Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка иммуноферментного ловушечного метода определения IgM и IgG антител при сифилисе с помощью пероксидазного трепонемного коньюгата

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР 2-й МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫ Й МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУ имени Н.И.ПИРОГОВА

На правах рукописи

ЛЯХОВ Виктор Федорович

УДК 616.972-07:616.153.962.4-097-078.33

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГОЛОВУШЕЧНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ^М И ДО АНТИТЕЛ ПРИ СИФИЛИСЕ С ПОМОЩЬЮ ПЕРОКСИДАЗНОГО ТРЕПОНЕМНОГО КОНЬЮГАТА (14.00.36 - аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991 25 сентября 1991 г.

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза, иммуноглобулинов аучно-исследовательекого института вирусных препаратов Акаде-ии медицинских наук СССР,

Научный руководитель: доктор биологических наук Е.В.СИДОРОВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор К.Д.ШАХАШНА .доктор медицинских наук, профессор Ю.И.ЗИМИН

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательский шститут вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Министерства (дравоохранения СССР,.

Защита диссертации состоится 199'/'р.

¡-м Московском ордена Ленина государственном медицинском инсти-?уте им. Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения РСФСР [Москва П7437, ул. Островитянова, д. I).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го Мос-совского ордена Ленина государственного медицинского института ш. Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения РСФСР.

часов на заседании специализированного Совета при

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета • кандидат медицинских наук

Т.Е.КУЗНЕЦОВА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в общей структуре заболеваемости сифилисом возрос удельный вес малосимптомных и скрыть« его форы. В то, же время надежные методы ранней диагностики сифилиса и критерии оценки эффективности его лечения отсутствуют. В связи с этим возникла настоятельная потребность в разработке подходов для выявления заболевания на ранних стадиях его развития, оценки активности инфекционного процесса и эффективности специфической терапии.

Насущные вопросы серологии сифилиса могут быть решены с учетом иммунопатологии этого заболевания. Особое, значение имеет определение антитрепонемных антител класса М и сравнительная оценка содержания противогрепонемных з^м и 1§а антител. Поскольку выработка специфических 1эМ антител имеет место не только при первичном заражении сифилисом, но и при его рецидивах или реинфекциях, персистенщя -ада антител рассматривается как показатель наличия в организме вирулентного возбудителя. По наличию противотрепонешьк антител» по их соотнесенности со специфическими ^ антителами можно судить об активности сифилитической инфекции и необходимости лечения.

Среди множества серологических методов диагностики наиболее перспективным является иммуноферментный анализ (ИФА). И4А сочетает высокую диагностическую эффективность с возможностью использования его для массового обследования населения. Наибольшее распространение получил непрямой вариант ША, на заключительном этапе которого применяются антивидовые антитела к изотипам иммуноглобулинов человека. Однако, при такой постановке возможна ошибочная "оценка содержания 1вм антител, приводящая к последующей неверной тактике ведения больных. За счет ревмато-

гдного фактора, представленного igi,i антителами против р0 -фра-«ента igG человека, могут формироваться ложноположительные ■езультаты определения противотрепонемных igia антител. Налро-ив, ложноотрицательные результаты опосредуются конкуренцией ежду специфическими более аффинными igG и менее аффинными ротивотрепонеынши igu антителами. В ловушечном ИФА нёдостат-:и, присущие нег^ямому И4А, сведены к минимуму. При ловушечном «ти- igM(lgG) -ИМ на твердую фазу первым слоем наносят антите-ia к М и g иэотипам иммуноглобулинов человека, вторым - иссле-[уеыую сыворотку, а затем - необходимые для выявления специфи-юских антител ингредиенты. Для сенсибилизации твердофазного юсителя обычно используют ыоноспецяфические антисыворотки, что «осит элемент нестандартности и обусловливает относительно вы-:окую неепецифическую реактивность тест-систем. Это заставляет [екать новые подходы, обеспечивающее специфичность выявления гротивотрепонемных антител.

Цель работы. Данная работа посвящена разработке высокоэффективного метода определения противотрепонемных IgM и, IgG ан-мтел при сифилисе. В соответствии с поставленной целью решаюсь следующие конкретные задачи:.

