Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Разработка информационного и нормативно-методического обеспечения системы гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием генно-инженерио-модифицированных микроорган

На правах рукописи

ХОВАЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ИНФОРМАЦИОННОГО И НОРМАТИВНО-МЕТОДИЧЕСКОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ СИСТЕМЫ ГИГИЕНИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

14.02.01 - Гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ФЕВ 2011

Москва-2011

4854126

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте питания РАМН.

Научные руководители академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 14 марта 2011 года на заседании диссертационного совета Д 001.002.01 в НИИ питания РАМН (Москва, Устьинский проезд, д. 2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ питания РАМН.

Автореферат разослан 3 февраля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Коденцова В.М.

Тутельян Виктор Александрович Народицкий Борис Савельевич

Русаков Николай Васильевич Истомин Александр Викторович

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Широкое применение современных методов биотехнологии, и в первую очередь, генной инженерии при производстве продовольствия сегодня признается наиболее перспективным направлением совершенствования качества и увеличения объемов пищевых продуктов. Разработка и использование генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) с улучшенными технологическими свойствами (повышенная продукция ферментов, биологически активных веществ, устойчивость к микробному загрязнению) выгодны прежде всего экономически, поскольку требуют значительно меньших объемов исходного натурального продовольственного сырья, трудозатрат и времени, чем применение традиционных промышленных микроорганизмов (Рогов И.А., Воробьев А.И., 2004; Тутельян В.А., 2003; Клер Робинсон, Глик Б., Пастернак Дж., 2002; Народицкий Б.С., 2006; MacKenzie D. J., 2000; James С., 2009; Chrispeels M.J., 2008).

Вместе с тем, большинство экспертов признает, что новые качества ГММ, особенно не имеющие истории безопасного использования в пищу, могут быть связаны с потенциальным риском для человека и окружающей среды, а созданные генетически модифицированные продукты (ГМ-продукты) перед выпуском на потребительский рынок в обязательном порядке должны подвергаться комплексным испытаниям на безопасность. При этом должно быть доказано отсутствие рисков неблагоприятного воздействия на человека и окружающую его среду, обусловленных как самими целевыми генами, так и кодируемыми ими новыми белками (в первую очередь, патогенности, аллергенности, токсичности). Одним из главных аргументов против использования трансгенных технологий в производстве пищи является нестабильность генетической конструкции, возможное присутствие генов антибиотикоустойчиво-сти, потенциально способных к трансмиссии в представителей резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и контаминации пищевых продуктов (ВОЗ, 2005; Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., 2006; Тутельян В.А., 2007; Кирпичников М.П., 2008).

Во избежание потенциального неблагоприятного воздействия продуктов, полученных с применением ГММ, на здоровье человека, животных и благополучие окружающей среды, при государственном регулировании генно-инженерной деятельности предусмотрены специальные требования к допуску ГММ и трансгенных продуктов на продовольственный рынок. Несмотря на существующие различия подходов, во всех национальных схемах регулирования ГММ предрегистрационный этап является определяющим в обеспечении безопасности новых ГМ-продуктов. Он включает индивидуальную оценку риска каждого конкретного ГММ, итогом которого должно быть доказательство такой же степени его безопасности, как и традиционного аналога (Рогов И.А., 2003; Стандарты ЕС CAC/GL 44-2003, CAC/GL 462003; Сорокина Е.Ю., Тутельян В.А., 2005; ФАО/ВОЗ, 2006,2008).

В настоящее время в мире не существует единых, гармонизированных подходов к созданию ГММ, к оценке их безопасности, маркировке и допуску трансгенных продуктов на международный рынок продовольствия.

В некоторых технологически развитых странах (США, Канада, Великобритания) в отдельных случаях не придают большого значения мерам контроля за ГММ. При этом мировые производители ссылаются на высокий научный и технологический потенциал при разработке ГММ, должный научно-методический уровень оценки и практически не подвергают сомнению, что любые риски от трансгенных продуктов, признанных безопасными, маловероятны (FDA, 1991; Food Chemicals Codex, 2001; Тутельян В.А., 2005).

Международные организации ФАО/ВОЗ и европейское законодательство стоят на позициях обеспечения прав потребителей на информированный выбор любых новых пищевых продуктов и предупреждения рисков. Механизмы регулирования ГММ должны включать систематический контроль за оборотом разрешенных и допущенных на продовольственный рынок пищевых продуктов, полученных с применением ГММ, а также использование специальной маркировки таких продуктов и технологии их производства (ILSI Europe, 1999; Директивы 18/2001/ЕЕС, 90/220ЕЕС)

Вместе с тем, во многих странах, в т.ч. государствах Европейского сообщества, не предусматривается маркировка допущенных на рынок трансгенных продуктов, выработанных по технологиям, предусматривающих полную очистку конечных продуктов от ГМ штаммов-продуцентов. В последние годы вследствие причин экономического характера производство по данным технологиям переносится в регионы с менее развитой культурой производства и дешевой рабочей силой. Данное обстоятельство является причиной риска некачественного полного удаления ГМ штаммов из продуктов и может привести к попаданию на рынок продовольствия живых ГММ (Правила ЕС 1829/2003, 1830/2003; Брукс Г., Барфут П., 2006).

Поступление на мировой продовольственный рынок ГМ-продуктов без маркировки в результате нерегулируемого статуса ГММ на пострегистрационном этапе, помимо нарушений прав потребителей, создает серьезную проблему в оценке безопасности при ввозе ГММ, которая должна проводиться с учетом требований законодательства импортирующих стран.

Наряду с мониторингом ГММ, разрешенных для реализации на внутреннем потребительском рынке, необходимо обеспечивать контроль и защиту от потенциально небезопасных, не прошедших процедур допуска и поступающих в страну нелегально, а используемые методы должны опережать развитие технологий создания ГММ и базироваться на современных приоритетных исследованиях биологической и медицинской науки, молекулярной биотехнологии.

Поэтому контроль за оборотом ГММ в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем, решение которых направлено на охрану здоровья населения и имеет большое социальное значение. Разработка системы гигиенического контроля ГММ в пищевых продуктах была начата в 2003-2004 гг., включает новейшие отечественные и зарубежные научные подходы и основана на всестороннем научно-организационном, информационном, методическом обеспечении мероприятий по изучению, обнаружению и оценке безопасности ГММ, разработке соответствующих им маркерных систем; продуктов, в которые они вводятся; объемов мирового производства и торговли ГМ-продовольствием, в том числе поступающего на внутренний рынок Российской Федерации; а также на разработку и применение адекватных, чувствительных и высокоспецифичных методов и средств обнаружения, анализа безопасности ГММ (Скрябин К.Г., 2003; Народицкий Б.С.,2004; Онищенко Г.Г., Филатов H.H., Гульченко Л.П., 2008).

Исследования проводились в соответствии с планами НИР по теме № 098: «Генно-инженерно-модифицированные источники пищи: безопасность и контроль».

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлась разработка информационного и нормативно-методического обеспечения системы гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием ГММ.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

■ на основании анализа данных литературы, изучения объемов мирового производства ГММ, структуры и объемов импорта в РФ пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, и их традиционных аналогов, разработать информационные (справочные) базы данных о ГММ с учетом безопасности классических промышленных микроорганизмов и пищевых продуктов - потенциальных объектов генетических модификаций;

■ провести выборочные исследования репрезентативного перечня различных видов пищевой продукции, изготавливаемой с использованием биотехнологических микроорганизмов, на наличие ГММ с целью оценки риска допуска на рынок продовольствия потенциально опасных трансгенных продуктов;

■ на основании сравнительного анализа применяемых методов обнаружения и оценки безопасности ГММ в пищевой продукции и результатов лабораторного тестирования пищевых продуктов обосновать необходимость применения скрининговых методов и средств для детекции ГММ при ввозе из-за рубежа и реализации продукции на продовольственном рынке;

■ разработать унифицированный метод, диагностический набор и алгоритм проведения анализов для лабораторного контроля и мониторинга продукции в обороте для специалистов учреждений санитарно-эпидемиологической службы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Впервые разработаны новые подходы к информационному анализу и нормативно-методическому обеспечению системы контроля пищевой продукции, основанные на молеку-лярно-генетических методах обнаружения и оценки безопасности ГММ в трансгенных и традиционных продуктах, которые могут служить объектами генно-инженерных модификаций.

Проведен научный анализ и разработаны информационные базы промышленных ГММ и их классических аналогов, представленных на мировом продовольственном рынке, статус легитимности, безопасности, уровень внедрения в производство (коммерциализации), определены ведущие страны и разработчики ГММ и пищевых продуктов на их основе.

Научно обоснована необходимость контроля (мониторинга), направленного на выявление живых ГММ в пищевых продуктах, содержащих пробиотическую микрофлору, на подтверждение отсутствия штаммов ГМ-продуцентов в ферментных препаратх, биологически активных веществах, пищевых добавках, используемых при производстве пищевых продуктов и подлежащих удалению из конечного продукта.

