Разработка методических подходов к гигиенической оценке новых источников пищевых веществ

Чернышева, Ольга Николаевна

Диссертации по медицине → Гигиена

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Разработка методических подходов к гигиенической оценке новых источников пищевых веществ

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Чернышева, Ольга Николаевна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.07

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка методических подходов к гигиенической оценке новых источников пищевых веществ

на правах рукописи

Чернышева Ольга Николаевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

К ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ НОВЫХ ИСТОЧНИКОВ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ

14.00.07.-гигиена

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории по изучению новых источников пищевых веществ ГУ научно-исследовательского института питания Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Доктор медицинских наук,

профессор,

академик РАМН

Тутельян Виктор Александрович

Доктор химических наук

Эллер Константин Исаакович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор,

академик РАМН

Ракитский Валерий Николаевич

Доктор биологических наук, профессор

Малышева Алла Георгиевна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

на заседании Диссертационного . . . г,. , ологии

человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН по адресу: Москва, ул. Погодинская, д.10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (119992, Москва, ул. Погодинская , д.10/15, строение 1)

Защита диссертации состоится

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В настоящее время одной из глобальных задач является решение проблемы увеличения продовольственных ресурсов, актуальной не только для развивающихся, но и для развитых стран, включая Россию.

В долгосрочной стратегии по обеспечению продовольственной безопасности Российской Федерации приоритетное место занимает устойчивое развитие сельского хозяйства и других отраслей агропромышленного комплекса, что нашло отражение в «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации на период до 2005 г» принятой Постановлением Правительства Российской Федерации от 10 августа 1998 г. № 917.

Центральная роль в покрытии мирового дефицита пищи отводится интенсификации сельскохозяйственного производства путем совершенствования методов селекции и внедрения новых технологий. Для создания высокопродуктивных и сбалансированных агросистем, обеспечивающих значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур и продуктивности животных требуются качественно новые подходы. Одним из перспективных решений этой задачи является использование биотехнологий и поиск новых нетрадиционных источников пищи.

Современная биотехнология позволяет во многих отраслях промышленности заменить традиционные методы получения пищевых продуктов, биотехнологическими процессам, такими как выращивание дрожжей и бактерий с целью получения аминокислот, витаминов, ферментов и белка одноклеточных (Тутельян В .А., 2003; Шевелуха B.C., 2003; Ладур Т.А, 2003). Выход на новый уровень эффективности с/х производства путем коммерциализации достижений биотехнологии позволяет улучшить качество продовольствия, обеспечить нужный темп прироста урожайности при минимальном ущербе окружающей среде (Уланова Р.В., 2003; Мелик-Саркисов С.О., 2005).

Общая площадь возделывания биотехнологических с/х культур в мире постоянно увеличивается, что приносит заметные социальные и экономические преимущества для потребителей и общества в целом, обеспечивает более устойчивое развитие окружающей среды и улучшение здоровья граждан (James С., 2005). В настоящее время более 900 линий ГМ растений, относящихся более чем к 50 видам, созданы и доведены до испытаний в полевых условиях (Chripeels M.J., 2002; James С., 2005), при этом более 100 линий ГМ растений допущено к промышленному производству (FDA, USA, 2005). В Российской Федерации 15 линий ГМ культур разрешены для использования в питании.

Значительный материал, накопленный, как отечественными, так и зарубежными исследователями, подтверждает перспективность методов микробиологического синтеза в решении задачи увеличения общих белковых ресурсов за счет производства белка одноклеточных на нетрадиционных субстратах; углеводороды нефти и продукты их переработки, этиловый и метиловый спирты, природный газ и др., путем выращивания на них различных видов дрожжей и бактерий, что способствует созданию кормовой базы для развития традиционного животноводства (Покровский A.A., 1972; Волгарев М.Н., 1984; Эрнст Л.К., 1988; Суясов H.A., 2003).

Задача обогащения рациона человека может быть решена также путем дальнейшего рационального и эффективного освоения разнообразных биологических ресурсов Мирового океана (Майструк П.Н. и др., 1984).

Медицинские аспекты проблемы изыскания и использования новых пищевых ресурсов связаны как с оценкой их пищевой и кормовой ценности, так и с гарантиями безопасности нетрадиционных источников пищи (Покровский В.И., 2002). В связи с этим, наряду с использованием общепринятых химических, токсикологических и других гигиенических исследований, большое внимание уделяется оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или из нетрадиционных источников.

Потенциальная опасность при создании новых видов кормового белка микробиологического происхождения, заключается в возможности накопления в составе биомасс компонентов субстрата, в частности, необычных (бактериальных) жирных кислот и ароматических углеводородов нефти (Алимова Г.А., 1980; Балахонцева В.Н., 1984). Жирные кислоты бактериальных биомасс, полученных на основе микробных продуцентов, отличаются постоянством структуры и не метаболизируют в организме человека. Ароматические углеводороды являются приоритетными загрязнителями, как в списке всемирной организации здравоохранения (WHO, 1998), так и в Российской Федерации (ГН 1.1.725-98). Глобальное загрязнение водных акваторий и суши химическими поллютантами приводит к накоплению в объектах окружающей среды и биосредах, в том числе гидробионтах, техногенных загрязнителей (токсичные элементы, пестициды, ароматические углеводороды) (Осадчая Т.С., 1995; Малышева А.Г., 2003 г.; Ракитский В.Н., 2003, 2004). Систематическое потребление контаминированных продуктов ослабляет защитные возможности организма, снижая антитоксическую функцию печени, почек, легких, кожи, провоцируя образование канцерогенов и коканцерогенов в организме (Онищенко Г.Г., 2003; Ракитский В.Н., 2005).

Создание новых видов рекомбинантных генов, ранее отсутствовавших в природе, бесконтрольное применение генно-инженерных технологий при создании новой пищи, может привести к выходу на рынок пищевой продукции, представляющей опасность для здоровья человека, что обуславливает необходимость оценки безопасности и разработки методов контроля за данной продукцией, в том числе, и при случайном или преднамеренном выпуске в окружающую среду новых видов генно-инженерно-модифицированных растений. (WHO, 2002; Тутельян В.А., 2003; Шевелуха B.C., 2003).

При гигиенической оценке реальных последствий воздействия нетрадиционных источников пищи на здоровье человека принципиально важен поиск и обоснование гигиенически значимых показателей этой оценки. Развитие современных гигиенических проблем не может быть полным без научно-методического и критериального обеспечения медико-биологического мониторинга с учетом установленных приоритетных загрязнителей и маркерных веществ в объектах среды и организме, формирования интегральных оценок, основанных на показателях риска поступления вредных веществ в организм человека в условиях комплексной техногенной нагрузки. В связи с этим, особую актуальность приобретает разработка и совершенствование методических подходов к контролю за новыми технологическими процессами производства и к оценке качества вновь вовлекаемых в сферу использования человеком новых биологических объектов и веществ для минимизации неблагоприятного воздействия на здоровье человека.

Цель исследования

Целью исследования явилась разработка методических подходов к оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пищи.

Задачи исследования:

^ 1-Определить основные гигиенически значимые показатели безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пищи.

2.Разработать метод идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования остаточных нефтяных углеводородов в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма дрожжи, выращенные на нефтяном субстрате, а также в тканях гидробионтов.

3. Разработать метод идентификации специфических (бактериальных) жирных кислот: в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования специфических (бактериальных) жирных кислот в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы.

4. Разработать методические подходы к гигиенической оценке пищевой продукции из генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения. Изучить возможность использования в качестве маркеров генетической модификации регуляторные последовательности, целевые гены и трансформационные события. Изучить возможность использования разработанных методических подходов для определения ГМО растительного происхождения в пищевой продукции, имеющей генно-инженерно-модифицированные аналоги (в т.ч., со сложным ингредиентным составом, подвергнутой глубокой технологической обработке).

Научная новизна работы

Разработан метод количественного определения углеводородов в биологических объектах с помощью хромато-масс-спектрометрии и УФ-спектрофотометрии.

Впервые с использованием разработанного метода изучен групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате.

Впервые проведен детальный анализ углеводородного состава тканей лабораторных и с/х животных, получавших дрожжи «паприн» в составе корма.

Показано, что использование в качестве кормовой добавки «паприна» приводит к аккумулированию в жировой ткани и печени животных ароматических углеводородов, характерных для нефтяного субстрата дрожжей.

Установлена идентичность группового и гомологического состава фракции ароматических углеводородов гидробионтов и нефтепродуктов, загрязняющих акватории.

Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах.

Впервые с использованием разработанного метода изучен состав фракции жирных кислот бактериальных биомасс.

Впервые проведен детальный анализ жирнокислотного состава тканей лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы.

Показано, что использование в качестве кормовой добавки бактериальных биомасс приводит к аккумулированию в жировой ткани и печени животных специфических (бактериальных) жирных кислот.

Стандартизованы и унифицированы методы индикации, идентификации и количественного определения рекомбинантной ДНК в продовольственном сырье и в пищевых продуктах (в т.ч. многокомпонентных и подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанные на использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и позволяющие выполнять контроль за пищевой продукции, произведенной из сырья растительного происхождения, имеющего ГМ аналоги.

Для мониторинга за ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и пищевой продукции применен метод идентификации рекомбинантной ДНК с использованием праймеров на регуляторные последовательности, маркерные и целевые гены, трансформационные события.

Унифицированы и стандартизованы методы идентификации трансформационных событий, прошедших регистрацию в РФ, в пищевых продуктах, произведенных из ГМО растительного происхождения, позволяющие осуществлять пострегистрационный контроль.

Практическая значимость работы

В практику здравоохранения внедрены высокочувствительные инструментальные методы анализа пищевых продуктов (Авторское свидетельство № 1337764, 06.08.1984 г. Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах; Авторское свидетельство №232606, 03.02.1986г. Способ определения состава жирных кислот в микроорганизмах; Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных и moho-, би- и три-, ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах № 4721-88 МЗ СССР; ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения»; Методические указания МУК 4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции»; Методические указания МУК.4.2.1913-04 «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания»).

На кафедре гигиены питания и токсикологии Медико-профилактического факультета послевузовского профессионального образования Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова диссертантом проведена подготовка специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека из всех регионов Российской Федерации и административных округов г. Москвы по теме «Генетически модифицированные источники пищи (ГМИ): методы лабораторного контроля».

Основные положения, выносимые на защиту

Разработан метод количественного определения насыщенных, moho-, би-, три-и ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах, позволяющий определять групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов, являющихся приоритетными загрязнителями, как в списке Всемирной организации здравоохранения (WHO, 1998), так и в Российской Федерации (ГН 1.1.725-98). Показана зависимость степени аккумулирования ароматических углеводородов в тканях лабораторных животных от количества дрожжевого белка в составе рациона.

Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах, позволяющий идентифицировать специфические жирные кислоты, характерные для бактериальных биомасс в биоматериале. Показано, что при включении в рацион биомассы «гаприн», в жировой ткани и печени лабораторных животных происходит достоверное накопление изомеров гексадеценовой кислоты (Д10, Д11) в отличие от контроля.

Использование унифицированных и стандартизованных методов индикации, идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и в пищевых продуктах сложного ингредиентного состава (в том числе, подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанных на детекции рекомбинантной ДНК с использованием метода ПЦР, позволяет выполнять контроль за пищевой продукцией, произведенной из ГМО растительного происхождения.

Апробация работы

Материалы и основные положения доложены и обсуждены на Научной конференции «Теоретические и практические аспекты изучения питания человека» (Москва, 1980); «Окружающая среда и здоровье населения» (Таллинн, 1984); на IV Всесоюзной конференции по масс-спектрометрии (Сумы, 1986); на V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа химических реактивов (Юрмала, 1987); на Всесоюзной научной конференции «Совершенствование ветсанитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК» (Москва, 1988); на I Всесоюзной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 1989); на Всесоюзном симпозиуме «Белковые продукты микробиологического синтеза: анализ качества, медико-биологическая оценка и эффективность применения в сельском хозяйстве» (Москва, 1989); на Симпозиуме «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» (Москва, 2003); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Указатель литературы содержит 103 отечественных и 103 зарубежный источника. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, включает 62 таблицы, 43 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились: новые виды кормового белка микробиологического происхождения (дрожжи «паприн», род Candida, выращенные на жидкой парафиновой фракции нефти, биомасса «гаприн», штамм продуцента Methylococcus capsulatus, ВСБ 874, выращенная на природном газе, бактериальная биомасса «меприн», штамм продуцента Methylobacills-methylophilus ВСБ-792, выращенная на синтетическом метаноле), продукты животноводства и рыбоводства, полученные с использованием новых видов кормового белка, мидии из черноморской акватории, продовольственное сырье и пищевые продукты, произведенные с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги.

Выделение углеводородов и жирных кислот из биоматериала осуществляли путем мягкого щелочного гидролиза с последующей экстракцией и фракционированием. Анализ фракций ароматических углеводородов осуществляли с использованием хроматографических методов исследования: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), колоночная хроматография (КХ), газо-жидкостная хроматография (ГЖХ), газо-хромато-масс-спектрометрия (ГЖХ-МС), УФ-спектрофотометрия, спектрофлюориметрия. Для анализа смесей жирных кислот использовали ГЖХ и ГЖХ-МС - анализ метиловых эфиров жирных кислот и их производных.

Вьщеление ДНК осуществляли методом, включающим инкубацию пробы в присутствии детергента (гексадецилтриметил-аммоний бромид), экстракцию хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом. Для идентификации рекомбинантной ДНК применен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий получить многочисленные копии искомой ДНК в циклическом ферментативном процессе (амплификация). Визуализацию результатов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле.

ГЖХ- анализ углеводородов и метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) проводили на хроматографах с пламенно-ионизационным детектором: «Биохром-1» с капиллярной кварцевой колонкой 30м х 0,25мм с SPB-5 (полибисцианопропйл силоксан); «Цвет-106» со стеклянной карбонизированной колонкой 50м х 0,25мм с ДЭГС (диэтиленгликольсукцинатом) в качестве жидкой неподвижной фазы.

УФ-спектры растворов ароматических углеводородов получены на двухлучевом сканирующем спектрофотометре «Hitachi-124». Спектры поглощения в спектрально чистом гексане записывали в области 360-210 нм.

Спектры возбуждения и эмиссии растворов аренов получали на сканирующем спектрофлуориметре «Perkin-Eimer MRF-44A».

ГЖХ-МС- анализ проводили на хромато-масс-спектрометре «Finnigan 3200 F» с автоматической системой обработки данных с капиллярной кварцевой колонкой 47м х 0,3 мм с химически связанной жидкой фазой для разделение углеводородов - SE-52 (диметилфенилсилоксан с 5% фенильных групп), для МЭЖК - SE-30 (диметилполисилоксан).

ПЦР анализ осуществляли на амплификаторе «iCycler™» фирмы «Bio-Rad» (США) и «АНК-16» ИАнП РАН (Россия), температурный диапазон 4-100 °С,

скорость нагрева/охлаждения активного элемента 3,3/2 °С/сек, температурная однородность ± 0,3 °С, нагреваемая крышка.

