Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Разработка метода лечения ожоговой ишемии коньюнктивы с применением оксида азота

На правах рукописи

Скала Софиан Бен Мохамед

Разработка метода лечения ожоговой ишемии конъюнктивы с применением оксида азота (экспериментальное исследование)

14.00.08 - глазные болезни 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: Д.м.н.,профессор Р.А.Гундорова Д.б.н.,профессор Н.БЛеснокова

Москва -2005

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца (Директор - доктор медицинских наук, профессор В.В.Нероев)

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор Р.А.Гундорова доктор биологических наук, профессор Н.Б.Чеснокова

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук, профессор А.В.Хватова доктор медицинских наук, профессор Наумов Ю.И.

Ведущая организация - Российская медицинская академия

последипломного образования

Защита состоится «_10_»_мая_2005г. в_14_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.042.01 при Московском научно-исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца по адресу: 103064, г.Москва, ул. Садовая-Черногрязская, дом 14/19

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИ глазных болезней им Гельмгольца.

Автореферат разослан «_»_2005г.

Учёный секретарь диссертационного совета - доктор медицинских наук,

профессор М-Б.Кодаов

Ожоги являются тяжёлыми повреждениями органа зрения, составляют от 6.1 до 38.4% всех травм глаза и приводят в 40% случае к инвалидности 1-2 группы по зрению (Пучковская Н.А.,1987, Либман Е.С.,1986).

Повреждение сосудов конъюнктивы, особенно краевой петлистой сети, в 40%- 70.7% случаях при тяжелых ожогах глаз является основной причиной осложнений, приводящих к развитию рецидивирующих эрозий, изъязвлений и перфораций, формирования грубого бельма роговицы, иридоциюшта, экссудации в переднюю камеру, повышения ВГД, помутнения хрусталика, развития симблефа-рона, анкилоблефарона (Тартаковская А.И.1968; Гундорова Р.А.1974; Волков В В. 1989; Ченцова Е.В.1999; Макаров П.В 2003, Дадашева З.Р. 2004).

Ожоговая ишемия конъюнктивы предшествует некрозу конъюнктивы.

Восстановление кровотока в пораженной конъюнктиве создает возможность не только интенсивной доставки питательных веществ к обожженным участкам, но также обеспечивает быстрое выведение из тканей токсических продуктов ( Гундорова Р. А, Бордюгова Г Г. 1974; Ченцова Е.В. 1998г.)

Проведение своевременного лечения, направленного на восстановление сосудов в ишемизированной конъюнктиве и в зоне лимба, может значительно улучшить функциональные результаты и избежать многих осложнений.

В связи с этим, поиск новых эффективных методов, направленных на восстановление кровообращения при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы, является актуальной проблемой.

В последнее время в регуляции сосудистого тонуса и гемостаза большую роль отводят биорегулятору оксиду азота, которая осуществляется благодаря его сосудорасширяющему, антиагрегантному и антитромбогенному действию (Ванин А.Ф. 80-е годы и по наст, время, Murad F., 1977, Furchgott R., 1980, Ignarro L 1987, Нероев B.B., Архипова M.M.,1997-1999).

В работах, проводимых в НИИ Гельмгольца, была показана эффективность лечения экспериментальных ожоговых травм роговицы с помощью газового потока, содержащего оксид азота. Был подобран оптимальный режим воздействия,

при котором нормализуется микроциркуляция, ослабляется воспалительная экссудация и клеточная инфильтрация, усиливается регенерация эпителия и эндотелия, создаются условия для сохранения нативной архитектоники стромы и снижения степени послеожогового помутнения роговицы (Гундорова P.A., Чеснокова Н.Б, Шехтер А.Б., Кваша О.И, Горбачева O.A., Косакян С М. 1999-2004г г).

Влияние оксида азота на ожоговую ишемию конъюнктивы не изучено.

Целью данной работы явилось исследование влияния оксида азота на течение репаративных процессов и некоторые показатели метаболизма при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы и оценка возможности его использования в комбинации с другими препаратами.

Задачи исследования: Отработать модель ожоговой ишемии конъюнктивы у кроликов. Изучить влияние оксида азота на состояние конъюнктивы при экспериментальной ожоговой ишемии и биохимические процессы в слёзной жидкости (протеиназно-ингибиторный баланс и антиокислительную активность).

Изучить влияние комплексного применения оксида азота и антипротеолитическо-го препарата на клинические проявления и биохимические процессы в слёзной жидкости (протеиназно-ингибиторный баланс) при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы.

Исследовать влияние комплексного применения оксида азота и эмоксипина на клинические проявления и биохимические процессы в слёзной жидкости (антиокислительная активность) при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы Разработать оптимальный режим лечения ожоговой ишемии конъюнктивы с применением оксида азота в газовом потоке в комплексной терапии ожогов глаз

Научная новизна и практическая значимость:

-Впервые доказано, что оксид азота в газовом потоке способствует восстановлению сосудов и улучшению микроциркуляции при ожоговой ишемии конъюнктивы.