1) разработать ловутечный метод анти- igM(lgG) -И4А, осно-¡анный на применении ыоноклональных антител к иммуноглобулинам юловека для сенсибилизации твердой фазы и пероксидазного тре-юнемного коньюгата для выявления специфических антител;

2) оценить содержание IgM и IgG изотипов противотрепо-1емных антител:

- у больных ранними формами сифилиса до лечения;

- у больных ранними формами сифилиса, подучивших лечение и шимающихся с диспансерного учета;

- у пациентов, имевших половой контакт с больными заразны-

ми формами сифилиса; ~

- у детей, рожденных от матерей, больных сифилисом и получивших лечение во время беременности;

- у больных с ложноположительными результатами стандартны) серологических реакций на сифилис;

3) сравнить диагностическую значимость двух методов иммунс ферментной диагностики сифилиса: непрямого igG-ИВД и ловушеч-ного анти- igM(igG) -ИSA.

Наущая новизна.

- Впервые отработаны условия очистки коммерческого трепо-немного антигена, резко повышающие специфичность взаимодействие его с антителами,

- Впервые получен высокоспецифичный препарат пероксидазно-го коныогата трепонемного антигена, не реагирующий с иммуноглобулинами нормальной сыворотки человека.

- Впервые в СССР разработан ловушечный вариант ША, основанный на применении для сенсибилизации твердой фазы мо.ноклона-лбных антител к igM и igQ человека.

- Впервые в СССР ловушечный метод USA. использован для дифференциальной диагностики противотрепонемных IgM и igG антител при ранних формах сифилиса (методапробирован в клинике на 449 сыворотках).

Практическая значимость. Разработанный метод позволяет проводить раннюю диагностику сифилиса, дифференцировать мало-симптомные формы заболевания, оценивать активность инфекционно го процесса и эффективность специфической терапии. Предлагаемы ловушечный метод анти- igM(igG) -ИМ ыожет быть использован в качестве реакции-арбитра при дифференциальном диагнозе врожден ного сифилиса и пассивной трепонемоспецифической имМуноглобу-линемии, а также для рекомендаций по снятию больных с клинико-

серологического контроля.

Апробация результатов. Апробация диссертации состоялась на Збщеинститутской конференции Научно-исследовательского института вирусных препаратов АМН СССР (1991).

Результаты работы были представлены на Конференции молодых ученых Центрального научно-исследовательского кожно-венррологи-1еского института МЗ СССР (1987), на Научно-практической конференции кафедры и клиники кожных и венерических болезней 1-го Московского ордена Ленина и Трудового Красного Знамени медицинского института имени И.М.Сеченова МЗ СССР (1989), на Отчетной тучной конференции Научно-исследовательского института вирус--йк препаратов АМН СССР (1990).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, эбзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, включающего 131 наименование (28 советских и 103 иностранных авторов). Объем -диссертации составляет 157 страниц, включая 9 рисунков и 7 таблиц.

материалы и метода

Экспериментальные животные. В модельных экспериментах использовали кроликов-самцов породы "шиншилла" весом 2,5-3 кг, иммунизированных аудированным коммерческим трепонемным антигеном. Антиген в полном адиованте Фрейнда вводили в 4 точки (5 мг 5елка на кролика) с последующей реиммунизацией через 30 дней, {ровь брали из ушной вены через неделю после реиммунизащи.

Сыворотки пациентов. Кровь для получения сывороток людей • 5рали натощак из локтевой вены пациентов.

Сыворотки получали стандартным методом и хранили пэсле эсветления при -20°С. 4

Трепонемный антиген. В качестве исходного антигенного материала использовали коммерческий препарат грепонемного антигена. Для очистки коммерческого препарата использовали хроматографию его на иымуносорбенте, синтезированном по методу А.Е.Гурвича и Е.ВЛехтцинд (1981), содержащем фиксированный на оксицеллюлозе поликлональный здоровых доноров. Антиген стандартизировали по содержанию в нем белка по Ъоту (1951).

Моноклональные антитела. В работе использовали мышиные мо-ноклональные антитела к ^ -цепям д^м' (анги-^1) и Рс -фрагмент; 1еа человека (анти-Ес), полученные в лаборатории биосинтеза иммуноглобулинов НИИ вирусных препаратов АМН СССР -фракции, выделенные из асцитньк жидкостей, содержащих моноклонапьт антитела).

Антисыворотки. Кроличьи антисыворотки, специфичные к и з^ц человека, а также ослиные антисыворотки, специфичные к иммуноглобулинам кролика, получали из НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи АМН ССОР, за что приносим глубокуь благодарность проф. К.Л.Шаханиной.

