Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Диагностика ранних форм сифилиса на основе определения специфических иммуноглобулинов класса М

На правах рукописи

ЭРМАТОВА ФОТИМА АБДУЖАЛИЛОВНА

ДИАГНОСТИКА РАННИХ ФОРМ СИФИЛИСА НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

КЛАССАМ

(клинико-лабораторное исследование)

14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 АПР

Москва-2014

005567525

005567525

Работа выполнена на кафедре дерматовенерологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент РОТАНОВ Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор профессор кафедры кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздрава России ЛОМОНОСОВ Константин Михайлович

доктор медицинских наук, профессор зав. кафедрой клинической биохимии и лабораторной диагностики

«Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Ведущее научное учреждение: ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Минздрава России (г. Санкт-Петербург).

Диссертационного совета Д 208.115.01 при ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России по адресу: 107076; г. Москва, ул. Короленко дом 3, строение 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦЦК» Минздрава России. о

ИВАНОВ Андрей Михайлович

Защита диссертации состоится

заседании

Автореферат разослан ^

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук

КАРАМОВА Арфеня Эдуардовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сифилис является антропонозной бактериальной инфекцией, вызываемой Treponema pallidum. Для микроорганизма характерен невысокий уровень метаболизма, что обусловливает длительный цикл его развития: период времени от одного деления микроорганизма до последующего занимает в среднем около 33-34 часов (P.P. Уилкокс, 1981). Указанное обстоятельство находит своё отражение в затяжном течении инкубационного периода (в среднем 3-4 недели), медленном и постепенном развитии клинических признаков заболевания.

В ответ на размножение Т. pallidum в организме больного происходит активация защитных реакций с преимущественным участием гуморального звена адаптивного иммунитета, проявлением чего на ранних этапах развития заболевания является выработка иммуноглобулинов класса М (Кашкин К.П., 2004; Хаитов P.M., 2009; Young Н„ 1992, 2000; Egglstone S.I., Turner A.J.L., 2000).

В значимых количествах трепонемоспецифические IgM в кропи больных сифилисом определяются не ранее 10-14 дней после инфицировании, а максимальное их содержание наблюдается на 6-9 неделях заболевания, что соответствует срокам окончания периода сифилиса первичного и сифилису вторичному свежему (Иванов A.M., 2007; Красносельских Т.В. и Соколовский Е.В., 2010; Luger А. 1998; Goh В.Т., 2001, 2005).

При сифилисе вторичным содержание специфических IgM в крови медленно понижается; при этом происходит переключение характера иммунного ответа с выработки антител класса М на продукцию трепонемоспецифических IgG и IgA. Специфические IgG к Т. pallidum в крови больных сифилисом появляются позднее IgM: на 3-4 неделе после заражения; их содержание быстро увеличивается и достигает существенно более высоких уровней по сравнению с IgM. Максимальные уровни IgG в крови больных определяют через 1-1,5 года, после чего они несколько понижаются, подвергаясь волнообразным колебаниям в зависимости от обострения или стихания клинического течения заболевания (Ляхов В.Ф., 1990; Ткачев В.К. и Вяткина Т.Г., 2005; Baker-Zander S.A. et al., 1986).

Для выявления больных сифилисом, а также установления клинической формы заболевания в настоящее время широко используют иммунохимические (серологические) исследования, основанные на определении в крови специфических Ig против характерных для Т. pallidum антигенных детерминант. Современные лабораторные методы позволяют выявлять трепонемоспецифические антитела классов М, G и А в виде суммарного пула или дифференцированно

IgG или IgM (Ломоносов K.C., 2002; Фриго Н.В., 2006, 2009; Фахретдинова Х.С. и др., 2010; Young Н„ 1992, 2000; STI: UK Guidelines, 2006, 2008).

Диагностике клинических форм сифилиса с использованием результатов выявления у больных пула специфических антител разными методами посвящено значительное количество научных исследований (Приказ МЗ РФ №87, 2001; Китаева Н.В. и др. 2008; Larsen S. etal., 1995,1998).

Дифференцированное определение антитрепонемных антител разных классов у больных сифилисом стало возможным благодаря развитию технологий получения на лабораторных животных высокоспецифичных моноклональных антител, сенсибилизированных к несвязанному Fc-фрагменту молекулы IgG или к ц-форме тяжелой аминокислотной цепи в структуре IgM (Ляхов В.Ф. и др., 1990; Сидорова Е.В. и др., 1995; Ткачев В.К. и Вяткина Т.Г., 2005).

Клиническое значение выявления специфических IgM при диагностике сифилис изучено недостаточно, что было обусловлено трудностями разработки высокочувствительных технологий для их определения. Разработка наборов реагентов российского производства для выявления трепонемоспецифических IgM в РИФабс или ИБ позволили осуществить выполнение настоящей работы.

Цель исследования

Совершенствование диагностики ранних клинических форм сифилиса на основании изучения информативности медицинских технологий определения специфических иммуноглобулинов класса М к антигенам Т. pallidum.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту применения современных иммунохимических методов исследования для ранней диагностики сифилиса в медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации.

2. Для диагностики клинических форм сифилиса изучить информативность использования результатов (по ГОСТ Р 53022.3-2008) иммуноферментно-го анализа, реакции непрямой иммунофлюоресценции и линейного имму-ноблоттинга с определением трепонемоспецифических антител класса М на примере наборов реагентов российского производства.

3. У больных сифилисом первичным изучить особенности содержания в крови антител классов М и G к антигенам Т. pallidum с использованием метода линейного иммуноблоттинга.

4. У пациентов, получивших специфическое лечение по поводу ранних форм сифилиса, изучить длительность циркуляции в крови трепонемоспецифи-

ческих иммуноглобулинов класса М.