При проведении скринингового анализа рекомбинантной ДНК для визуализации продуктов амплификации в агарозном геле использовали комплект оборудования для горизонтального электрофореза типа «Mini - Sub Cell GT System» фирмы «Bio-Rad» (США) и гель - документирующая система LabWorks фирмы Ultra-Violet Products Ltd, США.

Метрологическую оценку методов и полученных результатов проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Значимость расхождения результатов оценивали по критериям Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка методов анализа ароматических углеводородов

Источником контаминации ароматическими углеводородами пищевых продуктов может быть загрязнение водных акваторий нефтепродуктами, приводящее к накоплению экзогенных ароматических углеводородов в гидробионтах, а также остаточные количества этих углеводородов в биомассах дрожжей, выращенных на нефтяных субстратах (Градова Н.Б., 1971). Это определяет комплекс специфических задач, решаемых при токсиколого-гигиенической оценке этих новых кормовых средств и нетрадиционных пищевых продуктов, в частности, необходимость определять содержание и состав остаточных углеводородов в биомассе дрожжей, уровень возможного накопления этих соединений в тканях животных и, пищевых продуктах, полученных с использованием биомассы дрожжей.

Преимуществом разработанной схемы анализа ароматических углеводородов, особенно для дрожжей, является возможность извлечения внутриклеточных углеводородов и их концентрирование с помощь КХ и ТСХ.

Нами выполнена серия опытов по сравнению хроматографической подвижности и спектральных свойств различных углеводородов (алканы, гептадецилбензол, тетралин, нафталин, фенантрен, бенз(а)пирен и др.), как основных маркеров соответствующих фракций нефтяных углеводородов и основных компонентов неомыляемой фракции липидов тканей животных, на окиси алюминия и силикагеле. В опыте на модельной смеси соединений (фенантрен, бенз(а)пирен, бенз(а)антрацен, бенз(д)хризен) установлено, что полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) селективно выделяются из смесей с другими соединениями переэкстракцией из неполярных растворителей такими комплексообразователями, как ацетонитрил, диметилсульфоксид, диметилформамид. При этом, при использовании диметилформамида, степень извлечения этих ПАУ составляет соответственно 88, 92, 95, 95%. Эффективность введения этой стадии подтверждается существенным уменьшением содержания в экстракте мешающих примесей природных полиненасыщенных углеводородов из матрикса продукта.

На основании полученных данных была выбрана многостадийная схема (рис.1) выделения исследуемых групп углеводородов, позволяющая получить достаточно однородные по составу фракции углеводородов: насыщенные, моно-, би- и трициклические ароматические углеводороды.

Рис 1. Схема выделения из биоматериала и анализа насыщенных, moho-, би- и трициклических ароматических углеводородов и бенз(а)пирена.

Идентификацию исследуемых групп аренов проводили по характеристическим полосам в их УФ-спектрах: моноциклические арены 267-270 нм, бициклические арены 275 — 280 нм, трициклические арены - 255 нм и 290 нм. Количественное определение этих групп углеводородов осуществляли методом абсолютной калибровки по внешнему стандарту. Стандартами при построении градуировочных графиков зависимости оптической плотности растворов аренов от их концентрации явились фракции ароматических углеводородов, выделенные из образца дизельного дистиллята нефти.

Достоверную идентификацию компонентов фракций ароматических углеводородов проводили с помощью ГЖХ-МС (хроматограммы по полному ионному току, компьютерная реконструкция ГЖХ-МС хроматограмм по пикам молекулярных (М+) и специфических осколочных ионов). Определена структура компонентов гомологических серий углеводородов с формулой (С „ H 2п-р), где р = 6-20.

При определении методом ГЖХ-МС абсолютного количества насыщенных и moho-, би-, три- и ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах использовали внутренний стандарт. В качестве внутренних стандартов для фракций moho-, би- и трициклических аренов использовали соответственно гептадецилбензол, диметилнафталин и фенантрен. По полным ионным токам, 10

соответствующим внутренним стандартам (ПИТЕНСт.) и каждой группе углеводородов 0 - ¡Х '" к ПИТ ; С„ Н 2п-Р) с учетом коэффициента ионизации (8) и массы внутреннего стандарта ^ ст) рассчитывали массу углеводородов каждой группы.

По разработанной схеме были изучены образцы сала свиней, рационы которых содержали 7,5% (по массе рациона) дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате.

Таблица 1. Результаты анализа фракции ароматических углеводородов сала свиней методом ГЖХ-МС и УФ-спектрофотометрии (мг/кг массы образца)_

Определяемые группы Образец I Образец 2

ХМС УФ ХМС УФ

Моноциклические арены 2,7 ± 0,8 2,2 ± 1,0 5,6 ±1,7 6,2 ± 1,3

Бициклические арены 0,14 ±0,06 0,16 ±0,06 0,50 ± 0,08 0,53 ± 0,06

Трициклические арены 0,04 ±0,02 0,07 ± 0,03 0,09 ±0,04 0,12 ±0,04

п = 3,Р = 0,95.

Определение суммарного количества ароматических углеводородов в указанных фракциях с помощью ГЖХ-МС и УФ-спектрофотометрических методов показало хорошую сходимость полученных результатов (табл. 1), что свидетельствует о надежности использования экспрессного УФ-спектрофотометрического метода определения следов аренов в биологическом материале. Пределы обнаружения moho-, би- и трициклических аренов дизельных дистиллятов нефти в биоматериале составляют соответственно 3,9; 0,60; 0,10 мг/кг при относительном стандартном отклонении не более 0,20%. Для бенз(а)пирена предел обнаружения - 0,10 мкг/кг с учетом контрольного сигнала «холостого» опыта и его стандартного отклонения при относительном стандартном отклонении не более 0,28%.

Использование высокоселективной капиллярной ГЖХ и УФ-спектрофотометрии, а также ГЖХ-МС, позволило определять следовые количества нефтяных ароматических углеводородов в присутствии природных компонентов липидов.

Изучение содержания ароматических углеводородов в новых видах

кормового белка, выращенного на нефтяном субстрате, и продуктах животноводства и рыбоводства, полученных с использованием дрожжей

«паприн»

На примере новых видов кормового белка, полученного с использованием микробиологического синтеза: дрожжи, выращенные на дизельной фракции нефти и дрожжи, выращенные на очищенных парафинах нефти «паприн», изучен групповой состав ароматических углеводородов по разработанной схеме.

Анализ показал, что состав остаточных углеводородов дрожжей, выращенных на дизельной фракции нефти, практически совпадает с составом нефтяного субстрата и в значительной степени (около 10% от суммы углеводородов) представлен ароматическими углеводородами, в том числе moho-, би- и трициклическими аренами. Большую часть ароматической фракции остаточных углеводородов биомассы дрожжей, выращенных на очищенных парафинах нефти

«паприн», составляют высокомолекулярные алкилбензолы, относительно высока доля нафталинов, и в то же время значительно снижена доля нафтеноароматических соединений (табл. 2).

Таблица 2. Групповой состав ароматических углеводородов, выделенных из биомассы дрожжей, выращенных на дизельной фракции нефти, из биомассы дрожжей «паприн», из дизельной фракции нефти (% от суммы ароматических углеводородов).__

Группа углеводородов Объект исследования

«паприн» Дрожжи, выращенные на дизельной фракции нефти Дизельная фракция нефти

Светлоярский з-д Новополоцкий з-д

Алкилбензолы 42,0 58,3 27,0 21,0

Инданы (тетралины) 9,0 5,8 13,0 16,0

Динафтенбензолы 4,0 0,9 6,5 10,0

Нафталины 19,0 22,5 13,6 13,0

Аценафтены 2,0 6,4 8,1 10,0

Флуорены 4,2 1,8 5,9 9,0

Фенантрены 6,0 1,8 7,7 5,0

Нафтенофенантрены 0,1 0,1 1,4 1,5

Бензтиофены 9,0 1,6 10,6 10,4

Дибензтиофены 4,7 0,9 6,2 4,1

Анализ фракции ароматических углеводородов образцов «паприна», произведенного на различных заводах: Киришский БХЗ, Котовский ОПЗ БВК, Башкирский БХЗ, Кременчугский з-д БВК, Новополоцкий з-д БВК, - Светлоярский з-д БВК, Мозырский ЗКД показал, что состав остаточных ароматических углеводородов «паприна» очень вариабелен и зависит, прежде всего, от состава исходного сырья (табл. 3).

Таблица 3. Гомологический состав ароматических углеводородов образцов «паприна» (% от суммы ароматических углеводородов)._

Группа углеводородов Число атомов углерода в боковой цепи молекулы

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Алкилбензолы* 0,5 -11,2 0,5 -10,3 0,0527,8 5,731,9 9,822,5 6,636,2 2,423,8 1,028,4 1,08,9 0,152,9

Алкилинданы (тетралины)** 29,6" 28,0" 3,9 -7,7 7,810,8 10,519,6 9,519,9 3,520,2 3,412,5 8,8* -

Алкилнафтапины* 2,0 -4,6 7,0 -17,5 17,361,5 14,4 -29,7 4,820,2 2,014,8 0,814,2 0,36,3 0,2 х -

Фенантрены*** - - 10,316,0 30,345,0 24,230,7 8,119,7 2,08,5 2,7 х 2,4 х 1,2х

Бензтиофены х 28,6 12,1 3,7 - - - - - - -

Дибензтиофены * 33,7 34,6 7,8 1,6 0,1 - - - - -

*п=5 ; **п=2; ***п=3, п * =1 — число образцов «паприна».

Влияние кормового белка, полученного . с использованием микробиологического синтеза, на углеводородный состав тканей лабораторных и с/х животных, изучено на примере крыс и свиней, получавших в течение 18 месяцев изокалорийные сбалансированные рационы: контрольные группы -традиционный общевиварный, опытные - с включением кормового белка «паприн». Показано, что в жировой ткани и печени опытных животных аккумулируются ароматические углеводороды в количестве от. 0,10 мкг/кг (би- и трициклические арены) до 7,20 мг/кг (алкилбензолы).

ГЖХ-МС анализ узких углеводородных фракций, выделенных из свиного сала показал, что в их состав входят характерные для нефти, отличающиеся наличием большого количества изомеров, ароматические соединения: алкилбензолы, метил-, диметил-, триметилалкилбензолы, в т. ч. со специфической изопреноидной структурой, с числом атомов углерода 12 - 24 и максимумом распределения в области С]6 - Сгь нафтеноароматические углеводороды, относящиеся к группам индана и тетралина С]2 - С22 и максимумом в области С15- С2о ; алкилнафталины с 11-24 атомами углерода и алкилбензтиофены (С9Н8 - С22Н34); фенантрен и его ближайшие гомологи (Сц- С|8).

Хроматограммы, приведенные на рис.2, иллюстрируют изменения в составе ароматических и насыщенных углеводородов, выделенных из сала свиней, получавших традиционные корма и дрожжи, выращенные на нефтяном субстрате, с высоким содержанием н-алканов и небольшой примесью изо- и циклоалканов.

Рис. 2. Хроматограмма фракций алканов и циклоалканов из сала свиней, получавших: дрожжи «паприн» (А); дрожжи, выращенные на нефтяных дистиллятах (Б); традиционные корма (В).

Хроматограф «Биохром -1», стеклянный капилляр 30м х 0,25мм, 5РВ-5, Т испарителя =300°С, Т детектора=290°С, Т колонки: 120°С - 2мин., 8°/мин до 290°С, газ -носитель - азот 1,4 мл/мин., сброс 1:30

Анализ группового состава ароматических углеводородов сала свиней, получавших в составе корма дрожжи «паприн», показал, что в сале, как в нефтяном дистилляте и дрожжах, выращенных на этом субстрате, имеет место выраженное преобладание алкилбензолов по сравнению с долей би- и трициклических аренов (табл. 4).

Исследуемый образец Р (С„ Н2„.„ )

6 8 10 12 14 16 18 10 16

Свиное сало 80,4± 0,4 6,0± 1,3 7,5± 0,9 5,7± 1,7 0,7± 0,5 0,2± 0,0 0,4± 0,2 1,9± 1.0 0,2± 0.1

п=2, р=0,95

, При исследовании гушек прудовой рыбы (карпа), выращенной с ■использованием кормов, включающих различные продукты микробиологического синтеза, найдено, что содержание ароматических углеводородов в сумме углеводородов не превышает 10%, из них более 90% приходится на долю моноциклических аренов. Однако, включение в корма рыб достаточно высоких доз «паприна»: 10% и более (по массе), .может привести к накоплению в тканях рыб остаточных углеводородов дрожжей, в концентрации более чем на порядок превышающей природный углеводородный фон. Выходом их этой ситуации является использование в кормах сочетания различных продуктов микробиологического синтеза: углеводородных и гидролизных дрожжей. При этом уровень остаточных нефтяных углеводородов в рыбе соответствует практическому отсутствию в ней следов ароматических углеводородов (1-Змг/кг).

Изучение содержания ароматических углеводородов в тканях гидробконтов

Проведены исследования углеводородного состава черноморских мидий, собранных в акватории, хронически за1-рязненной нефтью. Анализ фракции ароматических углеводородов показал, что моноцшсличсские арены представлены .преимущественно алкплбснзолами, основными компонентами бициклических аренов являются нафталин и его гомологи, среди трициклических преобладают гомологи ' фенаптрена. Полученные данные свидетельствуют о сходстве ' группового состава фракции ароматических углеводородов из мидий и основного загрязнителя морской среды - моторного топлива (табл. 1). Содержание ароматических углеводородов в изученных опытных образцах мидий состазило 87,6±10,1 мг/кг. При анализе контрольных образцов мидий из зон, не загрязненных нефтепродуктами, ароматические соединения не были обнаружены. Содержание углеводородов в контрольных образцах мидий составило 6,6 мг/кг, что соответствовало природному фону. В основном это были н-алканы, максимальный .компонент- изопреноидный алкак пристан (2,6,10,14 - тетраметилпентадекан).

.Полученные результаты исследований подтверждают возможность использования разработанной схемы анализа ароматических углезодородоз для оценки уровня нефтяного загрязнения морепродуктов с целью исключения возможности попадания в пищу человека этих токсичных контаминантов. Широкое географическое ■ распространение, и большая доля биомассы в прибрежных экосистемах, высокие уровни концентрирования ими углеводородов делают эти организмы удобными для мониторинга загрязнения объектов окружающей среды углеводородами из техногенных источников нефтяного загрязнения. (Grimer G., " 1979; Farrington I.W., 1980).

. Обнаружение ароматических углеводородов в сале свиней, рыбе и. морепродуктах подтверждает правильность выбора этих гигиенически значимых ■ показателей для оценки безопасности нозых источников пищевых веществ с целью

индикации и идентификации остаточных углеводородов нефти в пищевых продуктах, имеющих тенденцию накапливаться в органах и тканях, богатых липидами (жировая ткань, печень). Поэтому, важно с одной стороны не допускать загрязнение сырья для производства продуктов питания, что обеспечивается системой мониторинга за состоянием окружающей среды, а с другой стороны -осуществлять тщательный гигиенический контроль за производством готовой продукции (Рахманин Ю.А., 2003; Габов Д.Н., 2004).