Пероксидазные конъюгаты. Использовали отечественный коммерческий препарат высокоочищенной пероксидазы хрена с И2 =3,0 Коньюгаты ослиных поликдональных антител к иммуноглобулинам 1фолика, ыьшных моноклональных антител к Рс -фрагменту человека и трепонемного антигена получали по модифицированной методике ^уааеп и КигеЪак (1984). В работе использовали также пероксидазный конъмгат козьих антител к иммуноглобулинам кролика ("Кальбчрхем", 8РГ). В качестве субстрата использовали орто-фенилендиадан.

Иммуноферментные методы. Непрямой ИФА проводили в модифи-вдэованном шкроварианте метода Уаааег (1980). В сенсибилизи-

дованше трепонемным антигеном лунки вносили испытуемые сыворотки или их гамма-глобулиновые фракции. Идентификацию' изотипов прореагировавших с фиксированным антигеном специфических имму-■юглобулинов осуществляли с помощью пероксидазных коныогатов соответствующих антивидовых антител.

При проведении ловушечного анти- вддЦва) -ИЗБА. лункя план-петов сенсибилизировали моноклональными анти-ул. и анти- з?с. Затем наносили испытуемые сыворотки и выявляли противотрепонемные антитела с помощью пероксидазного коныогата очищенного трепонем-того антигена. Результаты реакции оценивали визуально или спек-грофотометрически. При визуальной оценке характер окрашивания эпределяли по 4-балльной системе в условных единицах интенсивности (1+ - 4+). При количественной оценке результаты оценивали в единицах экстинкции при длине волны 492 нм (ОП^), используя •КЛегЬек Ми1-Ыакап МСС/34-0" (Финляндия).

Методы стандартной лабораторной диагностики сифилиса. Методы включали бактериоскопическую диагностику и серологическое тестирование (реакции связывания комплемента с кардиолипиновым л трепонемным антигенами, реакция ыикропреципитации на стекле и реакции иммунофдуоресценции и иммобилизации трепонем). Стандартные тесты выполнялись сотрудниками лабораторной службы ГКБ №14 ям, В.Г.Короленко, за что мы приносим им глубокую благодарность.

, Статистическая обработка результатов. Результаты обрабатывали статистически с помощью критерия Стьюдента (р < 0,05).

резушаты и обсуждение

В серии опытов для выявления противотрепонемных антител в сыворотках иммунизированных трепонемным антигеном кроликов и Зольных сифилисом мы попытались воспроизвести непрямой И5А. Ос-

новной трудностью, с которой мы при этом столкнулись, оказалось наличие высокого неспецифического связывания сывороток неиммунных кроликов и здоровых доноров с коммерческим трепонемным антигеном. Так, в трех контрольных сыворотках, полученных от здоровых доноров, интенсивность окрашивания составляла 3+, а у шести больных вторичным рецидивным сифилисом - 3+- 4+. Таким образом, различия представлялись недостоверными.

Очевидно, что ложная позитивность контрольных сывороток могла опосредоваться как иммуноглобулинами, так и сывороточными факторами неиммуноглобулиновой природы. Для решения этого вопроса были поставлены модельные опыты, в которых в непрямом И ФА использовали очищенную гамма-глобулиновую фракцию сыворотки не-иммунизированного кролика. Оказалось, однако, что использование иммуноглобулиновой фракции не только не снижает, но, напротив, даже повышает, неспецифическое связывание. Это позволило заключить, что ложноположительные результаты обусловливаются связыванием нормальных сывороточных иммуноглобулинов с какими-то компонентами коммерческого препарата трепонемного антигена.

Стало ясно, что использовать такой антиген для разработки высокоэффективного теста на сифилис нецелесообразно, и перед наш" встала задача получения очищенного антигена/ специфически реагирующего только с сыворотками больных.

I. Получение очищенного трепонемного антигена

Удаление из коммерческого трепонемного антигена неспецифи ческих компонентов достигалось хроматографией препарата на спе ц1фическом иммуносорбенте, содержащем igG человека. Предварительно препарат подвергался'дополнительному ультраозвучиванию целью повышения его гомогенности. Отработка условий озвучивали показала, что оптимальной является ультразвуковая дезинтеграци

при температуре 0°С 4 раза по 15 секунд (20 кГц, 50 Вт) с интервалами между энспозициями по 30 секунд.

