистана:Сб.науч.тр.Ташкент,1987.С.173.

11. Зайнутдинов Х.С. Выделение и очистка трихлорфенолята меди судебно-химическом исследовании загнившего биологического объе та//Химия .технология и фармакология ф:изологически активных ъ ществ:Сб. научн.тр.,Ташкент,- IE68,-C.42-46.

12. Зайнутдинов Х.С..ИкрамовЛ.Т.Анализ трихлорфенолята меда судебно-химической экспертизе трупного материала // Суд.-мед.si перт.-1938.-И ,3.-42-43.

13. Зайнутдинов Х.С..Икра.тав Л.Т. Изучение сохраняемости тетр? тилтиурамдисульфида/ТМТД/ при гнилостном разложении трупного матера ла//Ш съезд фармацевтов Туркм.ССР:Тез.докл. Ашхабад, 1989.-С.251-2

14. Зайнутдинов Х.С., Икрамов Л.Т., Изучение влияние этанола, консерванта на сохраняемость трихлорфеноляята на сохраняемость Tpv хлорфенолята меди в трупном материале.// Актуалны© вопросы судес медицинскаой экспертизы вещественных доказательств. Сборник научнш трудов., Ташкент, 1989 г. -С.

15. Зайнутдинов Х.С., Икрамов Л.Т., Определение трихлорфеноля1] меди методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии.// Мекдународнь научный симпозиум " Экологические аспекты в фармации", Москва, II-июня 1990 г. -С.

16. Зайнутдинов Х.С.,Икраммов Л.Т-., Вергейчик Т.Х. Определение

тетраметилтиурамдисульфида и трихлорфенолята меди в трупном материале методом производной спектрофотометрии.// Судебно- г .мед-ская экспертиза. 1990, N 4, -С27-30

17. Юлдашев З.А..Зайнутдпнов Х.С., Попков В.А. Газохроматографи-ческий анализ толуна. Тезиси докладов научно-практической конференции по теме: "Повышение качества лекарственного обеспечения населения и учрезденкй здравоохранения республики" .Ургенч.1990. -С.116

18. Зайнутдинов Х.С. Спектрофотометрический метод определения трихлорфенолята меди при судебно-химическом исследовании.// Актуалные вопросы судебно-медицшский экспертизы вещественных доказательств . .Сборник научных трудов.Ташкент.1990. -С. 50-54.

19. Зайнутдинов Х.С.,Икрзмов Л.Т.,Гиясов З.А. Судебно-химические исследования тетраметилтиурамдисульфида и трихлорфенолята меди.//Проблемы судебно-медицинской экспертизы.Сборник научных трудов.Выпуск 9 Алма-Ата.1991.-С.244-246.

20. Зайнутдинов Х.С..Муслимов, М.К.,Надыров Д.А..Субхаккулов М. Махкамов Д..Ккрамов Л.Т., Случай отравления фентиурамом.//Суд.- мэд. эксперт. - 1991. - N4. - С. 52-53.

21. Зайнутдинов Х.С., Экалогия в фармащи-актуальный вопрос медицины Узбекистана.// Краткие тезисы докладов I Съезда молодых учекных-медиков и врачей Узбекистана..Андижан,-1991,-С. 383-384.

22.Зайнутдинов Х.С.,Икрамов Л.Т. Химжо-токсикологичческое исследование внутренных органов животных отравленных трихлор1енолята меди //Состояние и перспективи развития фармации в Сибирии и на Дальнем Востоке. Тез.док.конференции 50-летию фармфакультета. Томск,-1991,-С. 63-64

Яя^ТПП1 тггип'о У П ТТлгтт/по Т* Л Т^'помгхтэ Я Ф Мол тттгглптэяцтт пЛ—

К»».« • • ^ • | 114/1X1 кЧЛ^ • /1 • I ип^ишои «1а X • пии^их^^иинии « и ^

наружение и определение тетраметилтиурамдисульфида и трихлорфенолята меди.// Состояние и перспективи развития фармации в Сибирии и Дальнем Востоке. Тез. док. конференции 50-летию фармфакультета. Томск,-1991, -С. 132-133.

24. Зайнутдинов Х.С., Попков В.А., 'Лчрамов Л.Т., Садиков 3.^. Методические рекомендации по анализу тетраметилтиурамдисульфида из биологическом объекте., Ташкент,1991, изд."Унверситет".-С.1-18.

25. Зайнутдинов Х.С., Еремин С.К., Попков В.А., Икрамов Л.Т.Определение трихлорфенолята меди методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии.// Судебно-медицинская экспертиза.1991, N 4, -С.

26. Зайнутдинов Х.С., Попков Б.А., Икрамов Л.Т. Свойства.токси ностъ,приминание тетргметилтиурамдисульфида и трихлорфенолята меди их анализ в различных объектах. Ташкент, 1991. изд. " Унверситет" -С. 1-32.

27.