Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Видеоцифровая регистрация для иммунологических и биохимических исследований в практике клинической лабораторной диагностики

На правах рукописи

Старовойтова Татьяна Авенировна

ВИДЕОЦИФРОВАЯ РЕГИСТРАЦИЯ ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПРАКТИКЕ КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

14.03.10 - КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2010

003494486

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении «Российский Государственный Медицинский Университет» Росздрава

Научный консультант:

Доктор медицинских наук,

профессор Тогузов Руслан Тимофеевич.

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Панченко Леонид Федорович

Доктор медицинских наук,

профессор Сапрыгин Дмитрий Борисович

Доктор медицинских наук,

профессор Титов Владимир Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова» Росздрава

Защита состоится « 21 » апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.071.04. при ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «РМАПО» Росздрава по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, Д.19.

Автореферат разослан « 1«:

1С» ЛКЫ^

2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор В.Т.Морозова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Важнейшая роль лабораторной диагностики в медицине является общепризнанным фактом, в связи с чем усовершенствование имеющихся и разработка новых вариантов аналитических лабораторных методов на основе использования современных и постоянно развивающихся компьютерных технологий представляется весьма актуальным. Очевидна направленность этих усовершенствований, призванных обеспечить повышение достоверности, точности, снижение времени выполнения и трудоемкости проведения анализов. («Концепция развития службы клинической лабораторной диагностики Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2004-2010 годы»).

Одной из важных зон внедрения новых лабораторных методик, основанных на использовании современных информационных технологий регистрации и обработки результатов, являются малые и средние лаборатории, где и в настоящее время большое количество лабораторных исследований проводится на основе визуальной интерпретации. К таким исследованиям относятся иммунологические агглютинационные и преципитационные анализы, тесты «сухой химии», иммунохроматографические тесты, иммунодот- и иммуноблот-анализы.

Важным технологическим направлением развития этих и других лабораторных методов является видеоцифровой компьютерный анализ. Применение видеоцифрового анализа к традиционным тестам с визуальной регистрацией решает задачу документирования и объективизации результатов анализа, что поднимает эти тесты на принципиально более высокий уровень достоверности и аналитической ценности. Видеоцифровой анализ открывает новые возможности и для усовершенствования методов, где применяются обычные варианты фотометрии и рефлектометрии, таких как иммуноферментный анализ, турбидиметрические исследования, тесты «сухой химии».

Другим перспективным направлением усовершенствования лабораторных методик является внедрение микрометодов, обеспечивающих проведение исследований с использованием минимальных количеств реагентов и образцов. Существенные преимущества дает сочетание подходов видеоцифровой регистрации и проведение аналитических процедур в микроматричном формате. Многими научными группами разрабатываются аналитические системы, включающие приспособления для проведения

реакций в минимальных объемах и видеоцифровые системы регистрации. Такие системы позволяют создать принципиально новые варианты высокопроизводительных и экономичных методик.

В связи с этим исследования, направленные на разработку и внедрение высокотехнологичных аналитических систем на основе видеоцифрового анализа, обеспечивающих эффективное проведение распространенных клинико-диагностических определений на высоком уровне достоверности, можно считать весьма актуальными.

Цель исследования -

Создать новые и усовершенствовать имеющиеся методы проведения распространенных клинико-диагностических исследований с применением видеоцифровой регистрации и оценить на клиническом материале аналитические характеристики созданных лабораторных комплексов и методов.

Задачи исследования:

1. Разработать лабораторные видеоцифровые системы для регистрации результатов латексной агглютинации, пассивной гемагглютинации, изосерологических исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа и биохимических тестов «сухой химии».

2. Сформулировать медико-технические требования к программному обеспечению видеоанализаторов и обосновать алгоритмы оценки результатов специфических аналитических реакций с учетом особенностей их прохождения.

3. Создать стандартизованные методики проведения агглютинационных тестов с документированием, автоматической оценкой результатов, обеспечивающие возможность внутрилабораторного контроля качества исследований.

4. Разработать систему регистрации результатов и планшеты для проведения латексных агглютинационных и изосерологических исследований со сниженным расходом реагентов.

5. Сконструировать приспособления формирования матриц микрокапель на планарных носителях и создать полные аналитические системы, включающие эти приспособления и программно-аппаратные комплексы для регистрации и интерпретации результатов иммунологических и биохимических исследований в микроматричном формате.

6. Провести расширенную апробацию разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными

лабораторными системами и подготовить научно обоснованную методическую базу для внедрения этих методов в практику клинической лабораторной диагностики.

Научная новизна работы.

Разработана не имеющая аналогов многофункциональная система регистрации результатов иммунологических исследований на основе сканера.

Впервые разработано программное обеспечение для регистрации результатов латекс - агглютинационных исследований на планарных носителях с количественной оценкой реакций для любых латекс -агглютинационных тестов.