Изучена распространенность ГМ-штаммов, представленных на мировом продовольственном рынке. Представлены методы идентификации, важные при осуществлении контроля на наличие в пробах ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции. Рассмотрены результаты микробиологических и молекулярно-генетических анализов пищевых ингредиентов, важные при контроле пищевых продуктов на наличие ГММ, указаны методы их определения и оценки безопасности, адекватные степени риска нелегитимного использования ГММ при производстве пищевых продуктов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Информационные базы ГММ, их традиционных аналогов, пищевой продукции, вырабатываемой с использованием промышленных микроорганизмов, алгоритмы лабораторного контроля были использованы при разработке Санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»).

Разработаны и внедрены в практику лабораторного контроля пищевой продукции в обороте Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные

аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретичеекой детекцией».

Разработан Набор реагентов («ГМ-БАКТ-1») для выявления ГММ бактериальной природы методом полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах (ТУ 9398-001-018973572008), который применяется при контроле ГММ в учреждениях Роспотребнадзора.

Результаты работы используются в учебном процессе МПФ ГОУ ППО Первого Московского медицинского университета им. И.И.Сеченова Росздрава на кафедре инфектологии, кафедре гигиены питания и токсикологии и кафедре социальной гигиены и организации санитарно-эпидемиологической службы с курсом основ лабораторного дела на базе ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертационной работы были доложены на 6-й и 7-й всероссийских конференциях «Молекулярная диагностика - 2007, 2010» (Москва, 28-30 ноября 2007 г. и 24-26 ноября 2010 г.), диссертация апробирована на совместной научной конференции ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России и НИИ питания РАМН 22 декабря 2010 г.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ, методические указания, санитарные правила и нормы.

ОБЪЕМ II СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора методов исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, приложения, включает 5 схем, 7 таблиц и 17 рисунков и диаграмм. Список литературы содержит 124 отечественных и 81 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследований использовали: 1. пищевые продукты, содержащие живые традиционные пробиотические микроорганизмы (кисломолочные продукты, сыры, напитки брожения, БАД к пище) и содержащие ингредиенты, полученные с использованием штаммов-продуцентов (ферментные препараты, витамины, незаменимые аминокислоты);

2. технологические пищевые добавки (ингредиенты), содержащие живые традиционные про-биотические микроорганизмы (бактериальные заквасочные, стартерные культуры), ферментные препараты, витамины, синтезированные из классических и ГМ-штаммов.

При выборе пищевых продуктов для лабораторного контроля на наличие ГММ учитывали современный перечень пищевых добавок и ингредиентов, получаемых из микроорганизмов, перечень традиционных пробиотических продуктов, рейтинги объемов использования промышленных микроорганизмов, перечень ГММ, имеющих официальное разрешение на применение в пищевой промышленности и получаемых на их основе пищевых добавок и ингредиентов.

Все образцы пищевых продуктов имели необходимую сопроводительную документацию, в которой имелись спецификация продукта и указание области применения, паспорт штамма, идентификационные данные, место депонирования, микробиологическая характеристика, устойчивость к антибиотикам, патогенность и другие свойства.

Были исследованы 1090 проб (образцов) пищевой продукции, предоставленных НИИ питания РАМН и учреждениями Роспотребнадзора. Количество и основные группы исследованной пищевой продукции представлены в таблице 1.

Таблица 1.

№№ Виды (группы) пищевой продукции количество

1 Закваски бактериальные (для производства кисломолочных продуктов, сыров и т.д.) 333

2 Стартовые культуры (для производства колбас, сыров и т.д.) 35

3 Ферментные средства, продуценты микроорганизмов 342

3.1 В том числе Ферментные препараты, полученные с применением ГММ 91

4 Пищевые добавки, в т.ч. дрожжи (для производства хлебобулочных изделий, вина и т.д.) 167

4.1 В том числе Пищевые добавки, полученные с применением ГММ 11

5 Биологически активные добавки к пище (БАДп), содержащие пробиотики или их продуценты 107

6 Пищевые продукты, содержащие пробиотики 106

Всего: 1090

Лабораторные исследования проводили в аккредитованном испытательном лабораторном центре (ИЛЦ) на базе лаборатории молекулярной биотехнологии, лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов, лаборатории хламидиозов НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н. Ф.Гамалеи. Для межлабораторных контрольных испытаний привлекалась лаборатория санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии НИИ питания РАМН.

При молекулярно-генетической оценке ГММ в пищевых продуктах в качестве основного метода для обнаружения и идентификация чужеродного генетического материала в штаммах применялась полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Для выявления генетической вставки использовали векторные последовательности. Специально подобранные пары праймеров использовали как для проверки целевого гена, так и для последовательностей, свидетельствующих о возможных генетических модификациях. Для обнаружения ГММ выбор праймеров проводили по следующим позициям:

1) для идентификации таксономической принадлежности микроорганизма (гены 16S/23S рРНК или другие специфические последовательности);

2) для идентификации целевых генов генетической вставки (гены, кодирующие продукцию технологически важных ферментов, например, таких как химозин; гены устойчивости к бактериофагам; гены-регуляторы уровня кислотности; гены устойчивости к этанолу и другим стрессовым факторам);

3) для идентификации генов селективных маркеров (гены устойчивости к антибиотикам, бактериоцинам, ауксотрофным селективным маркерам);

4) для идентификации маркерных (screenable) векторных генов (гены E.coli, кодирующие ß-галактозидазу, ß-глюкоронидазу или гены бактериофага Т7, кодирующие РНК полимеразу);

5) для идентификации неэкспрессируемых последовательностей (полилинкеры, промоторы и терминаторы);

6) для идентификации мигрирующих элементов, используемых для создания транспозируе-мых векторов (например, Ту -элементы).

Выбор праймеров проводили в соответствии с правилами молекулярного дизайна. Для выбора праймеров использованы программы Primer, Oligo или аналогичные программы, позволяющие осуществлять многофакторный анализ выбранных последовательностей. Сравнительный анализ выбранных олигонуклеотидов производили с помощью программы Blast для исключения наличия областей гомологии с ДНК родственных и неродственных видов.

Конкретный набор праймеров для проведения экспертизы определялся таксономической принадлежностью штамма; информацией о его генетическом статусе и характере генетических модификаций; а также характере и месте использования ГММ в технологии получения пищевых продуктов и вероятности попадания живых ГММ в организм человека.

Выделение ДНК из культур ГММ проводили перед постановкой реакции из замороженной бактериальной пасты по методу Бирнобойма и Доли.

Проведение ПЦР осуществляли с помощью ДНК-амплификаторов (термоциклеров) «Терцик» мод. ТПЧ-ПЦР01 (Россия). Для проведения ПЦР использовали термостабильную

Taq-полимеразу, соответствующий ей десятикратный ПЦР-буфер, растворы четырех дезок-сирибонуклеотидтрифосфатов и выбранной пары праймеров.

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в пластине 6%-ного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 в). Для этого применяли прибор для капиллярного электрофореза 3130, Genetic Analyzer (Великобритания). ДНК-маркерами служили стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alul. Окрашивание фрагментов ДНК осуществляли этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляли в условиях ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе.

При получении результатов, противоречащих или не соответствующих характеристикам, декларированным производителем продукции, в ПЦР-лабораториях ИЛД проводили 2-кратные повторные (арбитражные) исследования. Случаев расхождений результатов при испытаниях в ИЛЦ не зарегистрировано.

Для проведения исследований пищевой продукции на пострегистрационном этапе оборота применяли разработанный и апробированный метод ПЦР-анализа с электрофоретиче-ской детекцией. 202 исследования проведены с помощью набора ГМ-БАКТ-1. Для контроля результатов и стандартизации метода одновременно исследования проводили в ПЦР-лаборатории ИЛЦ.

Лабораторные исследования включали последовательные процессы: подготовка проб, выделение ДНК из образца пищевых продуктов, амплификацию ДНК, детекцию ДНК, анализ и интерпретацию результатов.

Метрологическую оценку методов и полученных результатов проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Для статистической обработки были использованы методы описательной статистики (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка среднего, медиана, максимум, минимум). Значимость расхождения результатов оценивали по критерию Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ мирового и отечественного продовольственного рынка ГММ

Анализ мирового продовольственного рынка показывает, что основные категории пищевой продукции, получаемой с применением биотехнологий, включают продукты:

- содержащие живые/жизнеспособные микроорганизмы (сбраживающие культуры для хлебопечения и пивоварения, молочнокислые бактерии и др.).

- содержащие нежизнеспособные/инактивированные ГММ.

- содержащие отдельные ингредиенты или добавки, синтезируемые ГММ (ферменты, витамины, незаменимые аминокислоты).

- содержащие отдельные ингредиенты, обработанные синтезируемыми ГММ ферментами, красителями и т.п.

Промышленные культуры микроорганизмов, имеющие документально подтвержденную историю безопасного применения, в первую очередь являются объектами генетических модификаций и используются для создания высокотехнологичных ГММ.

Данные мониторинга генно-инженерных биотехнологий и полученных с их использованием трансгенных микроорганизмов свидетельствуют о значительной роли промышленных пищевых микроорганизмов в производстве продовольствия.