Предложенная схсма анализа . позволяет определять групповой, гомологический и индивидуальный состав таких широко распространенных в окружающей среде ксенобиотиков, как ароматические углеводороды, в пищевых продуктах. Многие ароматические углеводороды, в частности бенз(а)пирен, могут обладать канцерогенными свойствами, что обуславливает необходимость контролировать их присутствие в пищевой продукции и окружающей среде и объясняет установленные низкие предельно допустимые концентрации (ПДК) этих соединений в пищевых продуктах, в воде, в воздухе. Так в России гигиенические нормы для бенз(а)пирена: в воздухе рабочей зоны - 0,15 мкг/м в атмосферном воздухе населенных пунктов 0,1 мкг/100 м 3, в питьевой воде - 1 нг/л; в почве - 20 мкг/кг; в пищевых продуктах - 1 мкг/кг (ГШ.1.725-98; ГН2.1.5.1315-03; ГН2.1.7.2041-06; СанПиН2.3.2.1078-01). Разработанный метод позволяет идентифицировать бенз(а)пирен в сложных смесях природных липидов на уровне 0,10 мкг/кг.

Разработка метода анализа специфических (бактериальных) жирных кислот

Исследования последних лет показали перспективность применения биомасс микробиологического синтеза в качестве кормового белка (Мелик-Саркиеов С О., 2005), однако химический состав этих продуктов нужно рассматривать не только с позиции наличия ь них полезных факторов питания, по и с позиции возможного присутствия компонентов, способных оказывать неблагоприятное влияние на здоровье человека через пищевые цепи. Отличительной особенностью химического состава бактериальных биомасс является наличие специфических для бактериальных клеток жирных кислот, содержащих в углеродной цепи разветвления, оксигруппу, циклопропановое кольцо, а также позиционные изомеры с необычным положением двойной связи. Известно, что некоторые из этих кислот могут оказывать отрицательное влияние на организм животных и человека, в частности кислоты с циклопропановым кольцом подавляют репродуктивную функцию крыс (Гальченко В.Ф., 1986).

Ферментная система высших животных и человека обладает недостаточным арсеналом для метаболизма таких веществ (Сорокина Е.Ю., 1987).

Структурные особенности бактериальной клетки, прежде всего, наличие сложных комплексов полисахаридов и белков, неэкстрагируемых липидов клеточных стенок, обуславливают особые требования к методам выделения специфических жирных кислот. Проведена серия опытов, показавшая, что мягкий, щелочной гидролиз биоматериала позволяет в одну стадию получить, сумму бактериальных жирных кислот, при этом проведение реакции в токе азота и предварительная очистка реактивов от перекисей предотвращает окисление непредельных соединений.

Рис. 3 Схема выделения и анализа жирных кислот

Анализ производных жирных кислот методом ГЖХ (рис. 3), позволяет идентифицировать специфические (бактериальные) жирные кислоты при сравнении хроматограмм исходных образцов метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) и их химических модификаций: гидрированных, бромированных, триметилсилильных производных.

Анализ фракций жирных кислот, выделенных из бактериальных биомасс, показал, что ЖК 15:0 и 17:0 с насыщенной цепью представлены триадами ЖК-нормалыюго, изо- и антеизостроения. В группе оксикислот также обнаружены два ненасыщенных соединения: Cis:i а-оксикислота и 19-циклопропан а-оксикислота. Дифференцированы моноеновые кислоты C|g | и Cig:i, а также циклопропановые кислоты Сп и С19. В группе гексадеценовых кислот определены два позиционных изомера C¡6.i Д9 и C]6 i Д11. Вакценовая кислота С]8 ) представлена одним изомером с двойной связью у 11 атома углерода.

Таким образом, по фрагментации производных ЖК проведена идентификация ЖК, выделенных из биомассы бактерий, выращенных на метаноле и природном газе.

В сложной смеси фракции жирных кислот, выделенной из биомассы, выращенной на природном газе, «гаприн», с помощью ГЖХ-МС-анализа пирролидидов были идентифицированы 4 позиционных изомера гексадеценовой кислоты (49,44%) и 3 позиционных изомера октадеценовой кислоты (15,26%), группа насыщенных оксикислот, характерные для бактерий (2,8%). Кроме того, идентифицированы кислоты с циклопропановым кольцом — цис-циклопропан 9,10 гексадекановая (С17) и цис-циклопропан 11,12 октадекановая (С]9) кислоты, установлено положение циклопропанового кольца, идентифицированы предельные кислоты с разветвленным строением углеродной цепи: изо- и антеизо-изомеры кислот Ci5 и Сп. Основным компонентом смеси бактериальных жирных кислот «гаприна» является пальмитиновая кислота 16:0 (42,98%).

При изучении фракции жирных кислот, выделенной из биомассы, выращенной на синтетическом метаноле, «меприн», идентифицированы жирные кислоты 5-ти основных групп, характерных для бактерий: изо- и антеизокислоты с нечетным числом атомов углерода (С]5 и Сп), циклопропановые кислоты Сп и С19, среди моноеновых кислот - характерные для бактерий пальмитвакценовая (16:1) и вакценовая (18:1) ЖК с положением двойной связи у 11 атома углерода (56,9%). Широко представлены оксикислоты (10,32%) с числом углеродных атомов 14,16,18,19, причем насыщенные соединения (14:0, 16:0, 18:0) имеют по два позиционных изомера: а- и р-оксикислоты. Выявлены также оксипроизводные вакценовой кислоты (а) и 11,12-циклопропаноктадекановой кислоты (а). Окси-кислота с 18-тью атомами углерода является в то же время непредельной, о чем свидетельствует изменение времени выхода пика, соответствующего этому соединению, после гидрирования. Основным компонентом смеси бактериальных жирных кислот «гаприна» является пальмитиновая кислота 16:0 (42,98%).

Комбинация методов ГЖХ и ГЖХ-МС позволила определить соотношение компонентов в смеси ЖК изученных бактериальных биомасс (табл. 5).

Был также изучен состав фракции жирных кислот тканей крыс, получавших в составе корма бактериальную биомассу «гаприн». Эксперимент выполнен на крысах-самцах линии Вистар с начальной массой 50-70г, получавших изокалорийные рационы в течение 6 месяцев, при этом опытная группа получала рацион с добавлением биомассы «гаприн» (50 % от квоты белка рациона), в рацион контрольной группы вводили соответствующее количество гидролизата пивных дрожжей.

Таблица 5. Содержание необычных бактериальных жирных кислот «гаприна» и «меприна» (% от суммы кислот)._

Кислота Содержание, % к сумме кислот

«гаприн» «меприн»

Оксикислоты 2,44 10,32

Кислоты с циклопропановым кольцом 0,87 5,55

Разветвленные кислоты 0,70 0,79

Изомеры кислот с необычным положением двойной связи 15,24 60,32

Сумма необычных бактериальных жирных кислот 19,25 76,86

Установлено отсутствие в исследованных тканях крыс опытной группы кислот с циклопропановым кольцом и оксигруппой. В то же время в этих тканях наблюдалось увеличение содержания по сравнению с контролем главных компонентов жирных кислот «гаприна» пальмитиновой и гексадеценовой кислот (табл. 6).

Таблица 6. Состав и содержание жирных кислот С]6 ! биомассы «гаприн» и тканей крыс контрольной и опытной групп.__

Образец Содержание кислот Состав фракции жирных кислот Ci6:1,

Cl6:l (% от суммы Cis-i ЖК)

(% от суммы ЖК) Д 7 Д 9 Д 10 Д 11

«гаприн» 49,4 2 68 27 3

Жировая ткань крыс

- контроль 1,6 38 62 не обн. не обн.

- опыт 4,8 10 50 34 6

Печень крыс

- контроль 0,5 30 70 не обн. не обн.

- опыт 3,3 15 42 36 6

Так, в жировой ткани суммарное содержание кислот C)S составляло в опыте 20,5%, а в контроле — 15,8% от суммы ЖК. Кроме того, в жировой ткани и печени крыс опытной группы отмечено изменение по сравнению с контролем состава изомеров положения двойной связи гексадеценовой кислоты: в тканях крыс контрольной группы кислота CiS:] представлена двумя изомерами — Д 7 и Д 9, в опытной группе - 4 изомера - Д 7, Д 9, Д 10, Д 11. Аналогичный состав изомеров имеет жирная кислота C16:i в «гаприне», при этом, изомеры с двойной связью в положении Д 10 и АН характерны для бактериальных биомасс.

При введении в рацион «гаприна» в количестве 15-20% от квоты белка, характерные для бактериальной биомассы изомеры Д 10 и Д11 гексадеценовой кислоты, оксикислоты и кислоты с циклопропановым кольцом в тканях животных опытной группы не были обнаружены.

Таким образом, предложенный метод анализа жирных кислот позволяет идентифицировать специфические (бактериальные) жирные кислоты, характерные для использованной в составе корма биомассы, в жировой ткани и печени лабораторных и с/х животных. На основании полученных данных при проведении

эксперимента на с/х животных квота замены белка рациона на бактериальную биомассу была снижена до 20%, что позволило избежать аккумулирования бактериальных жирных кислот в пищевой продукции.

При оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием бактериальных биомасс необходимо контролировать содержание таких гигиенически значимых показателей безопасности, как специфические (бактериальные) жирные кислоты, необычные для человека, чтобы исключить их попадание в пищевые цепи.

Разработка методических подходов «с гигиенической оценке пищевой продукции из генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО)

Пищевая продукция, произведенная из ГМО, подлежит оценке на безопасность до выхода на рынок, регистрации и, в большинстве стран мирового сообщества, пострегистрационному контролю, в том числе в России.

Для осуществления контроля за пищевой продукцией, имеющей генно-инженерно-модифицированные аналоги, были разработаны, апробированы и унифицированы методы идентификации ГМО растительного происхождения, основанные на определении рекомбинантной ДНК. Для определения генетически модифицированных источников пищи в качестве мишени может быть использована вся рекомбинантная ДНК (регуляторные последовательности, смысловой и маркерные гены).

При создании ГМО растительного происхождения наиболее часто используют промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и терминатор NOS, полученный из гена нопалин - синтазы Agrobacterium tumefaciens - почвенной бактерии (98% мирового производства ГМО). Использование данных регуляторных последовательностей в качестве маркеров генетической модификации дает возможность проведения широких скрининговых исследований с целью выявления пищевой продукции, произведенной из ГМО. Для индикации линий или сортов ГМО растительного происхождения, не прошедших систему регистрации и, следовательно, не разрешенных для использования в пищевой промышленности и реализации населению в России, необходима идентификация конкретных трансформационных событий. Проведение данного анализа предполагает амплификацию последовательности ДНК в области, включающей ДНК встроенной генетической конструкции и генома растения.

Первый этап анализа включает выделение ДНК из пищевых продуктов методом «СТАВ», основанном на стандартном протоколе, включающем инкубацию пробы в присутствии детергента (гексадецилтриметил-аммоний бромид), экстракцию хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом (рис. 4).

В качестве стандарта ГМО и негативного контроля использовали материалы Института эталонных материалов и измерений, произведенные совместно с Объединенным научным центром Европейской Комиссии. Амплификацию проводили на амплификаторе MyCycIer ™ фирмы «ВЮ-RAD» (США). Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Визуализацию результатов осуществляли с применением видеосистемы и компьютерной программы Lab Works фирмы Ultra-Violet Products Ltd, США.

Рис. 4. Схема идентификации и анализа рекомбинантной ДНК

В ходе исследований проведено изучение возможности использования различных по структуре праймеров на промотор 35 S и терминатор NOS. Наибольшая чувствительность, специфичность и воспроизводимость метода была показана при использовании праймеров, дающих продукты амплификации на уровне 195 п.н. (промотор) и 180 п.н. (терминатор) (рис.5).

1 - исследуемая проба;

2 - стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения;

3 - маркер молекулярной массы 100 п.н;

4 - стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи оастительного ггооисхождения.

Рис. 5. Пример ■ представления данных электрофореза по результатам идентификации рекомбинантной ДНК методом полимеразной цепной реакции.

Апробированы методы идентификации всех генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения, разрешенных для реализации населению в Российской Федерации.

Осуществлен анализ наличия ГМО растительного происхождения в 2300 образцах продовольственного сырья (соя, кукуруза, рис, сахарная свекла, картофель), пищевых продуктов (колбасные и кондитерские изделия, молочные продукты, продукты для детского питания, крахмалы, лецитины) и пищевых 20

добавок импортного и отечественного производства. В состав продуктов входили ингредиенты, произведенные из сырья растительного происхождения, имеющего генно-инженерно-модифицированные аналоги: соя, кукуруза, картофель, рис, папайя, цикорий, томаты, кабачки, лен, сахарная свекла.

Таблица 7. Результаты качественного анализа пищевых продуктов, произведенных из/или с использованием растительного сырья, имеющего генетически модифицированные аналоги.__

Наименование продукции Количество образцов ГМО

Не обнаружено Обнаружено

Соевые продукты 1050 825 225

Колбасы 300 210 90

Молочные продукты 50 40 10

Детское питание 470 468 2

Комплексные пищевые добавки 215 185 30

Лецитин соевый 75 65 10

БАД к пище 140 127 13

Итого 2300 1920 380

Рекомбинантная ДНК обнаружена в 380 образцах (19% от общего числа проанализированных продуктов), являющихся продуктами переработки соевых бобов или содержащих их в качестве компонентов (табл. 7).

Все образцы пищевой продукции, в которых скрининговыми методами обнаружена рекомбинантная ДНК, были подвергнуты дальнейшему анализу на наличие генетической конструкции. В 98% продукции, содержащей ГМО сою, идентифицирована рекомбинантная ДНК, характерная для генетически модифицированной сои, трансформационное событие 40-3-2, устойчивой к глифосату, фирмы «Монсатно», США.. Рекомбинантная ДНК, характерная для генетически модифицированной сои, трансформационное событие А5547-127, устойчивой к глюфосинату аммония, фирмы «БайерКропСаенс», Германия, обнаружена в 2% продуктов. Обе линии сои разрешены для использования в пищевой промышленности в Российской Федерации.

Количественный анализ показал, что в 10% образцах пищевой продукции, имеющей декларацию об отсутствии ГМО, содержится рекомбинантная ДНК в количестве от 0,1 до 0,5%.

Разработанная схема исследований позволяет:

- контролировать всю пищевую продукцию, имеющую генно-инженерно-модифицированные аналоги растительного происхождения, представленные на мировом продовольственном рынке на сегодняшний день;

- исключить возможность попадания на продовольственный ршок Российской Федерации ГМО, не прошедших Государственную регистрацию в установленном порядке, безопасность которых не доказана;

- осуществлять контроль за маркировкой пищевой продукции, произведенной из ГМО, которая в Российской Федерации является обязательной в соответствии с ФЗ от 21.12.2004 г №171 «О защите прав потребителей».

выводы

1. Впервые определены гигиенически значимые показатели безопасности и разработаны методы их обнаружения, идентификации и количественного определения в пищевой продукции, полученной с помощью биотехнологии — продуктах микробиологического синтеза и генно-инженерно-модифицированных организмах (ГМО) растительного происхождения.