С применением разработанных подходов видеоцифровой регистрации и микрометодов предложены новые, эффективные варианты проведения серийных исследований латексной агглютинации, изосерологических тестов в различных форматах, позволяющие снизить необходимые для анализов объемы реагентов и проб в 10-30 раз.

Разработана, защищенная патентом РФ, полная аналитическая система для проведения матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате, включающая приспособления нанесения микрокапель образцов и реагентов на планарные носители, видеоанализатор и специализированное программное обеспечение.

Практическая ценность работы.

Разработана лабораторная многофункциональная регистрирующая система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - 1 и гемагтлютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа. Эта универсальная видеоцифровая система с пакетом программ «Эксперт-Лаб» (Свидетельство о регистрации № 2007613095 в Реестре программ для ЭВМ от 20.07.2007) может рассматриваться как основной лабораторный комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра иммунологических исследований.

За разработку и внедрение системы комплекса «Эксперт-Лаб» присужден Диплом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007). Разработка видеоцифровых систем для лабораторной диагностики отмечена золотой медалью «Международного салона инноваций и инвестиций» (Москва, 2009).

На основе разработанного аналитического комплекса для матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате с видеоцифровой регистрацией предложены методы серийного дот - анализа альбумина в моче, глюкозы крови, латекс-агглютинационного метода определения содержания аналитов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, ACJIO) и изосерологических исследований, позволяющие в десятки раз снизить объемы реагентов и проб и повысить производительность.

Внедрение результатов работы.

Разработанная лабораторная система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа внедрена в серийное производство на предприятии ОАО «ЛОМО» (Санкт-Петербург) (Регистрационное удостоверение № ФС 02012006/3617-06 от 10.08.2006). Системы «Эксперт-Лаб» используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в практике работы КДЛ ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова», НУЗ «ЦКБ №1 ОАО «РЖД», ГУЗ «Московский областной перинатальный центр», ГУЗ ДЦ №1 УЗ ЮЗАО.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные и научно обоснованные подходы усовершенствования лабораторных методов с видеоцифровой регистрацией реализованы и внедрены в практику в виде многофункциональных программно-аппаратных комплексов, обеспечивающих получение объективных и достоверных результатов широкого спектра биохимических и иммунологических лабораторных исследований.

2. На основе сочетания подходов видеоцифровой регистрации и применения микрометодов создана и реализована в виде полного аналитического комплекса технология проведения биохимических и иммунохимических исследований в матричных форматах в микрообъемах реагентов и образцов.

3. Использование разработанных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологических и биохимических исследований повышает качество и достоверность лабораторных данных за счет объективизации их оценки, сохранения первичного документа теста для ретроспективного контроля.

Личный вклад автора.

Автор лично принимала участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: разрабатывала медицинские требования к приборным и аппаратным компонентам программно-аппаратных комплексов и приспособлений для проведения исследований в микроформатах, критерии для алгоритмов регистрации и дискриминации результатов иммунологических исследований, осуществляла оценку разработанных лабораторных методов в сопоставлении с референсными вариантами, сформулировала рекомендации для использования результатов исследований в клинико-диагностических лабораториях.

Апробация работы.

Результаты исследования докладывались на совместной научно-практической конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и проблемной научно-исследовательской лаборатории нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ «Росздрава» 06 октября 2009 года.

Печатные работы.

По теме диссертации опубликовано 19 публикаций в отечественной и зарубежной печати, из них в изданиях, рекомендуемых ВАК- 9 работ. Получены патент на изобретение №2325644 от 27.05.2008 и свидетельство №2007613095 «Пакет программ для лаборатории «Эксперт-Лаб» от 20.07.2007.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 163 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, практических рекомендаций, списка литературы, списка сокращений. Список литературы содержит 149 работ, из которых 44 отечественные источники. В диссертационную работу включены 11 таблиц и 48 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Контрольные материалы, образцы мочи, крови и сывороток были предоставлены ООО «КДЛ - тест» г. Москвы (всего более 12 000 образцов от 8860 пациентов, проходивших плановое или динамическое обследование).

Изображения аналитических объектов (96-луночных плоскодонных и круглодонных микропланшетов, разработанных микропланшетов формата 3x4, матричных объектов формата 5x6) в режиме светопропускания получали с помощью сканера «Epson Perfection-4990 Photo» («Epson», Япония), a

изображения матричных дот-объектов и иммунохроматографических тест-полосок в режиме отражения получали как с помощью сканера, так и с использованием рефлектометра «Рефлеком» (ООО «Синтэко-Комплекс», Россия.)

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с видеоцифровой регистрацией на наличие антител к Treponema pallidum было исследовано 9964 образца сыворотки. 96 проб параллельно тестировались в реакции Treponema pallidum particle agglutination (TPPA).

