Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Разработка и внедрение в практику клинических диагностических лабораторий иммунологических и биохимических тестов на основе видеоцифровой регистрации

На правах рукописи

Старовойтова Татьяна Авеяировна

РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ КЛИНИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ НА ОСНОВЕ ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИИ

14.00.46 - КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре лабораторной диагностики Факультета усовершенствования врачей Российского Государственного Медицинского Университета

Научный руководитель -

Доктор медицинских наук, профессор Р.Т. Тогузов. Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор В.Н. Титов, Доктор медицинских наук, профессор О.П. Шевченко.

Ведущая организация: ММА им. И.М.Сеченова

Защита состоится « » 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Российской медицинской

академии последипломного образования по адресу: Москва,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РМАПО.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета профессор, доктор медицинских наук

заслуженный деятель науки РФ ВТ.Морозова

то 9Цд1€

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема усовершенствования методов распространенных медицинских анализов, очевидно актуальна, так как основополагающая и все возрастающая роль лабораторной диагностики в медицине является общепризнанным фактом. Особенно важной эта проблема представляется для российской медицины, где самые необходимые лабораторные определения, такие как иммунологические, общеклинические и биохимические проводятся в большинстве лабораторий, в основном, устаревшими методами. Многие информативные определения вообще не проводятся из-за отсутствия соответствующих приборов и реагентов.

Эта ситуация усугубляется существенным отставанием отечественных разработок современной аппаратуры для лабораторной диагностики от мирового уровня. Для того, чтобы преодолеть отставание, необходимо создание базы разработки лабораторных диагностических методологий с применением новых современных технологий. В лабораторной диагностике примерами таких перспективных технологических направлений являются подходы миниатюризации и использование видеоцифрового компьютерного анализа.

В связи с этим исследования, связанные с разработкой и внедрением современных комплексов аппаратуры, приспособлений и программного обеспечения для лабораторной диагностики на основе подходов миниатюризации и видеоцифрового анализа, обеспечивающих производительное и экономичное проведение самых распространенных в медицинской практике клинико-диагностических определений можно считать весьма актуальными.

Цели и задачи работы

Цели работы - разработка комплексов регистрирующей аппаратуры, приспособлений и программного обеспечения для проведения иммунохимических и биохимических лабораторных исследований на основе подходов видеоцифрового анализа и миниатюризации, апробация этих лабораторных методологий на клиническом матартатеттго^гототка-д^ .

БИБЛИОТЕКА . |

С1 4»

рекомендаций по внедрению этих методов в практику лабораторной диагностики.

Основными этапами достижения поставленных целей исследования являлось решение следующих задач: 1 - разработка компьютерных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологического дот-анализа, биохимических анализов на основе сухой химии и иммунохроматографических тестов; 2 - формулирование медицинских требований, дизайн пользовательских интерфейсов для программного обеспечения видеоанализаторов; 3 - конструирование приспособлений для формирования упорядоченных матриц точек для серийных дот-иммунологических и биохимических определений; 4 - апробация разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными лабораторными методами.

Научная новизна работы

Разработаны новая аппаратура и программное обеспечение, ориентированные на масштабное применение для различных биологических и клинико-диагностических анализов.

Предложенная платформа для матричных дот-иммунологических и биохимических анализов, включающая систему нанесения упорядоченных матриц точек, видеоанализатор и программное обеспечение не имеет аналогов.

Впервые продемонстрирована возможность использования системы матричного дот-анализа для серийных определений уровня глюкозы крови на основе мембран «сухой химии».

Разработан новый вариант анализа микроальбумина в моче на основе матричного дот-анализа с видеоцифровой регистрацией.

Практическая ценность работы.

1. Разработаны программы для анализатора-рефлектометра «Рефлеком» (ООО «Синтэко-Комплекс», Россия) позволяющие документировать результаты иммунохроматографических тестов, тестов «сухой химии» и микродот определений.

2. Предложены методы серийного определения альбумина в моче и глюкозы крови с использованием анализатора «Рефлеком» и программы «Видеодот».

3. Разработанная аппаратура и программное обеспечение могут быть использованы в практике для проведения анализов во внелабораторных условиях (выездная диспансеризация, срочные анализы в приемных отделениях больниц, анализы в полевых условиях и т.п.).

4. Подготовлено и апробировано методическое пособие по применению системы регистрации результатов иммунохроматографических тестов при определении простатического специфического антигена.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на международных и всероссийских съездах, симпозиумах, совещаниях и семинарах, в том числе на международной конференции «Будущее онкофетальных белков» (Осака, 1991), на симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций» (Москва, 1999), на конференции диагностической медицинской ассоциации «Актуальные проблемы деятельности диагностических центров в современных условиях» (Москва, 2000), на II (VI) Конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики России (Москва, 2000), на научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004).