Сравнение коммерческого и очищенного препаратов трепонем-ного антигена в непрямом ИФА показало, что при использовании коммерческого антигена наблюдается значительное взаимодействие его с сыворотками здоровых доноров: уровень экстинкции,' ОП^^, составлял 0,216-0,018. Аналогичные показатели в случае применения очищенного антигена были на порядок ниже: 0,019-0,006. Сыворотки больных вторичным рецидивным сифилисом с коммерческим и очищенным антигенами давали ОП^^ соответственно 0,611-0,072 и 0,567^0,091. Таким образом, при использовании коммерческого препарата специфический сигнал превышал неспецифический не более, чем в 2-3 раза. При использовании очищенного препарата достигалось «¿0 - 30-кратное превышение специфического окрашивания над неспецифическим. Существенно, что чувствительность ИФА после иммуносорбции фактически не снижалась.

Поскольку препараты трепонемного антигена разных коммерческих серий отличались друг от друга по своей антигенности, для оптимизации определения противотрепонемных антител использовали пулированные коммерческие препараты. В результате был получен очищенный трепонемный антиген, позволяющий специфически выявлять противотрепонемные антитела в непрямом ИФА.

Ясно, однако, что даже использование очищенного антигена не снимает методологических недостатков, присущих непрямому ИФА. Поэтому на следующем этапе исследований мы перешли к отработке оптимальных условий постановки ловушечного анти-1вМ(1вО)--И$А на основе использования моноклональных антител и перокси-дазного конъюгата очищенного трепонемного антигена.

2. Отработка постановки ловушечного анти- XgM(IgG) -ИФА

В первую очередь следовало определить рабочее разведение трепонемного конъшгата и оптимальные сенсибилизирующие концентрации моноклональньк антител в ловушечном ИША.

Для определения рабочего разведения трепонемного коныогата в лунки 96-луночного планшета "litertek" вносили моноклональ-ные антитела анти- Рс (10 мкг/мл), а затем добавляли "положительную" сыворотку больных вторичным рецидивным сифилисом (в разведении 1:100), пероксидазный трепонемный конъюгат (в разведениях 1:100, 1:500, 1:1000) и, наконец, субстрат. В качестве контрольных использовали лунки, содержаще: а) анти-Fc + "отрицательную" сыворотку здоровых доноров + трепонемный конъюгат + субстрат, б) сыворотку + трепонемный коныогат + субстрат, в) анти-Рс + трепонемный конъюгат + субстрат, г) трепонемный конъюгат + субстрат. В контролях величины эксганкций Oll^gg не превышали 0,080. Показатели экстинкций в опытных, лунках значительно превышали контрольна уровень (рис. I). Сравнивали результаты определения противотрепонемных антител с помощью трепонемного коныогата в ловушечном ИФА и анти-Рс коныогата в непрямом И$А (рис. X). Как видно из рисунка, противотрепонемные антитела в сыворотках больных выявлялись при разведениях трепонемного конъюгага 1:100 - 1:1000. В ловушечном ИФА трепонемный конъюгат в разведении 1:100 выявлял примерно такое же количество специфических антител, что и анти-Рс конъюгат (рабочее разведение 1:5000) в непрямом ИФА. Поэтому во всех последующих по становках ловушечного ИМ в качестве рабочего использовали раз ведение трепонемного конъюгата 1:100.

Определение сенсибилизирующих концентраций моноклональных антител показало, что оптимальными являются концентрации

0П492 хЮ3

800

600

400

200

Рис. I. Определение противотрепонемньк антител с помощью конъюгата моноклональных антител к Рс -фрагменту IgG человека в непрямом ИМ (А.) и с помощью гре по немного конъюгата^ в ловушечном ИВД (В). к - коныогат анти-Рс (1:5000); Б - трепонемный коныогат в разведениях:

1 - 1:100,

2 - 1:500,

3 - 1:1000.

5 мкг/мл. Таким образом, окончательная схема постановки ловуще-чного анти--И$А. состояла в сенсибилизации твердофазного носителя мышиными моноклональными антителами к^ -цепям 1бМ и ро-фрагменту человека в концентрации 5 мкг/мл, нанесении на сенсибилизированный носитель испытуемых сывороток в разведении 1:100 и проявлении специфических антител пероксидазным трепонемным коньюгатом в разведении 1:100.