5. Разработать алгоритм обследования пациентов для диагностики ранних клинических форм сифилиса с использованием современных иммунохимиче-ских методов исследования на основе определения IgM к антигенам Т. pallidum.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что при диагностике ранних клинических форм сифилиса в специализированных медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации недостаточно используются современные иммунохимические исследования, основанные на выявлении специфических антител класса М к антигенам Т. pallidum.

2. Определена клиническая информативность применения современных иммунохимических тестов для диагностики сифилиса (ИФА1еМ, PHOa6c-IgM и ИБ-IgM) в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53022.3-2008, включающими оценку показателей клинической чувствительности и специфичности, диагностической эффективности, предсказательной ценности положительных и отрицательных результатов, на примере отечественных наборов реагентов.

3. У больных сифилисом первичным установлены разные профили иммунологической реактивности к основным иммунодоминантным антигенам бледной трепонемы (TpN15, TpN17, ТшрА и TpN47), используемым при диагностике сифилиса методами ИБ-IgM и ИБ-IgG.

4. У больных, получивших адекватное антибактериальное лечение по поводу ранних клинических форм сифилиса, современными иммунохимическими методами в крови длительное время могут определяться трепонемоспецифиче-ские антитела класса М; полное исчезновение указанных антител у всех пациентов происходит к сроку наблюдения около 3 лет.

5. Разработан алгоритм обследования больных ранними формами сифилиса с применением современных методов лабораторного исследования путём определения в крови антител класса М к иммунодоминантным антигенам Т. pallidum.

Научная новизна исследований

Впервые в медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации оценена частота использования для диагностики ранних форм сифилиса современных иммунохимических методов исследований (ИФА, РИФ и ИБ) с определением специфических IgM, IgG дифференцированно или суммарно (IgG+IgM+IgA).

Впервые охарактеризована по ГОСТ Р 53022.3-2008 клиническая информативность применения современных иммунохимических методов исследования (ИФА, РИФ и ИБ) путём определения специфических IgM к антигенам Т. pallidum на примере наборов реагентов российских производителей.

Впервые установлено, что на начальных этапах развития сифилитической инфекции у больных преобладает гуморальный ответ только на один из антигенов Т. pallidum (TpN15, TpN17, ТшрА и TpN47), применяемых для лабораторных исследований, и определена частота развития разных профилей иммунологической реактивности.

Впервые разработан алгоритм обследования пациентов для диагностики ранних клинических форм сифилиса с использованием иммунохимических методов определения трепонемоспецифических IgM, основанный на клинической информативности этих методов и особенностях гуморального иммунитета на начальных этапах развития инфекции, который предложен к внедрению в медицинские организации дерматовенерологического профиля России.

Практическая значимость работы

Применение разработанного алгоритма обследования пациентов современными иммунохимическими методами для определения трепонемоспецифических антител класса М направлено на своевременную диагностику ранних клинических форм сифилиса при оказании специализированной медицинской помощи по профилю дерматовенерология.

Установленные показатели клинической информативности разных иммунохимических исследований с выявлением специфических IgM к Т. pallidum (ИФА, РИФабс и ИБ) позволили осуществить сопоставление и обоснованный выбор наиболее чувствительного метода исследования для диагностики первичного и вторичного сифилиса.

Вариативность развития гуморального иммунного ответа на разные антигены бледной трепонемы (TpN15, TpN17, TmpA и TpN47) у больных первичным сифилисом необходимо учитывать при оценке результатов иммунохимических исследований при диагностике сифилиса.

Внедрение результатов исследования:

Результаты проведенных исследований по применению современных иммунохимических тестов определения специфических IgM для своевременной диагностики ранних клинических форм сифилиса, включены в учебные программы преподавания:

- на циклах общего и тематического усовершенствования в системе последипломной подготовки врачей дерматовенерологов и врачей клинической лабораторной диагностики в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России;

- в курсе дерматовенерологии на кафедре дерматовенерологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России.

Разработанный алгоритм обследования с использованием современных методов определения трепонемоспецифических антител класса М применяют в консультативно-диагностическом центре ФГБУ «ГНЦЦК» Минздрава России при диагностике раннего сифилиса

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Научно-практической конференции, организованной Минздравом Республики Башкортостан (г. Уфа, 2012), V Всероссийском конгрессе дерматовенерологов и косметологов (г. Казань, 2013), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (г. Москва, 2013), Научно-практической конференции врачей клинической лабораторной диагностики и дерматовенерологов Ярославской области (г. Ярославль, 2013).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения и 7 глав, включающих обзор литературы, характеристику материалов и методов, результаты собственных исследований, а также заключения, выводов, списка литературы и приложения.

Работа изложена на 168 листах компьютерного текста, включает библиографический список из 160 источников (106 отечественных и 54 зарубежных), 25 рисунков, 23 таблицы и 10 приложений.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автором самостоятельно подготовлен обзор отечественных и зарубежных источников научной литературы и разработан дизайн исследования; создана анкета, проведен опрос и изучение данных, предоставленных из медицинских организаций дерматовенерологического профиля субъектов России; сформированы опытная и контрольная группы исследования, образцы крови пациентов этих групп изучены в ИФА, РИФ и ИБ для диагностики сифилиса; проведены интерпретация, систематика и анализ полученных данных, расчёты и сравнительная оценка клинической информативности изучавшихся лабораторных методов. Разработан алгоритм обследования для диагностики ранних клинических форм сифилиса с использованием медицинских технологий, основанных на выявле-

нии трепонемоспецифических антител класса М. Диссертантом сформулированы выводы и практические рекомендации, установлены новизна и практическая значимость результатов проведенных научных исследований.