- Впервые показана эффективность применения оксида азота в газовом потоке в комплексном лечении с гордоксом и эмоксипином при ожоговой ишемии конъюнктивы

- Впервые показано влияние газового потока, содержащего оксид азота, на биохимические показатели слезной жидкости (трипсиноподобную, ангитршпиче-скую активность, уровень аг-макроглобулина, антиокислительную активность) и в комплексном применении с гордоксом и эмоксипином при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы

Практическая значимость работы:

- разработан новый эффективный метод лечения ожоговой ишемии конъюнктивы с применением оксида азота в газовом потоке

- доказана эффективность применения оксида азота в газовом потоке в комплексном лечении с гордоксом и эмоксипином для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы

- разработана схема лечения ожоговой ишемии конъюнктивы с применением оксида азота, гордокса и эмоксипина.

-применяемый для лечения аппарат "Плазон" не требует стерилизации, расходного материала, мобилен, автономен, надежен и прост в эксплуатации, что позволит его использовать в широкой клинической практике, как в стационаре, так и в амбулаторных условиях.

Положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Оксид азота в газовом потоке способствует улучшению микроциркуляции и восстановлению сосудов в зоне ишемии конъюнктивы, установлен оптимальный режим воздействия: время экспозиции, сроки и кратность воздействия.

2. Результаты калиброметрии показали, что наибольшее расширение микрососудов конъюнктивы с максимальным расширением резервных капилляров наблюдается при концентрации N0-011 =300 ррт и экспозиции 15 сек.

3. При воздействии на ишемизированную конъюнктиву NO-СГП с экспозицией 15 сек в слёзной жидкости происходит более раннее, по сравнению с нелеченными животными, повышение трипсиноподобной активности, при этом происходит возрастание антипротеолитического потенциала, что свидетельствует об ускорении и улучшении течения репаративных процессов.

4 Показано положительное влияние лечения ожоговой ишемии конъюнктивы NO-СГП на характер изменения антиокислительной активности слезной жидкости.

5 На основании результатов оценки клинической картины течения ожоговой ишемии коньюнктивы и полученных биохимических данных доказано, что лечение щелочного ожога глаз NO-СГП и гордоксом целесообразно проводить последовательно- в течение первых трех суток после травмы следует применять NO-СГП по отработанной схеме, затем в течение 10-14 дней проводится лечение гордоксом в виде инсталляций 4 раза в день

6 Результаты данных клинических и биохимических исследований показали преимущество сочетанного лечения N0- СГП с эмоксипином в виде инсталляций 3 раза в день в течение 21 дня.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены: на научно-практических конференциях, на межотделенческой конференции в МНИИ ГБ им. Гелъмгольца (Москва, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 7 работ. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 196 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы.

Работа содержит 19 таблиц, 31 рисунок, 74 фотографии. Список литературы включает 362 источника, из них 200 отечественных и 162 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Проведено 4 серии экспериментальных исследований на 87 кроликах породы шиншилла массой 2,5-3 кг.

В первой части работы отработана модель ожоговой ишемии конъюнктивы у кроликов (9 кроликов, 18 глаз). Во второй исследовано влияние различных доз оксида азота в газовом потоке на течение ожоговой ишемии конъюнктивы глазного яблока (20 кроликов, 40 глаз). В третьей части работы исследовано комплексное лечение оксидом азота и ингибитором протеиназ (гордоксом) ожоговой ишемии конъюнктивы (19 кроликов, 38 глказ). В четвертой части работы исследовано комплексное лечение оксидом азота и эмоксипином ожоговой ишемии конъюнктивы (22 кролика, 44 глаза).

Калиброметрия микрососудов конъюнктивы проведена на 17 (34 глаза) кроликах по негативам на стереокомпараторе "ЗОМЗ". Диаметр сосудов измеряли по крайним границам заполняющего их столба крови, так как стенки микрососудов не контрастируются.

Проведено биохимическое исследование 187 образцов слёзной жидкости, взятой с помощью кругов фильтровальной бумаги до нанесения химического ожога конъюнктивы и роговицы, на 1,3, 7,14,21, 28 сутки после него. В элюате слезы определяли активность трипсиноподобных сериновых протеиназ (ТПА), ингибитора протеиназ аг-макроглобулина (аг-МГ) и суммарную антитриптическую активность (ATA). Определение проводили ферментативным методом с использованием синтетического субстрата - И-бензоил-ОЬ-аргинин-р-нитроанилида (БАПНА).

Измерение оптической плотности образцов проводили на электрофотометре UV-160AV Шимадзу (Япония). При расчете ферментативной активности в слезной жидкости были использованы значения удельной активности, т. е. активности, отнесенной к 1мг белка в ферментном препарате. Концентрацию белка в про-

бе определяли по методу Лоури и соавт. Ферментативную и ингибиторную активность выражали в ммоль/мин. мг белка.

Для изучения антиокислительных свойств слезной жидкости использован метод регистрации кинетики хемилюминесценции (ХЛ) люминола в модельной системе гемоглобин-НгОг-люминол (НЬ- Н2О2 -Лм), в которой в качестве субстрата окисления выступает люминал. Введение в модельную систему анти-оксидантов приводит к торможению СЮ люминола. Это проявляется в изменении параметров кинетики ХЛ; в качестве измеряемого параметра использовали величину латентного периода. Антиокислительную активность (АОА) слезы выражали в мМ тролокс-эквивалента.