Аналитические характеристики программно-аппаратного комплекса при регистрации результатов иммуноферментного анализа (ИФА) исследованы на 1317 образцах сывороток (определение антител к ТПО и ТГ, ТТГ, общего ПСА, свободного тироксина, трийодтиронина, ДЕА-S, антител к Chlamidia trachomatis класса G, HBsAg). При постановке иммунологических реакций применяли коммерческие тест-системы.

Для разработки технологии проведения реакции латекс агглютинации (ЛА) и изосерологических исследований в формате 8x12 с видеоцифровой регистрацией результатов было отобрано 460 сывороток пациентов с известным содержанием СРБ, РФ, ACJIO и 201 образец цельной крови с установленной группой крови, соответственно.

Для формирования матриц микрокапель исследуемых образцов или реагентов на планарных носителях использовали разработанные нами аппликаторы со стальными пинами различной толщины.

Серийный анализ глюкозы методом «сухой химии» проводили, нанося на мембрану «Меридиан» (фирма «NDP», Австралия), помещенную на специальный носитель, образцы сыворотки крови с помощью разработанного 30-пинового аппликатора.

Серийное определение альбумина в моче проводили, нанося 30-пиновым аппликатором образцы мочи пациентов на нитроцеллюлозную мембрану «Schleicher & Schull» (Германия). После блокировки мембраны в растворе сухого молока проводили реакцию с генноинженерным рецептором или моноклональными антителами к альбумину, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем мембраны промывали буфером и помещали в субстратную смесь, содержащую диаминобензидин. Для калибровки применяли мочу с добавлением известных количеств сухого альбумина человека.

Серийные исследования факторов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, ACJIO) проводили, используя латексные реагенты «BioScience» (Франция),

«BioSystems» (Испания). 30-пиновым аппликатором забирали микрокапли (0,3-0,5 мкл) латексной суспензии и образцов двукратных разведений тестируемой сыворотки и контролей из соответствующих микропланшетов. С помощью системы позиционирования-смешивания помещали их последовательно на носитель в виде упорядоченной матрицы точек и перемешивали. Контроль воспроизводимости и чувствительности разработанных методов осуществляли с помощью контрольных сывороточных аттестованных образцов фирмы «Randox» и «DiaSis».

Оценку аналитических характеристик матричных микрометодов определения: - аналитов ревматоидной тройки в тестах JIA производили в ходе исследований 119 образцов сыворотки крови, - концентрации глюкозы в сыворотке и цельной крови при исследованиях 340 образцов и 37 образцов соответственно, - серийного определения содержания альбумина в моче в ходе исследований 67 образцов. ,

Серийные и мультиплексные исследования групп крови проводились с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-D-cynep фирмы «Медиклон» (Россия). Суспензию эритроцитов (или образцы крови) и цоликлоны (исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты - для перекрестного метода) аппликаторами наносили на стекло и перемешивали.

Иммунохроматографические тесты для определения простатического специфического антигена (ПСА) различных фирм («Alfa Scientific Design» США, «Cat Medical» ЮАР и др.) использовали в сочетании с разработанной системой видеорегистрации. В качестве образцов для иммунохроматографического определения ПСА использовали 207 сывороток крови пациентов с заболеваниями предстательной железы, проходивших обследование по городской программе скрининга мужчин старше 40 лет, а также 169 сывороток здоровых мужчин.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «STATISTICA-6 for WINDOWS» и MS Exell с учетом характера распределения и применением параметрических и непараметрических критериев.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Системы получения изображений аналитических объектов и принципы построения программного обеспечения для регистрации

результатов клинических лабораторных исследований

Сфера применения видеоцифровых устройств для лабораторных исследований постоянно расширяется благодаря улучшению характеристик

серийно выпускаемых сканеров и видеоцифровых камер, разработкам новых технологических решений. Методы видеоцифровой регистрации (ВЦР) могут быть использованы в качестве альтернативы методам обычной и отражательной фотометрии в приложении к традиционным объектам фотометрических исследований лабораторной диагностики, а в применении к методикам с визуальной регистрацией предоставляют такие преимущества как документирование и объективизация результатов исследований.

А. Использованные системы получения изображений аналитических объектов.

На рис.1 показаны варианты адаптированных к различным аналитическим объектам видеоцифровых систем получения изображения, использованных в данной работе, к которым разрабатывалось специализированное программное обеспечение.

а г

Рис. 1. Модификации регистрирующих видеоцифровых устройств на основе видеоцифровой камеры: (а) - «Рефлеком-Мини»; (б) - анализатор «Рефлеком»; (в) - «Рефлеком-компакт» и на основе сканера: (г) -разработанная нами система «Эксперт-Лаб».