В специально проведенной серии экспериментов бьшо показано, что предварительно сенсибилизированные планшеты могут храниться при температуре +4°С в течение трех месяцев.

3. Оценка содержания ревматоидного фактора ловушечным'ИФА

Известно, что в лойушечном анти- по сравнению с

непрямым Хзм-ИМ достигается снижение ложноположительных результатов, опосредованных ревматоидным фактором (РФ). Полностьк / исключить ложные реакции на 1еШ антитела, однако, даже в этом случае нельзя. Очевидно, что анти-д при наличии больших количеств РФ могут связать некоторое количество комплексов 1вм-1вС содержащих в том числе и противотрепонемный который б уде'

выявляться трепонемным коньюгатом как, якобы, 1ем.

Существенное содержание Р5 наблюдается при ряде диффузных заболеваний соединительной ткани. Среди обследованных наш больных пациентов, страдающих сочетанной патологией, не оказалось. Однако, для окончательного исключения возможных ложнополо ттелышх. результатов при сифилисе за счет Р5 при постановке ловушечного ИФА бьш использован следующий подход. На сенсибили зированную моноклональными анти-^ антителами пластиковую осно ву наносили сыворотки больных ревматоидным артритом, любезно предоставленные зав. лабораторией НИИ вирусных препаратов АМН

СССР Н.П ..-льцевой. Контролем служили сыворотки здоровых доноров. Изотипы связавшихся с твердой фазой иммуноглобулинов определяли с помощью соответствующих тест-реагентов. Наличие 1§Сг среди."уловленных" з^м выявляли, обрабатывая планшеты после нанесения сывороток пероксидазным конъюгатом анти-Рс (рис. 2). Как видно из рисунка, у больных ревматоидным артритом и здоровых доноров выявлялись примерно одинаковые количества При этом в сыворотках пациентов с ревматоидным артритом значительные количества "уловленных" анти-^к антителами, как и следовало ожидать, оказались связанными с з^й, который и был выявлен пероксидазным анти-Гс конъюгатом. В контрольных сыворотках выявить такой "связанный" не удалось.

- Таким образом, при иымуноферментной диагностике сифилиса ловушечным методом параллельное применение трепонемного и анти--Рс коншгатов позволяет в сомнительных случаях выявить наличие среди з^м антител, "уловленных" фиксированными анти-^, примесь Это, в свою очередь, позволяет судить о возможном

участии РФ в формировании ложноположительных результатов анти--1вМ-ИФА и помогает правильно трактовать данные серологического обследования.

4. Яовушечный ИФА. как универсальный метод серодиагностики раннего сифилиса

Значительный интерес представляло выявление возможности использования ловушечного ША для диагностики раннего сифилиса. С этой целью провели обследование 207 больньк различными формами раннего сифилиса до назначения специфического лечения. В их число вошли пациенты с первичным серонегативныы (8) и серопоэи-тивным (41), вторичным свежим (35) и рецидивным (72) и .скрытым , (51) сифилисом. Контрольная группа состояла из 100 здоровых до-

0П492 X 10"

1000

600 ■

600 •

400 -

200 -

к/

/ /

//

к

1 т

1

//<

1 / / %

Рис. 2. Выявление ревматоидного фактора в сыворотке больных ревматоидным арт-, ритоы с помощью ловушечного ИМ. А - здоровые доноры (п = 10); Б - больные ревматоидным артритом (а . 10);

- 101; О -

о

норов. ' ,

Известно, что для лабораторного подтверждения диагноза сифилиса требуется сочетанное применение нескольких методов стандартной лабораторной диагностики, поскольку при разных формах сифилиса чувствительность этих тестов меняется. В то же время при использовании ловушечного ИФА у всех больных ранним сифилисом были зарегистрированы положительные результаты, а у здоровых - отрицательные. Так как при всех формах раннего сифилиса анти-igMCigG) -И2А сохранял высокую чувствительность и высокую специфичность, ловушечный метод можно рекомендовать в качестве универсального метода серодиагностики си<|илиса.