Эксперименты проведены совместно со старшим научным сотрудником отдела травм органа зрения, реконструктивной хирургии и глазного протезирования МНИИ ГБ им. Гельмгольца, кандидатом мед.наук Кваша О.И.

Исследование переднего отрезка глазного яблока осуществляли с помощью фотощелевой лампы "гекБ-кпа" (Германия). Фоторегистрацию проводили на позитивной пленке "Со(1ас-100 Б".

Фотощелевая лампа '^¿ЗБ-кпа" обеспечивает увеличение при визуальном наблюдении от 10х до 40х и увеличение на негативе 1,6х, 2,5х, 4х. Для получения обзорных фотоснимков сети конъюнктивальных сосудов использовали увеличение 2,5х. Фотосъемку проводили со вспышкой с матовым стеклом на осветителе при полном открытии апертурной диафрагмы щелевой лампы и диафрагмы фотоаппарата - 3. Мощность импульсной лампы - 240 Дж, режим - 3, экспозиция -1/30 сек.

В качестве источника МО-содержащего газового потока (ЫО-СГП) использовали медицинский воздушно-плазменный аппарат "Плазон", разработанный группой ученых из НИИ энергетического машиностроения МГТУ им. Н.Э. Баумана (директор - канд. тех. наук Крылов В.И., разработчик- к т.н. Пекшев А.В.) Принцип действия аппарата основан на электрохимической реакции, когда под действием электрической дуги из атмосферного воздуха образуется плазма. Охлаждение плазмы до 35-45°С приводит к образованию газового потока, специфи-

ческой составляющей которого является оксид азота (N0). Высокая температура реакции (3000°С) обеспечивает стерильность потока, что является одним из преимуществ данного аппарата Концентрация оксида азота в газовом потоке зависит от расстояния выходного канала манипулятора аппарата до объекта воздействия и от температуры. Чем больше расстояние, тем меньше концентрация N0, и чем больше температура, тем больше концентрация N0. Расстояние, на котором N0-СГП оказывает терапевтический эффект на заживление ран мягких тканей, установлено эмпирическим путем и составляет 200 мм до объекта воздействия (Шех-тер А.Б., 1998). С помощью газового анализатора "КМ 9006 Quintox" было установлено, что на этом участке газового потока содержание оксида азота (NO) составляет 300 pprn (particles per million - количество частиц газа на 1 миллион частиц смеси газов, в которой этот газ находится), двуокиси азота (NO2) - 30 pprn и угарного газа (СО) - 3 pprn, содержание кислорода (Ог), азота (N2), углекислого газа (СО2) практически соответствует их нормальному содержанию в атмосфере (Шехтер А.Б., 1998). Аппарат "Плазон" мобилен, автономен, надежен и прост в эксплуатации, не требует расходного материала и стершшзационных процедур, что позволяет использовать его как в стационаре, так и в амбулаторных условиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для определения экспериментальной модели ожоговой ишемии конъюнктивы были проведены 2 серии эксперимента: с различной экспозицией воздействия 10% раствором NaOH ( 10,15,20,40 сек.) и различным объёмом повреждения (изолированный ожог конъюнктивы и сочетанное повреждение 1/4 роговицы и3А конъюнктивы).

В первой серии эксперимента (6 кроликов) ожог наносили на оба глаза животного с помощью диска полулунной формы из хлопчатобумажной ткани диаметром 7 мм, пропитанного 10% раствором NaOH, на область верхневнутреннего квадранта конъюнктивы, не захватывая роговицу. Время экспозиции -10,15,20 сек. После удаления травмирующего агента роговицу промывали 30 мл физиологического раствора.

При оценке клинической картины, проводимой на 1, 2, 3 сутки, определялось субконьюнктивальное кровоизлияние и отсутствие зоны ишемии конъюнктивы.

Во второй серии эксперимента (3 кролика) у животных моделировали дозированный по площади и глубине щелочной ожог Ш степени. Для моделирования ожога части роговицы, части конъюнктивы и фрагмента лимба использовали круги 0=7 мм из тонкой хлопчатобумажной ткани, пропитанные 10% раствором ИаОН, которыми наносили тяжелый дозированный щелочной ожог% конъюнкт ивы и 1/4 области роговицы в верхне-внутреннем квадранте глазного яблока. Круги наносили на 40 секунд, затем удаляли и промывали глаза 20 мл физиологического раствора.

Клиническая оценка, проводимая на 1, 2, 3 сутки, показала наличие ожоговой ишемии конъюнктивы, ишемию пернлимбальных сосудов и помутнение соответствующего отрезка роговицы.

Данная модель была выбрана для дальнейшей экспериментальной работы. Для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы использовали терапевтическую дозу N0-011, улучшающую микроциркуляцию (концентрация N0 - 300 ррт, экспозиция 15-60 сек). Экспериментальным путем был подобран оптимальный режим воздействия N0-0111. Для этого изменяли время экспозиции. Животные были разделены на четыре группы (одна из них контрольная).