Вследствие отсутствия веских доказательств безопасности и наличия рисков в мировом сообществе в настоящее время ГММ в жизнеспособном состоянии при производстве пищевых продуктов не применяются.

Доля пищевой продукции, содержащей инактивированиые (убитые) ГММ крайне незначительна, не получила большого распространения, так как требует обязательной маркировки. Инактивация ГММ в ряде случаев приводит к снижению пищевой ценности, качества и ухудшению потребительских свойств продукта.

Подавляющую часть мирового биотехнологического рынка, получившего наибольшее развитие в последнее десятилетие и соответствующего требованиям безопасности, занимает пищевая продукция, где ГМ-штаммы применяются только в качестве продуцентов пищевых ингредиентов на производственном этапе и подлежат полной очистке продукта от штаммов-продуцентов на конечном технологическом этапе.

Изучение научных и промышленных разработок ГММ для применения в пищевой индустрии позволяет сделать вывод о преимущественном использовании ГММ только в качестве продуцентов необходимых пищевых ингредиентов. Технологии безопасного использования ГММ предусматривают полное удаление штамма-продуцента из конечного продукта.

В настоящее время в большинстве экономически развитых стран имеются развернутые и постоянно обновляющиеся базы данных о поддерживаемом фонде бактерий, мицелиаль-ных грибов, дрожжей, в том числе ГММ, имеющих промышленное значение и депонированных в различных национальных Коллекциях микроорганизмов и клеточных культур. Информационные базы основных Коллекций (АТСС Американская коллекция культур (American Type Culture Collection), DSMZ Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), BKM (Всесоюзная, ныне Всероссийская, Коллекция Микроорганизмов) позволяют получать информацию о поддерживающихся культурах в необходимом для пользователя виде.

При разработке системе гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с применением ГММ, должна учитываться степень безопасности, которые связаны

с родовидовой принадлежностью штамма-донора и микроорганизма-реципиента, а также истории длительного безопасного применения.

Анализ безопасности ГММ в равной мере свидетельствует, как о широком применении технологии самоклонирования микроорганизмов, так и технологий получения ГММ из гете-рологичных микроорганизмов.

В настоящее время при производстве пищевых продуктов учитывается степень риска и безопасности ГММ.

Первый класс безопасности - штамм-донор генетического материала и штамм-реципиент принадлежат строго к одному и тому же роду, виду; являются микроорганизмами, имеющими длительную историю безопасного использования в пищу человеком.

В настоящее время в мировом научном сообществе нет единого мнения, согласно которому микроорганизмы полученные с применением биотехнологических методов самоклонирования относятся к ГММ. В ряде стран восточной Азии (Китай, Япония) самоклонированные микроорганизмы не считаются ГММ. В странах ЕС и России любые генные манипуляции с целью самоклонирования считаются генно-инженерными модификациями.

Второй класс безопасности - обмен генетическим материалом осуществлен между микроорганизмами, имеющими статус GRAS, но таксономически принадлежащими к различным родам. Третий класс безопасности - донорская ДНК принадлежит к роду организмов, не имеющему статуса GRAS. Рекомбинантные штаммы не должны содержать чужеродной ДНК кроме целевого гена, что должно быть подтверждено соответствующими исследованиями.

В 2009 г. (рисунок 1 ) мировой объем продаж составил 440 млн. евро, в том числе ферментов, произведенных с применением традиционных (классических) штаммов-продуцентов - 180 млн. евро (41% от общего объема продаж), гомологичных ГММ 1-2 классов безопасности - 132 млн. евро (30% от общего объема продаж). Объем продаж ферментов из гетероло-гичных ГММ 3 класса безопасности составил 128 млн. евро (29% от общего объема продаж на мировом продовольственном рынке) (Amfep, 2009) Рисунок 1.

Объёмы продаж ферментных препаратов, полученных из различных групп промышленных микроорганизмов,на мировом продовольственном рынке в 2009 году, в млн. евро (по данным Ассоциации производителей ферментных продуктов (ЛтГер))

I 132; 30%

Ш Доля продаж ферментных препаратов, иолученных с

ИСИОЛЬЧОнапнСМ традиционных (классических) микроорганизмов

■ Доля продаж фсрмагшых препаратов, получепныхе использованием гомологичных или самоклонировапныхГММ (I класс GRAS) □ Доля продаж ферментных препаратов, полученных с использованием гегерологичных ГММ (2 и 3 класс GRAS)

Анализ отечественного рынка продовольствия (таблица 2) свидетельствует о преимущественной доле импорта, который, в целом, составляет более 85%. Среди стран-экспортеров наиболее значимы государства Европейского Союза. Продукция этих стран составляет почти 70% от всей продукции и более 80% от всего импорта. В странах ЕС основными производителями и экспортерами являются Дания, Германия, Ниделанды. Рынок продукции из США, Китая значительно уступает европейскому и составляет в среднем 4%. Производство пищевой продукции с использованием микроорганизмов в странах СНГ и ее экспорт в Россию составляют менее 2%, что косвенно свидетельствует о низком уровне развития биотехнологий.

Таблица 2.

Репрезентативная выборка зарубежной и отечественной пищевой продукции, _полученной с использованием промышленных микроорганизмов_

Наименование стран- производителей Количество в%

пищевой продукции наименовании

Всего 1090 100

в т.ч.: производства России 156 14,3

зарубежного производства, в т.ч.: 934 85,7

Дания 200 18,3

Германия 148 13,6

Нидерланды 94 8,6

Италия 63 5,8

Франция 102 9,4

Австрия 23 2,1

Бельгия 42 3,9

Ирландия 17 1,6

Швейцария 13 1,2

Великобритания 9 0,8

Испания 5 0,5

Швеция 4 0,4

Финляндия 8 0,7

Польша 5 0,5

Чехия 3 0,3

Болгария 7 0,6

Румыния 4 0,4

Словения, Венгрия (по 2 продукта) 4 0,4

Всего по странам ЕС 751 68,9

Австралия (завод компании ДСМ, Нидерланды) 54 5,0

Страны СНГ (Украина, Белоруссия, Армения) 17 1,6

США/Канада 44/3 4,0/0,3

Китай 41 3,8

Япония 7 0,6

Южная Корея, Малайзия 3 0,3

ЮАР 4 0,4

Израиль 4 0,4

Турция 6 0,6

На отечественном продовольственном рынке ГММ применяются при производстве разнообразных ферментных препаратов, а также пищевых добавок, представляющих собой в основном витамины (провитамин А - бета-каротин, витамин В2 - рибофлавин, витамин В12 - цианокобаламин) для обогащения пищевых продуктов, низин, натамицин для стабилизации и консервации продуктов. По отношению к данным группам продуктов доля ферментных препаратов, полученных с применением ГММ, составляет около 27%, а пищевых добавок около 7%. В целом, пищевые ингредиенты, полученные с использованием ГММ, составляют 9,4% от числа всех ферментных препаратов, получаемых с помощью микробного синтеза.

Анализ показал (рисунок 2) ГММ на продовольственном рынке России составляют около 10%, остальные 90% продукции представляют собой различные заквасочные и стартер-ные культуры (31%), пищевые продукты и биологически активные добавки к пище (20%), содержащие классические (природные) традиционные пищевые микроорганизмы, или их продуценты в ферментных препаратах (28%) и пищевых добавках (14%).

Рисунок 2

Количество импортных и Российских пищевых продуктов, полученных с не пользованием ГММ или МГМА, зарегистрированных в РФ (с 16.09.2003 по31. 01 2010)

□ Закваски бактериальные (для производства кисломолочных проду ктов, сыров ит. д.)

I Стартовые культуры (для производства колбас, сыров и Т.Д.)

□ Ферментные препараты, всего

□ Ферментные препараты

полученные с использованием ГММ

О Пищевые добавки, в т.ч. дрожжи (для производства спирта, хлебобулочных изделий, вина и т.д), всего

в Пищевые добавки, в т.ч. дрожжи (для производства спирта, хлебобулочных изделий, вина и т.д), полученные с использованием ГММ

□ Биологически активные добавки к пище (БАДп), содержащие пробиотики

Результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований репрезентативной выборки пищевой продукции, произведенной с использованием промышленных микроорганизмов

За период с 2004 по 2010 гг. в России прошли полную медико-биологическую, микробиологическую и молекулярно-генетическую оценку и разрешены для использования в пищевой промышленности более 100 ферментных препаратов, полученных с использованием ГММ (в Государственный реестр пищевых продуктов, материалов и изделий, разрешенных для изготовления или ввоза на территорию РФ и оборота, внесено 70 наименований пищевых ингредиентов из ГММ). В настоящее время перечень такой продукции увеличился.