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 88 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, списка литературы. Работа содержит 23 рисунка, 2 таблицы. Список литературы состоит из 123 работ, из которых 37 - отечественные источники.

Материалы и методы

Контрольные материалы, образцы мочи и сывороток были предоставлены Диагностическим центром №5 ГУЗ г. Москвы.

Для апробации метода серийного определения альбумина в моче использовали 67 образцов мочи от 38 здоровых людей и 29 пациентов с сахарным диабетом.

Для оценки метода определения глюкозы крови были исследованы 109 образцов от 75 здоровых людей и 24 больных сахарным диабетом пациентов.

Как образцы для иммунохроматографического определения простатического специфического антигена (ПСА) использовали 207 патологических сывороток крови пациентов, проходивших обследование по городской программе скрининга мужчин старше 40 лет. Также были использованы 169 сывороток здоровых людей, не имеющих патологии предстательной железы.

Систему серийного иммунологического дот-анализа отрабатывали на модели с использованием моноклональных антител к трофобластическому Р-глобулину и очищенного антигена. Моноклональные антитела выделяли из асцитных жидкостей на колонках с белком А и конъюгировали с пероксидазой хрена методом Nakane и Kawaio(1974). Очищенный антиген получали из ткани плаценты по методике ААТерентьева с соавт. и О.П.Шевченко с соавт. Для нанесения антигена на нитроцеллюлозные мембраны фирмы «CUNO, Inc.» (США), «Schleicher & Schull» (Германия), «Millipore» (США) и «Advanced Microdevices PVT. LTD» (Индия) использовали аппликаторы со стальными пинами различной толщины. После нанесения антигенов на мембрану и блокировки мембраны в растворе сухого молока проводили реакцию с конъюгатом моноклональных антител с пероксидазой хрена. Затем мембраны промывали буфером и помещали в субстратную смесь, содержащую диаминобензидин.

Система серийного определения альбумина в моче основана на схеме прямого афинного анализа образцов мочи пациентов, нанесенных на нитроцеллюлозные мембраны с проявлением конъюгатами на основе антител к альбумину или генноинженерного рецептора альбумина с пероксидазой хрена. Образцы мочи пациентов наносили на мембрану с помощью 30-пинового

б

аппликатора. Реакцию с конъюгатами проводили, как это описано выше. Для калибровки применяли нормальную мочу с добавлением известных количеств сухого альбумина человека.

Система серийного анализа глюкозы была основана на использовании мембран «сухой химии» для глюкометра «Меридиан», предоставленных фирмой «NDP» (Австралия). Мембраны нарезали на прямоугольники размерами 30 х 25 мм, помещали в специальные слайды и наносили образцы сыворотки с помощью 30-пинового аппликатора.

Иммунохроматографические тесты для определения простатического специфического антигена различных фирм [Alfa Scientific Design (США), Pan Probe (США), Rapid Diagnostic (США), AmeriTek, Inc. (США), Human (Германия), VedaXab. (Франция), Kat Medical (ЮАР), ZER Hitech (Израиль)] использовали в сочетании с разработанной системой видеорегистрации.

Для регистрации результатов разработанных нами тестов использовали видеоанализатор «Рефлеком» (ООО «Синтэко-Комплекс», Россия). Изображения объектов сохраняли в форматах файлов BMP, TIF и JPG.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «STATISTICA for WINDOWS».

Результаты и обсуждение

Наиболее перспективными в использовании с видеоцифровыми системами регистрации являются следующие распространенные типы тестов на основе применения планарных носителей: 1) биохимические тесты «сухой химии»; 2) иммунодот-тесты; 3) иммунохроматографические тесты.

Результаты этих анализов основаны на появлении контрастных, окрашенных объектов (аналитических зон, пятен, полос) на планарном носителе, что является удобным объектом видеоцифровой регистрации. Эти биохимические и иммунологические подходы можно использовать для диагностики целого спектра различных патологических состояний. Видеоцифровая регистрация особенно эффективна при выполнении серийных

анализов, где она сочетается с подходом формирования упорядоченных матриц аналитических зон в ходе проведения анализов. В этом случае за счет одновременного исследования многих образцов резко увеличивается производительность лабораторных методик.

В связи с этим, первым этапом являлась задача создания простых и производительных приспособлений для формирования упорядоченных матриц образцов на планарных носителях, разработка программного обеспечения для регистрации результатов анализов в таких матрицах на модельной системе. Затем полная платформа, включающая систему нанесения, программное обеспечение и видеоанализатор, применялась для конструирования новых вариантов проведения конкретных иммунохимических и биохимических тестов, востребованных в практике лабораторной диагностики.

Предложенная универсальная регистрирующая система -видеоанализатор с различными вариантами программного обеспечения может быть использована и с иммунохроматографическими тестами.