Клинические проявления ожоговой ишемии конъюнктивы глаз оценивали во всех экспериментах по бальной системе на 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 21 сутки по 10 критериям: отделяемое из конъюнктивальной полости, площадь ишемии, отёк, окраска конъюнктивы в зоне ишемии, гиперемия окружающей конъюнктивы, густота сосудов в зоне ишемии и в зоне лимба (краевой петлистой сети), васкуляри-зация роговицы, наличие симблефарона, глубина дефекта роговицы в зоне лимба.

Парный глаз в качестве контроля не использовали, так как нельзя исключить возможность попадания на него газообразного оксида азота.

В контрольной группе в послеоперационном периоде лечение не проводили.

Для определения влияния оксида азота при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы и выбора оптимальной дозы воздействия опытные животные были разделена на 3 подгруппы, в зависимости от времени экспозиции (табл. 1). Воздействие проводили с расстояния 200 мм 3 раза в течение заживления - через сутки после ожога конъюнктивы, через 2-е и 3-е суток.

Таблица 1. Схема эксперимента по определению оптимального режима воздействия N0-071 для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы глаз.

Группа Начало лечения Режим воздействия N0-011 Кол-во воздействий

1. Через 24 часа Кони N0 300 ррт, экспозиция 15 сек, ежедневно. 3

2 Через 24 часа Конц. N0 300 ррт, экспозиция 30 сек, ежедневно 3

3 Через 24 часа Конц N0 300 ррт, экспозиция 60 сек, ежедневно 3

4 контроль Лечение не проводилось

Результаты эксперимента показали что, во всех опытных группах по сравнению с контрольной, быстрее уменьшилась воспалительная реакция и быстрее произошло восстановление более нежной сосудистой сети в зоне ишемии конъюнктивы (рис.1). Ж)-СГП со временем экспозиции 15 секунд при трехкратном воздействии (через сутки после ожога, вторые и третьи сутки), уменьшает гиперемию и отёк конъюнктивы, способствует быстрому восстановлению нежной сосудистой сети в зоне ишемии и краевой петлистой сети, что способствует быстрому уменьшению площади ишемии и конъюнктива становится розовой уже к 7 суткам, образованию умеренной васкуляризации роговицы не сопровождающейся её изъязвлением, отсутствием симблефарона.

N0-011 с экспозицией 30 сек. также как в первой группе способствовал более быстрому восстановлению конъюнктивы, но в более поздние сроки.

По клиническим данным в группе N0-011 бОсек. при трёхкратном воздействии (через сутки после ожога, вторые и третьи сутки) гиперемия и отёк конъюнктивы сохраняется до 21 суток, но восстановление сосудов в зоне ишемии и краевой петлистой сети происходит уже после первого воздействия N0-011, но сосуды более грубые по сравнению с группами ЖМХП 15 и ЗОсек. Роговица быстрее восстанавливает прозрачность. Васкуляризация умеренная, изъязвление роговицы не наблюдалось. Важным недостатком данной дозы N0-0111 является наличие на трёх глазах симблефарона.

Таким образом, N0-0111 со временем экспозиции 15 секунд при трехкратном воздействии (через сутки после ожога, вторые и третьи сутки), уменьшает гиперемию и отёк конъюнктивы, способствует быстрому восстановлению сосудов в зоне ишемии и краевой петлистой сети, в связи с этим быстрее оказывает лечебный эффект в зоне ожога, таким образом является более предпочтительной по сравнению с другими экспозициями.

Для подтверждения полученных данных, нами проведена калиброметрия сосудов конъюнктивы.

В первом эксперименте использовали 9 кроликов (18 глаз) которые были разделены на 3 группы по 3 кролика (6 глаз) в каждой:

1 группа - химический ожог конъюнктивы, части роговицы и фрагмента лимба с последующим ежедневным воздействием на передний отрезок глаза N0-СГП в течение 15 секунд на 2,3,4 сутки после ожога; 2 группа - то же воздействие N0-0111 в течение 30 секунд; 3 группа - контроль.

площадь ишемии

конгрохъ N0-15 сек N0-30 сек N0-66 ев*.

Рис. 1. Динамика выраженности величины площади ишемии в зоне ожога в контроле и в опытных группах при воздействии разных режимов N0-1111

* - отличие от уровня контроля статистически достоверно р < 0.05

диаметр микрососудов коньюнкгивы

"•250 200 150 100 50

N015 сек N030 сек -Контро/ь

1

8

15

22 СУТКИ

Рис.2. Динамика расширения микрососудов в зоне ишемии конъюнктивы в контроле и в опытных группах при воздействии разных режимов N0-0111 По оси абсцисс - сроки наблюдения, сутки По оси ординат - изменения калибра сосудов конъюнктивы, в % от исходного *) - р< 0,05

Микрососуды конъюнктивы обоих глаз фотографировали до воздействия N0-СГП и через 1, 2, 8, 15, 22 дня после ожога (Рис.2). Через сутки после ожога во всех группах отмечалось увеличение плотности сосудистой сети конъюнктивы за счет раскрытия нефункционирующих резервных капилляров. Диаметр измеряемых микрососудов в первые сутки увеличился по группам в 2,5; 2,4; 1,7 раза соответственно. Максимальное расширение микрососудов конъюнктивы во всех группах было отмечено на 8 сутки после ожога (в 3,7; 3,4; 2,4 раза соответственно) и продолжалось до 15 суток и снизилось к 22 суткам.