Публикации

По материалам научных исследований, представленным в диссертации, опубликованы 9 печатных работ: из них 5 (в том числе 3 научные статьи) в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки Российской Федерации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования

На разных этапах выполнения работы в качестве материалов и объектов изучения были использованы:

- 60 заполненных анкет, полученных в 2013 году при опросе серологических лабораторий и клинических отделений специализированных медицинских дерматовенерологических организаций 83 субъектов Российской Федерации;

- данные официальной государственной статистической отчётности Минздрава России о заболеваемости населения ранним сифилисом в 2012 году;

- 492 больных сифилисом с впервые в жизни установленным диагнозом до проведения антибактериальной терапии (основная опытная группа); в том числе: сифилис первичный - 79, вторичный - 205, скрытый ранний - 114, скрытый неуточнённый как ранний или поздний - 62, скрытый поздний - 32;

- 341 больных ранними клиническими формами сифилиса после проведения им антибактериального лечения в сроки наблюдения от 3 месяцев до 3 лет (дополнительная опытная группа); в том числе: сифилис первичный - 30, вторичный - 148 и скрытый ранний - 163;

- 153 пациента без указаний на наличие активного или перенесенного ранее сифилиса (контрольная группа); в том числе: от 123 активных доноров крови и от 30 лиц с БЛПР в лабораторных тестах на сифилис.

Методы исследования:

- социологический (анкетный) опрос специалистов медицинских организаций дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации;

- иммунохимические (серологические) исследования для диагностики сифилиса: ИФАабМ+1ЕМ8А) («РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела», кат. № О-1854-б, РУ №ФСР 2007/00614 от 17.08.2007; ЗАО «Вектор-Бест», Россия); ИФА1еМ («ИФА-АНТИ-ЛЮИС-М», кат. № Ь-154-5, РУ № РЗН 2013/126

от 26.02.2013; ООО «НПО «Диагностические системы», Россия); РИФа6с («Лю-миБест антипаллидум», кат. № D-1812, РУ № ФСР 2007/13695 от 30.07.2012; ЗАО «Вектор-Бест», Россия); РИФабс-IgM («Антипаллидум-Флюороген-IgM» кат. № 03.04.02, РУ № РЗН 2013/247 от 28.02.2013; ЗАО «ЭКОлаб», Россия); ИБ-IgG/IgM («Лайн-Блот Сифилис» кат. № 03.22.2-3 № РЗН 2014/1657 от 05.06.2014; ЗАО «ЭКОлаб», Россия); ИБ-IgM («recomBlot Treponema IgM», РУ № ФС 2006/2221 от 26.12.2006; «Mikrogen® GmbH», Германия);

- оценка клинической информативности клинических лабораторных методов исследований в соответствии с требованиями по ГОСТ Р 53022.3-2008;

- статистическая обработка результатов исследований проведена в соответствии с требованиями по ГОСТ Р 50779.10-2000.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Применение методов определения трепонемоспецнфических IgM при диагностике сифилиса в Российской Федерации

При проведении анкетного опроса 83 специализированных дерматовенерологических медицинских организаций субъектов России о применении при диагностике раннего сифилиса лабораторного обследования и количестве выполненных в 2012 году исследований разными методами заполненные анкеты были получены от 60 (72,3%) медицинских организаций всех 8 Федеральных округов России. В 7 из 8 ФО в опросе приняли участие от 54,5 до 85,7% медицинских организаций, а в 1-м (ЮФО) - только 33,3%, что позволило нам оценить представленные данные как репрезентативные, в полной мере характеризующие состояние проблемы как большинству ФО, так и по России в целом.

Установлено, что для диагностики сифилиса в обследованных организациях применяется обследование современными лабораторными методами: ИФА -в 100%, а РИФ - в 75,00%, в то время как ИБ - только в 28,33%. Количество исследований, выполненных каждым методом, отличается. Исследования в ИФА составили значительную часть - 23,08% от общего количества иммунохимиче-ских тестов, а в РИФ и в ИБ - только по 1,36 и 0,03% соответственно (табл. 1).

Таблица 1.

Структура иммунохимических исследований для диагностики сифилиса, выполненных в 2012 году в лабораториях дерматовенерологических организаций субъектов Российской Федерации, принявших участие в исследовании

Показатель Методы иммунохимических исследований

РМП РПР РСКТ РСКк ИФА РПГА РИФ ИБ ихл РИТ ВСЕГО

Кол-во исследований (в %) 43,57 3,53 10,84 10,70 23,08 6,75 1,36 0,03 0,09 0,07 100

Среди всего объёма иммунохимических исследований для диагностики сифилиса ^М-тесты составили всего 1,30%, в их структуре преобладали исследования в ИФА^ - 97,27%, лишь небольшую часть составили исследования в РИФ-^М и ИБ-^М - по 2,0 и 0,73% соответственно, что являлось отражением отсутствия производственного выпуска доступных наборов реагентов российского производства для РИФабс-1еМ и ИБ-^М, в то время как наборы реагентов для ИФА1ем были представлены в широком ассортименте, а сам метод используется в лабораториях в течение длительного времени.

Интересные данные получены при оценке доли применения модификаций методов с определением антител класса М при диагностике сифилиса (рис. 1).

ИФА РИФ ИБ

7,65

5,47

1,82

33,22

86,88

98,08

66,78

| IgG+IgM+IgA

IgG

а

IgM

Рис.1. Соотношение количества определений антитрепонемных антител разных классов, выполненных разными методами в лабораториях дерматовенерологических организаций в 2012 году.