2. Разработан метод обнаружения, идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в дрожжах, выращенных на нефтяном субстрате, основанный на хромато-масс-спектрометрии и УФ-спектрофотометрии (предел обнаружения для moho-, би-, трициклических аренов и бенз(а)пирена, соответственно 3,9; 0,60; 0,1; 0,0001 мг/кг).

Показано, что использование в качестве кормовой добавки дрожжей, выращенных на очищенных парафинах нефти («паприн»), приводит к аккумулированию в тканях лабораторных и с/х животных ароматических углеводородов в количестве от 0,10 мкг/кг (би- и три-, полициклические арены) до 7,20 мг/кг (алкилбензолы).

Количественное определение ароматических углеводородов, в частности бенз(а)пирена, рекомендуется для осуществления гигиенического контроля за безопасностью пищевой продукции, полученной с использованием в качестве кормовых добавок биомасс, выращенных на нефтяном субстрате.

3. Показано, что ароматические углеводороды в пределах от 77,40 до 97,70 мг/кг обнаруживаются в гидробионтах (мидии), выращенных в акваториях, загрязненных нефтепродуктами, что служит обоснованием необходимости гигиенического контроля за их содержанием в морепродуктах.

4. Разработан газо-жидкостный и хромато-масс-спектрометрический методы индикации и идентификации специфических жирных кислот (содержащих оксигруппу, циклопропановое кольцо, позиционные изомеры с необычным положением двойной связи или разветвлением) в бактериальных биомассах («меприн», «гаприн»).

Показано, что использование бактериальных биомасс в качестве кормовых добавок приводит к аккумулированию в тканях лабораторных животных специфических (бактериальных) жирных кислоты (изомеры гексадеценовой кислоты Д10и Д11)в количестве до 3% от суммы жирных кислот.

Определение специфических (бактериальных) жирных кислот рекомендуется для использования при гигиеническом контроле за безопасностью пищевой продукции, полученной с использованием бактериальных биомасс.

5. Оптимизированы методы индикации и идентификации ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и пищевых продуктах, в т.ч. многокомпонентных и подвергнутых глубокой термической или технологической обработке, основанные на полимеразной цепной реакции с использованием праймеров на регуляторные последовательности (промотор и терминатор), смысловой и маркерные гены (чувствительность менее 0,1%). Методы стандартизованы в виде ГОСТ Р 52173-2003 и МУК 4.2.1902-2004 для качественного анализа ГМО в пищевых продуктах.

6. Унифицированы методы количественного определения рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах, основанные на лолимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (чувствительность 0,01 %) и позволяющие осуществлять контроль за маркировкой пищевой продукции, произведенной из ГМО растительного происхождения (МУК 4.2.1913-2004).

7. С использованием разработанных методов осуществлен анализ наличия ГМО растительного происхождения в 2300 образцах продовольственного сырья (соя, кукуруза, картофель, рис, папайя, цикорий, томаты, кабачки, лен, сахарная свекла) и пищевых продуктов (колбасные изделия, продукты детского питания, кондитерские изделия, крахмалы, лецитины). Наличие ГМО растительного происхождения, зарегистрированных в установленном порядке в РФ, выявлено в 380 образцах, в т.ч. в 10% образцов продукции, декларированной как не содержащей ГМО, обнаружена рекомбинантная ДНК в количестве 0,1 - 0,5%.

Внедрение результатов в практику:

1. «Способ определения состава жирных кислот в микроорганизмах»- Авторское свидетельство № 232606 от 03.02.1986 г. /Ушакова Т.М, Воробьева JI.III, Чернышева О.Н., Федотова Н.Ю, Медведев Ф.А.

2. «Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах».- Авторское свидетельство № 1337764 от 15.09.1987 г./Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н.

3. «Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных и моно, - би-, три-, ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах» (МУ № 4721-88). М.: МЗ СССР, 1988. / Тутельян В.А., Аксюк И.Н., Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н., Ляпков Б.Г., Медведев Ф.А.

4. «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения». ГОСТ Р 52173-03.- М.: Госстандарт России, 2003/ Тутельян В.А.,Сорокина ЕЛО. Чернышева О.Н., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б., Асадова Ю.Е.

5. «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции» (Методические указания. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. МУК.4.2.1902-04). М.: Минздрав России, 2004, 45с. / Тутельян В.А., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Анисимова О.В., Петухов А.И., Беляев E.H., Брагина И.В,, Воронцова Т.В., Потапова Т.Н., Авдеенко Т.Ф., Терехова С.Ю., Зароченцев М.В., Филатов H.H., Пискарева И.И., Салова И.Я., Сизых Е.В., Суханов Б.П., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б., Асадова Ю.Е., Рогов И.А., Кроха Н.Г., Валихов А.Ф.

6. «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания» (Методические указания. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. МУК.4.2.1913-04). М.: Минздрав России, 2004, 31с. / Тутельян В.А., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Левицкая А.Б., Шипулин Г.А., Яцышина С.Б., Петухов А.И., Беляев ЕЛ L, Брагина И.В., Воронцова Т.В., Потапова Т.Н., Авдеенко Т.Ф., Терехова С.Ю., Зароченцев М.В., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б.

Список работ, опубликованный по теме диссертации в научных журналах:

1. Ушакова Т.М., Эллер К.И., Воробьева Л.Ш., Федотова Н.Ю., Чернышева О.Н. Углеводороды некоторых пищевых продуктов животного и растительного происхождения. // Вопросы питания. - 1979,- № 5.- С. 61-62.

2. Медведев Ф.А, Воробьева Л.Ш., Ушакова Т.М., Чернышева О.Н. Хромато-масс-спектрометрическое определение следовых количеств углеводородов в биологических объектах. // Журнал аналитической химии.-1991.- Т.46, вып. 9. - С.1828 -1837.

3. Медведев Ф.А., Чернышева О.Н., Воробьева Л.Ш., Ушакова Т.М. Изучение жирнокислотного состава бактериальных биомасс с помощью хромато-масс-спектрометрии. // Журнал аналитической химии. - 1991,- Т.46, вып. 9. -С. 1862-1869.

4. Воробьева Л.Ш., Зеленцова Е.И., Чернышева О.Н. Определение бенз(а)пирена в кофе и кофейных суррогатах. // Вопросы питания. -1993. -

№ 5. - С. 61-63.

5. Медведев Ф.А., Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н. Хромато-масс-спектрометрический анализ нефтяных загрязнений воды и гидробионтов. // Журнал аналитической химии,-1996. - Т.51, № 11. - С. 1181- 1185.

6. Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н. Современные методы идентификации ГМИ в пищевых продуктах. //Пищевая промышленность. -2003.-№6.- С.20-21.

7. Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю., Анисимова О.В., Филатов Н.Н. Идентификация ГМИ в пищевых продуктах: результаты мониторинга //Пищевая промышленность. - 2003,- №6.- С.22-23.

8. Тутельян В.А., Филатов Н.Н., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Салова Н.Я., Сизых Е.В., Анисимова О.В. Мониторинг оборота пищевой продукции из генетически модифицированных источников в Москве.// Вопросы питания. -2003. - Т. 72, № 3.- С.20-23.

9. Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю., Анисимова О.В. Идентификация трансгенной ДНК в пищевых продуктах: результаты мониторинга. // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 5. - С. 100.

в материалах научных конференций:

10. Чернышева О.Н., Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Звягина О.П. Жирнокислотный состав тканей лабораторных животных, в рационах которых использовался «гаприн». // Материалы Всесоюзного симпозиума «Белковые продукты микробиологического синтеза: анализ качества, медико-биологическая оценка и эффективность применения в сельском хозяйстве» -Москва, 12-16 декабря 1989.- Москва,- С.62-63.

11. Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Федотова Н.Ю., Чернышева О.Н. Метод определения алифатических и ароматических углеводородов в продуктах питания. // Материалы научной конференции «Теоретические и практические аспекты изучения питания человека».- Москва.- 1980. - С. 45.

12. Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н., Медведев Ф.А., Аксюк И.Н. Характеристика жирнокислотного состава нетрадиционных кормовых средств и получаемых с их применением продуктов животноводства.//Материалы Всесоюзной научной конференции «Совершенствование ветсанитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК»,- Москва,- 1988. - С.93-94.

13. Ушакова Т.М., Чернышева О.Н., Воробьева Л.Ш. Влияние применения микробного жира, как компонента корма на углеводородный и жирнокиелотный состав продуктов животноводства.//Материалы Всесоюзной научно-практической конференции «Производство и использование кормового белка, состояние и перспективы. - Томск.-1989. - С.67-69.

14. Воробьева Л.Ш., Медведев Ф.А., Ушакова Т.М., Чернышева О.Н.и др Разработка унифицированных методов анализа углеводородов нефти и полициклических ароматических углеводородов в морских организмах // Морская санитарная гидробиология./ Под. ред. Миронова О.Г. Севастополь.- 1995. - С. 49-58.

15. Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю., Анисимова О.В. Количественное определение генетически модифицированных организмов в продуктах переработки кукурузы. // Материалы VII Всероссийского конгресса «Оптимальное питание — здоровье нации». - 26-28 октября 2005. - Москва. -С.279.

Для заметок

Заказ № 234/10/06 Подписано в печать 23.10.2006 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,5

°°° "ЦиФРовичок"'тел- (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 чО--'/1 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Оглавление диссертации Чернышева, Ольга Николаевна :: 2006 :: Москва

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Новые источники пищи: проблемы и перспективы

2.1.1. Продукты микробиологического синтеза

2.1.2. Гидробионты

2.1.3. Генетически модифицированные растения

2.2. Методические подходы к оценке качества и 28 безопасности новых и генетически модифицированных источников пищи

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ

3.1. Обоснование цели и выбора методов исследования

3.2. Материалы и методы исследования

3.2.1. Исследуемые материалы, экспериментальные 49 животные, условия эксперимента

3.2.2. Характеристика и способы подготовки 54 реагентов

3.2.3. Методы исследования, характеристики приборов:

- тонкослойная хроматография

- колоночная хроматография

- газожидкостная хроматография

- хромато-масспектрометрия

- УФ- и спектрофотометрия

- полимеразная цепная реакция

3.2.4. Метрологическая оценка методов

3.3 Результаты собственных исследований

3.3.1. Разработка методов анализа ароматических 62 углеводородов

3.3.2. Изучение содержания ароматических 80 углеводородов в новых видах кормового белка, полученного с использованием микробиологического синтеза

3.3.3. Изучение содержания ароматических 85 углеводородов в тканях с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы

3.3.4. Изучение содержания ароматических 91 углеводородов в гидробионтах

3.3.5. Разработка метода анализа специфических 96 (бактериальных) жирных кислот

3.3.6. Изучение содержания специфических 112 (бактериальных) жирных кислот в новых видах кормового белка, полученного с использованием микробиологического синтеза («меприн», «гаприн»)

3.3.7. Изучение содержания специфических 122 (бактериальных) жирных кислот в органах и тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы («меприн», «гаприн»)

3.3.8. Разработка методических подходов к 136 гигиенической оценке пищевой продукции из генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения

3.3.9. Изучение содержания ГМО растительного 163 происхождения в пищевых продуктах, произведенных с использованием растительного сырья, имеющего генетически модифицированные аналоги

Введение диссертации по теме "Гигиена", Чернышева, Ольга Николаевна, автореферат

Актуальность работы. В настоящее время одной из глобальных задач является решение проблемы увеличения продовольственных ресурсов, актуальной не только для развивающихся, но и для развитых стран, включая Россию.

Современная биотехнология позволяет во многих отраслях промышленности заменить традиционные методы получения пищевых продуктов биотехнологическими процессам, такими как выращивание дрожжей и бактерий с целью получения аминокислот, витаминов, ферментов и белка одноклеточных [90, 91, 81, 41]. Выход на новый уровень эффективности с/х производства путем коммерциализации достижений биотехнологии позволяет улучшить качество продовольствия, обеспечить нужный темп прироста урожайности при минимальном ущербе окружающей среде [92,47].

Общая площадь возделывания биотехнологических с/х культур в мире постоянно увеличивается, что приносит заметные социальные и экономические преимущества для потребителей и общества в целом, обеспечивает более устойчивое развитие окружающей среды и улучшение здоровья граждан [147]. В настоящее время более 900 линий ГМ растений, относящихся более чем к 50 видам [145-147], созданы и доведены до испытаний в полевых условия, при этом более 100 линий ГМ растений допущено к промышленному производству [163]. В Российской Федерации 15 линий ГМ культур разрешены для использования в питании.

Значительный материал, накопленный, как отечественными, так и зарубежными исследователями, подтверждает перспективность методов микробиологического синтеза в решении задачи увеличения общих белковых ресурсов за счет производства белка одноклеточных на нетрадиционных субстратах: углеводороды нефти и продукты их переработки, этиловый и метиловый спирт, природный газ и др., путем выращивания на них различных видов дрожжей и бактерий, что способствует созданию кормовой базы для развития традиционного животноводства [63,103, 89].

Задача обогащения рациона человека может быть решена также путем дальнейшего рационального и эффективного освоения разнообразных биологических ресурсов Мирового океана [50]. Медицинские аспекты проблемы изыскания и использования новых пищевых ресурсов связаны как с оценкой их пищевой и кормовой ценности, так и с гарантиями безопасности нетрадиционных источников пищи [72, 54]. В связи с этим, наряду с использованием общепринятых химических, токсикологических и других гигиенических исследований, большое внимание уделяется оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или из нетрадиционных источников.

Потенциальная опасность при создании новых видов кормового белка микробиологического происхождения, заключается в возможности накопления в составе биомасс компонентов субстрата, в частности, необычных (бактериальных) жирных кислот и ароматических углеводородов нефти [1,4]. Жирные кислоты бактериальных биомасс, полученных на основе микробных продуцентов, отличаются постоянством структуры и не метаболизируют в организме человека. Ароматические углеводороды относятся к приоритетным загрязнителям, как в списке всемирной организации здравоохранения [12], так и в Российской Федерации [13]. Глобальное загрязнение водных акваторий и суши химическими поллютантами приводит к накоплению в объектах окружающей среды и биосредах, в том числе гидробионтах, техногенных загрязнителей (токсичные элементы, пестициды, ароматические углеводороды) [45, 70, 71]. Систематическое потребление контаминированных продуктов ослабляет защитные возможности организма человека, снижая антитоксическую функцию печени, почек, легких, кожи, провоцируя образование канцерогенов и коканцерогенов в организме [54, 55, 71].

При гигенической оценке реальных последствий воздействия нетрадиционных источников пищи на здоровье человека принципиально важен поиск и обоснование гигиенически значимых показателей этой оценки. Развитие современных гигиенических проблем не может быть полным без научно-методического и критериального обеспечения медико-биологического мониторинга с учетом установленных приоритетных загрязнителей и маркерных веществ в объектах среды и организме, формирования интегральных оценок, основанных на показателях риска поступления вредных веществ в организм человека в условиях комплексной техногенной нагрузки. В связи с этим, особую актуальность приобретает разработка и совершенствование методических подходов к контролю за новыми технологическими процессами производства и к оценке качества вновь вовлекаемых в сферу использования человеком новых биологических объектов и веществ для минимизации неблагоприятного воздействия на здоровье человека.

Цель исследования

Целью исследований явилась разработка методических подходов к оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пищи.