1. Разработка системы формирования упорядоченных матриц точек и программного обеспечения для серийных дот-определений на модели трофобластического Р-глобулина и моноклональных антител.

Самым распространенным иммунологическим тестом на планарных носителях, когда результаты выявляются в виде окрашенных или контрастных точек, являются дот-тесты на нитроцеллюлозных мембранах. Поэтому в качестве первичной модельной системы для конструирования серийных систем дот-иммуноанализа было выбрано определение белкового антигена -трофобластического |3-глобулина (ТБГ). Антиген ТБГ представляет собой глипопротеин с молекулярной массой около 90 Кда.

Ранее нами были получены моноклональные антитела к этому антигену и на основе антител одного из клонов создана иммуноферментная тест-система с применением в качестве ферментативной метки пероксидазы хрена.

В системе моделирования дот-анализа очищенный антиген ТБГ разводили до разных концентраций и наносили его с помощью пинов

различной формы и размеров на несколько видов нитроцеллюзных мембран. Затем, после блокировки свободных зон мембраны, связавшийся с мембранами антиген выявляли с помощью конъюгата пероксидазы хрена с моноклональными антителами к ТБГ, как это описано в разделе «Материалы и методы».

С применением этой модельной системы решались две задачи:

- создание оптимальной, простой, применимой в минимально оснащенной лаборатории системы серийного нанесения микроколичеств образцов в виде упорядоченной матрицы точек на любые планарные носители;

- формулирование медицинских требований и создание гибкого программного обеспечения для количественной обработки результатов серийного дот анализа.

После первичных экспериментов наиболее перспективной была признана система пинового нанесения исследуемых образцов. Этот метод основан на погружении в образец пина (микростержня) с последующим переносом формирующейся на пине микрокапли на мембрану. Очевидно, что объем микрокапли образца зависит от свойств анализируемой жидкости, материала и размера пина. Объем капель, а также свойства самой мембраны, время и степень контакта пина с мембраной определяют размер окрашенных точек на конечной фазе анализа.

0 12 3

Рис. 1. Изображения нитроцеллюлозных мембран после нанесения антигена ТБГ в различных концентрациях с проявлением конъюгатом монАТ-пероксидаза и ДАБ; а,- нанесение антигена микрошприцом по 1 мкл, б,в - нанесение системами пинов различного размера.

На рисунке 1 показаны изображения мембран после типичных

экспериментов дот-анализа с нанесением модельного антигена в различных концентрациях на нитроцеллюлозную мембрану и выявлением конъюгатом моноклональных антител с пероксидазой.

Решение задачи нанесения на планарный носитель воспроизводимых по объему капель образцов в виде упорядоченной матрицы было достигнуто за счет разработки многопиновых систем, включающих микропланшет для внесения образцов и соответствующий мультиаппликатор. Для систем пинов, формирующих матрицы с дистанциями между точками менее 3 мм, была разработана специальная конструкция микропланшета с лунками грушевидной формы.

На рис. 2 представлены два варианта многопиновых аппликаторов. Аппликатор, на рис. 2А, выполнен из нержавеющей стали. Такой аппликатор позволяет создавать матрицы точек с расстояниями между точками 4,4 мм. Для

этого аппликатора был разработан вариант микропланшета с 30-лунками (5x6 лунок), в который можно помещать 10-15 мкл образцов. Такая система позволяет наносить одновременно 30 образцов.

Аппликатор на рис. 2Б представляет собой два ряда пинов в плексигласовом держателе и позволяет создавать матрицы точек с расстоянием 2,4 мм между их центрами. С таким аппликатором применяется разработанный нами микропланшет с лунками грушевидной формы, в широкую часть которых обычной микропипеткой помещают 20 мкл образцов, а пины погружаются в сближенные между собой узкие части лунок. Применение грушевидных лунок позволяет достичь минимального расстояния 1,25 мм между центрами точек формируемых матриц.

Принцип применяемой системы обработки изображений состоит в выделении оператором участков изображения («зон интереса»), отвечающих конкретным образцам, с обсчетом интенсивности отраженного света от точек объекта в данной зоне.

На рис. 2в приведен пример такого выделения зон интереса, представляющих в данном случае внутренность окружности, охватывающей точки матрицы нанесенных на мембрану образцов.

Возможно и автоматическое выявление объектов в ходе программной цифровой обработки изображений. Этот вариант во многих случаях является предпочтительным, однако, он применим, когда все параметры используемой системы дозирования-нанесения образцов, химические и иммунологические компоненты проведения реакций фиксированы для однотипных анализов. При этом все настройки камеры, соответствующие геометрии объекта, диапазонам изменений интенсивности его окраски устанавливаются однократно и сохраняются в памяти компьютера для каждого типа анализа.