Таким образом, наибольшее расширение микрососудов конъюнктивы с максимальным раскрытием резервных капилляров, продолжавшееся весь период наблюдения, получено при ежедневном воздействии на глаз кролика ЬЮ-СГП в течение 15 секунд. Это способствовало поддержанию постоянного активного кровоснабжения и регенерации поврежденных при ожоге тканей.

Полученные результаты свидетельствуют, что в клинических исследованиях для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы следует предпочесть воздействие МО-СГП на конъюнктиву в течение 15 секунд.

В нашей работе исследовано влияние оксида азопга и широко используемого для лечения ожогов глаз ингибитора протеиназ ( гордокса) на состояние сосудов конъюнктивы при лечении ожоговой ишемии.

Для определения эффекта совместного воздействия оксида азота и ингибитора протеиназ при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы исследование проведено на 19 кроликах.

Таблица 2. Схема эксперимента по исследованию совместного действия N0-СГП и ингибитора протеиназ (гордокса) при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы глаз.

Группа Начало лечения Способ лечения Количество

после ожога воздействий

1 Через 24 часа N0-011300 ррт, экспозиция 15 сек №3

ежедневно.

2. Через 24 часа 4раза в день

Инсталляции гордокса, ежедневно в теч 7 дней

3 Через 24 часа N0-0117 300 ррт, экспозиция 15 сек + инсталляции гордокса ежедневно №3 4раза в день в теч 7 дней

4 Контрольная группа Лечение не проводилось

5. Ингактная группа, для биохимических исследований слезы

После ожога глаза животных 1-ой опытной группы (4 кролика) подвергали воздействию Ж)-содержащего газового потока с концентрацией 300 ррт, экспозицией 15сек., лечение 2-ой опытной группы ( 4 кролика) проводили препаратом гордоксом (Гедеон Рихтер, Венгрия) в виде инсталляций ампульного раствора ( 100 ООО КИЕ в 10 мл). Лечение гордоксом проводили 4 раза в день в течение 7 дней. В 3-ей опытной группе ( 4 кролика) лечение проводилось одновременно двумя методиками Животные были разделены на пять групп (одна из них контрольная -4 кролика и 3 кролика интактных для контроля при биохимических исследования слезы).

Рис. 3. Динамика выраженности площади ишемии в зоне ожога в контроле и в опытных группах при воздействии N0-011 и гордокса. * - отличие от исходного уровня статистически достоверно р < 0.05

Результаты эксперимента показали, что во всех опытных группах по сравнению с контролем раньше уменьшилась воспалительная реакция и наступило восстановление сосудов в зоне ишемии конъюнктивы (на 10 сутки) н краевой петлистой сети (на 7 сутки), отсутствовало изъязвление роговицы. В группах с применением гордокса раньше восстановилась прозрачность роговицы, но было более интенсивное расширение восстановленных сосудов в зоне ишемии, в то время как воздействие N0-011 без применения гордокса способствовало образованию более нежной сосудистой сети в зоне ишемии, краевой петлистой сета и умеренной васкуляризации роговицы. Для подтверждения результатов эксперимента нами проведено исследование калиброметрии микрососудов конъюнктивы.

Во второй части эксперимента калиброметрии микрососудов конъюнктивы проводили лечение химического ожога конъюнктивы, части роговицы и фрагмента лимба в 2 группах кроликов: 1 группа (4 кролика - 8 глаз) - лечение гордок-сом;

2 группа (4 кролика - 8 глаз) - лечение гордоксом в сочетании с N0-011.

Микрососуды обоих глаз кроликов фотографировали до и после курса ежедневного применения гордокса и гордокса в сочетании с N0-0111 на протяжении двух недель. Полученные данные свидетельствуют о том, что расширение микрососудов конъюнктивы кроликов началось с первого дня и сохранялось на протяжении всего эксперимента. Увеличение диаметра микрососудов преобладало во 2 группе, где применение гордокса сочеталось с воздействием на конъюнктиву N0-СГП.

При сравнении результатов I и II экспериментов нами отмечено, что наибольшее расширение микрососудов конъюнктивы с максимальным расширением резервных капилляров наблюдалось в группе кроликов, получавших лечение только N0-071.

В развитии воспалительной реакции, возникающей в тканях глаза в ответ на

щелочной ожог, важнейшая роль принадлежит протеолитическим ферментам, в частности, трипсиноподобным сериновым протеиназам. Эти ферменты разрушают поврежденные белковые молекулы, подготавливая тем самым ткани к последующей репарации, активизируют другие ферментные системы, участвующие в репаративных процессах. Однако, чрезмерная активация протеолитических ферментов может привести к повреждению здоровых тканей и развитию осложнений ожоговой болезни в виде изъязвления, которое, как правило, заканчивается образованием грубого рубца, а иногда приводит к перфорации.

Существует несколько механизмов, контролирующих активность протеи-наз, но наиболее универсальным и распространенным является регуляция, осуществляемая с помощью мощной системы ингибиторов этих ферментов.