Задачи исследования

1. Определить основные гигиенически значимые показатели безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пищи.

2. Разработать метод идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования остаточных нефтяных углеводородов в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма дрожжи, выращенные на нефтяном субстрате, а также в тканях гидробионтов.

3. Разработать метод идентификации специфических (бактериальных) жирных кислот в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования специфических (бактериальных) жирных кислот в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы.

Научная новизна работы

Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах.

Впервые с использованием разработанного метода изучен состав фракции жирных кислот бактериальных биомасс.

Стандартизованы и унифицированы методы индикации, идентификации и количественного определения рекомбинантной ДНК в продовольственном сырье и в пищевых продуктах (в т.ч. многокомпонентных и подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанные на использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и позволяющие выполнять контроль за пищевой продукцией, произведенной из сырья растительного происхождения, имеющего ГМ аналоги.

Практическая значимость работы

Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных и моно-, би- и три-, ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах № 4721-88 МЗ СССР; ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения»; Методические указания МУК 4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции»; Методические указания МУК 4.2.1913-04 «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания»).

Основные положения, выносимые на защиту

Разработан метод количественного определения насыщенных, моно-, би-, три-, и ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах, позволяющий определять групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов, являющихся приоритетными загрязнителями, как в списке Всемирной организации здравоохранения [12], так и в Российской Федерации [13]. Показана зависимость степени аккумулирования ароматических углеводородов в тканях лабораторных животных от количества дрожжевого белка в составе рациона.

Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах, позволяющий идентифицировать специфические жирные кислоты, характерные для бактериальных биомасс, в биоматериале. Показано, что при включении в рацион биомассы «гаприн», в жировой ткани и печени лабораторных животных происходит достоверное накопление изомеров гексадеценовой кислоты (Д10, Д11) в отличие от контроля.

Апробация работы

Материалы и основные положения доложены и обсуждены на Научной конференции «Теоретические и практические аспекты изучения питания человека» (Москва, 1980); «Окружающая среда и здоровье населения» (Таллинн, 1984); на IV Всесоюзной конференции по масс-спектрометрии (Сумы, 1986); на V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа химических реактивов (Юрмала, 1987); на Всесоюзной научной конференции «Совершенствование ветсанитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК» (Москва, 1988); на I Всесоюзной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 1989); на Всесоюзном симпозиуме «Белковые продукты микробиологического синтеза: анализ качества, медико-биологическая оценка и эффективность применения в сельском хозяйстве» (Москва, 1989); на Симпозиуме «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса.» (Москва, 2003); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 48 работ, в том числе 9 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 2 авторских свидетельства, 1- ГОСТ Р, 3 -Методических указания.

Объем и структура диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка методических подходов к гигиенической оценке новых источников пищевых веществ"

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые определены гигиенически значимые показатели безопасности и разработаны методы их обнаружения, идентификации и количественного определения в пищевой продукции, полученной с помощью биотехнологии -продуктах микробиологического синтеза и генно-инженерно-модифицированных организмах (ГМО) растительного происхождения.

2. Разработан метод обнаружения, идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в дрожжах, выращенных на нефтяном субстрате, основанный на хромато-масс-спектрометрии и УФ-спектрофотометрии (предел обнаружения для моно-, би-, трициклических аренов и бенз(а)пирена, соответственно 3,9; 0,60; 0,1; 0,0001 мг/кг).

Показано, что использование бактериальных биомасс в качестве кормовых добавок приводит к аккумулированию в тканях лабораторных животных специфических (бактериальных) жирных кислоты (изомеры гексадеценовой кислоты Д 10 и Д 11) в количестве до 3% от суммы жирных кислот.

6. Унифицированы методы количественного определения рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (чувствительность 0,01 %) и позволяющие осуществлять контроль за маркировкой пищевой продукции, произведенной из ГМО растительного происхождения (МУК 4.2.1913-2004).

6. ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

1. «Способ определения состава жирных кислот в микроорганизмах»-Авторское свидетельство № 232606 от 03.02.1986 г. /Ушакова Т.М, Воробьева J1.UI, Чернышева О.Н., Федотова Н.Ю, Медведев Ф.А.

3. «Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных и моно, - би-, три-, ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах» (МУ№ 4721-88). М.: МЗСССР, 1988./Тутельян В.А., Аксюк И.Н., Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н., Ляпков Б.Г., Медведев Ф.А.

4. «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения». ГОСТ Р 52173-03.- М.: Госстандарт России, 2003/ Тутельян В.А.,Сорокина Е.Ю. Чернышева О.Н., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б., Асадова Ю.Е.

5. «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции» (Методические указания. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. МУК.4.2.1902-04). М.: Минздрав России, 2004, 45с. / Тутельян В.А., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Анисимова О.В., Петухов А.И., Беляев Е.Н., Брагина И.В., Воронцова Т.В., Потапова Т.Н., Авдеенко Т.Ф., Терехова С.Ю., Зароченцев М.В., Филатов Н.Н., Пискарева И.И., Салова И.Я., Сизых Е.В., Суханов Б.П., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б., Асадова Ю.Е., Рогов И.А., Кроха Н.Г., Валихов А.Ф.

6. «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания» (Методические указания. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. МУК.4.2.1913-04). М.: Минздрав России, 2004, 31с. / Тутельян В.А., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Левицкая А.Б., Шипулин Г.А., Яцышина С.Б., Петухов А.И., Беляев Е.Н., Брагина И.В., Воронцова Т.В., Потапова Т.Н., Авдеенко Т.Ф., Терехова С.Ю., Зароченцев М.В., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Медицинские аспекты использования новых пищевых ресурсов наряду с доказательством их высокой пищевой и кормовой ценности касаются, прежде всего, гарантии их безопасности. При этом, используя общепринятые химические, токсикологические и другие гигиенические критерии, большое внимание уделяется поиску специальных, ключевых параметров, являющихся характерными для пищевой продукции, полученной из новых источников или с применением новых технологий, и позволяющих с большой степенью надежности контролировать данную категорию продукции.

Целью работы явилась разработка методических подходов к оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пищи.

Объектами исследования явились: новые виды кормового белка микробиологического происхождения (дрожжи «паприн», род Candida, выращенные на жидкой парафиновой фракции нефти, биомасса «гаприн», штамм продуцента Methylococcus capsulatus, ВСБ 874, выращенная на природном газе, бактериальная биомасса «меприн», штамм продуцента Methylobacills-methylophilus ВСБ-792, выращенная на синтетическом метаноле), продукты животноводства и рыбоводства, произведенные с использованием новых видов кормового белка, мидии из черноморской акватории, пищевые продукты произведенные из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги.

Потенциальная опасность при создании новых видов кормового белка микробиологического происхождения, заключается в возможности накопления в составе биомасс компонентов субстрата (ароматических углеводородов нефти) и необычных (бактериальных) жирных кислот. При использовании в питании морепродуктов, которые также не являются традиционными источниками пищи, следует учитывать возможность загрязнения водных акваторий нефтепродуктами, что в свою очередь может привести к накоплению экзогенных ароматических углеводородов в конечном продукте. Бесконтрольное применение генно-инженерных технологий при создании новой пищи, может привести к случайному или преднамеренному выходу на рынок пищевой продукции, представляющей опасность для здоровья человека, что обуславливает необходимость оценки безопасности и разработки методов контроля за данной продукцией. Для выполнения поставленных задач при изучении пищевой продукции, произведенной с использованием биотехнологии, были выбраны следующие гигиенически значимые показатели безопасности: для продукции, выращеной на природном газе и спиртовом субстрате - необычные (бактериальные) жирные кислоты; для продукции, выращенной на нефтяном субстрате и для гидробионтов - остаточные углеводороды нефти; для генно-инженерно-модифицированных организмов -рекомбинантная ДНК.

Выраженные кумулятивные свойства нефтяных углеводородов создают предпосылку для загрязнения ими пищевых продуктов, получаемых при использовании дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате, или из морепродуктов, что с учетом токсичности ряда, прежде всего ароматических, углеводородов нефти в определенной степени является фактором риска и требует детального изучения. Для изучения динамики аккумулирования ароматических углеводородов в продуктах животноводства, полученных с использованием дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате, и в тканях гидробионтов возникла необходимость разработать высокочувствительный и точный метод количественного определения ароматических углеводородов в биологических объектах, пригодный для серийных анализов. Исходя из необходимости определения в различном биоматериале следовых количеств ароматических углеводородов, был разработан единый метод выделения из биомассы дрожжей, тканей животных и пищевых продуктов, идентификации и количественного определения компонентов нефтяных дистиллятов - алканов и циклоалканов, моно-, би- и трициклических аренов, а также бенз(а)пирена. Схема выделения включает разрушение биоматериала щелочным гидролизом, экстракцию неомыляемой фракции липидов, из которой с использованием последовательно адсорбционной хроматографии на силикагеле и в тонком слое окиси алюминия, переэкстракции из гексанового раствора водным диметилформамидом, хроматографии на колонке с сефадексом LH-20 и в тонком слое ацетилированной целлюлозы получают узкие фракции указанных выше углеводородов. Эффективность предложенной схемы подтверждена масс-спектральными исследованиями. Для идентификации и количественного определения ароматических углеводородов применен комплекс современных высокочувствительных методов: ГЖХ (насыщенные углеводороды), ГЖХ, УФ-спектрофотометрия (моно-, би- и трициклические арены) и флуоресцентная спектрофотометрии (бенз(а)пирен), а также ГЖХ-МС.

Пределы обнаружения моно-, би- и трициклических аренов дизельных дистиллятов нефти в биоматериале составляют соответственно 3,9; 0,60; 0,10 мг/кг при относительном стандартном отклонении не более 0,20%. Для бенз(а)пирена предел обнаружения - 0,10 мкг/кг с учетом контрольного сигнала «холостого» опыта и его стандартного отклонения при относительном стандартном отклонении не более 0,28%.

К достоинствам предлагаемого метода можно отнести его универсальность, позволяющую получить сопоставимые результаты при анализе углеводородов дрожжей, тканей животных и пищевых продуктов, чего не дает разработанный только для дрожжей расчетный метод определения аренов [36], возможность определения в одной навеске биоматериала насыщенных и ароматических компонентов парафиновой фракции нефти, на что не рассчитан принятый нами за основу разработанный в Институте питания АМН СССР метод [62] или наиболее близкая к предлагаемой схема выделения из биоматериала полициклических аренов [118]. Использование высокоселективной капиллярной ГЖХ и УФ-спектрофотометрии, а также ГЖХ-МС, позволило определять следовые количества нефтяных ароматических углеводородов в присутствии природных компонентов липидов.

Впервые углеводородный состав дрожжей изучен масс-спектральными методами. Использованная схема включала определение 1руппового состава расчетным методом, ГЖХ-МС-анализ с применением компьютерной реконструкции хроматограмм по молекулярным и осколочным ионам и рассмотрением масс-спектров отдельных соединений. Сочетание разработанной схемы разделения сложных углеводородных смесей с масс-спектральными исследованиями позволило установить несомненное сходство насыщенных и ароматических фракций нефтяного субстрата и выращенных на этом субстрате дрожжей. В ароматической фракции углеводородов дрожжей идентифицированы такие характерные для нефти соединения, как алкилбензолы разнообразного строения, алкилинданы и алкитетралины, алкинафталины, фенантрен и его гомологи, нафтеноароматические соединения с двумя и тремя ароматическими циклами в молекуле. Групповой и гомологический состав ароматической фракции дрожжей вполне соответствует структуре нефтяного субстрата.

Таким образом, химический анализ показал, что в биомассе дрожжей имеется определенное количество представляющих потенциальную опасность токсических веществ, прежде всего ароматических углеводородов. Информация о содержании и составе выделенных из биомассы дрожжей углеводородов явилась надежным основанием для гигиенических исследований продуктов питания, полученных с их применением. Результаты опытов на лабораторных животных показали необходимость определения углеводородного профиля при гигиенической оценке продуктов животноводства, полученных с использованием исследуемых дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате. Выявленные закономерности аккумулирования экзогенных углеводородов в богатых липидами тканях позволили сосредоточить внимание на анализе ключевых параметров при определении возможного загрязнения углеводородами нефти тканей сельскохозяйственных животных, гидробионтов и произведенных из них пищевых продуктов.

Влияние кормового белка «паприн», на УВ состав тканей с/х животных изучено на свиньях, получавших изокалорийные сбалансированные рационы: контрольные - традиционный общевиварный, опытные - с включением «паприна» (7,5% по массе). Анализ группового состава ароматических углеводородов, выделенных из сала свиней, получавших паприн в течение 18 месяцев, показал, наличие в сале только основных компонентов «паприна»: алкилбензолов в количестве 2,2-7,2 мг/кг образца (как метаболически менее активных) и незначительного количества би- и трициклических аренов в количестве 0,1-0,5 и 0,04-0,1 мкг/кг.

Проведены исследования группового состава ароматических углеводородов черноморских мидий, собранных в акватории, хронически загрязненной нефтью. Анализ фракции ароматических углеводородов показал, что моноциклические арены представлены преимущественно алкилбензолами, а бициклические - нафталином и его гомологами, среди трициклических преобладают гомологи фенантрена. Полученные данные свидетельствуют о сходстве группового состава фракции ароматических углеводородов из мидий и основного загрязнителя морской среды - моторного топлива. Содержание ароматических углеводородов в изученных опытных образцах мидий составляло 87,6±10,1 мг/кг. При анализе контрольных образцов мидий из зон, не загрязненных нефтепродуктами, ароматические соединения не были обнаружены.

Обнаружение ароматических углеводородов в сале свиней, рыбе и морепродуктах подтверждает правильность выбора этих гигиенически значимых показателей для оценки безопасности новых источников пищевых веществ с целью индикации и идентификации остаточных углеводородов нефти в пищевых продуктах, имеющих тенденцию накапливаться в органах и тканях, богатых липидами (жировая ткань, печень). Поэтому, важно с одной стороны не допускать загрязнение сырья для производства продуктов питания, что обеспечивается системой мониторинга за состоянием окружающей среды, а с другой стороны - осуществлять тщательный гигиенический контроль за производством готовой продукции [72, 54].

Предложенная схема анализа позволяет определять групповой, гомологический и индивидуальный состав таких широко распространенных в окружающей среде ксенобиотиков, как ароматические углеводороды, в пищевых продуктах. Многие ароматические углеводороды, в частности бенз(а)пирен, могут обладать канцерогенными свойствами, что обуславливает необходимость контролировать их присутствие в пищевой продукции и окружающей среде и объясняет установленные низкие предельно допустимые концентрации (ПДК) этих соединений в пищевых продуктах, в воде, в воздухе. Так в России гигиенические нормы для бенз(а)пирена: в воздухе рабочей зоны -0,15 мкг/м , в атмосферном воздухе населенных пунктов 0,1 мкг/100 м , в питьевой воде - 1 нг/л; в почве - 20 мкг/кг; в пищевых продуктах - 1 мкг/кг (ГН1.1.725-98; ГН2.1.5.1315-03; ГН2.1.7.2041-06; СанПиН2.3.2.1078-01). Разработанный метод позволяет идентифицировать бенз(а)пирен в сложных смесях природных липидов на уровне 0,10 мкг/кг.