В применяемых в нашей работе форматах (периоды 4,4 мм, 2,4 мм, 1,25 мм и размеры точек 1,8 мм, 1,2 мм, 0,8 мм, соответственно) при использовании видеокамер с разрешением 352x288 и подбором поля зрения 4x5 см даже в последнем формате на каждую точку изображения приходится не

менее 50-100 регистрируемых пикселов. Это количество пикселов обеспечивает достаточно точные измерения интенсивности отраженного света, что позволяет применять анализатор во всех этих форматах, не изменяя элементов конструкции.

Для регистрации результатов дот-анализа разработана программа «Видеодот», в которой использован принцип автоматического выделения зон интереса в рамках фиксированной геометрии формируемых с помощью многопиновых систем матриц точек. Программа «Видеодот» позволяет обрабатывать результаты дот-анализа в матрицах с различным количеством рядов и столбцов, автоматически определяет контуры окрашенных точек, и выдает информацию об интенсивности сигнала в виде таблицы.

На рис. 3 показаны фрагменты окон программы «Видеодот».

Программа предусматривает возможность введения калибровочной кривой, и тогда для каждой точки (то есть для каждого образца) могут быть получены результаты измерений в единицах, принятых для данного аналита.

Предложенная платформа для мультидот-анализа, включающая видеоанализатор, систему аппликаторов для высокопроизводительного нанесения образцов от пациентов, программное обеспечение «Видеодот»

является перспективной для проведения различных серийных биохимических анализов.

На базе этой платформы были разработаны иммунологический и клинический биохимический анализы, а именно: тест на микроальбуминурию (определение альбумина в моче) и определение глюкозы крови.

2. Система серийного определения альбумина в моче (тест на микроальбуминурию).

Для системы дот-определения альбумина в моче была выбрана схема прямого твердофазного анализа. При этом пробы мочи наносятся в виде упорядоченных матриц точек на мембраны, а затем присутствующий в образцах альбумин выявляется с помощью конъюгата генно-инженерного рецептора альбумина или антител к альбумину с пероксидазой.

На рис. 4 представлен типичный вид мембраны, на которую нанесены с помощью аппликатора (формат 4,4 мм; наносимые капли объемом 0,5 мкл) пробы нормальной мочи с добавлением различных концентраций альбумина, после проведения процедуры анализа Очевидно, что интенсивность окрашивания пятен возрастает с повышением концентрации альбумина в пробах.

■ • 9 0 9

#р . ш ж Ж- |Г

• -{г ^

* г г г г

Рис 4 Видеоизображение мембраны с нанесенными пробами мочи после проведения всех этапов реакции выявления альбумина Цифрами на рисунке указана концентрация альбумина в пробах в мкг/мл

Для проведения серийного анализа подобраны оптимальные размеры и форма пинов, объемы образцов мочи в планшетах, типы используемых нитроцеллюлозных мембран, а также параметры иммунологической системы определения, такие как, концентрации конъюгатов, время инкубации, состав

блокирующего буфера, другие параметры тестов.В качестве оптимального варианта нанесения был выбран аппликатор формата 4,4 мм с 30 пинами. В 30-луночный микропланшет помещали по 30 мкл проб мочи и с помощью аппликатора переносили капли проб на мембраны. Результаты анализировали с помощью программы «Видеодот».

На рис. 5 представлены калибровочные кривые для определения альбумина в моче для различных нитроцеллюлозных мембран и данные сопоставления результатов серийного дот-анализа с референсным методом. По данным референсного метода в 16 из 67 образцов мочи концентрация альбумина составляла от 32,2 до 82,6 мг/л, а в 38 образцах от здоровых пациентов и в 13 - от больных сахарным диабетом - до 30 мг/л. Коэффициент корреляции Пирсона (г) составляет 0,99. Чувствительность определения альбумина в моче для всех образцов мембран была около 10-20 мг/л. Как известно, пороговым значением для выявления микроальбуминурии является 30 мг/л. Можно заключить, что иммунологический тест на микроальбуминурию на основе видеорегистрации в мультидот-формате обладает достаточной чувствительностью и может быть использован в практике.

3. Система серийного определения глюкозы крови

Серийное определение концентрации глюкозы в цельной крови или сыворотке производили на основе технологии «сухой химии» с использованием

мембран «Меридиан», заработанной фирмой «N0?» (Австралия), для чего на мембрану с помощью систем пинов наносили капли цельной гепаринизированной крови или сыворотки. Результаты измерений концентрации глюкозы в единицах мМ/л, получали с помощью программы «Видеодот».

На рис. 6 приведены зависимость интенсивности окрашивания точек от концентрации глюкозы в образцах и данные сопоставления результатов определения глюкозы цельной крови методом серийного дот-анализа и референсным методом. По данным референсного метода из этих образцов 77 -имело содержание глюкозы от 3,0 до 5,9 ммоль/л; 14 - от 6,0 до 7,0 ммоль/л; 11-от 7,1 до 11,0 ммоль/л и 17 более 11 ммоль/л.