Проведены микробиологические и молекулярно-генетические исследования (таблица 3) 1292 образцов пищевой продукции, произведенной из или с использованием ГММ и МГМА. Из них исследованиям и экспертной оценке на наличие ГММ с целью государственной регистрации в России подверглись 1090 проб (образцов). Технологические вспомогательные средства (ферментные препараты и пищевые добавки), полученные с применением ГММ, составили 102 пробы (10%). Таблица 3

Молекулярно-генетические исследования бактериальных заквасочных _культур для производства молочных продуктов (256 проб)

Наименование штамма Видовая идентификация штаммов Обнаружены гены анти-биотикорези-стентности Маркерные гены

Bifidobacterium (adolescentis, animalis, bifidum, breve, infantis, longum) 48 3 -

Lactobacillus (acidophilus, casei, delbruecki subsp. delbruecki, delbrueckii subsp. bulgaricus, delbrueckii subsp. lactis, fermentum, johnsonii, kefiri, lactis, pa-racasei, plantarum, reuteri, rhamnosus) 182 1

Lactococcus (lactis subsp. cremoris, subsp. lactis, subsp. lactis biovar diacetilactis) 122 - -

Leuconostoc (lactis, mesenteroides) 42 - -

Streptococcus (salivarius, thermophilus) 39 1 -

При исследованиях традиционных живых микроорганизмов, входящих в состав бакте-

риальных заквасочных культур и пищевых продуктов из репрезентативной выборки ГММ обнаружены не были.

Результаты лабораторных исследований пищевой продукции, содержащей живые микроорганизмы, в целом, позволили сделать вывод о ее соответствии показателям безопасности, декларируемым изготовителями.

Вместе с тем, в 5 лиофилизированных заквасочных культурах, содержащих Bifidobacterium bifidum, infantis, longum, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus ther-mophilus выявлены гены устойчивости к эритромицину, ermC, тетрациклину, tetO.

Устойчивость микроорганизмов к эритромицину и тетрациклину может быть связана с природной множественной резистентностью к антибиотикам, но не была отражена в характеристиках штаммов, удостоверениях Национального Банка Промышленных микроорганизмов и клеточных культур страны-производителя о депонировании штаммов и не декларировалась производителем заквасок. В связи с обнаруженной устойчивостью к антибиотикам продукция была признана несоответствующей требованиям качества и безопасности.

Молекулярно-генетические исследования (таблица 4), показали, что в 4-х ферментных препаратах термостабильной альфа-амилазы, используемых для производства спирта, обнаружены жизнеспособные штаммы-продуценты Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, ДНК маркерных векторных генов (lacZ), ДНК маркеров устойчивости к ампицилину.

Таблица 4.

Молекулярно-генетические исследования ферментных препаратов, синтезированных из

классических штаммов-продуцентов (342 пробы)

Наименование штамма ПЦР-анализ Обнаружена Обнаружены мар- Обнаруже-

ДНК штамма- ДНК штамма- керы антибиоти- ны маркер-

продуцента продуцента корезистентности ные гены

Bacillus licheniformis 97 2 2 2

Bacillus subtilis 88 2 2 2

Pseudomonas fluorescens 4 - - -

Streptomyces (rubiginosus, mobaraensis) 5 - - -

Aspergillus niger 61 - - -

Aspergillus oryzae 86 - - -

Trichoderma reesei_ (longi-brachiatum) 12 - - -

Kluyveromyces 1actis 5 - - -

Fusarium venetatum 1 - - -

Pénicillium (funiculosum, emersonii) 3 - - -

Talaromyces emersonii 2 - - -

Таблица 5.

Молекулярно-генетические исследования ферментных препаратов, синтезированных из _ГМ штаммов-продуцентов (91 проба)__

Наименование штамма ПЦР-анализ ДНК штамма-продуцента Обнаружена ДНК штамма-продуцента Обнаружены маркеры ан-тибиотикоре-зистентности Обнаружены маркерные гены

Bacillus licheniformis 29 - - .

Bacillus subtilis 27 1 1 1

Aspergillus niger 20 - - -

Aspergillus oryzae 26 - - -

Trichoderma reesei_ (longi-brachiatum) 5 - - -

Kluyveromyces ¡actis 2 - - -

Talaromyces emersonii 2 - - -

В 1 случае при исследовании ферментного препарата, произведенного с применением ГМ штамма Bacillus subtilis, обнаружены ДНК микроорганизма, маркерные векторные гены (lacZ, Ori), что также свидетельствует о нарушении технологии полного удаления микроорганизма и очистке конечного продукта (таблица 5).

Таким образом, при исследованиях микроорганизмов-продуцентов, применяемых при производстве ферментных препаратов, в ряде случаев были обнаружены ДНК штаммов-продуцентов, селективные маркеры и маркерные векторные гены, свидетельствующие о возможных генетических модификациях (таблица 6).

Таблица 6

Признаки генетических модификаций, обнаруженные при исследовании традиционных штаммов-продуцентов ферментов

Показатели Количество

Наличие ДНК живых клеток штамма-продуцента Bacillus licheniformis 2

Наличие ДНК живых клеток штамма-продуцента Bacillus subtilis 2

ДНК маркерных векторных генов (lacZ) 4

| ДНК маркеров антибиотякоустойчивости_]_4_|

Анализ данных показал нарушения в методах использования промышленных штаммов, несоблюдения надлежащего качества технологии производства, что явилось причиной непреднамеренной попытки трансграничного перемещения не декларированных ГММ в составе пищевой продукции из региона с низким уровнем репутации экспортируемых товаров.

Анализ ферментных препаратов и пищевых добавок (таблица 7) показал, что при их производстве чаще всего выявляются нарушения технологии очистки конечного продукта, о чем свидетельствуют наличие ДНК штаммов-продуцентов, селективных маркеров и маркерных векторных генов. Выявление ГММ в ферментных препаратах свидетельствует о высокой степени биотехнологических рисков производства и требует лабораторного контроля ГММ.

Таблица 7

Частота обнаружения ГММ в ферментных препаратах _

Показатели Количество % к данной группе продуктов % ко всей продукции

Ферментные препараты, полученные из классических микроорганизмов 4 1,2 0,4

Ферментные препараты, полученные из ГММ 1 1,0 0,01

Всего 5 1,5 0,5

Таким образом, полученные результаты лабораторных исследований позволяют сделать следующие выводы:

- на продовольственный рынок России поступают микроорганизмы с различными характери-

стиками (классические, селекционные, полученные с применением методов генной инженерии);

- ГМ штаммы преимущественно применятся при производстве ферментных препаратов и

других технологических пищевых ингредиентов;

- наиболее часто встречаются нарушения технологии очистки конечного продукта от штам-

мов-продуцентов;

- полученные данные о содержании ГММ в ферментных препаратах подтвердили наличие

потенциальной опасности для здоровья потребителей пищевых продуктов, полученных с их использованием;

- мониторинг генетических маркеров, свидетельствующих о присутствии ГММ, только на

этапах регистрации и допуска на рынок пищевых продуктов является недостаточным для России, импортирующей много продовольствия. В связи с этим для защиты от потенциально небезопасных ГММ контроль такой продукции в обороте должен быть приоритетным направлением в системе гигиенического контроля.

Разработка информационных баз ГММ и традиционных аналогов.

применяемых в производстве пищевой продукции Результаты изучения и анализа мирового и отечественного продовольственного рынка

ГММ и промышленных микроорганизмов были положены в основу при разработке информационных баз данных, включающих перечень ГММ применяемых в мировом производстве продовольствия, перечень и характеристики штаммов имеющих генетически модифицированные аналоги, перечень и характеристики плазмид используемых для создания ГММ.

В перечень ГММ, имеющих коллекционный статус и применяемых для производства пищевой продукции, вошло 134 микроорганизма. Основными из них являются бактерии, ми-целиапьные грибы и дрожжи. Удельный вес и характеристика основных ГММ представлены в таблице 8.

Таблица 8

Характеристика ГММ по классам безопасности__

ГММ Всего I класс II класс III класс

(абс.ч./%) безоп. безоп. безоп.

Bacillus licheniformis 13/9,7% 7 2 4

Bacillus subtilis 26/19,4% 14 8 4

Другие бактерии 18/13,4% 2 7 9

в том числе Escherichia coli 3/2,2% 0 0 3

Fusarium venetatum 3/2,2% 0 0 3

Streptomyces 4/3,0% 0 4 0

Мицелиальные грибы и дрожжи 77/57,5% 33 3 41

в том числе Aspergillus niger 24/17,9% 17 1 6

Aspergillus oryzae 26/19,4% 7 2 17

Trichoderma reesei 20/14,9% 7 0 13

Saccharomyces cerevisiae 4/3,0% 0 0 4

Kluyveromyces 3/2,2% 2 0 1

ВСЕГО 134/100% 56/41,8% 20/14,9% 58/43,3%

Данные таблицы показывают, что наиболее часто при производстве пищевой продукции используются ГМ-штаммы Bacillus subtilis и Aspergillus oryzae (по 26 штаммов с разными функциональными характеристиками или по 19,4%). ГМ-штаммы-продуценты различных ферментов Aspergillus niger стоят на втором месте по частоте применения. 24 разновидности штаммов Aspergillus niger составляют около 18% от всех зарегистрированных в основных коллекциях. ГМ-штаммы Trichoderma reesei и Bacillus licheniformis также относятся к широко распространенным микроорганизмам, использующихся в качестве продуцентов при производстве ферментных препаратов (20 штаммов Trichoderma reesei и 13 штаммов Bacillus licheniformis, около 15 и 10% от всех ГММ соответственно).