На рис. 1(а-в) представлены несколько вариантов систем на основе видеоцифровых камер. Обычная система «Рефлеком» (б) позволяет регистрировать результаты иммунохроматографических тестов, матричных дот - тестов в формате 5x6 в режиме отражения и тестов в формате 3x4 в режиме пропускания. Разработанные нами системы «Рефлеком-Компакт» (в) и вариант «Рефлеком-Мини» (а) (решенная в виде моноблока с мини-

компьютером), предназначены для работы с иммунохроматографическими тестами в полевых условиях и являются модификацией исходной системы, работающей с тем же программным обеспечением. Все системы «Рефлеком» в автономном режиме могут питаться от батареи компьютера. На рис. 2 (г) показана разработанная нами система «Эксперт - Лаб» на основе сканера.

Системы получения изображения на основе видеокамер и сканеров имеют свои достоинства и недостатки. Видеоцифровые ПЗС - камеры компактны, позволяют получать качественные изображения, обеспечивают высокую скорость съемки, дают возможность конструировать малогабаритные мобильные и универсальные, чем сканеры, приборы. К недостаткам систем с видеокамерами относятся: небольшое поле зрения и сложность создания равномерного освещения исследуемого объекта.

Сканеры доступны по ценам, дают изображения высокого разрешения, обладают хорошей цветопередачей. Из-за больших размеров и требований к электропитанию они используются в основном только как стационарное оборудование.

Существенным достоинством системы «Эксперт - Лаб» является возможность работы с широко распространенными лабораторными тестами, проводимыми в 96-луночных планшетах, изображения которых можно получать в режиме пропускания, а затем вычислять аналитические параметры, относящиеся к каждой из 96 лунок планшета.

Разработка систем ВЦР велась на основе универсального построения программного обеспечения для всех устройств получения изображений. Алгоритмы обработки информации создавались в соответствии с характеристиками конечных результатов для конкретных типов реакций. Благодаря этому подходу удалось создать многофункциональные устройства, способные обеспечивать достоверную и объективную регистрацию результатов широкого спектра клинических лабораторных исследований.

Б. Построение программного обеспечения (ПО) для иммунохроматографических полосок и полосок «сухой химии» с регистрацией в режиме отражения.

В настоящее время одним из важных направлений развития лабораторных иммунологических и биохимических экспресс исследований стали иммунохроматографические тесты и тесты «сухой химии».

На иммунохроматографических (ИХ) тест - полосках в результате исследования предусмотрено появление нескольких линий - контрольной, обозначающей пригодность теста, и тестовых, обозначающих наличие или

отсутствие определяемого аналита. Номенклатура доступных ИХ тестов постоянно расширяется, и почти полностью совпадает со спектром распространенных иммуноферментных определений. Однако в лабораторной диагностике ИХ тесты имеют ограниченное применение из-за проблем, связанных с отсутствием документирования и субъективностью оценки результатов.

Нами разработано программное обеспечение «Видеотест», позволяющее документировать и проводить количественную оценку результатов ИХ тестов. На рис. 2 (а) показано выделение рамкой аналитически значимой зоны ИХ полоски и представление в рабочем окне гистограмм интенсивности линий на полоске после проведения теста.

М

78С т к ЖГО

б.

в.

Рис. 2. Фрагменты окон настройки разработанных нами программ обработки результатов ИХ - тестов и тестов «сухой химии», (а) - выделение рамкой аналитического поля ИХ - тест - полоски в окне настройки программы и его изображение в окне программы с гистограммой интенсивностей; (б) -расположение аналитических зон на тест - полоске сухой химии; (в) -рабочее окно представления информации об изменении цвета тест - полоски в ходе реакции с сывороткой крови в кинетическом режиме.

Разработанное ПО дает возможность не только выделить аналитически значимые части изображения («зоны интереса»), которыми являются линии, появляющиеся в результате реакции, но рассчитывать и регистрировать в цифровом виде интегральную интенсивность линий в контрольной и тестовой зонах. Интегральная интенсивность линий, как цифровая характеристика, затем используется во всех дальнейших вычислениях, в частности для оценки результатов. Можно также установить пороговые

значения для автоматического определения положительных или отрицательных результатов теста, или наличия контрольной полосы для подтверждения пригодности теста.

Программа «Видеотест» для ИХ полосок предусматривает сохранение всей аналитической информации в цифровом виде в памяти компьютера, включая исходное изображение аналитической зоны тест - полосок, которое в данном случае является «первичным документом теста» (ПДТ).

Программное обеспечение «Видеотест» является универсальным и может быть адаптировано к любым иммунохроматографическим полоскам. Результаты, полученные при применении программы «Видеотест» для полуколичественных определений на примере простатического специфического антигена (ПСА) приведены далее.

Тест - полоски «сухой химии» для биохимического анализа крови и мочи широко используются в клинической лабораторной диагностике и являются традиционным объектом регистрирующих приборов на основе обычной рефлектометрии. Однако и для этих объектов видеоцифровая регистрация обладает рядом преимуществ. На рис. 2(6) и 2 (в) показаны расположение аналитической зоны («зона интереса») и компенсации на изображении тест - полоски и окно представления информации об изменении цвета тест - полоски в кинетическом режиме, соответственно.