Коэффициент корреляции Пирсона (г) составляет 0,97 (ДИ 95% = 0,95 -0,98) при уровне вероятности р<0,0001, что указывает на пропорциональную зависимость между этими методами.

Серийное измерение глюкозы крови с применением системы матричного дот-нанесения образцов и видеоцифровой регистрации отличается исключительно высокой производительностью. Время проявления цветового

пятна на мембране составляет не более 60 секунд. Первый этап анализа состоит в помещении 20 мкл образца гепаринизированной крови или сыворотки в лунку планшета. При накоплении необходимого количества образцов с помощью

30-пинового аппликатора все образцы наносятся на слайд с мембраной, который сразу же переносится в видеоанализатор. Время регистрации результатов также не превышает 30-40 секунд. Вся процедура (после заполнения планшета) занимает не более 2-3 минут, причем результаты, представленные в электронной форме, могут сохраняться в базе данных или распечатываться.

Ориентировочные экономические расчеты показывают, что серийный анализ глюкозы крови с помощью матричного дот-нанесения и видеорегистрации сопоставим по стоимости одного теста с наиболее экономичными вариантами фотометрических определений при гораздо меньшей трудоемкости.

4. Разработка базового программного обеспечения для регистрации результатов имунохроматографических тестов

В настоящее время одним из важных направлений развития иммуноанализа стали экспрессные иммунохроматографические тесты, основанные на принципах иммунохроматографии с использованием в качестве меток частиц коллоидного золота. Основные преимущества этих методов -простота выполнения анализа, быстрое получение результата, надежность определений, не требующих высокой квалификации оператора.

В результате исследования на тестовой полоске предусмотрено появление двух линий - контрольной, обозначающей пригодность теста, и тестовой, обозначающей результат анализа. Таким образом, в этом случае объектом регистрации являются контрастные линии, а не точки, как в дот-анализе.

Номенклатура доступных иммунохроматографических тестов постоянно

расширяется, и почти полностью совпадает со спектром распространенных иммуноферментных определений. Однако в лабораторной диагностике иммунохроматографические тесты имеют ограниченное применение из-за проблем, связанных с отсутствием при визуальной регистрации документирования и полной объективности оценки результатов.

Для решения этих проблем на основе применения видеоцифрового анализатора нами разработано программное обеспечение «Видеотест», позволяющее документировать и проводить количественную оценку ИХ-тестов. Предлагаемое программное обеспечение дает возможность выделить аналитически значимую часть изображения и регистрировать интегральную интенсивность линий в контрольной и тестовой зонах.

На рис.7 проиллюстрированы этапы настройки параметров и показано

основное рабочее окно программы «Видеотест».

[

□ □

Рис. 7. Фрагменты окон настройки и основное окно программы «Видеотест», а - выделение рамкой аналитического поля тест-полоски в окне настройки программы; б - аналитическое поле тест-полоски с тестовой и контрольной линиями и денситограммы линий; в - основное окно программы.

После определения границ диагностических линий программой проводится расчет интегральной интенсивности окрашивания линий, которая затем используется во всех дальнейших вычислениях. Численное значение интенсивности в условных единицах представляется в окне результатов. В

настроечном окне можно также установить пороговые значения для автоматического определения положительных или отрицательных результатов теста, или достаточной интенсивности контрольной полосы для подтверждения пригодности теста.

При определении пороговых значений в окне результатов анализа для тестовых зон появляется надпись «положительный» или «отрицательный», а в окне для контрольной зоны - надпись «годен» или «не годен». Численные значения интегральной интенсивности полос также могут быть использованы для количественного определения аналитов, с помощью калибровочной кривой, которая вводится в специальном окне программы.

Программное обеспечение «Видеотест» было адаптировано для определений общего простатического специфического антигена.

5. Система определения общего простатического специфического антигена на основе иммунохроматографических тестов с видеоцифровой регистрацией

Простатический специфический антиген (ПСА), присутствует в составе тканей предстательной железы, и его концентрации в крови здоровых лиц и больных раком предстательной железы (РПЖ) существенно различаются. ПСА считается эффективным маркером для дифференциальной диагностики РПЖ и доброкачественной гиперплазии простаты (ДГПЖ), а также для контроля эффективности лечения РПЖ.

ПСА в незначительных концентрациях присутствует в крови и здоровых людей. Уровень ПСА в крови ниже 3 нг/мл считается нормальным, концентрация от 3 до 10 нг/мл - зона риска. Обнаружение ПСА в крови в этом диапазоне означает, что пациенту необходимо специальное, более углубленное обследование уролога, а затем, если нет других показаний, необходимо постоянное наблюдение, включающее периодическое повторение определения ПСА.