Несмотря на технологическую привлекательность ГМ-штаммы Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Fusarium venetatum для производства пищевой продукции применяются редко (2-3% от общего числа зарегистрированных промышленных коллекционных

ГММ), но для создания всех этих штаммов в качестве донора использовались гетерологич-ные микроорганизмы.

При изучении трансгенных штаммов микроорганизмов важным является их характеристика безопасности. Так 65% широко использующихся ГММ Aspergillus oryzae и Tricho-derma reesei созданы из гетерологичных микроорганизмов и относятся к III классу безопасности и соответственно требуют особого внимания при оценке целесообразности их использования. Вместе с тем другая разновидность генетически модифицированного мицелиально-го грибка Aspergillus niger в основном, в 70 % случаев, производится из самоклонированных или гомологичных микроорганизмов. ГМ-штаммы Bacillus subtilis создаются в 53% от всех разновиднодностей из самоклонированных или гомологичных микроорганизмов и только в 15% из гетерологичных штаммов.

Изучение пищевой продукции при производстве которой используются различные бактерии, мицелиальные грибы и дрожжи, а также анализ частоты и распространенности имеющих место генетических модификаций позволили систематизировать и сформировать информационную базу основных микроорганизмов, имеющих наибольшее значение при контроле ГММ впищевых продуктах.

Наибольшее число штаммов представлено разновидностями Escherichia coli (более 460 штаммов). Escherichia coli является наиболле удобным и широко используемым материалом для проведения генетических модификаций, создания плазмид и ГММ. Бактерия Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872 имеет 23 классических штамма, подвиды Bacillus sp. - 152 штамма, Streptomyces sp. - около 400 штаммов. Использование информационной таблицы позволяет сравнить характеристики изучаемого штамма со штаммами, депонированными в коллекциях ВКПМ и DSMZ.

Сравнительный анализ микроорганизмов, используемых при производстве пищевой продукции, депонированными в основных коллекциях позволили разработать информационную базу плазмид, используемых для создания ГММ, которая содержит идентификационные данные, информацию о маркерах для их обнаружения и идентификации, характеристики плазмид.

База содержит характеристику более 250 плазмид. Использование информации о плаз-мидах, использующихся для создания ГММ, облегчает сравнительную экспертную оценку микроорганизмов, применяемых для производства конкретной пищевой продукции.

Разработка алгоритмов проведения лабораторного контроля ГММ в различных видах пищевых продуктов

На основании анализа зарубежных методических подходов к контролю за оборотом

ГММ, особенностей отечественного рынка ГММ и существующих нормативных требований

к их обороту были разработаны алгоритмы проведения лабораторного контроля на наличие ГММ в пищевых продуктах в обороте.

Алгоритм 1 (рисунок 3) лабораторного контроля пищевой продукции, произведенной с использованием живых МГМА на наличие ГММ

Рисунок 3

Алгоритм 2 (рисунок 4) лабораторного контроля пищевой продукции, произведенной с использованием ГММ, не допускающей или допускающей присутствие ДНК штамма-продуцента согласно нормативной документации (НД), включает следующие последовательные анализы.

Рисунок 4

Разработанные алгоритмы лабораторного контроля пищевой продукции адаптированы для пострегистрационного мониторинга ГММ в обороте и были использованы при разработке СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»). Разработка скрининговых методов и средств лабораторного контроля ГММ в пищевых продуктах.

Анализ наиболее распространенных ГМ-штаммов и обобщение опыта проведения мо-лекулярно-генетического и микробиологического анализа пищевых продуктов на наличие ГММ в ИЛЦ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи позволили обосновать и разработать скрининговые методы детекции ГММ, направленные на выявление наиболее типичных маркерных и селективных генов, используемых в генетических конструкциях по технологии рекомбинантных ДНК в различных группах микроорганизмов (бактерии и грибы), используемых в пищевой промышленности.

Для применения в лабораториях учреждений Роспотребнадзора, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль, были разработаны методы определения ГММ в пищевой продукции, полученной из/или с использованием микроорганизмов. Методы основаны на постановке ПЦР в реальном времени или ПЦР с детекцией результатов методом электрофореза.

С целью обеспечения единого методического подхода для определения ГММ при мониторинге пищевой продукции применение этих методов нормировано и утверждено Главным государственным санитарным врачом в Методических указаниях МУК 4.2.2305-07.

Требования, которые учитывались при разработке методов детекции ГММ, включали доступность оборудования и материалов, типовая оснащенность ПЦР-лаборатории, уровень подготовки врача-микробиолога (вирусолога) Центра гигиены и эпидемиологии.

Для разных видов пищевых продуктов были подобраны специальные методы пробо-подготовки и экстракции ДНК.

Для выявления генетических модификаций у микроорганизмов бактериальной природы был выбран и скомпонован в виде тест-систем ряд праймеров для анализа маркерных генов, наиболее часто употребляющихся при конструировании ГММ. Поскольку эти маркерные гены происходят из не пищевых микроорганизмов, то обнаружение таких последовательностей в штаммах, используемых при производстве пищевых продуктов, может свидетельствовать о произведенных генетических модификациях. В систему входят праймеры, фланкирующие следующие последовательности:

1. гена егтС, кодирующего устойчивость к эритромицину у плазмиды рЕ194 Staphylococcus aureus (размер фрагмента 349 п.н.);

2. гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину хромосомы Streptococcus pneumoniae, (размер фрагмента 242 п.н.);

3. гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину плазмиды pBR322, (размер фрагмента 321 п.н.);

4. гена lacZ, кодирующего фермент р-галактозидазу хромосомы Esherichia coli, (размер фрагмента 158 п.н.).

5. гена ori, кодирующего ориджин репликации, плазмиды р15А Esherichia coli, (размер фрагмента 382 н.п.);

6. гена hph, кодирующего устойчивость к гигромицину, хромосомы Streptomyces hygroscopicus, (размер фрагмента 288 н.п);

7. гена Sh Ые, кодирующего устойчивость к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus (размер фрагмента 301 н.п.).

Лабораторные исследования включают последовательные процессы: подготовка

проб, выделение ДНК из образца пищевых продуктов, амплификацию ДНК, детекцию ДНК методом электрофореза, анализ и интерпретацию результатов.

Метод ПЦР с электрофоретической детекцией является наиболее доступным и приемлемым для целей лабораторного контроля наличия ГММ при мониторинге пищевых продуктов на пострегистрационном этапе оборота.

Развитие системы идентификации ГММ в пищевой продукции связано с количественным определением специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Наиболее перспективным является метод ПЦР в реальном времени, основанный на детекции флюоресценции, отражающей накопление ампликонов на каждой стадии амплификации ДНК определенного ГММ в пище.

Молекулярно-генетический анализ пищевой продукции на наличие ГММ методом ПЦР в реальном времени проводится с использованием амплификаторов с оптической приставкой типа Rotor Gene - 3000, ABI Prism 7000, ¡Cycler IQ или отечественные аналоги производства «Синтол», «ДНК-технология».

Исследования проводят с использованием модифицированного комплекта реагентов для амплификации ДНК. Модификация заключается в использовании в реакционной смеси не только праймеров, но и флуоресцентно-меченых зондов "Taqman", а также использование контрольной ДНК в нескольких десятикратных разведениях известной концентрации.

Метод ПЦР в реальном времени является информативным и одновременно более сложным и требует специального оборудования и навыков работы с генетическим материалом.

Метод ПЦР с электрофоретической детекцией более подходит для скрининговых исследований пищевых продуктов на наличие ГММ. Анализ наиболее типичных ГММ, применяемых в производстве пищевых продуктов, позволили оптимизировать число праймеров для разработки тест-системы для лабораторного контроля ГММ в обороте.

Для реализации целей контроля в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН был разработан набор реагентов ГМ-БАКТ-I (ТУ 9398-001-018973572008) для выявления ГММ в пищевых продуктах, который позволяет производить детекцию ГММ подготовленному врачу-микробиологу (вирусологу) в условиях ПЦР-лаборатории.

Набор реагентов для выявления ДНК генетически модифицированных микроорганизмов методом ПЦР представляет собой многокомпонентный набор, предназначенный для качественного определения ДНК ГММ в пищевых продуктах, ферментных препаратах, стар-терных и заквасочных культурах, БАД к пище.

При апробации и стандартизации тест-системы для проведения исследований использовались программируемый термостат (ДНК-амплификатор) типа "Терцик МС2" или иные типы амплификаторов, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном поряд-

ке, термостат поддерживающий температуру + 45°С, Центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об/мин, встряхиватель вибрационный типа "Вортекс" со скоростью вращения до ЗОООоб/ мин, прибор для горизонтального электрофореза и другие типовые лабораторные материалы.

В систему входят праймеры, фланкирующие следующие последовательности:

- гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину плазмиды pBluescriptll',

- гена lacZ, кодирующего фермент (5-галактозидазу в плазмиде pBluescriptll;

- гена егтС, кодирующего устойчивость к эритромицину плазмиды рЕ194\

- гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину плазмиды pACYC184.