Каждая «зона интереса» и изображение каждой полоски может обрабатываться независимо и одновременно. Это дает системам ВЦР существенные преимущества перед традиционными рефлектометрическими методами, такие как: 1- сохранение первичного изображения тест - полоски (ПДТ); 2- возможность работать с произвольным количеством независимых каналов регистрации, то есть анализировать несколько полосок одновременно; 3- применимость этого подхода к различным типам тест -полосок в режиме конечной точки и в кинетическом режиме.

Таким образом, с использованием разработанного гибкого ПО для полосок «сухой химии» возможна объективная интерпретация результатов в режиме качественной оценки и получение информации в виде концентраций соответствующих аналитов при количественных определениях.

Для иммунохроматографических полосок и полосок «сухой химии» предусмотрено также сохранение первичной информации о прохождении исследований с возможностью ретроспективного контроля и коррекции ошибочных результатов.

В. Принципы построения ПО для регистрации исследований в 96-луночных планшетах и на основе матричных объектов.

Как было отмечено выше, существенным достоинством систем ВЦР является возможность выделения и независимой обработки информации любого количества зон интереса. То есть, системы ВЦР при соответствующем построении ПО являются многоканальными с произвольным количеством каналов. Особенно эффективным такой многоканальный режим является при работе с объектами, представляющими собой совокупность многих аналитических зон. К самым распространенным в клинических лабораториях объектам такого типа относятся 96-луночные плоскодонные или круглодонные микропланшеты для иммунологических исследований. Широко используются и другие аналитические объекты, представляющие собой упорядоченные матрицы точек, микроматричные («гшсгоаггау») объекты или микрочипы.

С позиции построения интерфейсов ПО такие объекты принципиально не отличаются друг от друга. Получение изображений 96-луночных планшетов из-за их значительных размеров и трехмерной (не плоскостной) геометрии возможно только с помощью сканерной системы «Эксперт-Лаб», в то время как с матричными объектами в микроформате можно применять и анализатор «Реф леком».

Зонами интереса для 96-луночного планшета и для мембраны с матрицей окрашенных точек являются индивидуальные лунки планшета и точки матрицы, соответственно. После получения изображения в каждой из лунок микропланшета и в каждой из точек матрицы с помощью разработанных алгоритмов можно в численной форме определить или оптическую плотность содержимого лунки, или интенсивность окрашивания индивидуального пятна. По этим численным значениям можно определить концентрации соответствующих аналитов.

Более сложные математические процедуры необходимы в тех случаях, когда в результате иммунологических реакций возникают неоднородные объекты. Такие реакции, как реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция латекс - агглютинации, реакции агглютинации эритроцитов приводят к формированию в лунках осадков, характерных для каждого типа исследования, по наличию или отсутствию которых и определяется положительный или отрицательный результат реакции. Для каждого варианта таких исследований разрабатывался свой алгоритм обработки изображения.

Единый принцип построения интерфейсов всех программ, относящихся к матричным объектам, проиллюстрирован на рис. 3 на примере программы для регистрации результатов реакции латексной агглютинации, проводимой на крышке стандартного 96-луночного микропланшета (программа «Эксперт-Лаб Агглютинация»),

Ш ,0 3 ">•' .4 ■ Ч 4 Ф V

эг (СиЬоП) - 4000

00ШШ0Ш0Ш

Отрицательный и положительный контрольный образец (увеличенное изображение)

□______

Ш

ШкШ

Ш

шш

Сохраняемое

первичное

изображение

Численное выражение результатов

программной обработки изображения

Увеличенное изображение лунок с наличием агглютинации (инструмент «лупа»).

Рис. 3. Схема организации основных рабочих окон разработанного нами ПО сканерной системы для регистрации результатов исследований в формате 96-луночного планшета на примере окна программы «Эксперт-Лаб Агглютинация».

В нижнем левом углу компьютерного окна представлено сохраняемое первичное изображение результатов реакции, зафиксированное в строго заданный методикой момент времени. Сохранение исходного изображения в цифровом формате обеспечивает ретроспективный контроль результатов, возможность консультаций, выявление ошибок, связанных с «человеческим фактором», что особенно важно для тестов с визуальной оценкой результатов. В левой верхней части экрана отображены данные автоматической интерпретации результатов с возможным обозначением цветом.

Помимо этих возможностей, существенное значение имеет применение компьютерного редактирования цифровых изображений. Любая часть

изображения может быть контрастирована, помещена в отдельное окно, увеличена. Все это позволяет оператору быть более объективным при визуальной оценке результатов, так как изображение фиксируется в строго определенный момент времени. Этот последний факт особенно важен для таких быстро протекающих реакций как латексная агглютинация. При необходимости, можно одновременно вывести на экран увеличенное изображение нескольких проб (положительный и отрицательный контроль).

Численная характеристика агглютинации также выводится на экран (рис.3, справа вверху), обеспечивая дополнительной информацией для принятия верного решения.