В настоящее время определение общего ПСА с успехом используется для

скрининговых обследований. Одним из наиболее доступных вариантов порогового определения общего ПСА являются иммунохроматографические тесты.

Традиционные лабораторные иммунологические методы определения ПСА требуют дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала. Система на основе иммунохроматографических тест-полосок и видеоцифрового анализа, позволяет проводить с достаточной достоверностью скрининговые обследования на ПСА, и может существенно повысить доступность и широту внедрения полезного скринингового обследования.

На рис.8 показаны типичные регистрируемые картины аналитических полей различных ИХ-тестов фирм «Alfa Scientific Design» и «Kat Medical» для сывороток с различным содержанием ПСА.

A 1 .л la ju

ншии шяш i

,.....А - ,j\_

яшм ........................! шш \ Í ....... . ..

Alfa Scientific Design Kat Medical

Рис. 8. Изображения аналитических полей ИХ-тестов и денситограмм интенсивностей аналитических зон (линий) для сывороток с концентрацией ПСА около 10 нг/мл (вверху) и 4-5 нг/мл. (внизу). Слева-тестовая полоса, справа -контрольная полоса.

При концентрациях ПСА около 10 нг/мл все тесты обычно показывают два хорошо различимых и детектируемых пика. В этих случаях, типичные примеры которых приведены на рис. 8, визуальная интерпретация не вызывает проблем, и это характерно для большей части сывороток при концентрациях

19

ПСА выше 6-7 нг/мл. Однако иная картина наблюдается при концентрации ПСА около порогового значения тестов. Существенное снижение интенсивности тестовой полосы значительно затрудняет вывод о наличии или отсутствии полосы. Это может приводить к сомнительной интерпретации результатов тестов при концентрации ПСА, близкой к пороговой.

В ситуациях с неоднозначным результатом, безусловно, необходимо сохранение первичного документа о проведенном исследовании, чтобы его можно было сопоставить с дальнейшими исследованиями. Более того, применение видеоцифровой регистрации приближает ИХ-метод по диагностической ценности к другим лабораторным методикам.

На рис.9 приведены результаты измерений концентрации ПСА в исследуемой панели сывороток на анализаторе «Виктор» с наборами «Дельфия» в сопоставлении с данными интегральной интенсивности полос ИХ-тестов фирмы «Alfa Scientific Design» (рис. 9а) и «Kat Medical» (рис.9б). Показаны результаты для 207 патологических сывороток уровень ПСА в которых по данным референсного метода был выше 4 нг/мл. Данные для сывороток пациентов с концентрациями ПСА в сыворотке менее 1 нг/мл не приводятся.

2D

Результаты показывают высокую степень взаимосвязи между методами для обоих типов полосок (для «Alfa Scientific Design» и «Kat Medical» - г =0,81 и г =0,85, соответственно). Они также указывают на важность введения для концентрации 2-5 нг/мл при видеоцифровой регистрации порогового уровня выраженного в единицах интенсивности тестовой полосы. При более высоких концентрациях анализатор с тестами может также определять концентрации ПСА (при наличии стандартов). Результаты могут быть представлены на полуколичественном уровне, с отнесением исследуемых сывороток к различным диагностически важным диапазонам концентраций. Данные по сопоставлению отнесения исследуемых сывороток к различным диапазонам с помощью ИХ-метода и референс-метода приведены в таблице 2.

Таблица 2. Сопоставление отнесения исследованных сывороток к различным диапазонам концентраций ПСА с помощью ИХ-метода с видеоцифровой регистрацией и референсного метода.

Концентрация ПСА, нг/мл

0-3 3- 10 10-20 >20

Фирма-производит ель тестов диапазон интенсивности Число совпадений/ всего,% диапазон интенсивности Число совпадений/ всего, % диапазон интенсивности Число совпадений/ всего,% диапазон интенсивности число совпадений/ всего,%

Kat Medical 0.1-0.4 12/14 (86) 0.5-1.4 41/43 (95) 1.5-2.5 7/9 (78) 2.6-3.4 5/6 (83)

Alfa Scientific Design 0.1-0.4 27/33 (82) 0.5-1.5 66/83 (80) 1.6-2.0 12/25 (48) 2.1-4.8 10/14 (71)

Результаты исследования показывают, что имунохроматографический анализ с видеоцифровой регистрацией является адекватным и достоверным методом, и может эффективно применяться для скрининга. Такой метод может быть вариантом выбора для скрининга, так как не требует дорогостоящего оборудования, условий оснащенной лаборатории, обученного персонала и

легко реализуется при выездных обследованиях.

Выводы.

1. Разработаны система формирования упорядоченных матриц точек и базовое программное обеспечение для серийных дот-биохимических и иммунологических анализов на модели трофобластического (3-глобулина и моноклональных антител к ТБГ.