Существенным преимуществом разработанного метода количественного определения ароматических углеводородов в биологических объектах но сравнению с существующими аналогичными схемами анализа углеводородов [135, 167] является его пригодность для выполнения серийных исследований с использованием доступных приборов и реактивов. Разработанная методика признана предметом изобретения [АС №1337764 от 15.09.1987г].

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что бактериальные жирные кислоты характеризуются наличием специфических соединений, которые значительно менее распространены в высших организмах, а если и присутствуют в них, то в малых концентрациях. К ним относятся оксикислоты, кислоты с циклопропановым кольцом, непредельные кислоты с необычным положением двойной связи, насыщенные кислоты с прямой и разветвленной цепью.

Разработанная схема анализа жирнокислотного состава бактериальных биомасс включает на предварительном этапе подготовки образца щелочной гидролиз биомассы и экстракцию кислот из неомыляемой фракции липидов, что позволяет в одну стадию получить сумму жирных кислот. При этом, проведение гидролиза в токе азота и предварительная очистка реактивов о г перекисей предотвращает окисление непредельных соединений. Анализ производных жирных кислот позволяет идентифицировать специфические (бактериальные) жирные кислоты при сравнении хроматограмм исходных образцов метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) и хроматограмм их химических модификаций: гидрированных, бромированных, триметилсилильных производных. В качестве основной хроматографической характеристики использованы величины эквивалентных длин цепи метиловых эфиров.

Для расширения возможностей идентификации с применением ГЖХ-МС анализа были исследованы не только метиловые эфиры, но их пирролидиды. Установлены основные направления фрагментации молекул производных кислот под воздействием электронного удара и определены ключевые фрагменты в масс-спектрах метиловых эфиров и пирролидидов жирных кисло г бактерий. Идентифицированы насыщенные кислоты нормального и разветвленного строения, оксикислоты, непредельные кислоты и кислоты с циклопропановым кольцом. В масс-спектрах насыщенных кислот с прямой цепью максимальным является ион с m/z 74, для насыщенных кислот с разветвленной цепью характерен слабый ион (М-65)+, образующийся благодаря отрыву от молекулярного иона Н20, СН3ОН и СН3. Присутствие иона (М-57)* обусловлено а-разрывом цепи относительно разветвления в молекуле с антиизо-строением. В спектрах 2-оксикислот максимальным является ион с m/z 90, аналог перегруппировочного иона с m/z 74, в то же время, как 3-оксикислоты характеризуются наличием иона с m/z 103. Масс-спектры метиловых эфиров непредельных кислот - моноеновых и диеновых, содержат достаточно интенсивные пики (М-31)+ и (М-32)+, образующиеся при отрыве от молкулярного иона метоксила и метанола. Сходные с моноеновыми кислотами масс-спектры дают циклопропановые кислоты. Дифференцировать непредельные и циклопропановые кислоты удается после гидрирования смеси МЭЖК, при котором циклопропановое кольцо остается незатронутым. Исследование масс-спектров таких производных кислот как пирролидиды, позволило решить сложный вопрос локализации двойной связи и циклопропанового кольца в углеродной цепи. Иону с m/z 113 соответствует в спектре максимальный пик, фрагмент с m/z 125 начинает гомологический ряд полярных фрагментов, в котором интенсивные пики разделены интервалом 14 а.е.м. (СНг-группа). Появление интервала в 12 а.е.м. между фрагментами Сп-1 и Сп свидетельствует о наличии двойной связи между п и (п-1) атомами углерода.

С помощью разработанной схемы анализа изучен жирнокислотный состав биомассы некоторых видов бактерий. Найдено, что широко распространенные моноеновые кислоты нормального строения представлены рядом позиционных изомеров. Так, были идентифицированы 4 позиционных изомера кислоты С: Д7, Д9, Д10, Д11 (пальмитвакценовая) и 3 изомера кислоты Cigri: Д9, All (вакценовая), Д12. Определена также характерная для клеток бактерий группа соединений с циклопропановым кольцом - цис-циклопропан-9,10-гексадекановая и цис-циклопропан-9,10—октадекановая (дигидрострекуловая) кислоты. При анализе позиционных изомеров предельных и непредельных оксикислот, входящих, в частности, в состав липополисахаридов клеточных стенок бактерий, идентифицированы предельные кислоты С 14.0, С]б.о и С18.0 с гидроксильными группами в положении -2 и -3, ненасыщенная 2-гидроксивакценовая кислота, оксикислота с циклопропановым кольцом - цис-11,12-циклопропан-2-гидроксиоктадекановая. Достоверно определены изо- и антеизо-изомеры предельных кислот С15.0 и С^.о

В сложной смеси фракции жирных кислот, выделенной из биомассы, выращенной на природном газе, «гаприн», с помощью ГЖХ -МС-анализа пирролидидов были идентифицированы 4 позиционных изомера гексадеценовой кислоты и 3 позиционных изомера октадеценовой кислоты, группа насыщенных оксикислот, характерные для бактерий. Кроме того, идентифицированы кислоты с циклопропановым кольцом и установлено для них положение циклопропанового кольца: цис-циклопропан-9,10-гексадекановая (Сп) и цис-циклопропан-11,12-октадекановая (С19) кислоты, идентифицированы предельные кислоты с разветвленным строением углеродной цепи: изо- и антеизо-изомеры кислот С]5 и С17. Основным компонентом смеси бактериальных жирных кислот «гаприна» является пальмитиновая кислота 16:0 (42,98%).

При изучении фракции жирных кислот, выделенной из биомассы, выращенной на синтетическом метаноле, «меприн», идентифицированы жирные кислоты 5-ти основных групп, характерных для бактерий: изо- и антеизокислоты с нечетным числом атомов углерода (Ci5 и С!7), циклопропановые кислоты С17 и С19, среди моноеновых кислот - характерные для бактерий пальмитвакценовая (16:1) и вакценовая (18:1) ЖК с положением двойной связи у 11 атома углерода. Широко представлены оксикислоты с числом углеродных атомов 14,16,18,19, причем насыщенные соединения (14:0, 16:0, 18:0) имеют по два позиционных изомера: а- и Р-оксикислоты. Выявлены также оксипроизводные вакценовой (а) и 11,12-циклопропаноктадекановой (а) кислот. Окси-кислота с 18-тью атомами углерода является в тоже время непредельной, о чем свидетельствует изменение после гидрирования времени выхода на хроматограмме пика, соответствующего этому соединению. Основным компонентом смеси бактериальных жирных кислот «меприна» является вакценовая кислота 18:1 (56,9%).

Комбинация методов ГЖХ и ХМС позволила определить соотношение компонентов в смеси ЖК изученных бактериальных биомасс (табл. 62).

Содержание необычных бактериальных жирных кислот «гаприна» и «меприна» (% от суммы кислот)

Кислота «гаприн» «меприн»

Оксикислоты 2,80 10,32

Кислоты с циклопропановым кольцом 0,81 5,55

Разветвленные кислоты 0,70 0,79

Изомеры кислот с необычным положением двойной связи 15,26 60,77

Сумма необычных бактериальных жирных кислот 19,57 77,43

Специфические бактериальные жирные кислоты представляют собой биологически активные соединения, поэтому их определение является составной частью гигиненической оценки новых видов продуктов микробиологического синтеза пищевого и кормового назначения.

При изучении влияния бактерильной биомассы на жирнокислотный состав тканей экспериментальных животных показано, что предложенный метод анализа жирных кислот позволяет идентифицировать специфические (бактериальные) жирные кислоты, характерные для использованной при кормлении биомассы, в жировой ткани и печени лабораторных и с/х животных, в продуктах питания.

Был изучен состав фракции ЖК тканей крыс, получавших в составе корма «гаприн» (50% от квоты белка) на протяжении 18 месяцев. Отмечено изменение состава изомеров положения двойной связи гексадеценовой кислоты (16:1) в тканях опытных животных (параэпидидимальный жир и печень) по сравнению с контрольными. Другие специфические бактериальные кислоты не были идентифицированы.

На основании полученных данных при проведении эксперимента на с/х животных квота замены белка рациона на бактериальную биомассу была снижена до 20%, что позволило избежать аккумулирования бактериальных жирных кислот в пищевой продукции.

Разработанная методика определения состава специфических (бактериальных) жирных кислот в бактериальных биомассах признана предметом изобретения [АС № 232606 от 03.02.1686 г.].

При оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием бактериальных биомасс необходимо контролировать содержание таких гигиенически значимых показателей безопасности, как специфические (бактериальные) жирные кислоты, необычные для высших организмов, чтобы исключить их попадание в пищевые цепи человека.

При выборе метода определения ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах учитывали следующие факторы: выбор мишени для определения, ее доступность и степень разрушения, специфичность и чувствительность метода, формат анализа.

В качестве мишени для идентификации ГМО была выбрана рекомбинантная ДНК:

• ДНК стабильна при технологической обработке пищевых продуктов.

• ДНК в отличие от белка, присутствует во всех частях растения, в том числе и предназначенных в пищу.

• Вся рекомбинантная ДНК: регуляторные последовательности (промотор, терминатор), смысловой ген, маркерные гены может быть мишенью для идентификации, что позволяет проводить как скрининговые исследования, так и идентификацию конкретных трансформационных событий.

Для анализа продуктов был применен метод полимеразной цепной реакции.

Проведено изучение возможности использования различных по структуре праймеров на промотор 35 S и терминатор NOS. Наибольшая чувствительность, специфичность и воспроизводимость метода была показана при использовании праймеров, дающих продукты амплификации на уровне 195 п.н. и 180 п.н. соответственно.

Показано с использованием стандартных образцов состава и свойств чувствительность метода - 0,1 % для технологически необработанных пищевых продуктов и 1,0 % для сложных многокомпонентных, технологически обработанных пищевых продуктов.

С использованием стандартов состава и свойств, содержащих 0,0 % ГМО, кукурузу линии GA21 (только NOS) и кукурузу линии Btl 76 (только 35S) показана высокая специфичность данного метода.

Унифицированы методы идентификации конкретных трансформационных событий прошедших систему регистрации в Российской Федерации.

Разработан алгоритм проведения инструментального анализа пищевой продукции, имеющей генно-инженерно-модифицированные аналоги.

Проведены исследования различной пищевой продукции, имеющей генно-инженерно-модифицированные аналоги на мировом продовольственном рынке, в том числе, многокомпонентной и с глубокой технологической обработкой.

Показано, что разработанный алгоритм проведения инструментального анализа пищевой продукции на наличие рекомбинантной ДНК с использованием ПЦР позволяет осуществлять контроль за 96% ГМ культур растительного происхождения, представленных на мировом рынке, а также, за наличием маркировки пищевой продукции, произведенной из ГМО, которая в Российской Федерации является обязательной в соответствии с ФЗ от 21.12.2004 г № 171 «О защите прав потребителей».

На кафедре гигиены питания и токсикологии медико-профилактического факультета послевузовского профессионального образования ММА им. И.М.Сеченова диссертантом проведена подготовка специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека из всех регионов Российской Федерации и административных округов г. Москвы по теме «Генетически модифицированные источники пищи (ГМИ): методы лабораторного контроля».

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Чернышева, Ольга Николаевна

1. Алимова Г.А., Павлюк Н.Ф., Тайле А.А., Семенов JI.B. Исследование селективности растворителей в процессе деароматизации жидких парафинов // Нефтехимия.-1980.-t.20, №4.-С.417-419;

2. Алтон JI.B., Рыыс О.О. Продолжительность выживания Proteus Vurgaris в почве, загрязненной дизельным топливом .//Гигиена и санитария.-1986.-№11.-С.76-78;

3. Бачурин Б.А. Идентификация нефтяной составляющей органического загрязнения гидросферы // Водные ресурсы, геологическая среда и полезные ископаемые Южного Урала. Оренбург: ОГУ, 2000, с. 143-153;

4. Величкина Н.Г. Состояние вопроса глубокой деароматизации жидких парафинов//Нефтехимия. -1980.-т.20.,№4.-С.418-421;

5. Вигдергауз М.С. Расчеты в газовой хроматографии,- М.: Химия, 1978. 200с.;

6. Воробьева Л.Ш. Разработка методов анализа и характеристика углеводородного состава продуктов животноводства, полученных с использованием дрожжей из дизельных дистиллятов нефти, для их гигиенической оценки.: Дис.канд.биол.наук. Москва. 1987.-240с.;

7. Воробьева Н.С., Земскова З.К., Петров Ал.А. Полициклические нафтены состава С14-С26 в нефти месторождения Сива // Нефтехимия. -1978.т.18.-С.855-863;

8. П. Гальченко В.Ф., Андреев J1.B., Троценко Ю.А. Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино. Научный центр биологических исследований. ИбиФМ АН СССР. 1986. 95 е.;

9. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. ч.1- ВОЗ. Женева.-1981,-С.37-38;

10. Гигиенические нормативы ГН 1.1.7256-98 «Перечень веществ, продуктов, производственных процессов, бытовых и природных факторов, канцерогенных для человека» //Госкомсанэпиднадзор России. 1 февраля 1999 г.;

11. Гигиенические нормативы ГН 2.1.5.1315-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования» //МЗ РФ 15 июня 2003.;

12. Гигиенические нормативы ГН 2.1.7.2041-06 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве» //Минздравсоцразвития -19 января 2006;

13. Головко А.К., Камьянов В.Ф., Коробицина JI.JI., Кураколова Е.А., Русинова Г.В., Петров Ал.А. Высококипящие арены палиозойской нефти Западной Сибири.// Нефтехимия.- 1984.-t.24., №5.-С.855-863;

14. Гончаров А.Н., Буткова O.JI. Определение микро- и ультрамикроколичеств нефтепродуктов в минеральных водах//Пиво и напитки.-2004.-№3.-С.25-31;

15. Горбалинский В.А., Ларина П.Т., Ботникова Т.А. Алкановые и ароматические углеводороды очищенных жидких парафинов//Белок из углеводородов.- 1968.- вып.З.-С.ЗЗ-Зб;

16. Градова Н.Б., Диканская Э.М., Михалева М.М. Использование углеводородов дрожжами.-М.: Мир, 1971.-119 е.;

17. Грачева Н.Б., Гаврилова Н.Н., Иванова А.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М.: Мир, 1980.-228с.;

18. Гринберг А.А., Багдаш Г.В., Леонтьев С.А., Кабуков Б.Д. Количественное определение группового состава ароматических углеводородов дизельных топлив методом жидкостной хроматографии// Журнал аналитической химии.-1984.-т.39,№1.-С.83-85;

19. Гринберг А.А., Багдаш Г.В., Леонтьева С.А. Определение насыщенны углеводородов в дизельных топливах методом жидкостной хроматографии //Журнал аналитической химии.-1984.-t.29., №1.-С. 166-169;

20. ГОСТ Р 8.563-96 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений;

21. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 ч. 1, ч. 4, ч. 6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений»;

22. Гулевская С.А., Шишиканова Н.В. Субмикроскопическая организация поверхности клеток Candida lipolitica при росте на гексадекане//Успехи современной биологии.-1979.-r.88.-C. 198-201;