Условия проведения реакции определяют степень точности и воспроизводимости результатов. Их отработка была произведена для каждой конкретной пары праймеров. Выбор условий проведения ПЦР включал подбор оптимального соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода детекции результатов. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР обеспечил высокий уровень чувствительности и специфичности прохождения реакции, исключающий наличие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК.

В состав набора входят 3 комплекта реагентов и 1 вспомогательный реагент:

- комплект № 1А для выделения ДНК из образца ферментных культур, заквасок, бакконцен-тратов и БАД;

- комплект № 1Б для выделения ДНК из образца кисломолочных пищевых продуктов и сыров;

- комплект № 2 для амплификации ДНК;

- комплект № 3 для детекции ДНК;

- вспомогательный реагент MQ (вода деионизированная высокоочищенная).

Проверку набора на специфичность осуществляли на препаратах ДНК, выделенных из штаммов пищевых микроорганизмов из коллекции лаборатории санитарно-пшцевой микробиологии и микроэкологии НИИ питания РАМН. Список штаммов приведен в таблице 9. Проверку проводили методом полимеразной цепной реакции с детекцией специфических амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.

В пробах с положительными контролями ДНК селективных маркеров в концентрации не менее 5х104ГЭ/мл были получены положительные результаты ПЦР, и не было получено перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при концентрации не менее 1х103 ГЭ/мл.

Таблица 9

№№ Микроорганизм номер штамма

1 Escherichia coli M-17

2 Lactobacillus acidophilus Шт. Биобакгон

3 Lactobacillus acidophilus Шт. 1КВ-2991

4 Bifidobacterium animalis (¡actis) ВЬ -12

5 Bifidobacterium bifidum Шт. №1

6 Lactobacillus acidophilus Е.Р.317/402

7 Lactobacillus casei Шт. 163

8 Lactobacillus acidophilus К/Ак - 08

9 Saccharomyces cerevisiae Шт. АлкоИст

10 Композиция бифидобактерий В. bifidum, № ВКПМ Ас 1248(8-

Bifidobacterium bifidum 3); В.longum, №Ас 1531 (ДВА -

Bifidobacterium bifidum 13), В. bifidum 791 БАГ

Bifidobacterium longum

12 Lactobacillus paracasei, subsp. paracasei Шт. Dalton

13 Композиция Lactobacillus plantarum + Шт. 8Р-АЗ La + шт. 90ТС-4

Lactobacillus fermentum

14 Lactobacillus casei Шт.-01

15 Lactococcus cremoris Шт. 322

16 Streptococcus themophilus Шт. КТс 3 Е.А.

Поскольку набор предназначен для выявления ДНК генетически модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах с различными уровнями содержания микробной ДНК и ДНК пищевого субстрата, то для выделения ДНК из образцов различной природы предусмотрено два разных комплекта: Комплект № 1А для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД; Комплект № 1Б для выделения ДНК из образца пищевых продуктов.

Лабораторные исследования включают типовые последовательные процессы, включающие амплификацию ДНК, детекцию ДНК методом электрофореза, анализ и интерпретацию результатов.

В процессе стандартизации метода и набора ГМ-БАКТ-1 (ТУ 9398-001-01897357-2008) в целях гигиенического контроля и мониторинга за ГММ в процессе оборота проведены исследования 202 кисломолочных продуктов, выработанных из бактериальных заквасок производства «Хр.Хансен» и «Даниско», имеющих государственную регистрацию. Из них 110 образцов исследованы по заявлению продавцов с целью подтверждения отсутствия ГММ и дополнительной маркировки. Образцы продуктов в этом случае отбирались в крупных торговых сетях Москвы и Московской области представителями продавцов совместно со специалистами Центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. В целях контроля за ГММ в пищевых продуктах на стадиях оборота проведены сравнительные контрольные исследования 92 образцов пищевых продуктов по направлениям из Центров гигиены и эпидемиологии Брянской и Белгородской областей.

В настоящее время тест-система успешно применяется для лабораторного контроля ГММ в субъектах РФ.

Таким образом, разработка и внедрение в практику метода обнаружения ГММ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией и набора ГМ-БАКТ-1 обеспечивают преемственность и последовательность в лабораторном контроле пищевой продукции, выработанной с использованием ГММ или традиционных микроорганизмов, после допуска на продовольственный рынок на всех этапах ее оборота.

Постоянный регистрационный мониторинг ГММ в обороте должен иметь обратную связь с целью немедленного принятия мер в случае обнаружения ГМ продукции.

Результаты по обнаружению потенциально опасных для здоровья потребителей ГММ в ряде ферментных препаратов, полученные в ходе лабораторных исследований репрезентативной выборки пищевых продуктов, свидетельствуют о достаточной чувствительности и специфичности применявшихся методов лабораторного контроля и диагностической тест-системы ГМ-БАКТ-l и подтверждают необходимость лабораторного мониторинга за ГММ после допуска продукции на рынок продовольствия.

ВЫВОДЫ

На основе мониторинга современных стратегий, методов обнаружения и оценки безопасности ГММ, проведенных лабораторных исследований в системе гигиенического контроля за оборотом ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции разработаны:

❖ информационная база традиционных (классических) микроорганизмов, применяемых при производстве пищевой продукции;

❖ информационная база ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции;

❖ информационная база ферментных препаратов, полученных с использованием промышленных микроорганизмов (ГММ), позволяющие целенаправленно проводить выбор объектов и методов экспертной оценки продукции в целях контроля;

•> алгоритм проведения лабораторного контроля на наличие ГММ в различных видах пищевой продукции при пострегистрационном мониторинге;

♦> скрининговый метод обнаружения ГММ в пищевых продуктах на основе ПЦР с электрофоретической детекцией с использованием Набора «ГМ-БАКТ» (ТУ 9398-00101897357-2008).

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации:

1. Ховаев A.A. Вопросы безопасности и тенденции использования генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов при производстве пищевых продуктов, пищевых ингредиентов и продовольственного сырья // Вопросы питания - 2008,- Т. 77, № 3. - С. 58-63.

2. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Нестеренко Л.Н., Зигангирова H.A., Ховаев A.A.. Народицкий Б.С., Иванов Г.Е., Тутельян В.А., Гинцбург А.Л. Требования к медико-биологической оценке и гигиеническому контролю за оборотом пищевой продукции, полученной из генно-инженерно-модифицированных'микроорганизмов // Вопросы питания. 2008. -1.11, №3,- С. 49-57.

3. Ховаев A.A.. Нестеренко Л.Н., Народицкий Б.С. Современные методы обнаружения и оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ), применяемых при производстве пищевой продукции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2011,- № 1.-С.108-НЗ.

Другие издания:

4. Ховаев A.A.. Нестеренко Л.Н., Шевелева С.А., Ананьина Ю.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., Тутельян В.А. Оценка безопасности и система контроля генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах // Химическая и биологическая безопасность. - ВИНИТИ, 2010,- № 1-3. С. 3-14.

Материалы научных конференций

5. Ховаев A.A.. Нестеренко Л.Н., Зигангирова H.A., Народицкий Б.С. Молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов // Труды 6-й Всероссийская конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» 28-30 ноября 2007 г.,- М.:, 2007 - Т.1, С. 230-231.

6. Ховаев A.A.. Нестеренко Л.Н., Зигангирова H.A., Народицкий Б.С. Молекулярно-генетические методы детекции генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) в системе гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием промышленных микроорганизмов // Труды 7-й Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» 24-26 ноября 2010 г.,- М.:, 2010-Т.2, С. 36-39.

7. Ховаев A.A.. Нестеренко Л.Н., Шмаров М.М., Зигангирова H.A. Подходы и принципы законодательного и нормативно-методического регулирования применения и оборота пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных организмов (ГМО) // Вестник Российской военно-медицинской академии (II съезд Военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ) Приложение - С-Пб, № 1(15)-2006 - С. 317-319.

8. Зигангирова H.A., Нестеренко Л.Н., Шмаров М.М., Ховаев A.A. Опыт проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (ГММ) и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги (МГМА) // Вестник Российской военно-медицинской академии (II съезд Военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ) Приложение-С-Пб,№ 1(15)-2006 - С. 319-321.

Внедрение результатов в практику:

9. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») М.: Роспотребнадзор. 2008.

10. Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией» - приложение к Постановлению Главного государственного санитарного врача от 30,11.2007 № 80 «О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО». М.: Роспотребнадзор. 2008.

11. Набор реагентов для выявления ГММ бактериальной природы методом полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах «ГМ-БАКТ-1». ТУ 9398-001-01897357-2008.

Заказ № 133-а-31/01/2011 Подписано в печать 31.01.2011 Тираж 200 экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 иЛ^; , www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru

Широкое применение современных методов биотехнологии, и в первую очередь, генной инженерии при производстве продовольствия сегодня признается наиболее перспективным направлением совершенствования качества и увеличения объемов пищевых продуктов. Разработка и использование генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) с улучшенными технологическими свойствами (повышенная продукция ферментов, биологически активных веществ, устойчивость к микробному загрязнению) выгодны прежде всего экономически, поскольку требуют значительно меньших объемов исходного натурального продовольственного сырья, трудозатрат и времени, чем применение традиционных промышленных микроорганизмов [39,44, 49, 51, 63, 77, 84, 92, 93].