Основными ингибиторами сериновых трипсиноподобных протеиназ в слезной жидкости являются ai-антитрипсин (щ-АТ) и аг-макроглобулин (аг-МГ). Существует три основных пути поступления ингибиторов протеиназ в слезную жидкость: поступление из кровеносного русла в результате увеличения проницаемости сосудов конъюнктивы; синтез ингибиторов протеиназ de novo клетками конъюнктивы; поступление ингибиторов протеиназ из клеток моноцитарно-макрофагального ряда.

Поскольку известно, что N0 оказывает влияние на все перечисленные процессы, нами исследовано влияние воздействия NO-СГП, гордокса и их сочетания на протеиназно-ингибиторный баланс в слезе (Рис.4,5,6).

Результаты исследования показали более раннее повышение ТПА в слезе животных, обработанных NO-СГП, что можно считать благоприятным фактором, так как трипсиноподобные протеиназы принимают активное участие в удалении некротизированных тканей и являются необходимым условием успешной дальнейшей регенерации.

' Трипсиноподобная активность в слезе кроликов в % от контроля —♦— нелеченные

%

350 -i

—■—гардокс

300-

/

гордокс+NO N0

контроль

250-

200

150

100

50-

0

0

7

14

21

сутки после ожога

Рис. 4. Изменение активности трипсиноподобных протеиназ в слезной жидкости кроликов при ожоговой ишемии конъюнктивы и влияние на неё NO-СГП и гордокса; по оси абсцисс - время после ожога в сутках;

по оси ординат - активность трипсиноподобных протеиназ в % от уровня активности трипсинопо добных протеиназ у ингактных животных *) - р< 0,05.

Наиболее низкие значения ТПА на протяжении всего эксперимента наблюдались в группе, получавшей гордокс, что объясняется ингибирующим действием апротинина на трипсиноподобные протеиназы.

В период с 7 по 21 сутки самые высокие значения антитриптической активности (ATA) отмечены в группе, получавшей лечение NO-СГП, при лечении гор-доксом - самые низкие, а при совместном применении гордокса и NO-СГП уровень ATA в слезе занимал промежуточное положение и не отличался от уровня ATA у не леченных животных.

Ангигригтгжеская активность в слезе кролжов в % от контроля

_UAnÉUAUUklfl П01ЮЧ9ПП01«

гордою -гордокс+NO -NO

контроль

14 21

сутки после ожога

Рис. 5. Изменение антатрштгической активности в слезной жидкости кроликов при ожоговой ишемии конъюнктивы и влияние на неё NO-СГП и гордокса по оси абсцисс - время после ожога в сутках;

по оси ординат - антитриптическая активность в % от уровня контроля.*) - р< 0,05

В период с 3 по 14 сутки у большинства животных активность а^-МГ постепенно снижалась, а на 21 сутки отмечался небольшой подъем, отвечающий увеличению трипсиноподобной активности (ТПА) в этот момент, причем, как и в случае с ATA, в группе, получавшей лечение NO-СГП, он оказался самым высоким, что является благоприятным признаком.

Полученные данные свидетельствуют о разнонаправленном действии оксида азота и ингибитора сериновых протеиназ апротинина (действующее начало препарата Гордокс) на воспалительную реакцию, развивающуюся после ожога роговицы. Оксид азота (N0) способствует ускорению макрофагальной реакции на

ожог и расширению сосудов. Апротинин, напротив, замедляет миграцию макрофагов в зону воспаления и снижает проницаемость сосудов.

nanñfiftian »о

—■—гордсжс —*—гаяпмс+NO

—У— N0

КОНфОЛЬ

200

150-

100

50

О

0

7

сутки пост ожога

14

21

Рис. 6. Изменение уровня агмакроглобулина в слезной жидкости кроликов при ожоговой ишемии конъюнктивы, влияние на него NO-СГП и гордокса по оси абсцисс - время после ожога в сутках;

по оси ординат - антитриптическая активность в % от уровня у интактных животных.

* - отличие от уровня контроля статистически достоверно р < 0.05

Полученные нами биохимические данные и результаты оценки клинической картины течения ожоговой болезни глаз позволяют сделать вывод о том, что лечение щелочного ожога глаз NO-СГП и гордоксом целесообразно проводить следующим образом: в течение первых трех суток после травмы следует применять NO-СГП по отработанной схеме, а затем в течение 10-14 дней проводить лечение гордоксом. Такая схема лечения обеспечит быстрое и эффективное протекание первой фазы раневого процесса, направленной на очищение раны. Применение гордокса после воздействия NO-СГП позволит снизить активность протеин аз, ги-перакгивация которых в эти сроки может способствовать расширению зоны некроза.

Ожоговая болезнь глаз, как любой воспалительный процесс сопровождается активацией свободнорадикальных реакций Для снижения активности свободно-радикальных процессов в офтальмологии, в частности, для лечения ожогов глаз традиционно применяют эмоксипин (Ченцова Е.В.,1991). При этом отмечалось положительное действие эмоксипина на течение послеожогового процесса. Особенностью воздействия эмоксипина на обожженную роговицу является предупреждение образования грубого помутнения роговицы в исходе ожога

Учитывая, вышесказанное, нами изучено совместное влияние N0- содержащего газового потока и эмоксипина на течение ожоговой ишемии конъюнктивы.