2. Разработано программное обеспечение «Видеодот» для количественной оценки интегральной интенсивности окрашивания точек в составе упорядоченных матриц при проведении серийных дот-биохимических и иммунологических анализов.

3. На основе применения видеоанализатора, приспособлений для формирования упорядоченных матриц точек и программы «Вйдеодот» создан чувствительный метод определения альбумина в моче, применимый для диагностики микроальбуминурии.

4. Предложен метод серийного высокопроизводительного измерения глюкозы крови на мембране «сухой химии» с применением видеоанализатора, приспособлений формирования матриц точек и программы «Видеодот». Продемонстрировано удовлетворительное совпадение результатов разработанного метода измерения глюкозы с традиционными методами.

5. Разработано гибкое программное обеспечение «Видеотест» для регистрации, автоматической оценки, документирования результатов иммунохроматографических тестов, применимое к любым типам тестов горизонтального потока.

6. На основе коммерчески доступных иммунохроматографических тестов, видеоанализатора «Рефлеком» и программного обеспечения «Видеотест» предложена система определения простатического специфического антигена, которая позволяет эффективно различать диагностически важные диапазоны концентраций данного онкомаркера.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. S.M. Vorobiev, M.E. Seveiina, T.A. Starovoitova, S.O. Gudima, A.V. Sokolov, Yu.Yu. Vengerov. Creation of monoclonal antibody enzyme immunoassay for pregnancy beta-1 glycoprotein//Biomedical.Science. - 1990.-Vol. 1.-N6.-P. 650-655.

2. СМ. Воробьев, М.Е. Северина, ТА Старовойтова, СО. Гудима,

A.B. Соколов, Ю.Ю.Венгеров. Создание иммуноферментной тест-системы для определения трофобластического бета-1-гликопротеина с использованием моноклональных антител // Биотехнология. - 1991. - № 4. - С. 82-85.

3. СМ. Воробьев, М.Е, Северина, Т.А Старовойтова. Клиническое применение иммуноферментной тест-системы для определения трофобластического бета-1 гликопротеина // Будущее онкофетальных белков: Тез. докл. Межд.Симп. 1991 г. - Осака.

4. Т.А Старовойтова, СГ. Волощук, Е.В. Максимова, Т.В. Гупалова,

B.Г. Палагнюк, А.А. Тотолян, Ю.Ю. Венгеров. Высокопроизводительные скрининг-методы на основе микродот-анализа с видеоцифровой регистрацией // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - №10. - С. 16.

5. А.А. Папченко, Т.А Старовойтова, СГ. Волощук, Е.В. Максимова, В.Н. Сорокин, Л.П. Мартынкина, Ю.Ю. Венгеров. Анализаторы и программное обеспечение для видеоцифровой регистрации результатов электрофоретических и иммуноферментных определений // Клиническая лабораторная диагностика. -1999. - №9. - С 50.

6. Т.А Старовойтова, Е.Е. Егоров, Е.В. Максимова, СГ. Волощук, АА Папченко, В.Н.Сорокин, Н.В. Маршутина, Ю.Ю. Венгеров. Иммунохроматографические тесты определения онкомаркеров с видеоцифровой регистрацией - перспективы для первичной диагностики злокачественных образований // Клиническая лабораторная диагностика. -2000.-М10.-СЛ4-15.

7. С.Г.Волощук, ТАСтаровойтова, ВАКутвицкий, АЕ.Туголуков, В.В.Зайко, НАСтереополо, Е.Е.Егоров, В.Е.Барский, Л.П.Мартынкина, Ю.Ю.Венгеров. Системы видеоцифрового анализа для лабораторной диагностики. Аппаратура и программное обеспечение. // Лабораторная медицина. - 2002. - №5. - С. 82-87.

8. Б.Б.Дзантиев, АВЖердев, В.О.Попов, Ю.Ю.Венгеров, Т.А.Старовойтова, Р.Т.Тогузов. Системы экспрессной иммунодетекции биологически активных соединений // Клиническая лабораторная диагностика -2002.-№8.-С. 25-31.

9. Т. А. Старовойтова, В.В.Зайко, С.Г.Волощук, НАСтереополо, Л.П.Мартынкина, Н.И.Савина, НАЗайцева, Ю.Ю.Венгеров. Иммунохроматографический анализ простатического специфического антигена с видеоцифровой регистрацией // Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины: Тез. докл. научно-практ. конф. - Астрахань-Москва, 2004. - С. 15-20.