Вместе с тем, большинство экспертов признает, что новые качества ГММ, особенно не имеющие истории безопасного использования в пищу, могут быть связаны с потенциальным риском для человека и окружающей среды, а созданные трансгенные продукты перед выпуском на потребительский рынок в обязательном порядке должны подвергаться комплексным испытаниям на безопасность. При этом должно быть доказано отсутствие рисков неблагоприятного воздействия на человека и окружающую его среду, обусловленных как самими целевыми генами, так и кодируемыми ими новыми белками (в первую очередь, аллергенности, токсичности). Одним из главных аргументов против использования трансгенных технологий в производстве пищи является возможное присутствие генов антибиотикоустойчивости, потенциально способных к трансмиссии в представителей резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и пищевых продуктов [120, 125, 142].

Во избежание потенциального неблагоприятного воздействия продуктов, полученных с применением ГММ, на здоровье человека, животных и благополучие окружающей среды, при государственном регулировании генно-инженерной деятельности повсеместно предусмотрены специальные требования к допуску ГММ и трансгенных продуктов на продовольственный рынок. Несмотря на существующие различия подходов, во всех национальных схемах регулирования ГММ предрегистрационный этап является определяющим в обеспечении безопасности новых ГМ-продуктов. Он включает индивидуальную оценку риска каждого конкретного ГММ, итогом которого должно быть доказательство такой же степени его безопасности, как и традиционного аналога [75,99,116, 119].

Ведущие мировые производители ГММ (Германия, Нидерланды, Бельгия, США), ссылаясь на высокий научный и технологический потенциал при разработке ГММ и научно-методический уровень оценки, практически не подвергают сомнению, что любые риски от ГМ-продуктов, признанных безопасными, маловероятны. В связи с этим в ряде стран недооцениваются необходимость пострегистрационного мониторинга и маркировки допущенных ГММ, аргументируя это неприменимостью указанных мер к безопасным продуктам [134, 144, 162].

Напротив, рекомендации международных организаций ФАО/ВОЗ и европейское законодательство стоят на позициях обеспечения прав потребителей на информированный выбор любых новых пищевых продуктов и предупреждения рисков, для этических и религиозных предпочтений человека, в том числе во избежание негативного отношения к ним населения. Поэтому к механизмам регулирования ГММ они относят также систематический контроль за оборотом разрешенных и допущенных на продовольственный рынок пищевых продуктов, полученных с применением ГММ, и использование специальной маркировки о технологии производства [143, 144, 193, 194].

Поступление на мировой продовольственный рынок ГМ-продуктов без маркировки в результате нерегулируемого статуса ГММ на пострегистрационном этапе, помимо нарушений прав потребителей, создает серьезную проблему в оценке безопасности при ввозе ГММ, которая должна проводиться с учетом требований законодательства импортирующих стран.

В связи с этим, актуальной задачей является разработка унифицированных алгоритмов исследований, простых и надежных методов и средств для детекции ГММ при ввозе из-за рубежа и реализации продукции на продовольственном рынке.

Контроль за оборотом ГММ сегодня является одной из наиболее актуальных проблем, решение которых имеет не только социально-политическое значение, но и направлено на охрану здоровья населения. Это диктует необходимость странам, в том числе и России, разрабатывать собственные системы государственного гигиенического контроля ГММ [7,8, 116, 121, 124, 125].

Наряду с отслеживанием ГММ разрешенных для реализации на внутреннем потребительском рынке, система должна обеспечивать контроль и защиту от потенциально небезопасных, не прошедших процедур допуска и поступающих в - страну нелегально, а используемые методы должны опережать развитие технологий создания ГММ и базироваться на современном молекулярно-генетическом анализе. Поэтому органы здравоохранения и научное сообщество - в России признают необходимость обоснования и разработки реальной системы контроля за оборотом ГММ, допущенных на потребительский рынок РФ, и постоянного совершенствования этой системы на основании современных приоритетных исследований биологической и медицинской науки.

В то же время решение вопросов контроля за оборотом ГММ на практике может осуществляться только на основе определенных научных и организационных мероприятий, направленных на получение исчерпывающей информации о разновидностях используемых ГММ с учетом не прошедших процедуру допуска (нелегализованных), соответствующих им маркерных системах; о видах продуктов, в которые они вводятся; об объемах мирового производства и торговли ГМ-продовольствием, в том числе поступающего на внутренний рынок Российской Федерации; а также на обоснование выбора адекватных, чувствительных и высокоспецифичных методов обнаружения, анализа безопасности ГММ.

Цель исследования

Цель исследования: разработка системы гигиенического контроля за оборотом пищевой продукции, полученной из/или с использованием ГММ.

Исходя из положения о том, что система контроля включает взаимосвязанные между собой элементы (научного, информационного, нормативного, кадрового, материально-технического обеспечения и ресурсов, организационной структуры, методик, процедур) основной целью работы являлась разработка информационного и методического потенциала системы контроля.

Задачи исследования

- создать информационную базу данных о ГММ и их традиционных аналогах, представленных на мировом продовольственном рынке, с учетом объемов мирового производства ГММ, структуры и объемов импорта в Российскую Федерацию пищевой продукции, имеющей генетически модифицированные аналоги (ГМ-аналоги) или выработанные с использованием ГММ;

- провести сравнительный анализ существующих методов обнаружения и оценки безопасности ГММ в пищевой продукции; обосновать и унифицировать единую методику на основе ПЦР для выявления ГММ в пищевых продуктах;

- провести выборочные исследования репрезентативного перечня различных видов пищевой продукции, изготавливаемой с использованием биотехнологических микроорганизмов, на наличие ГММ;

- разработать алгоритм проведения лабораторного контроля в обороте пищевой продукции, полученной с использованием ГММ или их аналогов;

Научная новизна работы

Впервые разработаны новые подходы к информационному анализу и нормативно-методическому обеспечению системы контроля пищевой продукции, основанные на молекулярно-генетическим методам обнаружения и оценки безопасности ГММ в традиционных продуктах, которые могут служить объектами генно-инженерных модификаций.

Проведен научный анализ опубликованных данных о существующих и разрабатываемых видах ГММ, разработан перечень промышленных штаммов ГММ и штаммов микроорганизмов, имеющих ГМ-аналоги, представленных в настоящее время на мировом рынке, статус их легитимности, уровень внедрения в производство (коммерциализации).

Изучение распространенности ГММ и структуры мирового рынка пищевой продукции, вырабатываемой с использованием ГММ и их аналогов, позволили обосновать выбор объектов исследования и методов детекции для их практического применения при проведении лабораторного контроля на наличие ГММ в пищевой продукции.

Разработан метод выявления маркеров генных модификаций микроорганизмов с использованием ПЦР-анализа для обнаружения ГММ в ферментированных пищевых продуктах, бактериальных заквасках, стартовых культурах и биологически активных добавках к пище.

Научно обоснована необходимость контроля (надзора), направленного на выявление живых ГММ в пищевых продуктах, содержащих пробиотическую микрофлору, на подтверждение отсутствия штаммов ГММ-пр оду центов в ферментных препаратх, биологически активных веществах, пищевых добавках, используемых при производстве пищевых продуктов и подлежащих удалению из конечного продукта.

Практическая значимость работы Разработаны и внедрены в практику:

- Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПНР с электрофоретической детекцией» - приложение к Постановлению Главного государственного санитарного врача от 30.11.2007 № 80 «О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО»;

- Методические указания (МУ 2.3.2.2789-10) по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов;

- Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») регламентирующие организацию деятельности Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека при надзоре (контроле) за оборотом пищевой продукции, полученной из / или с использованием ГММ.

Разработан перечень пищевой продукции, подлежащей санитарно

- эпидемиологической экспертизе на наличие ГММ, необходимый практическим учреждениям, осуществляющим надзор за качеством и безопасностью пищевых продуктов.

Проведена стандартизация метода ПЦР-анализа для выявления ГММ в пищевых продуктах.

Разработан набор реагентов «ГМ-БАКТ-1» для выявления ГММ в пищевых продуктах, который позволяет производить детекцию ДНК генетических маркеров в концентрации не менее 5x104 ГЭ/мл при содержании генетически л

- модифицированных бактерий не менее 1x10 клеток/мл при анализе кисломолочных продуктов и сыров, стартовых культур, заквасок, бактериальных концентратов и биологически активных добавок к пище.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедрах инфектологии, гигиены питания и токсикологии МПФ ППО ММА им. И.М.Сеченова и кафедре социальной гигиены и организации санитарно-эпидемиологической службы с курсом клинической лабораторной диагностики ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на 7-й всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (М., 24-26 ноября 2010 г.), диссертация апробирована на межлабораторной научной конференции НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи 22 декабря 2010 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ, 2 методических указания, санитарные правила и нормы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана система обнаружения и идентификации ГММ в различных видах пищевой продукции, основанная на применении полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными для основных видов генетических модификаций.