Исследование проведено на модели ожоговой ишемии конъюнктивы у 22 кроликов. После ожога глаза животных 1-ой опытной группы (5 кроликов) под вергали воздействию Ж)-содержащего газового потока, экспозицией 15сек., лечение 2-ой опытной группы (5 кроликов) проводили препаратом эмоксипин 1% в виде инсталляций 3 раза в день в течение 21 дня. Для

определения взаимодействия N0-0111 и препарата эмоксипин в 3-ей опытной группе (5 кроликов) лечение проводили одновременно двумя методиками. Животные были разделены на пять групп (одна из них контрольная -4 кролика, в которой после ожога лечение не проводилось и 3 кролика интактных для исследования слезы).

Таблица 3. Схема эксперимента по определению совместного действия N0-СГП и эмоксипина при лечении ожоговой ишемии конъюнктивы глаз.

Группа Начало лечения После ожога Способ лечения Количество воздействий

1. Не получали лечения

2 Через 24 часа Инсталляции эмоксипина 1%, ежедневно Зраза в день в теч 28 дней

3 Через 24 часа N0-011300 ррт, экспозиция 15 сек. +инсталляции эмоксипина 1% ежедневно №3 Зраза в день в теч 28 дней

4 Через 24 часа N0-0111300 ррт, экспозиция 15 сек ежедневно №3

¡ 5 Интактаная группа, для исследования

[ слезы

Клиническое исследование показало, что в опытных группах гиперемия конъюнктивы была более выражена на ранних сроках после ожога, но купировалась к 10 суткам (в контроле на 21 сутки), отёк конъюнктивы был менее выражен в опытных группах, особенно в группе NO-C111+ эмоксипин и к 10 суткам полностью исчез, в то время как в контрольной группе удерживался до 21 суток. Восстановление сосудов и цвета конъюнктивы в зоне ишемии, а также краевой петлистой сети в опытных группах наступило к 10-14 суткам, лучшие результаты были получены в опытных группах NO-СГП и NO-СГП + эмоксипин. В группах с применением эмоксипина васкуляризация была умеренной и раньше восстановилась прозрачность роговицы. В опытных группах изъязвление роговицы не наблюдалось, в контрольной груше развилось на 5 глазах.

Таким образом, одновременное применение оксида азота в газовом потоке с экспозицией 15 сек. и инсталляции эмоксипина в течение 21 дня, способствует более быстрому купированию воспаления, уменьшению отёка, более быстрому восстановлению конъюнктивы в зоне ожога и краевой петлистой сети, а также способствует меньшей васкуляризации и быстрому восстановлению прозрачности роговицы.

Известно, что слезная жидкость играет важную защитную роль для переднего отрезка глаза благодаря наличию в ней целого ряда биологически активных компонентов. Важную роль выполняют антиоксиданты слезы, предохраняющие внешние структуры глаза от свободнорадикального окисления (СЮ) как в норме, так и при патологии.

При повреждении переднего отрезка глаза и развитии воспаления в слезу происходит выброс большого количества окислителей и свободных форм кислорода из клеток роговицы и конъюнктивы, а также го активированных нейтрофи-лов и макрофагов, мигрирующих в слезу при воспалении. Способность слезы тормозить СЮ какого-либо субстрата характеризует ее антиокислительную активность (АОА). Таким образом, слезная жидкость, обладая собственной АОА,

способна предохранить ткани роговицы от действия СТО. Кроме того, антиокси-данты слезы могут предотвращать окисление ингибиторов протеолитических ферментов, которые играют важную роль в репарации повреждений переднего отрезка глаза Таким образом, представляет интерес исследование зависимости между уровнем АОА слезной жидкости и характером патологического процесса при одновременном использовании оксида азота и эмоксипина в лечении ожоговой ишемии конъюнктивы.

При сочетанном ожоге глаз (конъюнктива + роговица) на 1-3 сутки после травмы происходит значительное снижение АОА слезной жидкости, и, при отсутствии лечения, только к 28 суткам АОА возвращается к уровню, близкому к исходному. В опытных группах отмечено положительное влияние лечения на характер изменения АОА слезной жидкости - АОА нормализуется к 7 суткам. Имеется ряд отличий в опытных группах Так, в группах, получающих N0 и N0 + эмоксипин, на 21 сутки после ожога происходит снижение АОА до уровня контрольной группы, но к 28 суткам АОА вновь достигает уровня интактных животных. В группе животных, получающих эмоксипин отмечаются наибольшие колебания АОА: после спада на 1-3 сутки отмечается значительный подъем АОА на 7 сутки, спад на 14, подъем на 21 и спад на 28 сутки после ожога. Таким образом, наилучшие результаты отмечаются в группах, получающих N0 и N0 + эмоксипин При сопоставлении полученных результатов с данными клинических исследований, можно говорить о преимуществах сочетанного лечения N0 и N0 + эмоксипин.