Исследования в ИФА1аМ составили 5,47% от всех исследований методом ИФА, в PH®a6c-IgM - 1,82% от всех исследований в РИФ, в то время как в ИБ-IgM - 33,22% от всех исследований методом ИБ. Выявленные положения подтвердили актуальность нашего исследования, так как продемонстрировали реальную потребность практического здравоохранения в применении методов детекции антитрепонемных IgM для диагностики сифилиса.

Для количественной характеристики указанной потребности нами был осуществлён расчёт количества выполненных в лабораториях исследований каждым методом в пересчете на один вновь выявленный в 2012 году клинический случай раннего сифилиса. Установлено, что при обследовании населения и постановке клинического диагноза раннего сифилиса по России в целом проводили 6,86 исследований с определением IgM к антигенам Т. pallidum, в том числе: в ИФА^м - 6,68 в PH®a6c-IgM - 0,14, а в ИБ-IgM - 0,05 исследований.

Анализ частоты применения указанных диагностических лабораторных методик показал, что в 2012 году они наиболее интенсивно применялись в регио-

нах с наиболее высокими уровнями заболеваемости населения сифилисом: в ЦФО, ПрФО, СЗФО, ДВФО и СФО (по 7,91; 7,90; 6,86; 6,67 и 6,54 исследований соответственно), в которых было установлено по 3 796, 6 392, 1 130, 3 043 и 6 7058 случаев раннего сифилиса соответственно. В то время как в ФО с более низкими показателями заболеваемости ранним сифилисом: УФО, СКФО и ЮФО (по 1 574, 922 и 829 случаев) исследований с определением трепоне-моспецифических IgM было проведено по 4,21; 5,28 и 4,19 ед. в расчете на 1 вновь диагностированный случай раннего сифилиса.

2. Оценка информативности ИФАдо при диагностике сифилиса

При аттестации 492 образцов опытной группы (больные сифилисом до лечения) в HOA(igG+igM+igA) было получено 98,98% положительных результатов (при сифилисе первичном - 97,47%, при вторичном и скрытом раннем - по 100%, при скрытом неуточнённом как ранний или поздний - 96,77% и при скрытом позднем - 96,88%); отрицательные результаты наблюдали с 1,02% образцов.

Исследование этих сывороток крови опытной группы в ИФЛ,8М выявило присутствие специфических IgM к Т. pallidum (положительные результаты) только в 76,83% образцов: при сифилисе первичном - в 97,47%, при вторичном - в 93,66%, скрытом раннем - в 62,28%, скрытом неуточнённом как ранний или поздний - в 53,23% и скрытом позднем - в 15,63% случаев. С 23,17% образцов крови опытной группы в ИФА1еМ были получены отрицательные результаты исследования, свидетельствовавшие об отсутствии в них значимых количеств тре-понемоспецифических IgM (табл. 2).

Таблица 2.

Результаты определения в ИФА антител к Т. pallidum у больных сифилисом

Клиническая форма сифилиса Результаты исследования

Количество положительных результатов в тестах (абс / %) Оцепка содержания антител но КП (М±т)

nOAigc+igM+igA ИФАгеМ ИФАде+до+ДО ИФА|ем

Первичный п=79 77/97,47% 77/97,47% 8,44±0,38 12,54±0,58

Вторичный п=205 205 / 100% 192/93,66% 14,10±0,25 9,78±0,39

Скрытый ранний п=114 114/100% 71 /62,28% 12,19±0,37 5,95±0,53

Скрытый неуточнён-ный как ранний или поздний п=62 60 / 96,77% 33/53,23% 11,23±0,50 4,51 ±0,74

Скрытый поздний п=32 31 /96,88% 5/15,63% 8,60±0,74 2,57±0,68

Всего больных сифилисом п=492 487 / 98,98% 378 / 76,83% 12,15 ±0,20 9,05±0,30

Оценка содержания в образцах специфических IgM (по величине коэффициента позитивности аналитического сигнала в ИФА) соответствовала современным представлениям о динамике образования антител при бактериальных инфекциях: гуморальный иммунитет больного после инфицирования Т. pallidum рано и активно дебютирует выработкой специфических IgM с постепенным переключением на более выраженный синтез антител класса G, а также А и одновременным снижением образования антител класса М (рис. 2).

□ кп в ИФА-lgM □ КП в ИФАсумм

Рис. 2. Полуколичественная оценка содержания IgM и суммарно Ig(M+G+A) к Т. pallidum в образцах опытной группы методом ИФА по коэффициенту позитивности.

Было установлено, что только при сифилисе первичном средний уровень КП в ИФА^м (12,54±0,58) был достоверно выше, чем в H®A(IgG+igM+igA) (8,44±0,38) (р < 0,01); при постановке исследований для диагностики каждой последующей клинической формы сифилиса значения КП в ИФА1вМ были достоверно ниже, чем в H№A(IgG-ugM+igA) (р < 0,01).

Аттестация в ИФА(1гИгМ+1гА) 123 сывороток крови от лиц без указаний на наличие сифилиса и 30 образцов с БЛПР (контрольная группа) показало отрицательные результаты определения антител во всех случаях.

Исследование в ИФА1вМ 153 сывороток крови контрольной группы показало отрицательные результаты в 97,39% случаях и ложноположительные результаты в 2,61% случаях (с 1,63% сывороток крови в подгруппе здоровых доноров и с 6,67% - в подгруппе лиц с БЛПР).