Было также проведено сравнительное обследование сывороток 14 пациентов с различными формами сифилиса с помощью непрямого IgG-ИФА и ловушечного анти- igM(igG) -MäSA (таблица). Данная группа была представлена лицами, страдающими ранними формами сифилиса (б), серорезистентностью, развившейся после лечения ранних форм сифилиса (2); сюда же вошли патенты, которым было назначено превентивное лечение после полового или тесного бытового контакта с больными заразными формами сифилиса (4), и пожилые яоди, отягощенные соматическими заболеваниями, с ложнопо-ложительными результатами стандартных серологических реакций на си<£илис - JHP (2). Как видно из таблицы, ловушечный метод обладает явными преимуществами перед непрямым И$А, поскольку, во-первых, позволяет идентифицировать не только IgO, но и igM антитела, и, во-вторых, выявляет наличие антител, не определяемых непрямым Ш6А, т.е. является более информативным.

Обнаружение противотрепонемных IgM антител свидетельствовало об активности сифилитического процесса и позволяло обоснованно решать вопросы тактики ведения пациентов. Отсюда вытекает, что наибольшее прикладное значение анти- lgM(igö)-HSA может 14

Таблица

Сравнение данных, полученных методами непрямого -И4А. и ловушечного анти-18М(]^) -И$А

1 Непрямой! Ловушечный ! ^(З-ЩИанти- 1БМС1ва>И4А

Диагноз обследуемого пациента I-!-

! З&й ! 1вМ ; з^в !антитела!антите-!антитела __!_!ла 1_

I. Сифилис вторичный рецидивный 2+ 2+ 3+

2. Сифилис вторичный рецидивный 3+ 4+ 2+/3+

3. Сифилис вторичный рецидивный 2+/3+ 4+ 2+/3+

4. Сифилис скрытый ранний 2+ 2+ 3+

5. Сифилис скрытый ранний 1+/2+ отр. 3+

б. Сифилис врожденный ранний 2+ 2+ 1+-/2+

7. Серорезистентность отр. отр. 1 +

8. Серорезистентность отр. 2+/3+ 1+

9. Превентивное лечение отр. 2+ 3+

10. Превентивное лечение ' отр. отр. отр.

II. Превентивное лечение отр. 3+ 2+/3+

12. Превентивное лечение отр. отр. отр.

13. ЛПР отр'. ' отр. 1+ ■

14.' ЛПР 1+/2+ отр. 1+

Отрицательная контрольная сыворотка отр. отр. отр.

Положительная контрольная сыворотка 4+ 4+ 4+

№ п/п опыта

иметь при оценке тех состояний сифилитической инфекции, которые сопровождаются присутствием igM антител. Это прежде всего относится к раннему сифилису, когда в сыворотках патентов имеется высокое содержание специфического IgM. При позднем же сифилисе, когда соотношение противотрепонемных антител сдвигается в /

пользу igG изотипа, повышается ценность сравнительного рпреде-ления содержания igu и IgG антител.

5. Оптимизация лечебной тактики ведения больных сифилисом с помощью ловушечного ИФА

По результатам определения IgM антител в ловушечном ИФА. мы смогли разделить больных ранним .скрытым сифилисом на две группы: lgM-позитивных (41 человек) и igu -негативных (IÖ человек) . Это имеет принципиальное значение для выбора лечебной тактики ведения данной категории пациентов. Выявление противо-трепонемного IgM, согласно устоявшемуся взгляду на иммунопатологию сифилиса, указывает на присутствие в организме вирулентного возбудителя и развивающегося сифилитического процесса. Вот почему в плане ведения больных с lgM-позитивныи ранним скрытым сифилисом оправдано назначение специфической антибиотикотера-пии. Цель такой терапии - перевести бледную трепонему в мало-или авирулентное состояние. При раннем скрытом igM-негативном сифилисе бледная трепонема пребывает в инактивироввнном состоянии. Наблюдается не патологический процесс, характеризующийся прогредиентностью течения, а трепонемоносительство с цист- и Ь-формами. Применение антибиотиков при igü-негативном латентном сифилисе неоправдано. Более того, перенасыщенное лечение антибиотиками, обладающими иммуносупрессивными свойствами, способно,' нарушив сложившееся равновесие между сано- и патогенезом, вызвать обострение специфического процесса. Вот почему в

плане ведения больных с ^¡¿-негативным ранним скрытым сифилисом было бы полезно предусмотреть назначение иммуномодуляторов, препаратов, стимулирующих неспецифические защитные механизмы. Указанные лекарственные средства содействовали бы дальнейшей элиминации возбудителя.