Результаты агглютинационных иммунологических реакций традиционно учитываются визуально, и применение систем ВЦР с сохранением и компьютерной обработкой информации существенно повышает достоверность таких исследований.

Подробное описание специализированных пакетов программ для регистрации результатов клинических лабораторных исследований на основе матричных объектов и результаты оценки характеристик применения ПО в сочетании с видеоцифровыми системами получения изображений приведены далее.

2. Оценка характеристик видеоцифрового аппаратно-программного комплекса «рефлеком» для регистрации результатов иммунохроматографических тестов и тестов «сухой химии»

А. Определение общего простатического специфического антигена на основе ИХ-тестов с регистрацией аппаратно-программным комплексом «Рефлеком».

Простатический специфический антиген (ПСА) считается эффективным маркером для дифференциальной диагностики рака предстательной железы (РПЖ) и доброкачественной гиперплазии простаты (ДГПЖ), а также для контроля эффективности лечения РПЖ. ПСА в незначительных концентрациях присутствует в крови здоровых людей. Уровень ПСА в крови ниже 4 нг/мл считается нормальным, концентрация от 4 до 10 нг/мл - зона риска. В настоящее время определение общего ПСА с успехом используется для скрининговых обследований. Одним из наиболее доступных вариантов порогового определения общего ПСА являются ИХ -тесты.

Традиционные лабораторные иммунологические методы определения ПСА требуют дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного

персонала. Система на основе ИХ тест - полосок и видеоцифрового анализа позволяет проводить с достаточной достоверностью скрининговые обследования на ПСА и может существенно повысить доступность и широту внедрения скринингового обследования.

На рис. 4 (а) показаны типичные регистрируемые картины аналитических полей ИХ - тестов фирм «Alfa Scientific Design» для сывороток с различным содержанием ПСА.

I

ЛJ

:

График соответствия интенсивности концентрации ПСА (коэффициент корреляции = 0,92, р<0,05)

ПСА, нг/мл, Делфия

а. б.

Рис. 4. (а) Изображения аналитических полей и гистограмм ИХ-полосок фирмы «Alfa Scientific Design» для сывороток с содержанием ПСА 10 нг/мл (вверху) и менее 3 нг/мл (внизу); (б) Сопоставление данных интенсивности окрашивания тестовой полосы (интегральной величины левого пика гистограмм на рис 4 (а) в условных единицах и концентрации ПСА образцов сывороток крови.

При концентрациях ПСА около 10 нг/мл все тесты обычно показывают две хорошо различимых линии. В этих случаях визуальная интерпретация не вызывает проблем, и это характерно для большей части сывороток при концентрациях ПСА выше 6-7 нг/мл. Однако при значениях концентрации ПСА около порогового значения (3-4 нг/мл), где трудно определить наличие или отсутствие тестовой полосы, интерпретация теста затруднена. В ситуациях с неоднозначным результатом, безусловно, необходимо сохранение первичного документа о проведенном исследовании. Применение видеоцифровой регистрации приближает ИХ-метод по диагностической ценности к более сложным лабораторным методикам.

На рис. 4 (б) приведены результаты измерений концентрации ПСА в исследуемой панели сывороток на анализаторе «VICTOR 1420» с наборами

«Дельфия» в сопоставлении с данными интегральной интенсивности полос ИХ - тестов фирмы «Alfa Scientific Design». Показаны результаты для сывороток, уровень ПСА, в которых по данным референсного метода, был выше 4 нг/мл.

Результаты показывают высокую степень взаимосвязи между методами (г =0,92, при р<0,05). Приведенные данные позволяют сделать вывод, что иммунохроматографический анализ с видеоцифровой регистрацией является адекватным и достоверным методом. Такой метод может быть вариантом выбора для скрининга, так как не требует условий оснащенной лаборатории, обученного персонала и легко реализуется при выездных обследованиях.

Б. Биохимические исследования крови на основе тестов «сухой химии» с применением аппаратно-программного комплекса «Рефлеком-БХК».

Программно-аппаратный комплекс «Рефлеком-БХК» на основе ВЦР был разработан для измерения ряда биохимических параметров с использованием тест - полосок «сухой химии» производства фирмы «Аркрей» (Япония) для применения в условиях орбитальной станции.