23. Давидов Е.Р., Белова B.C., Гололобов А.Д., Райхман A.M. О природе адаптации дрожжей рода Candida к окислению углеводородов // Микробиология. -1982. т.55, №5.-С.1005-1009;

24. Давидова Е.Г., Рачинский В.В. Поглощение н-алканов дрожжевыми клетками//Успехи современной биологии. -1979.-t.88.-C 198-201;

25. Данцер К., Тан Э., Мольх Д. Аналитика.-М.: Химия, 1981.-270 е.;

26. Дженнингс В. Газовая хроматография на стеклянных капиллярных колонках.-М.: Мир, 1980.-231 е.;

27. Дикун ГШ., Калинина И.А., Хесина А .Я., фриц В. Сравнительные исследования загрязнения пищевых продуктов канцерогенными ПАУ в СССР и ГДР (метод определения бенз(а)пирена//Вопросы питания.-1981.-№3.-С.63-67;

28. Дрожжи кормовые ОСТ 59-17-76;

29. Дрожжи кормовые (Паприн) ОСТ 59-03-04537-84;

30. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов.-СПб.- 2000;

31. Егоренкова Г.Н., Белов JI.17. Структурная организация клеточных стенок у дрожжей рода Candida//Микробиология.-1984.-т.53,№2.-С.300-304;

32. Ерошин В.К., Дедюхина Э.Г. Углеводороды, синтезированные микроорганизмами.//Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей.- М.: Наука, 1972.-С. 71-74;

33. Земфанова В.П., Ильина В.И., Дедюхина Э.Г., Ерошина В.К. Состав липидов и углеводородов Candida tropicalis, выращенных на средах с органическими кислотами//Микробиология.-1974.-т.43.-С.686-688;

34. Исмаилов Н.М. Ароматические углеводороды как индукторы ферментов расщепления ароматического ядра у Candida Guil Iiermondi //Микробиология-1982-Т.51, №66 -с. 1005-1009;

35. Кучеренко Г.А. Онкологические аспекты регламентирования бенз(а)пирена в продуктах питания//Экологическая безопасность.-2002.-№. 2.-С. 527-530;

36. Ладур.Т.А., Лукин Н.Д. Применение биотехнологии в производстве сахаристых продуктов из крахмала. // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состяние и перспективы развития».-М. 2003 С.265;

37. Ларина Л.Г., Горбалинский В.А. Состав остаточных углеводородов, выделенных из кормовых дрожжей, полученных на очищенных парафинах//Микробиологических синтез.-1971.-№2.-С.45-48;

38. Ленинджер А.Л. Основы биохимии.- М.: Мир, 1985.- 1057 е.;

39. Малышева А. Г. Неучтенная опасность воздействия химических веществ на здоровье человека.// Гигиена и санитария 2003 - №6 -С. 34-36;

40. Медведев Ф.А., Лукашенко И.М., Бродский Е.С. Методики масс-спектрометрического анализа нефтяных фракций, продуктов нефтепеработки и нефтехимии.-М.: ВНИИ НП.-1971.-138 е.;

41. Мелик-Саркисов С.О. Биотехнология в аграрном секторе США: Экономика развития.-М.: ВНИИ СБ РАСХН, 2005. -288 с.

42. Мельникова А.А., Ляпина Н.К., Карманова Л.П. Структурно-групповой состав сероорганических соединений и углеводородов дистиллята 200-360°С Усинской нефти//Нефтехимия.-1980.-т.20, №4.-С.510-515;

43. Миронов О.Г. Влияние нефти и нефтепродуктов на морские организмы и их сообщества // Проблемы химического загрязнения вод Мирового океана.: Л., Гидрометеоиздат, 1984.-Т.4.-С.6-95;

44. Новые направления биотехнологии. Материалы VIII конференции. М., 1998;

45. Одинцова Т.А. Эколого-гигиенические аспекты трансформации органического вещества нефтезагрязненных геосистем // Моделирование стратегии и процессов освоения георесурсов. Сборник докладов. Пермь: Горный институт УрОРАН, 2003.-С.241-245;

46. Онищенко Г. Г. Влияние состояния окружающей среды на здоровье населения. Нерешенные проблемы и задачи. // Гигиена и санитария 2003 - №1 -С. 3-5;

47. Онищенко Г. Г. Критерии опасности загрязнения окружающей среды.// Гигиена и санитария 2003 - №6 -С. 3-4;

48. Основы биотехнологии: Учебное пособие / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина-М.: Академия, 2005. 208 е.;

49. Остроухов С.Б., Арефьев О.А., Пустильникова С.Д., Забродина М.Н., Петров Ал.А. Н-алкилбензолы состава С12-С30 в нефтях.// Нефтехимия. -1983.-т.23,№1.-С.20-30;

50. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. -М.:Медицина, 1973.-148с.;

51. Петров Ал. А. Углеводороды нефти.-М.: Наука, 1984.-262 е.;

52. Петров Ал. А. Химия нефти. -М. Наука, 1971.-3 88с.;

53. Пищевая биотехнология: в 4 кн. Кн. 1. Основы пищевой биотехнологии. : Учебник/ И.А. Рогов, JI.B. Антипова, Г.П. Шуваева- М.: КолосС, 2004. -440 е.;

54. Покровский А.А. Итоги медико-биологических исследований углеводородных дрожжей // Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей. -М.: Наука, 1972.-С.449-452;

55. Покровский А.А., Маркелова В.Ф., Тациевский В.А., Левачев М.М. К вопросу о превращении углеводородов в организме животных. //Биохимия .-1969.-t.34, №4.- С.791-794;

56. Покровский А.А., Пономарева Л.Г., Ушакова Т.М., Эллер К.И., Кузнецов Д.И. Определение углеводородов (н-алканов) в тканях животных//Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей.-М.: Наука, 1972.-С. 214-218;

57. Полякова А.А., Хмельницкий Р.А. Введение в масс-спектрометрию в органической химии. М.: Химия.-1972.-367 е.;

58. Полякова А.А. Молекулярный масс-спектральный анализ органических соединений.-М., Химия-1983.-С.82-86;

59. Полякова А.А. Молекулярный масс-спектральный анализ органических соединений. М.: Химия, 1986.-202 е.;

60. Ракитский В. Н., Ильницкая А. В., Юдина Т. В., Федорова С. Г., Березняк И. В., Липкина Л. И. Определение фактических экспозиционных уровней для оценки риска воздействия пестицидов на здоровье работающих. // Гигиена и санитария 2002 - №6 -С. 76;

61. Ракитский В. Н., Синицкая Т. А. Ассортиментный индекс пестицидной нагрузки территорий в системе социально-гигиенического мониторинга. // Гигиена и санитария 2004 - №5 -С. 38-39;

62. Ракитский В. Н., Турусов B.C. Мутагенная и канцерогенная активность химических соединений. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2005-№3;

63. Рахманин Ю. А., Русаков Н. В. Приоритетные направления и критерии оценки загрязнения окружающей среды.// Гигиена и санитария 2003 - №6 -С. 14-16;

64. Робинсон К. Технологии генетической модификации и пищевые продукты. Здоровье и безопасность потребителей: -Бельгия, Брюссель. -1LSI Europe.-2003.- International Life Sciences Institute.- 46 е.;

65. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы.-М.: Наука, 1977.-48 е.;

66. Руденко Б.Е. Капиллярная хроматография.-М: Наука, 1978,-225с.;

67. Рузанова А.И., Воробьев Д.С. Трансформация донных сообществ в условиях нефтяного загрязнения / Экология пойм сибирских рек и Арктики / Под ред. В.В. Зуева. Новосибирск: Изд-во СО РАН. - 1999. -С.71-78;

68. Санин П.И., Пицугина Н.Н., Сучкова А.А., Сущик Р.Я. Определение общего содержания остаточных углеводородов в кормовых дрожжах, полученных на основе парафиновых углеводородов нефти // микробиологическая промышленность.-1972.-№1.-С.27-30;

69. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» -: М., Минздрав России.-2002.-164с.;

70. СанПиН 42-128-4433-87 «Санитарные нормы. Допустимые концентрации химических веществ в почве»-: М. Минздрав России.-2002.-164с.;

71. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник / Отв. ред. B.C. Шевелуха.-М.: Высш. шк.,2003.-469с.;

72. Соловьева JI.M., Иващенво Н.В. Биологическая ценность белков БВК и биошрота: Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей.- М.: Наука, 1972. -С.112-116;

73. Соловьева JI.M., Левачев М.М., Птицина Т.Н. Сравнительная оценка показателей жирового обмена у крыс, получавших БВК и биошрот в качестве источника белка: Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей.-М.: Наука, 1972. -С. 120-126;

74. Сорокина Е.Ю. Изучение активности органеллоспецифических ферментов различных органов крыс при гигиенической оценке новых продуктов микробиологического синтеза: Дис.канд. мед. наук. Москва. 1987.-178 е.;

75. Способ количественного определения углеводородов в содержащем их сырье: А.С. СССР С01/31/08//Максимова Г.Н., Рожкова М.И., Воробьева Г.И.: ВНИИсинтезбелок №175731, опубл. 09.10.65, Бюлл.№20;

76. Способ определения углеводородного состава дизельного топлива: А.С.СССР GO 1 N31/08/ Зрелов В.Н., Красная JI.B., Постникова Н.Г. -№794509.-опубл.07.10.81, Бюлл .№ 1;

77. Статистическая обработка лабораторных и клинических данных./ Каминский JI.C. -JT.-Медицина, 1984 250с.;

78. Суясов Н.А., Шакир И., Панфилов В.И. Биоконверсия отходов мясоперерабатывающей промышленности в белковую кормовую добавку. // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состяние и перспективы развития».-М. 2003 С.299;

79. Тутельян В.А. Мы оперируем только фактами// Пищевая промышленность -2003-№6-С.5;

80. Тутельян В.А., Сорокина Е.Ю. Медико-биологическая оценка ГМИ пищи: принципы оценки безопасности, методические подходы.// Пищевая промышленность -2003-№6.- С. 17-18;

81. Федорович P.M. Определение состава углеводородов в биологических объектах хроматографическими методами// Хроматография в биологии и медицине.- М.-1985.-С.83-87;

82. Федорович P.M., Сидоров И.П., Шаров В.М. Метод выделения, идентификации и количественного определения углеводородов в растительных объектах// Тез. конф.: IV Всесоюзная конференция по аналитической химии органических соединений. Москва. 1980.-С.191.;

83. Финогенова Т.В. Микробиологическое получение карбоновых кислот. // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».-М. 2003 С.259-260;

84. Фриц В. Определение и оценка ароматических углеводородов // Гигиена и санитария 1986 - №10 -с. 54-55;

85. Чепиго С.В., Бойко И.д., Гололобов А.Д., Крючкова А.П., Воробьева Г.И., Рожкова М.И., Фишер П.Н., Покровский В.К., Коротченко Н.И. Получение кормовых дрожжей из углеводородов нефти. //Прикладная биохимия и микробиология. 1967.-Т.З, №5.-С.577-589;

86. Эрнст Л.К. Влияние интеграции гена рилизинг-фактора соматотропина на фенотип свиней.// Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состяние и перспективы развития».-М. 2003 С.241;

87. Adham G.,Stenhagen E.//Biochemical Applications of Mass Spectrometry.:: N.Y., Acad.Press.-1972.-211p.;

88. Akoto L., Pel R., Irth H., Brinkman U.A.T. and Vreuls R.J.J. Automated GC-MS analysis of raw biological samples Application to fatty acid profiling of aquatic micro-organisms.//J. Anal. Appl. Pyrol.-2005. N 73.- P.69-75;

89. Albro P.W, Fishbein L. Adsorption of aliphatic hydrocarbons by rats//Biochem/Biophys/Acta.-1970.-v.219, N2.-P.437-446;

90. Andersson B.A. Mass spectrometry of fatty acid pyrrolidides. //Prog. Chem. Fats other Lipids.-1978. N16.- P. 279-308;

91. Andersson B.A. and Holman R.T. Pyrrolidides for mass spectrometric determination of the position of double bonds in monounsaturated fatty acids.// Lipids.-1974. N 9. -P. 185-190;

92. Anklam E. Analitical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant -derived food products.// European Food Research and Technology.- 2002. v. 214, N.l -P.3-26;

93. Basile F., Beverly M.B., Abbas-Hawks C., Mowry C.D., Voorhees K.J. and Hadfield T.L. Direct mass spectrometric analysis of in situ thermally hydrolyzed and methylated lipids from whole bacterial cells.// Anal. Chem.-1998. N 70.-P. 1555-1562;

94. Bateman H.G. and Jenkins T.C. Method for extraction and separation by solid phase extraction of neutral lipid, free fatty acids, and polar lipid from mixed microbial cultures. //J. Agric. Food Chem.-1997. N 45.-P. 132-134;

95. Body DF.R. Characterisation of bovine rumen liquor isoprenoid hydrocarbons with reference to dietaiy phytol// Lipids.-1977. -v. 12, N2.-P.204-207;

96. Butler A.C., Sibbalt R.R. Isolation and gas-chromatographic determination of satarated and polycyclic aromatic hydrocarbons in musslls//Buii. Environ. Contain. Toxicol.-1986.-v.34,N4/-P.570-578;

97. Carrapiso A.I. and Garcia C. Development in lipid analysis: Some new extraction techniques and in situ transesterification. // Lipids.-2000.N 35.-P.l 167-1177;

98. Cheng C.F. and Gross M.L. Applications and mechanisms of charge-remote fragmentation. //Mass Spectrometiy Reviews.-2000. N 19.-P. 398-420;

99. Christie W.W. Gas chromatography-mass spectrometry methods for structural analysis of fatty acids.// Lipids.-1998. N 33.-P. 343-353;

100. Christie W.W. Lipid Analysis (3rd Edition): Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids.- Bridgwater.: Oily Press, 2003.- 416p;

101. Cifuenttes A. Detection of Genetically Modified Maize by the Polymerase Chain

102. Cravedi I.P., Tullies I. Accumulation, distribution and depuration in trout of naphtenic and isoprenoid hydrocarbons (dodecylcyclohexan and pristan)//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1982.-v.28, №2.-P.154-157;

103. Cravedi I.P., Tullies I. Distribution and elimination Routes of naphtenic hydrocarbons (dodecylcyclohexane) in Raibow Trout //Bull. Eviron. Contam. Toxicol.-1981 .-v.26,N3.-P.337-347;

104. CX/FBT 02/9, 2002 и CX/MAS 02/8,2002;

105. Desideri R.G., Lepri L., Meimler D., Giannesi S., Checchini L. Concentration, separation and determination of hydrocarbons in sea water // J. Chromatogr. -1984.- v.284, NIO-p. 167- 178;

106. Dillon Т.Н. Dietary accumulation of dimethylnaphthaline by Grass Shimp palaemonetes puquo under stable and fluctuating temperature//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1982.-v.28, N2.-P. 140-151;

107. Dobson G. and Christie W.W. Mass spectrometry of fatty acid derivatives. // Eur. J. Lipid Sci. TechnoL-2002. N 104.-P. 36-43;

108. Dodds E.D., McCoy M.R., Rea L.D. and Kennish J.M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. //Lipids, -2005.N40.-P.419-428;