6. Ловушечный ИМ в оценке эффективности и достаточности специфической антибиотикотерапии

После получения больным сифилисом специфической антибиотикотерапии перед клиницистом встает ванный вопрос о ее достаточности и эффективности. Хорошим подспорьем в решении этой проблемы могут служить результаты ловушечного И ФА, свидетельствующие о присутствии и з^в антител. Нами было проведено обследование бб больных, получивших курс специфической антибиотикотерапии. Больше находились под клинико-серологическим контролем в течение 2-13 лет, поскольку у них сохранялись противо-трепонемные антитела, определяемые стандартными серологическими методами. Все эти реакции, однако, не позволяли надежно судить о достаточности терапии.

Результаты анти- ади^а) -ИВА позволяют предложить практические рекомендации по снятию больных с диспансерного учета. Так, патентам, у которых определяются специфические иммуноглобулины М изотипа, можно рекомендовать продолжить клинико-серо-логическое наблюдение с обязательным назначением дополнительного курса антибиотикотерапии. Лечение лиц, у которых 1вм антитела отсутствуют, может быть признано полноценным и-эффективным; соответственно можно рекомендовать снятие их с диспансерного учета.

7. Ловушечный ИМ в выработке критериев для назначения превентивного лечения

Пациентам, имевшим половой или тесный бытовой контакт с больными заразными формами сифилиса, обычно назначается превентивное лечение даже при отрицательных стандартных серологических реакциях (по эпидемиологическим показаниям). Однако'бледные трепонемы не обладают абсолютной контагиозностью: незаражение сифилисом отмечается в 6-49$ клинических наблюдений. Так как антибиотики оказывают ряд побочных эффектов, для их назначения желателен более жесткий критерий. Таким критерием может служить обнаружение igM антител. Известно, что появление противогрепо-немного igM является ранним признаком заражения сифилисом и показанием для специфической терапии.

Ловушечным методом нами было обследовано 58 человек, имевших половой контакт с больными ранним сифилисом. Лишь в 10 из ■ обследованных случаев были обнаружены специфические 1еМ антитела, этим лицам и следовало рекомендовать превентивное лечение.

8. Ловушечный ИМ в дифференциальной диагностике врожденного сифилиса и пассивной трепонемоспецифической иммуноглобулинемии

Ловушечный И$А может быть использован для ранней диагностики не только приобретенного, но и врожденного сифилиса. Патогенез врожденного сифилиса связан с проникновением в развивающийся плод бледных трепонем. Они могут туда проникнуть не ранее 4-5 месяца беременности,' когда начинает функционировать плацентарное кровообращение. В том случае, если специфическое лечение матери было своевременным и эффективным, заражение плода-не происходит. Принцип диагностики врожденного сифилиса базируется 18

на избирательной проницаемости плацентарного барьера: он пропускает только IgG и непреодолим для материнского IgM. В том случае, если специфический IgM обнаружен в крови плода или ребенка, можно говорить о его инфицированности, т.е. о врожденно! сифилисе. Если же находят лишь IgG антитела при отсутствии противотрелонемного IgM, речь идет о пассивной иммуноглобулин-емии, опосредованной материнским специфическим IgG, прошедшим через плаценту в кровь ребенка. Ясно, что при врожденном сифилисе необходимо специфическое лечение. При пассивной иммуногло-булинемии резидуальные материнские IgG антитела выводятся самопроизвольно из кровотока ребенка без назначения каких-либо препаратов.

С помощью ловушечного анти- igM(IgG) -ИФА мы смогли дифференцировать врожденный сифилис и пассивную иммуноглобулинемию. Двум из трех обследованных детей, рожденных матерями, больными сифилисом, можно было рекомендовать профилактическую противо-трепонемную антибиотикотерапию.

9. Ловушечный ИША кап реакция-арбитр ложноположительных результатов стандартных серологических реакций на сифилис

В условиях современного патоыорфоза сифилиса возрастает применение серологических реакций. Вместе с расширением масштабов серологического тестирования возрастает количество ложноположительных результатов. В качестве реакции-арбитра мы предлагаем использовать ловушечный анти- IgM (IgG) -И$А. Метод был ащ)обир0$ан на сыворотках 15 пациентов с ложноположительной реактивностью при беременности, хронических соматических и инфекционных вирусных заболеваниях. Ловушечный метод подтвердил .свои высокую специфичность: у всех обследованных пациентов противо-

грепонемные антитела выявлены не были и, следовательно, был верифицирован диагноз ложноположительной реактивности.