Полученные данные позволили определить клиническую информативность исследований в ИФА1бМ и ИФА^о+^+^а) при диагностике сифилиса (по ГОСТ Р 55022.3-2008) и сопоставить их друг с другом. Анализ рассчитанных показа-

телей установил, что клиническая чувствительность и диагностическая эффективность исследований в ИФАГ£М при диагностике сифилиса первичного достаточно высокие (97,47 и 97,41%) и соответствуют таковым при ИФА^о+^м.^д) (97,47 и 97,41% соответственно). В то же время эти показатели в ИФА1еМ при сифилисе вторичном (93,66 и 95,25%) были ниже, чем в ИФА^см^+^а) (100 и 98,88%), а при скрытых формах сифилиса установленный разрыв в величине показателей становился более выраженным: при скрытом раннем - 62,28 и 82,40% против 100 и 98,50%, при скрытом неуточнённом как ранний или поздний - 53,23и 84,65% против 96,77 и 97,21% и при сифилисе скрытом позднем -15,63 и 83,24% против 96,88 и 97,84%.

Клиническая специфичность исследований в ИФА1кМ при диагностике сифилиса (97,39%) несколько уступала показателю в ИФА(1Есл-1£М+18а) (100%).

3. Определение информативности исследований в РИФ,6с-^М

Аттестация образцов крови больных опытной группы в РИФа6с(^С) выявила положительные результаты в 98,17% случаях (при сифилисе первичном -в 94,94%, вторичном и скрытом раннем - по 100%, скрытом неуточнённом как ранний или поздний - 95,16%, скрытом позднем - в 93,75%) и отрицательные результаты в 1,83% случаях (при сифилисе первичном - в 5,06%, скрытом неуточнённом как ранний или поздний - в 4,84%, скрытом позднем - в 6,25%).

Аттестация в РИФ>бс(^С) образцов крови пациентов из группы контроля позволило получить 89,54% отрицательных и 10,46% слабоположительных результатов, из числа которых: 7,19% - с кровью здоровых доноров и 3,27% - с сыворотками крови, демонстрировавшими БЛПР.

Исследование в РИФа6<.-^М образцов крови больные сифилисом (опытная группа) позволило получить 75,41% положительных (95,89% - в подгруппе с сифилисом первичным, 89,50% - вторичным, 53,93% - скрытым ранним, 42,11% - скрытым неуточнённом как ранний или поздний и 26,09% - скрытым поздним) и 24,59% отрицательных результатов (при сифилисе первичном - 4,29%, при вторичном - 10,50%, при скрытом раннем - 46,07%, при неуточнённом как ранний или поздний - 57,89% и при скрытом позднем - с 73,91%).

Изучение в РИФа5с-^М сывороток крови, полученных от лиц без сифилиса (группа контроля) было выявлено 86,30% отрицательных и 13,70% ложнополо-жительных результатов (5,77% - в подгруппе здоровых доноров крови и 33,33% -с образцами, представленными от лиц с БЛПР).

Полученные в этом разделе исследования результаты позволили нам рассчитать и в сравнительном аспекте охарактеризовать клиническую информа-

тивность исследований в РИФабс(^С) и РИФабс-1вМ при диагностике сифилиса

Только при сифилисе первичном клиническая чувствительность РИФа6с-

(95,89%) превышала соответствующий показатель в РИФабс(^0) (94,94%). При сифилисе вторичном, скрытом раннем, скрытом неуточнённом как ранний или поздний и скрытом позднем клиническая чувствительность исследований в РИФабс(1ёО) была достоверно выше соответствующих показателей в РИФа6с-^М (100; 100; 95,16 и 93,75% против 89,50; 53,93; 42,11 и 26,09%).

Клиническая специфичность исследований в РИФа6с при диагностике сифилиса составила: при РИФа6с(^С) - 89,54% и при РИФабс-^М - 86,30%.

При ранних манифестных формах сифилиса диагностическая эффективность применения методики РИФа6с-18М была достаточно высокой: при сифилисе первичном и вторичном - 91,10 и 88,64%; однако при скрытых формах инфекции она была недостаточной - 68,52-71,88%. Более высокая частота получения неспецифических положительных результатов в РИФа6с-1§М по сравнению с РИФабс (^О) обусловила также отставание показателя диагностической эффективности РИФабс-18М при всех формах сифилиса (77,02%) в сравнении с РИФа6с (^в) (96,74%); так же соотносились между собою показатели диагностической эффективности при отдельных клинических формах инфекции: при сифилисе первичном, вторичном, скрытом раннем, скрытом неуточнённом как ранний или поздний и скрытом позднем диагностическая эффективность исследований в РИФа6с(1ёО) была достоверно выше, чем в РИФа6с-1§М: 92,24; 95,53; 94,01; 90,74 и 90,80% против 91,10; 88,64; 68,52; 71,17 и 71,88%.

Предсказательная ценность получения положительного результата (ПЦ4) при определении 1§М в РИФабс при диагностике сифилиса (96,96%) была выше, чем при определении (96,79%), эта же тенденция была характерна для исследований при сифилисе первичном и вторичном: в РИФа6с-1§М - 87,50 и 94,71% и в РИФа6с(1£0) 82,42 и 92,76%.

Предсказательная ценность отрицательного результата исследования (ПЦ") в РИФабс (^в) при всех клинических формах сифилиса была выше, нежели в РИФа6с-18М: при сифилисе первичном (97,16 и 95,45%), вторичном (100 и 75,00%), скрытом раннем (100 и 60,58%), скрытом неуточнённом как ранний или поздний (97,85 и 74,12%) и скрытом позднем (98,56 и 78,75%).

Полученные данные позволили обосновать показания к применению каждой модификации изучавшегося нами метода исследования.

4. Определение информативности исследований в ИБ-1оМ

Исследования в ИБ-^М и ИБ-^С были проведены с 76 из 79 образцов

крови больных сифилисом первичным (из состава опытной группы) и 24 образцами сыворотки крови доноров (из состава контрольной группы).

В ИБ-IgM в опытной группе было получено 85,53% положительных, 10,84% неопределенных и 2,63% отрицательных результатов; в контрольной группе - 100% отрицательных результатов.