109. Duijn van G, Biert van R. Bleeker-Marcelis H et al. Detection methods for genetically modified crops // Food control.-1999.-v.l0,N6.-P.375-379;

110. Ebert A.I., Schleifer C.R., Hess S.M. Absorption, disposition and excretion of 3h-Mineral oil in rat//J.Farm.Sci.-1966.-v.55,N9.-P.923-929;

111. Evershed R.P. Mass spectrometry of lipids. In Lipid Analysis. A Practical Approach// R.J.Hamilton.- Oxford.: IRL Press, 1992.-P.263-308;

112. Fang J.S. and Findlay R.H. The use of a classic lipid extraction method for simultaneous recovery of organic pollutants and microbial lipids from sediments. //J. Microb. Methods.-1996. N27,- P. 63-71;

113. Farrington I.W. Biogeochemistry: An everview of the biogeochemistry of fossil fuel Hydrocarbons in marine environmental//Petroleum in marine environmental-advences in chemistry series.-1980.-N185.-P27-34;

114. Fletcher G.L., Kiceniuk J.W., King M.J., Payne L.F. Reduction of blood plasma cooper concentrations in Marine fish following a six month exposure to crude oil//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1979.-v.22, N4/5.- P.548-552;

115. Garces. R. and Mancha. M. One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues.//Anal. Biochem.-1993. № 211.- P. 139-143;

116. Garcia-Canas V., Gonzales R., Cifuenttes A., Detection of Genetically Modified Maize by the Polymerase Chain Reaction and Capillary Gel Electrophoresis with UV Detection and Laser-Induced Fluorescence//J.Agric. Food Chem. 2002,-Vol.50.-P. 1016-1021;

117. Giacometti J., Milosevic A. and Milin C. Gas chromatographic determination of fatty acids contained in different lipid classes after their separation by solid-phase extraction.//J. Chromatogr.-2002. N 976.-P. 47-54;

118. Grigson S.I.W., Matherson I. The role of C-CC-MS in environmental monitoring of North sea oil operarion//British Mass spetrometry society fourteenth meeting 1984-P. 74-79;

119. MO.Grimer G., Jacobs J., Nanjack K.W. Profile of the polycyclic aromatic hydrocarbons from librieatihg oils inventory by GC/MS-PAN in environmental materials, part 1//Fresenins L. Anal/ Chem.-1981.-V.306.-P.347-355;

120. Hasselbaink D.M., Roemen T.1I.M. and Van der Vusse G.J. Determination of long-chain fatty acids in heart and skeletal muscle by capillary gas chromatography.// Anal. Chim. Acta.-2002.N 465.- P.351-357;

121. Hoffman D.I. Embriotoxic and teratogenic effects of crude oil on Mallard Embryon on day one of development//Bull.Environ. Contam. Toxicol.-1979.-v.22, N4/5.-P.632-634;

122. Hubner P., Waiblinger h.-U., Pietsch, et al Validation of PCR Methods for Quantitation of Genetically Modified Plants in Food // Journal of AOAC International.- 2001 .-v.84,N.6.-P. 1855-1864;

123. Jaccaud E., Hohne M., Meyer R Assesment of Screening Methods for the Identification of Genetically Modified Potatoes in Raw Materials and Finished Products. //J.Agric. Food Chem. -2003.-v.-51.-P.550-557;

124. James C. Global Status of Commercialized Biotech//GM Crops:2005. ISAAA Brief N34: Preview. -Ithaka, N.Y.:ISAAA.-2002;

125. James C. Global Status of Commercialized Biotech//GM Crops:2005. ISAAA Brief N34: Preview. -Ithaka, N.Y.:ISAAA.-2004;

126. James C. Global Status of Commercialized Biotech//GM Crops:2005. ISAAA Brief N34: Preview. -Ithaka, N.Y.:ISAAA.-2005;

127. Jump D., Clarke. S. Regulation of gene expression by dietary fat// Annu. Rev. Nutr. 1999. v.-19.-P. 63-90;

128. Kates M. Techniques of lipidology. Isolation, analisys and identification of lipids // From: laboratory techniques in biochemistry and molecular biology.-Elsevier.- 1986. v.3,p.2.- 103p.;

129. Kira S., Isumi Т.,Ogata M. Detection of Dibensothiophene in «Mussel Mytilus edulis» as a marker of pollution by organosul for compounds in marine environmental//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1983.-v.31, N5.-P.518-522;

130. Klein R.A. and Schmitz B. Double bond location in fatty acids; a critical analysis of the feasibility of using specifically deuterated pyrrolidides for mass spectral analysis. //Biomed. Envir. Mass Spectrom.-1986.N 13.-P. 429-438;

131. Knap A.H., Solbakken I.E., dodge R.E.,Sleeter T.D., Wyers S.Y., Palmark R. H. Accumulation and Elumination of 9-14C phenanthrene in the reef-building coral//bull. Environ. Contam. Toxocol.-1982.-v.28, N.3.-P.281-284;

132. Knut G. В., Jensen A.H. Roundup Ready soybean event-specific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses //Eur. Food Ras Technol. -2001 .-v.213.-P. 432-438;

133. KolaftuendyP.E., Hankiu L. Metabolism of a plant waxparaffin (n-nonacosane) in the rat//J.Nutr.-1966.-v.90,N2.-P. 167-174;

134. Kosima S., Babasaki T.,Kiyozumi M. and Nokagava M. Dictribution and excretion of monoisopropylnaphthalene in rats//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1981 .-v.26, N5.-P.626-630;

135. Kuiper H.A. Summary report of the ILSI Europe workshop on detection methods for novel foods derived from genetically modified organisms //Food control. -1999.-v. 10,N6.-P.339-349;

136. Lester D.E. Normal paraffins in living matter occurece, metabolism and pathology//Progress in food and nutrition science.-1979.-v.3, N.1-2.-P.1-66;

137. Leung T.S., Bulkley R.V. Effect of petroleum hydrocarbons on length of uncubation and hatching success in Japanese Madaca//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1979.-v.23, N1/2.-P/236-240;

138. Lichtenthales R.G. Instrumental analysis of petrolium hydrocarbons//Anal. Org. Micropolutants Water: Proc. 3 Ear/ Symp.-Oslo.l983.-Dertecocht, 1984.-P.198-203;

139. Lipp M., Brodman P., Pietsch et. AI. IUPAC Collaborative Trial Stady of a Method to detect Genetically Modified Soy Beans and Maize in Dried Powder//Journal of AOAC International.-1999.-v.82, N4.-P.923-929;

140. List of Completed Consultations on Bioengineered Foods.// FDA/CFSAN Biotechnology.-2005.- http://www.cfcan.fda.gov/~lfd/biocon.html;

141. Livingstone D.R., Wtickle W.B., Kapper M., Shiano Wang Microsomal detoxication ensyme responses of msrine snail "Thais haemastoma " to laboratory oil exposure// Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1986.- v.36, N6.-P.843-850;

142. Meyer R. Development and application of DNA analitical methods for the detection of GMO in food.// Food control. 1999.-Vol.10.-N 6.-P.391-399;

143. Middledith B.S., Basile В., Chang E.S. Alkanes in shrimp from buccaneer oil fielcLVBull.Environ.Contam.Toxicol.-1982-V.29, N1 -p. 18-22;

144. Mitchell C.E. A method for determination of polycyclic aromatic hydrocarbon animal tissue// Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1979-V.23, N6-p.669-673;

145. Mix M.C., Schaffer R.L. Benso (a) pyrene concentration in Mussels (Mytilus edulis) from Yoquana Bay, Oregon during June. 1976 May 1978// Bull. Environ. Cotam. Toxicol. - 1979 - V.23, N6 - p.677-679;

146. Modica R., Fiume M., Bartosek Y. Gas-liquid chromatographic assay of polycyclic aromatic hydrocarbons mixtures: Specifically modofied method for rat tissues// J. Chromatogr.-1982.-v.247.-P.352-355;

147. Overton E.B., Lasater Y.L. Distribution of aromatic hydrocarbons in sedimrnts from selected Atlantic guls of Mexico and Pasific outer Continantal shelf areas//Petroleum in marine environmental. Advances in chemistry series.-1980., N5.-P.327-341;

148. Padgette R.S., Taylor N.B., Nida D.L. The Composition of Glyphosate -Tolerant Soybean Seeds is Equivalent to That of Conventional Soybeans // J.Nutrition.-1996.-v. 126.-P.702-716;

149. Palmark K.H., Solbakken J.E. Distribution and elumination of 9-I4C phenanthrene in house mussel//Bull. Environ. Contam. Toxicol-1981.-v.26,N2.-P.196-199;

150. Pan L. and Pawliszyn J. Derivatization/solid-phase microextraction: New approach to polar analytes.// Anal. Chem.-1997. N 9.- P. 196-205;

151. Pancirou P.J., Scazl T.D., Brown R.A. Methods of analysis for polynuclear aromatic hydrocarbons in environmental samples// Petroleum in marine environmental advantage in chemistry series 1980. -№185. -p. 123-140;

152. Petrakis L., Jewell, Benusa W.F. An overview of prictices in petroleum industry laboratories with emphasis on biodegradotion//Petroleum in marine environmental.-1980.-N 185.-P.92-97;

153. Polynuclear aromatic hydrocarbons in Drinking-water. Guidelines for Drinking-water Quality.// who.sde.wsh.03.04/59.-1998;

154. Popovic M. , Gernecevil N., Dimovski I. Absorption of n-parafins in the rat//Acta Pham/Yogoslav.-1973.-v.23,N4.-P.195-201;

155. Popping B. Methods for the detection genetically modified organisms: Precision, pitfalls and proficiency // International Laboratory.- 2001. № 5.-P.23-29;

156. Popping B. Methods for the detection genetically modified organisms: Precision, pitfalls and proficiency//International Laboratory.-2001.-N5.-P-23-29;

157. Rogan G.J., Dudin Y.A., Lee T.C. Immunodiagnostic methods for detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Roundup Ready soybeans //Food control.-1999. v.10,N 6.-P.407-414;

158. Rontani J.F., Christodoulou S. and Koblizek M. GC-MS structural characterization of fatty acids from marine aerobic anoxygenic phototrophic bacteria.// Lipids.-2005. N 40.-P. 97-108;

159. Rosales F.H. Yeast as protein source for human nutrition//Acta microbial. Hung.-1984.-v.31 ,N3.-P. 153-172;

160. Roubal W.T., Collier Т.К., Malins D.S. Accumulation and metabolism of carbon-14-labeled benzene, naphthalene and anthracene by young Coho salmon// Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1977.-v.5.-P.513-518;

161. Russell L.C., Fingerman M. Exposure to water soluble fraction of crude oil or naphthalenes alters breathing rates in gulf killfish "Fundulus graundis'7/Bull. Evinron. Contam. Toxicol.-1984.-v.32,N3.-P.363-368;

162. Ryhage R., Stenhagen E.//Masss Spectrometry of Organic Ions.: N.Y., Acad.Press.-1963. 349 p.;

163. Schewerbrandt G., Block K.I.// J. Biol. Chem.- 1962.V.237.-P.2064; Goldfine G.//J. Biol. Chem. -1974.V.239.-P.3130;

164. Schlunegger U.P. Distribution patterns of n-Alkanes in human liver, urine and sweat//Biochem. Biophys. Acta/-1972.-v.260, N3.-P-339-344;

165. Slieter T.D., Butler J.N., Barbash J,E. Hydrocarbons in the sediments of the Bermuda region: Lagoonal to Abyssial depths// Petroleum in marine environmental. Advances un chemistry series.-1980.-N.185.-P. 142-147;

166. Solbakken J.E., Knap A.H. Desposition of Phenanthrene and Octachlorstyrene in spiny lobsters "Panulirus aegus" after intragastic administration//Bull.Environ.Contam.Toxicol. -1986. -v.37, N5 P.747-751;

167. Solbakken J.E., Knap A.H., Sislr C.E., Palmork K.H. Uptake and elumination of 9-14C phenanthrene in turkey mind mussel (Asra rerba)//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1983.-v.30,N4.-P.420-422;

168. Solbakken J.E. , Jeffry F.M.H., Knap A.H., Palmark K.H. Accumulation and elumination of 9-HC phenanthrene in calico clam (Macrocalista macukata)//Bull. Environ. Contam. Toxicol.-1982.-v.28, N5.-P.530-534;

169. Solbakken J.K., Knap A.H., Palmork K.H. Desposition of (9-14C)phenanthrene in subtropical marine Fellost (Haemulou sciurus)//Bull.Environ.Contam.Toxicol.-1982.-v.28, N3.-P.285-286;

170. Terrorist threats to food: guidance for Establishing and Strengthening Prevention and Response Systems.// Food Safety Department. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. 2002. - ISBN 92 4 154584 4;

171. Tullies J., Bories G. Metabolism of paraffinic and naphthenic hydrocarbons in the higher animals II Accumulation and Mobolisation in rat// Ann.Nutr.Alim.-1975.-v.29, N6.-P.213-221;

172. Tullies J., Bories G., Peleran J.C. Effect of prologed ingestion of paraffin oil by the pig. Selective retention,interference with cholesterol metabolism//Hebd.Seances Acad.Sci.Ser.D.-1975.-v.280, N19.-P.2261 -2264;

173. Tullies J.,Bories G. Metabolism of paraffinic and naphthenic hydrocarbons in the higher animals I retention of paraffins in rat// Ann.Nutr.Alim.-1975.-v.29,N6.-P.201-211;

174. Tulliez I.,Bories G.,Boudene C., Fevrier C. Hydrocarbons of Spirulins Alga: their nature and the fate of heptadecane fed to the rat and pig//Ann.Nutr/Alim.-1975.-v.29,N6.-P.563-572;

175. Vaczi V. The Biological Role of bacterial Lipides.: Budapest.- 1973, 185 c.; Kaneda T.// Bacteriolog. Rev. -1977. -V.4,. №2.- P.301;

176. Vangildcr L.D., Peterle T.Y. South Louisiana grude oil and DDE in the diel of Mallard hens Effect on reproduction and diclingII Bull. Environ. Contam. Toxicol. -1980., v.25, N 1.-P.63-67;

177. Vetter W. and Walther W. Preparation of pyrrolidides from fatty acids via trimethylsilyl esters for GC-MS analysis.// J.Chromatogr.-1990, N513. -P 405407;

178. Vetter W. and Walther W. Pyrrolidides as derivatives for the determination of the fatty acids of triacylglycerols by gas-chromatography. //J. Chromatogr. A.-1994, N 686.-P. 149-154;

179. Wainer J.D., Rigger R.M., Engel T.M. Racant advances in determination of aromatic hydrocarbons in zooplankton and makfauna// Petroleum in marine environmental. Advances un chemistry series.-1980, N.185.-P,164-169;

180. Zimmermann A., Liniger M., Luthy J. et al A sensitive detection method for genetically modified MaisGard TM corn using a nested- PCR system. Lebensm.-Wiss.U.-Technol. 1998, N 31.-P.664-667;

181. Zitko V. The analysis of aquatic sediments for organic compounds // Contaminants and sediments. Analysis, chemistry, biology. Ad. Baker R.A. -1980 —v. 1 -p.89-92.