В разработанном комплексе использовалась регистрация изменений цвета и/или интенсивности окрашивания аналитических зон тест - полосок при нанесении на них образцов сыворотки крови или плазмы. Из-за необходимости регистрации результатов в широком спектральном диапазоне, изображение аналитических зон тест - полосок осуществлялось с помощью освещения в различных длинах волн видимой части спектра. Невозможность применения автоматизированных систем в условиях невесомости обусловила необходимость нанесения образцов сыворотки на тест - полоски с помощью обычных микродозаторов. Для сокращения времени проведения анализа по многим параметрам использовался многоканальный вариант регистрации, обеспечивающий одновременное проведение реакции на 8-ми тест -полосках:

Применена модифицированная конструктивная схема прибора «Рефлеком», адаптированная по размерам поля зрения видеокамеры и спектральным характеристикам освещения. Система позиционирования обеспечивает размещение 8 тест-полосок и поддержание постоянной температуры 37°С в аналитической зоне. ПО «Рефлеком-БХК» позволяет автоматически получать изображения аналитических зон тест-полосок той или иной видеокамерой, в зависимости от типа определяемого параметра и обрабатывать изображения с получением соответствующих значений концентраций аналитов. Данные по сходимости при измерении контрольной сыворотки фирмы «Аркрей» с регистрацией результатов на анализаторе

«Рефлеком-БХК» суммированы в таблице 1. Обращает на себя внимание, что практически по всем аналитам СУ не превышает ПДЗ СУЮ согласно приказу МЗ РФ № 45 от 07.02.2000 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

Таблица 1. Данные измерений контрольной сыворотки (диапазон паспортных значений приведен в таблице) на ВЦР анализаторе «Рефлеком-

БХК».

Название теста Паспортные значения Единицы измерения Среднее значение (Хер) Коэффициент вариации (CV, %) ПДЗ коэффициент вариации (CV10,%) (приказ № 45)

АЛТ 210-314 МЕ/л 260,4 4,3 16,0

ACT 201-301 МЕ/л 275,8 13,5 11,0

Амилаза 285-427 МЕ/л 351,3 10,9 11,0

ГГТ 222-332 МЕ/л 289,8 9,1 11,0

КФК 367-551 МЕ/л 437,4 9,9 22,0

лдг 965-1447 МЕ/л 1193,2 9,2 11,0

Общий холестерин 3,04-4,56 ммоль/л 3,8 0,7 8,0

Три-глицериды 1,45-2,17 ммоль/л 1,4 . 3,2 16,0

ЛПВП 0,29-0,69 ммоль/л 0,5 3,8 8,7

Глюкоза 173-211 ммоль/л 10,5 1,6 5,0

Фруктоз-амин 455-637 мкмоль/л 553,4 3,2 4,2

Альбумин 22-34 г/л 28,3 3,3 4,0

Общий билирубин 60-90 мкмоль/л 75,9 2,5 16,0

Мочевина 13,1-19,7 ммол/л 16,8 1,2 11,0

Мочевая к-та 352-528 мкмоль/л 445,9 1,9 8,0

Са 2,99-4,49 ммоль/л 3,7 1,6 з,з

Mg 0,82-1,23 ммоль/л 1,1 1,8 7,0

Неорганический фосфор 1,27-1,9 ммоль/л 1,5 1,6 8,0

3. Оценка характеристик аппаратно-программного комплекса

«эксперт-лаб» для регистрации иммунологических исследований в формате стандартного 96-луночного и разработанного 12-луночного планшета

В этом разделе приводятся данные исследований применения разработанной нами системы «Эксперт-Лаб» на основе сканера с различными типами специализированного ПО для регистрации результатов иммуноферментного анализа (ИФА), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и латексной агглютинации (ЛА) в формате стандартного 96-луночного планшета и латексной агглютинации (ЛА) в формате 12-луночного планшета,

А. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа в 96-луночных микропланшетах.

Разработанный нами аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с ПО «Эксперт-Лаб ИФА» может быть с использован в качестве вертикального фотометра для микропланшетов при проведении ИФА. Он не уступает по характеристикам высококлассным фотометрам с расширенными опционными возможностями. Оценка характеристик регистрации результатов ИФА с применением комплекса «Эксперт Лаб» была проведена в сопоставлении с данными анализатора «VICTOR 1420» («Wallac», Финляндия) при длине волны 450 им. Воспроизводимость двух систем сопоставлялась при многократных измерениях набора фильтров КПА-01 для метрологической поверки вертикальных фотометров. Полученные коэффициенты вариации во всем диапазоне оптических плотностей для обоих приборов не превышали 1%.

Следующим этапом работы являлась апробация аппаратно-программного комплекса для обычных задач ИФА в КДЛ. На рис. 5. представлены данные измерений значений ОП модельного планшета, полученные с помощью аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и на анализаторе «VICTOR 1420». Очевидно полное совпадение результатов в диапазоне оптических плотностей от 0 до 3 оптических единиц (коэффициент корреляции по Спирмену - 0,999). При значениях оптических плотностей выше 3,0 прибор «VICTOR» выходит за паспортный предел измерений, который для него составляет 3,0, а сканер позволяет измерять и такие значения оптической плотности.

Количественные методы лабораторных измерений подразумевают построение калибровочной кривой и определение по ней концентрации аналитов. Программа «Эксперт-Лаб ИФА» позволяет вводить значения калибраторов, строить калибровочную кривую и определять значения концентраций исследуемых веществ. Для применяемых в лабораторной практике вариантов количественных определений ИФА были проведены сопоставления значений концентраций для различных схем постановки реакций.