В результате исследования в ИБ-IgG образцов опытной группы получено 92,11% положительных, 6,58% - неопределенных и 1,31% отрицательный результат, а в контрольной группе - 100% отрицательных результатов.

Полученные результаты характеризовали клиническую чувствительность исследований в ИБ-IgM при сифилисе первичном на уровне 85,53%, в ИБ-IgG -92,11%, клиническую специфичность обоих методов - по 100%, а показатели диагностической эффективности составили 89,00 и 94,00% соответственно.

Полученные нами данные также позволили определить информативность определения иммунных антител к каждому из 4 рекомбинантных антигенов Т. pallidum, наносимых производителями наборов реагентов на стрипы для проведения иммуноблоттинга. При первичном сифилисе наибольшую клиническую чувствительность, клиническую специфичность и диагностическую эффективность имели результаты исследования в ИБ-IgM и ИБ-IgG с антигенами: ТшрА (90,79; 100; 93,00% и 96,05; 100; 97,00% соответственно), TpN47 (75,00; 100; 81,00% и 93,42; 100; 95,00% соответственно) и TpN17 (71,05; 100; 78,00% и 78,95; 100; 84,00% соответственно), а минимальную - с TpN15 (35,53; 100; 51,00% и 57,90; 100; 68,00% соответственно).

5. Изучение особенностей образования антител к разным антигенам Т. pallidum при первичном сифилисе

При изучении в иммуноблоттинге 76 образцов сыворотки крови больных сифилисом первичным нами были установлено различные варианты спектра антител к антигенам Т. pallidum, входящим в состав иммуносорбента (TpN15, TpN17, TpN37, TpN47 и ТшрА). Это позволило придти к заключению, что на начальных этапах развития гуморального иммунитета при сифилисе наблюдается более выраженное содержание IgM только к одному из антигенов при существенно более низких уровнях антител против других.

Нами установлено, что у больных сифилисом первичным приоритет анти-телообразования в отношении антигена ТтрА наблюдался наиболее часто - в 65,79% случаев, в то время как в отношении 3 других антигенов более выраженный антителогенез определяли значительно реже: к TpN17 - в 22,37%, к TpN47 - в 9,21% и к TpN15 - в 2,63% случаев. Нами не установлено выраженно-

го иммунного ответа на антиген Тр№7 у больных сифилисом первичным. Выявленную закономерность мы определили как варианты или профили иммунологической реактивности.

Сопоставление данных исследования в ИБ-1§М и ИБ-^в позволило нам подтвердить справедливость установленного наблюдения, так как полуколичественная оценка содержания антител в отношении каждого из антигенов в условных единицах «плюсах» имела симметричную конфигурацию (рис. 3).

условные ед. тр1М15

6. Изучение длительности циркуляции трепонемоспецифических IgM у больных после антибактериальной терапии ранних форм сифилиса

В ИФА1§М был изучен 341 образец сыворотки крови, полученный от больных ранними клиническими формами сифилиса в сроки от 3 месяцев до 3 лет после окончания адекватного антибактериального лечения по схемам, рекомендуемым методическими и клиническими рекомендациями, утвержденными Минздравом России (1999) или разработанными Экспертным советом Российского общества дерматовенерологов и косметологов (2010, 2012).

Установлено, что содержание антител в крови этих пациентов постепенно понижается уже при сроках наблюдения 3 и 6 месяцев. Количество положительных результаты исследования в ИФА^м постепенно снижалось в период наблюдения от 9 месяцев до 2,5 лет; с образцами крови, полученными через 3 года поле лечения, результаты исследовании были отрицательными в 100% случаев (рис. 4).

Не установлено достоверных различий в сроках прекращения продукции IgM к антигенами Т. pallidum у больных после лечения ранних клинических

«плюсы»

TpN47

TpNl7 Рис. 3. Определение в крови

больных сифилисом первичным IgM и IgG к антигенам Т. pallidum методом ИБ

TmoA

форм сифилиса в зависимости от применявшегося метода антибактериальной терапии (лечение бензатина бензилпенициллином или цефтриаксоном).

Q Положительные результаты □ Отрицательные результаты

Рис 4. Соотношение положительных и отрицательных результатов в ИФА-IgM при исследовании образцов крови больных ранними клиническими фромами сифилиса после лечения.

Длительная циркуляция в крови антител класса М к антигенам Т. pallidum не позволила рекомендовать это исследование в качестве раннего индикатора эффективности лечения при клинико-серологическом наблюдении над больными ранним сифилисом, получившими адекватную антибактериальную терапию.

7. Разработка Алгоритма обследования пациентов при диагностике раннего сифилиса с использованием современных иммунохимических методов определения IgM к антигенам Т. pallidum

Результаты проведенного исследования позволили нам определить, что современные методики иммунохимических исследований доступны и с различной степенью интенсивности применяются в специализированных дерматовенерологических организациях субъектов России при диагностике раннего сифилиса.

Исследования образцов крови опытной и контрольной групп позволили рассчитать клиническую информативность иммунохимических методов определения трепонемоспецифических IgM (ИФА1вМ, PMOa6c-IgM. ИБ-IgM) на примере новых наборов реагентов российского производства, в настоящее время разрешенных к применению в медицинских организациях России (табл. 3).

Полученные данные позволили разработать Алгоритм обследования пациентов с целью диагностики раннего сифилиса с применением лабораторных методик определения трепонемоспецифических IgM, учитывающий особенности и клиническую информативность каждого из этих методов, а также специфику

иммунологической реактивности у больных сифилисом первичным по отношению разным к антигенам Т. pallidum, используемым в лабораторных исследованиях (рис. 5).

Таблица 3.