10. Корреляция динамики трепонемоспецифической иммуноглобулинемии с клинической стадийностью раннего сифилиса

)

Ловушечный анти- -ИФА. позволил оценить динамику

трепонемоспецифической иммуноглобулинемии и выявить связь этого процесса с формами раннего сифилиса (рис. 3). Иммунный ответ на поступление бледных трепонем начинался с преимущественной выработки специфических 1вм антител. Первичный серонегативный сифилис характеризовался' высоким уровнем 15м (0,937-0,109) и относительно низким - (0,464^0,157). Постепенно происходило снижение содержания противотрепонемного г^и и повышение содержания Изменение количества специфических антител изотипов I и О прогрессировало по мере генерализации инфекционного процесса. При массовой гематогенной диссеминации бледных трепонем (вторичный свежий сифилис) содержание 1ва антител (0,809-0,034) уже превышало содержание антител (0,678-0,016). Латентное состояние инфекции, когда отсутствуют какие-либо клинические проявления заболевания и снижается количество бледных трепонем (ранний скрытый-сифилис), было ассоциировано с уменьшением продукции и Iем, и антител. Таким образом, циклические колебания противоинфекционного иммунитета коррелировали с клинической стадийностью раннего сифилиса.

0п492 х ю3

1000

800 -

600 -

400 -

200

х)

гЬ

- т

V,

Т Ч/

//

/ ч

/

7 '/

/ //

/ /,

л '/

й-

ГП+,

/

Рис. 3. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобулинемии при ранних формах сифилиса.

Горизонтальная линия (ОП492 = 0,200) соответствует пограничному уровню экстинкции. I - здоровые доноры; ,

2-6 - ранние формы сифилиса: 2 - сифилис первичный серонегативный, 3 - сифилис первичный серопозитив-ный, 4 - сифилис вторичный свежий, 5 - сифилис ранний скрытый, б - сифилис вторичный рецидивный.

@ - специфические антитела класса 1еМ;

О - специфические антитела класса

выводы

1. Методом аффинной хроматографии получен очищенный препарат коммерческого трепонемного антигена, на основе которого синтезирован высокоспецифичный пероксидазный трепонемный конъю-гат.

I

2. На основе использования пероксидазного трепонемного коньюгата в сочетании с моноклональными антителами к иммуноглобулинам человека разработан иммуноферментный ловушечный метод анти- -ИИ. для определения 1вМ и антител при сифилисе. Метод апробирован на сыворотках 100 здоровых доноров и 349 пациентов с различными формами сифилиса и другими заболеваниями .

3. Ловушечный анти- ВД/ЦЛ^С}) -ИФА представляет собой универсальный метод для выявления ранних форм сифилиса.

4. Ловушечный анти- 12М(1вО) —И35А может использоваться для ранней диагностики врожденного и приобретенного сифилиса, оценки активности инфекционного процесса и эффективности специфического лечения. '

5. Ловушечный анти- 1еМ(1ва) -ИФА может служить реакцией-арбитром в случаях ложноположительных результатов стандартных серологических реакций на сифилис.

6. Применение на заключительном этапе ловушечного анти--1вМ-И$А коньюгата моноклональных антител к Рс -фрагменту человека позволяет учитывать роль ревматоидного фактора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Определение антитрепонемных 1вМ и 1в0 антител человека с помощью коньюгата трепонемного антигена с пероксидаэой хрена // Иммунология. - 1990. - № 5. - С. 54-56 (совместно с 22

Е.В.Сидоровой, Т.К.Борисовой, Ю.С.Хац).

2. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобулинемии при ранних формах, сифилиса // Вестн. дерматол. венерол. - 1990. -№ 8. - С. 38-42 (совместно с К.К.Борисенко, Н.С.Потекаевым, Т.К.Борисовой, Е.В.Сидоровой).

3. Корреляция трепонемоспецифической иммуноглобулинемии с клиническими формами раннего сифилиса // Тезисы докладов П Дагестанской конференции дерматологов и венерологов. - Махачкала, 1990. - С. 108 (совместно с К.К.Борисенко).

4. Усовершенствованный метод иммуноферментной диагностики сифилиса // Тезисы XXI научно-практической конференции Латвии "Новейшие данные о патогенезе и лечении хронических дерматозов и сексуально-трансмиссивных заболеваний". - Рига, 1990. -

С. 50 (совместно с К.КЛЗорисенко, Е.В.Сидоровой, Т.К.Борисовой)