2. Впервые создана информационная база данных, характеризующая все известные виды ГММ и их традиционных аналогов, используемых в пищевой промышленности, включая характеристики штаммов доноров и реципиентов, идентификационные маркеры, плазмиды, позволяющая выявлять ГММ в различных матриксах пищевой продукции.

3. На основании исследования 1292 образцов пищевой продукции, полученной с применением ГММ и их традиционных аналогов, охарактеризована структура зарегистрированной в РФ продукции, в которой преобладают пищевые ингредиенты (ферментные препараты) полностью освобожденные от штаммов-продуцентов (49,5%). Частота обнаружения незаявленных генетических модификаций составила менее 1%. ГММ в жизнеспособном состоянии при производстве бактериальных заквасочных культур, продуктов на основе пробиотических микроорганизмов и дрожжей не обнаружены.

4. Показано, что в 1% образцов заквасочных культур на основе живых микроорганизмов (Bifidobacterium, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus) обнаружена антибиотикоустойчивость, которая носит природный характер, не свидетельствует о генетических модификациях, но должна учитываться при экспертной оценке и лабораторном контроле.

5. В целях предупреждения циркуляции нелегитимных ГММ и нарушений прав потребителей на информированный выбор наряду с контролем пищевых продуктов на основе ГММ обоснована необходимость лабораторного контроля в обороте пищевой продукции, полученной на основе традиционных микроорганизмов - аналогов ГММ как потенциальных объектов генетических модификаций.

6. Обнаружение в ферментных препаратах трансмиссивной антибиотикоустойчивости, маркерных векторных генов (1,2 %) свидетельствует о потенциальной опасности для потребителей и подтверждает необходимость контроля рекомбинантной ДНК в продукции на основе как традиционных так и ГМ-штаммов продуцентов.

7. Разработанные методы и средства детекции ГММ, алгоритмы контроля обеспечивают обнаружение основных типов генетических модификаций у микроорганизмов, циркулирующих на продовольственном рынке России.

ГЛАВА 6. ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

1. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.2340-08 (Дополнения и изменения № 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») М.: Роспотребнадзор. 2008.

2. Методические указания МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих

- генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией» - приложение к Постановлению Главного государственного санитарного врача от ЗОЛ 1.2007 № 80 «О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО». М.: Роспотребнадзор. 2008.

3. Методические указания (МУ 2.3.2.2789-10) по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. М.: Роспотребнадзор. 2010.

4. «ГМ-БАКТ-1». Набор реагентов для выявления ГММ бактериальной природы методом полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах. ТУ 9398-001-01897357-2008. Применяется в 50 субъектах РФ.

5. Информационная база традиционных (классических) микроорганизмов, применяемых при производстве пищевой продукции.

6. Информационная база ГММ, применяемых при производстве пищевой продукции.

7. Информационная база ферментных препаратов, полученных с использованием промышленных микроорганизмов (ГММ).

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При разработке системы гигиенического контроля за пищевой продукцией, полученной с использованием ГММ, должен применяться комплексный, многоуровневый и многофакторный подход, основанный на результатах непрерывного изучения и анализа мирового биотехнологического рынка разработок и производства ГММ, мониторинга современных стратегий, методов обнаружения и оценки безопасности ГММ. Этот подход должен обеспечивать постоянный процесс изучения, анализа и исключения или нивелирования различных технологических и биологических рисков использования ГММ.

При разработке системы гигиенического контроля за ГММ необходимо учитывать продовольственную политику государства и стратегию в отношении производства и использования ГММ, уровень и качество обеспеченности населения продовольственным сырьем и пищевыми продуктами, уровень научного, информационно-аналитического, материально-технического обеспечения разработок и использования ГММ, методов обнаружения и оценки безопасности ГММ, систему формирования законодательной и нормативно-правовой базы, готовность и степень ее гармонизации с международными - правилами и стандартами.

Разработка системы контроля за оборотом пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, включает создание взаимосвязанных между собой элементов (научного, информационного, нормативного, кадрового, материально-технического обеспечения и ресурсов, организационной структуры, методик, процедур) с учетом объемов, структуры и тенденций развития мирового рынка биотехнологий, доли импорта продовольствия, с целью обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов при обороте на продовольственном рынке России и защиты прав потребителей.

Мировой опыт показывает, что основной проблемой контроля за ГММ в пищевой продукции является обнаружение несанкционированных или неизвестных ГММ. Основной причиной биологических рисков и неблагоприятных последствий при употреблении в пищу ГММ является нестабильность генетической конструкции и генома микроорганизма.

В связи с этим в условиях бурного развития биотехнологии должна быть создана эффективно функционирующая, гармонизированная, адекватная законодательная, нормативная и контрольно-методическая база, регулирующая производство и оборот пищевой продукции, полученной из ГММ на мировом рынке. Основой такой системы должны быть научно обоснованные требования, адаптированные к новым достижениям в области науки и биотехнологий, основанные на концептуальном подходе оценки рисков и непрерывном мониторинге.

Широкомасштабное (коммерческое) использование ГММ и полученных из них продуктов питания допустимо только при наличии исчерпывающих доказательств их полной (как реальной так и потенциальной) биологической безопасности для человека и окружающей его среды и только после проведения полной и всесторонней медико-биологической и молекулярно-генетический оценки.

При разработке государственной системы контроля за ГММ в пищевых продуктах, предназначенных для потребления человеком, должно быть предусмотрено решение следующих основных задач:

- Контроль разрешенных объемов поставок в страну партий пищевых продуктов, полученных с применением ГММ, предназначенных для потребления человеком;

- Определение наличия несанкционированных ГММ с целью защиты здоровья людей, в соответствии с законодательством страны в области биобезопасности.

Предотвращение непреднамеренного импорта ГМ продуктов в коммерческих целях.

Система гигиенического контроля за пищевой продукцией, полученной с использованием ГММ, должна состоять из двух последовательных и - преемственных этапов: предрегистрационного (при допуске на рынок) и пострегистрационного.

При разработке государственной стратегии и нормативно-методических подходов к оценке и методам обнаружения ГММ должны учитываться такие факторы как многообразие пищевых продуктов и пищевых ингредиентов, полученных с использованием микроорганизмов (ферментов, белков, биологически активных веществ и др.), значительная, до 80%, доля импорта этих продуктов на отечественный продовольственный рынок, зарубежный опыт контроля за оборотом ГММ, особенности рынка и оборота продукции в России, имеющиеся научный потенциал и технические возможности для проведения экспертизы в нашей стране.

При выборе пищевых продуктов для лабораторного контроля на наличие ГММ необходимо руководствоваться современным перечнем пищевых добавок и ингредиентов, получаемых из микроорганизмов, рейтингом и тенденциями использования промышленных микроорганизмов, перечнем ГММ имеющих официальное разрешение на применение в пищевой промышленности и получаемых на их основе пищевых добавок и ингредиентов.

Разработка новых и совершенствование имеющихся методов обнаружения и оценки безопасности ГММ должны осуществляться на основе глубокого научно-технического информационного анализа и прогноза разработок в пищевой биотехнологии.

Стандартизация и гармонизация методов обнаружения и оценки ГММ позволяет разработать единую адекватную унифицированную систему оценки и обеспечить преемственность при контроле за ГММ в пищевой продукции между импортирующими и экспортирующими сторонами на международном продовольственном рынке.

Перечень и объем стратегий и методов, применяемых для детекции ГММ должен определяться исходя из вероятности несанкционированного, намеренного использования ГММ, степени технологических рисков и обеспечения качества при производстве пищевой продукции, полученной с применением биотехнологий.

Изучение и анализ рисков в системе оценки безопасности ГММ и допуска их на потребительский рынок продуктов, мониторинг новых биотехнологических продуктов на всех этапах оборота и потребления должны быть основаны на всесторонней индивидуальной оценке каждого вида ГММ и проводиться с учетом конкретных свойств, характеристик и параметров безопасности каждого вида ГММ на основании информационных баз и результатов лабораторного анализа.

Детализированное изучение структуры импорта на внутренний рынок РФ указывает на преобладание среди ведущих поставщиков и производителей ГМ-продукции, к которой не предъявляют требований о маркировке и которая может поступать на рынок без деклараций. Это требует принятия дополнительных мер при контроле.

Сложившиеся подходы к лабораторным испытаниям пищевой продукции на наличие ГММ, применение высокоспецифичных и чувствительных методов анализа при предрегистрационном контроле и мониторинге при обороте позволяют максимально нивелировать несакционированное трансграничное перемещение нелегитимных ГММ на продовольственный рынок России.

Контроль наличия рекомбинантной ДНК должен проводиться не только в продуктах, полученных с применением ГММ, но и в традиционных продуктах, имеющих генетически модифицированные аналоги, которые могут использоваться для генно-инженерных модификаций.

Итогом проведенной работы, включающей в себя результаты всех разделов и заключительные положения диссертации, является разработка информационного и нормативно-методического обеспечения системы контроля за пищевой продукцией, полученной с применением ГММ.