Показатели клинической информативности современных иммунохимических исследований для диагностики сифилиса

Показатель и клиническая форма сифилиса Методика исследования

ПФЛ|емИгО-ГеА ИФА|гМ PIl®„6c(IgG) РИФябс-1ёМ ИБ-IgG ИБ-IgM

КЧ (все формы) 98,95 76,83 98,17 75,41 - -

первичный 97,47 97,47 94,94 95,89 92,11 85,53

вторичный 100 93,66 100 89,50 - -

скрытый ранний 100 62,28 100 53,93 - --

скрытый неуточнённый 96,77 53,23 95,16 42,11 -- -

скрытый поздний 96,88 15,63 93,75 26,09 -- -

КС (все формы) 100 97,39 89,54 86,30 100 100

ДЭ (все формы) 99,22 81,71 96,74 77,02 - -

первичный 97,41 97,41 92,24 91,10 94,00 89,00

вторичный 98,88 95,25 95,53 88,64 - --

скрытый ранний 98,50 82,40 94,01 68,52 - -

скрытый неуточнённый 97,21 84,65 90,74 71,17 - --

скрытый поздний 97,84 83,24 90,80 71,88 - -

ПЦ+(все формы) 100 95,06 96,79 96,96 - -

первичный 100 97,41 82,42 87,50 100 100

вторичный 100 97,96 92,76 94,71 - -

скрытый ранний 100 94,67 87,69 82,76 - -

скрытый неуточнённый 100 89,19 78,67 61,54 -- --

скрытый поздний 100 55,56 65,22 37,50 - -

ПЦ" (все формы) 96,82 56,65 93,84 37,72 -- -

первичный 97,41 98,68 97,16 95,45 80,00 68,57

вторичный 98,88 91,98 100 75,00 -- --

скрытый ранний 98,50 77,60 100 60,58 - -

скрытый неуточнённый 97,21 83,70 97,85 74,12 -- -

скрытый поздний 97,84 84,66 98,56 78,75 - --

* тёмным цветом выделены показатели выше 95%, что соответствует современным требованиям к информативности иммунохимических тестов для диагностики сифилиса (Приказ Минздрава России №78 от 21.03.2001 г.).

Алгоритм обследования пациентов при диагностике раннего сифилиса с применением лабораторных методик, основанных на определении трепонемоспецифических ^М

■рг

с жалобами на наличие на коже или видимых слизистых оболочках клинических проявлений, характерных для раннего г.иАипися

мя

без клинических проявлений сифилиса, но указывающие на незащищенный контакт с больным сифилисом (в пределах 2-х месяцев до обращения)

обследование крови в ИФА1еМ и/или РИФабс-[§М

Ж-

не имеющие на момент обследования клинических проявлений сифилиса, но указывающие на их наличие в анамнезе (в пределах 2-х

последних лет)

положительные результаты исследования

дискордантные или отрицательные результаты исследования в ИФА[ем и РИФа1к-1йМ

постановка клинического диагноза

обследование в 1{Б-1;М

20

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при диагностике раннего сифилиса в специализированных медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации недостаточно применяются современные модификации иммунохимических методов, основанные на определении трепонемоспеци-фических антител класса М: в 2012 году доля IgM-методов составила 1,30% от общего количества исследований для диагностики сифилиса, а в их структуре преобладали ИФАТ,,М - 97,27%, в то время как исследования в РИФа6с_^М и в ИБ-IgM составили всего 2,0 и 0,73% соответственно, что, на наш взгляд, было обусловлено отсутствием производственного выпуска разрешенных к применению российских наборов реагентов, а также клинически обоснованных рекомендаций для их практического использования.

2. В сравнительном аспекте изучена клиническая информативность при диагностике раннего сифилиса трёх современных IgM-технологий (ИФА^м, РИФабс-IgM и ИБ-IgM). При сифилисе первичном установлена наиболее высокая клиническая чувствительность ИФА1вМ (97,47%) и PH®a6c-IgM (95,89%), при сифилисе вторичном - только ИФА1еМ (93,66%), что позволило рекомендовать эти методы как приоритетные при диагностике соответствующих форм заболевания. При сифилисе первичном определена клиническая информативность ИБ-IgM: клиническая чувствительность - 85,53%, клиническая специфичность -100%, диагностическая эффективность - 89,00%, предсказательная ценность положительных и отрицательных результатов - 100 и - 68,57%, что позволило рекомендовать этот метод для использования в клинической практике в качестве подтверждающего теста. Применение IgM-методов при диагностике сифилиса скрытого раннего представляется нецелесообразным в виду низкой клинической чувствительности (ИФА,ёМ - 62,28 и РИФ^с-IgM -53,93%).

3. При сифилисе первичным установлены различные профили гуморального иммунитета, отличающиеся преобладанием в крови содержания антител к одному из иммунодоминантных антигенов Т. pallidum: превалирование антител к ТшрА выявлено в 65,79%, в то время как более высокое содержание антител к другим антигенам определялось с меньшей частотой (к TpN17 - в 22,37%, к TpN47 - в 9,21% и к TpN15 - в 2,63% случаев), что необходимо учитывать при диагностике раннего сифилиса.

4. У больных ранними формами сифилиса, получивших адекватное специфическое лечение, в крови методом ИФА^м длительное время могут определяться трепонемоспецифические антитела класса М, полная их элиминация

происходит к сроку наблюдения около 3 лет.

5. Разработан алгоритм обследования пациентов с целью диагностики раннего сифилиса, основанный на использовании результатов лабораторных методов определения в крови трепонемоспецифические антитела класса М (ИФА,еМ, РИФабс-IgM или ИБ-IgM).