Us 21 7 3 7

РНБ Русский фонд

2005-4 21151

Актуальность исследования

Проблема усовершенствования методов проведения распространенных медицинских анализов, очевидно актуальна, так как основополагающая и все возрастающая роль лабораторной диагностики в медицине является общепризнанным фактом. Особенно важной эта проблема представляется для российской медицины, где самые необходимые лабораторные определения, такие как иммунологические, общеклинические и биохимические проводятся в большинстве лабораторий, в основном, устаревшими методами. Многие информативные определения вообще не проводятся из-за отсутствия соответствующих приборов и реагентов, что связано с недостаточным уровнем финансирования.

Эта ситуация усугубляется существенным отставанием отечественных разработок современной аппаратуры для лабораторной диагностики от мирового уровня. Для того чтобы преодолеть это отставание, необходимо создание базы разработки лабораторных диагностических методологий с применением новых современных технологий. В лабораторной диагностике примерами таких перспективных технологических направлений являются подходы миниатюризации и использование видеоцифрового компьютерного анализа.

В связи с этим, исследования, связанные с разработкой и внедрением современных комплексов аппаратуры, приспособлений и программного обеспечения для лабораторной диагностики на основе подходов миниатюризации и видеоцифрового анализа, обеспечивающих производительное и экономичное проведение самых распространенных в медицинской практике клинико-диагностических определений можно считать весьма актуальными.

Цели и задачи работы

Цели работы - разработка комплексов регистрирующей аппаратуры, приспособлений и программного обеспечения для проведения иммунохимических и биохимических лабораторных исследований на основе подходов видеоцифрового анализа и миниатюризации, апробация этих лабораторных методологий на клиническом материале и подготовка рекомендаций по внедрению этих методов в практику лабораторной диагностики.

Основными этапами достижения поставленных целей исследования являлось решение следующих задач: 1 - разработка компьютерных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологического дот-анализа, биохимических анализов на основе «сухой химии» и иммунохроматографических тестов; 2 - формулирование медицинских требований, дизайн пользовательских интерфейсов для программного обеспечения видеоанализаторов; 3 - конструирование приспособлений для формирования упорядоченных матриц точек для серийных дот-иммунологических и биохимических определений; 4 - апробация разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными лабораторными методами.

Научная новизна работы

Разработаны новая аппаратура и программное обеспечение, ориентированные на масштабное применение для различных биологических и клинико-диагностических анализов.

Предложенная платформа для матричных дот-иммунологических и биохимических анализов, включающая систему нанесения упорядоченных матриц точек, видеоанализатор и программное обеспечение не имеет аналогов.

Впервые продемонстрирована возможность использования системы матричного дот-анализа для серийных определений уровня глюкозы крови на основе мембран «сухой химии».

Разработанный новый вариант анализа микроальбумина в моче на основе матричного дот-анализа с видеоцифровой регистрацией.

Практическая ценность работы.

1. Разработаны программы для анализатора-рефлектометра «Рефлеком» (ООО «Синтэко-Комплекс», Россия) позволяющие документировать результаты иммунохрома-тографических тестов, тестов «сухой химии» и микродот определений.

2. Предложены методы серийного определения альбумина в моче и глюкозы крови с использованием анализатора «Рефлеком» и программы «Видеодот».

3. Разработанная аппаратура и программное обеспечение могут быть использованы в практике для проведения анализов во внелабораторных условиях (выездная диспансеризация, срочные анализы в приемных отделениях больниц, анализы в полевых условиях и т.п.).

4. Подготовлено и апробировано методическое пособие по применению разработанной системы регистрации результатов иммунохроматографических тестов при определении простатического специфического антигена.

выводы

1. Разработаны система формирования упорядоченных матриц точек и базовое программное обеспечение для серийных дот - биохимических и иммунологических анализов на модели трофобластического бета-глобулина (ТБГ) и моноклональных антител к ТБГ.

2. Разработано программное обеспечение «Видеодот» для количественной оценки интегральной интенсивности окрашивания точек в составе упорядоченных матриц при проведении серийных дот-биохимических и иммунологических анализов.

3. На основе применения видеоанализатора, приспособлений для формирования упорядоченных матриц точек и программы «Видеодот» создан чувствительный метод определения альбумина в моче, применимый для диагностики микроальбуминурии.

4. Предложен метод серийного высокопроизводительного измерения глюкозы крови на мембране «сухой химии» с применением видеоанализатора, приспособлений формирования матриц точек и программы «Видеодот». Продемонстрировано удовлетворительное совпадение результатов разработанного метода измерения глюкозы с традиционными методами.

5. Разработано гибкое программное обеспечение «Видеотест» для регистрации, автоматической оценки, документирования результатов иммунохроматографических тестов, применимое к любым типам тестов горизонтального потока.

6. На основе коммерчески доступных иммунохроматографических тестов, видеоанализатора «Рефлеком» и программного обеспечения «Видеотест» предложена система определения простатического специфического антигена, которая позволяет эффективно различать диагностически важные диапазоны концентраций данного онкомаркера.