1

Рис. 7. Изменение уровня антиокислительной активности слезной жидкости кро-тиков при ожоговой ишемии конъюнктивы и влияние на него воздействия N0-СГП и эмоксипина

по оси абсции-время после ожога в сутки

по оси ординат- АОА слёзной жидкости в % от уровня контроля

.*) -р< 0,05

Проведённые нами исследования подтверждают, что оксид азота в газовом потоке способствует восстановлению микроциркуляции в обожженной конъюнктиве, оказывает противовоспалительное действие, ускоряет регенерацию повреждённых тканей. Метод перспективен для лечения ожоговых повреждений глазного яблока. ?

Схема включения N0-0111 в комплексную терапию лечения ожоговой ишемии конъюнктивы.

1. для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы рекомендовано воздействие N0-содержащим газовым потоком с расстояния 200мм (при концентрации N0 300 ррт) с экспозицией 15 секунд трёхкратно ежедневно в ближайшие сроки после ожога с одновременными инсталляциями эмоксипина 1% 4 раза в день.

А нлм/о*цслш|«ль«ая акяминосга*

с/миюб жпакости крапика. , нвя

% от интактных ,. ^О

сутки

2. на 2-5 сутки после окончания воздействий N0- СГП проводится лечение гор-доксом в виде инсталляций, инъекций.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что лечение ожоговой ишемии конъюнктивы оксидом азота в газовом потоке, продолжительностью до 30 секунд и при концентрации 300 ррт N0 способствует восстановлению микроциркуляции и регенерации повреждённых при ожоге тканей.

2 Отработан оптимальный режим применения для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы: воздействие N0-0 II при концентрации N0 300 ррт с экспозицией 15 секунд трёхкратно ежедневно в ближайшие сроки после ожога.

3. Под действием N0-0 11 в предлагаемом режиме в слёзной жидкости подъём протеолитической активности происходит в более ранние сроки, что способствует очищению раны, и возрастает активность эндогенных протеаз, обеспечивающих сохранность неповреждённых тканей.

4. Совместное применение N0-0171 и гордокса показало, что в течение первых трех суток после травмы следует применять N0-0171 при концентрации N0 300 ррт с экспозицией 15 секунд трёхкратно, а затем в течение 10-14 дней проводить лечение гордоксом, что подтверждается данными биохимических исследований. Такая схема лечения обеспечит быстрое и эффективное протекание первой фазы раневого процесса, направленной на очищение раны

5 Совместное применение N0-0171 при концентрации N0 300 ррт с экспозицией 15 секунд трёхкратно и инсталляции эмоксипина в течение 21 дня способствует более быстрому купированию воспаления, уменьшению отёка, более быстрому восстановлению конъюнктивы в зоне ожога и краевой петлистой сети, меньшей васкуляризации и быстрому восстановлению прозрачности роговицы, что подтверждается данными биохимических исследований.

6. Предложена схема включения N0-0171 в комплексную терапию лечения ожоговой ишемии конъюнктивы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Использование оксида азота при травматических повреждениях глазного яблока// Неотложная помощь, реабилитация и лечение осложнений при травмах органа зрения и чрезвычайных ситуациях.- материалы научно-практической конференции// Москва, 16-17 апреля 2003 с.79-82 (соавт. Гундорова P.A., Чеснокова Н.Б., Кваша О.И., Давыдова Н.Г., Косакян С.М., Горбачёва O.A., Безнос O.JI.)

2. Влияние NO-содержащего газового потока на тонус сосудов глазного яблока (экспериментальное исследование)// Лечение посправматической патологии заднего отдела глаза у пострадавших в экстремальных ситуациях. Материалы научно-практической коуференции// Москва, 21-22 апреля 2004 с.183-186. (соавт. Чеснокова Н.Б., Давыдова Н.Г., Кваша О.И., Горбачёва O.A.).

3. Лечение ожоговой ишемии конъюнктивы оксидом азота в газовом потоке (в эксперименте)// Лечение посправматической патологии заднего отдела глаза у пострадавших в экстремальных ситуациях. Материалы научно-практической конференции// Москва, 21-22 апреля 2004 с.65-66 (соавт. Гундорова P.A., Чеснокова Н.Б., Давыдова Н.Г., Кваша О.И., Косакян С М.).

4. Влияние газообразного оксида азота на антиокислительную активность слёзной жидкости кроликов в норме и при ожогах глаз различной локализации// П Международная конференция «Патофизиология и современная медицина», Москва, 22-24 апреля 2004,с 353 (соавт. Столярова Е.П., Безнос ОВД ваша

О.И.,Чеснокова Н.Б.).

5. Использование оксида азота в газовом потоке для лечения ожоговой ишемии конъюнктивы (экспериментальное исследование) // Глаз, 2004,№ 6 С.11-13

6. Влияние NO-содержащего газового потока на морфологические изменения в тканях глаза при экспериментальном ожоге роговицы// Материалы научно-практической конференции// Москва, 16-17 марта 2005,с 110-112 (соавт.Гундорова P.A., Чеснокова Н.Б.ДПехтер А.Б.Дваша О.И.Хорбачёва O.A.).

7 Роль оксида азота в офтальмологии// Материалы научно- практической кон ференции// Москва, 16-17 марта 2005, с. 108-110 (соавт. Кваша О.И.).

Заказ № 343. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.nl

РНБ Русский фонд

2005-4 42809

I 9»

•з ?¡ir}