Практические рекомендации

1. Иммунохимические исследования, основанные на определении специфических антител класса М к антигенам Т. pallidum (ИФА^м, PH®a6c-IgM и ИБ-IgM), являются трепонемными диагностическими тестами, они предназначены для применения в клинических диагностических лабораториях специализированных медицинских организаций дерматовенерологического профиля.

2. Для выявления ранних клинических форм сифилиса при обследовании пациентов показано применение IgM-технологий (ИФЛ1еМ, PH®a6c-IgM и ИБ-IgM): в первую очередь - при сифилисе первичном, а также сифилисе вторичном; использование этих методик нецелесообразно при диагностике сифилиса скрытого раннего в виду низкой клинической чувствительности.

3. Для диагностики сифилиса раннего в клинических лабораториях медицинских организаций рекомендуется использовать только наборы реагентов для IgM-методик (ИФАщц, РИФа6с-^М и ИБ-IgM), разрешённые к применению в Российской Федерации.

4. Диагностику раннего сифилиса рекомендуется проводить в соответствии с разработанным для этого алгоритмом обследования пациентов, основанном на дополнительном применении современных IgM-методов (ИФА1еМ, РИФабс-IgM и ИБ-IgM) с учётом величины показателей их клинической информативности (по ГОСТ Р 53022.3-2008), а также особенностей развития гуморального ответа к иммунодоминантным антигенам Т. pallidum (TpN15, TpN17, TmpA и TpN47) у больных начальными формами сифилиса

Список научных работ соискателя, опубликованных по теме диссертации

1. Ротанов С.В. Показатели клинической информативности ИФА^м при обследовании больных сифилисом. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // XII Всероссийский Съезд дерматовенерологов и косметологов: Тезисы научных работ, г. Москва: РОДВК, 26-29 июня 2012: 54.

2. Ротанов С.В. Информативность ИФА^м при обследовании больных с сифилитической инфекцией. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // Клиническая лабораторная диагностика 2012: 9: 86.

3. Ротанов С.В. Выявление антител класса М к антигенам Т. pallidum до лечения у больных сифилисом. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // Актуальные вопр. дерматовенерол. и косметол.: Тез. науч. работ. Юбилейная науч.-пр. конф. дерматовенерол. и косметол., посвящ. 75-летию дерматовенерол. Службы Челябинской обл. Челябинск, 2012: 99-100.

4. Ротанов С.В. Методы выявления антител класса М к антигенам Т. pallidum для ранней диагностики сифилиса. / С.В. Ротанов, Р.Н. Чупров-Неточин, Ф.А. Эрматова // Вестник дерматологии и венерологии 2013: 1: 14-20.

5. Эрматова Ф.А. Информативность непрямой реакции иммунофлюо-ресценции для выявления антител класса М к антигенам Т. pallidum у больных сифилисом. / Ф.А. Эрматова // Вестник РГМУ 2013: Спец. выпуск 1: 52-53. Материалы VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, 2013.

6. Ротанов С.В. Информативность трепонемоспецифических антител класса М при диагностике сифилиса. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // Вестник дерматологии и венерологии 2013: 3: 48-55.

7. Ротанов С.В. Выявление антител классов М и G к антигенам Т. pallidum у больных первичным сифилисом. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // Вестник дерматологии и венерологии 2013: 4: 63-72.

8. Ротанов С.В. О применении тестов для определения антител класса М к Т. pallidum при диагностике сифилиса в Российской Федерации. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // V всероссийский конгресс дерматовенерологов и косметологов: Тезисы научных работ. Казань, 17-20 сентября 2013: 49.

9. Ротанов С.В. Эффективность определения трепонемоспецифических IgM у больных ранними формами сифилиса методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих наборов реагентов. / С.В. Ротанов, Ф.А. Эрматова // V всероссийский конгресс дерматовенерологов и косметологов: Тезисы научных работ. Казань, 17-20 сентября 2013: 49-50.

БЛПР -

дэ

ИБ

ИФА -

ИХЛ

КС

КЧ

ПЦ+ и ПЦ

РИТ РИФ

РМП РПР

РИГА -РСК

РУ

ФО

Ig

Т. pallidum

Список использованных сокращений

биологически ложноположительные результаты исследования в иммунохимических (серологических) реакциях для диагностики сифилитической инфекции;

диагностическая эффективность лабораторного исследования; иммуноблоттинг (модификации метода ИБ-IgG и ИБ-IgM); иммуноферментный анализ (модификации метода ИФА,еМ+1еС+ГгЛ, ИФА,еС и ИФАим);

иммунохемилюминесцентные исследования клиническая специфичность лабораторного исследования; клиническая чувствительность лабораторного исследования; предсказательная ценность положительных и отрицательных результатов лабораторного исследования; реакция иммобилизации бледных трепонем реакция непрямой иммунофлюоресценции (модификации метода РИФ200, PHOaic(IgG), РИФ^-IgM); реакция микропреципитации быстрый плазмареагиновый тест реакция пассивной гемагглютинации;

реакция связывания комплемента (модификации РСКк - с кардио-липиновым и РСКТ - трепонемным антигенами) регистрационное удостоверение для медицинских изделий на право применения в медицинских организациях России; Федеральные округа Российской Федерации (СЗФО - Северозападный, ЦФО - Центральный, ЮФО - Южный, СКФО - Северокавказский, ПрФО - Приволжский, УФО - Уральский, СФО -Сибирский, ДВФО - дальневосточный);

immunoglobulin's, иммуноглобулины - фракция белков крови, содержащая антитела;

- Treponema pallidum, бледная трепонема.

Подписано в печати 02.04.15 Заказ № 9854 Тираж: 100 экз.

Типография «ОПБ-Принт» ИНН 7715893757 107078, г. Москва, Мясницкий пр-д, д. 2/1 (495)777 3314 www.opb-print.ru