Оптическая плотность модельного планшета, измеренная на " Victor" и "Эксперт-Лаб".

4.5 4,0 3.5

£ 3,0

I

I

5

|»

I м

о

1.0 0,5 0.0

0 20 40 60 80 100 • Victor

□ Scaner

N9

Рис. 5. Сравнение значений ОП, полученных с помощью разработанного нами аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и на анализаторе «VICTOR 1420».

Данные сопоставительных исследований приведены в таблице 2. Уравнения регрессии и коэффициенты корреляции для различных типов иммуноферментных реакций: количественный конкурентный (свободный тироксин, трийодтиронин, ДЕА-S), количественный «сэндвич» (антитела к ТПО и ТГ, ТТГ), качественный с определением «cut off» (антитела к Chlamidia trachomatis класса G, HBsAg) демонстрируют статистическую неразличимость данных, полученных с помощью двух систем регистрации.

Предлагаемое для сканерной системы ПО дает возможность разных вариантов обсчета и представления получаемой информации во всех режимах измерения (оптические плотности, вариант «cut off», измерение концентраций). Программа обеспечивает удобную предварительную разметку планшета, гибкие варианты распечаток.

Таблица 2. Статистическая проверка сопоставимости концентраций аналитов, измеренных на фотометре и сканере. _

Аналит Уравнение Регрессии Коэффициент Корреляции

Антитела к ТПО у = 1,0274х-2,6629 0,968

Антитела к ТГ у = 0,9994х-0,7105 0,843

ТТГ у =1,0016х +0,0521 0,999

Свободный тироксин у = 1,0047х-0,3034 0,995

Трийодтиронин у = 0,9917х-0,4691 0,942

ДЕА-S у = 1,1354х -0,1163 0,998

Антитела к Chlamidia у = 0,9117х+0,1691 0,999

trachomatis класса G

HbsAg у = 0,8919х+0,171 0,999

На основе анализа изображения лунок для ПО «Эксперт-Лаб ИФА» разработана опция автоматического выявления лунок, имеющих неоднородную окраску, которые отмечаются в итоговом протоколе анализа. Эта уникальная функция, принципиально недоступная для обычных фотометров, дает возможность выявить неправильные измерения, часто имеющие место, например, для гиперактивных образцов, измерение которых приводит к выпадению субстрата в осадок из-за повреждений поверхности лунок и других ошибок проведения ИФА определений. Применение функции выявления лунок с негомогенной окраской показано на рис. 6.

Рис. 6. Пример выявления лунок с негомогенной окраской с помощью ПО «Эксперт-Лаб ИФА» (увеличенное изображение и выделение лунки А12 с неоднородной структурой).

Кроме того, сканерная система позволяет сохранять первичное изображение планшета, что обеспечивает ретроспективный контроль для любых спорных, требующих повторного анализа, ситуаций.

Таким образом, полученные результаты показывают, что аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с соответствующим ПО может использоваться в качестве вертикального фотометра, причем предоставляет пользователю ряд преимуществ, принципиально недоступных для обычных фотометров.

Б. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакции агглютинации желатиновых частиц.

Для регистрация результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) разработка алгоритмов ПО («Эксперт-Лаб РПГА») проводилась по экспериментальным данным, полученным при применении трепонемных эритроцитарных диагностикумов для скрининга наличия антител к Treponema pallidum.

Основное окно программы построено по описанному выше принципу с представлением сохраняемого первичного изображения, расчетных оценок интенсивности реакции в каждой лунке, данных автоматической интерпретации результата реакции для каждого образца. Предусмотрена опция вывода на экран увеличенных изображений любых лунок, обеспечивающая возможность более объективного заключения о прохождении реакции.

Для изучения характеристик разработанной системы регистрации результатов РПГА было исследовано 9964 сыворотки, из них 381 образец (3,8%) имел положительный результат РПГА, 75 образцов (0,75%) были сомнительными.

Наличие численной оценки интенсивности реакции на основании рассчитанных целевых значений позволяет вести контроль качества. Для этого использовали лиофилизированную сыворотку (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), выпускаемую для внутрилабораторного контроля качества. На рис. 7 приведен пример контрольной карты. Для расчета CV и построения контрольной карты вычисляли коэффициент позитивности (КП -интенсивность агглютинации пробы/интенсивность агглютинации отрицательного контроля). Целевые значения составили: Хер = 3.1, SD = 0.57, CV2o= 18%.

РПГА с ВЦР, построенная на основе числовой оценки интенсивности реакции.

Сравнение визуального и инструментального учета результатов РПГА разработанной системой показало высокий уровень корреляции получаемых результатов (К Спирмена 0,999, р =0,00005).

Были проведены эксперименты по сопоставлению автоматического учета и оценки результатов четырьмя опытными операторами, которые продемонстрировали субъективность при визуальном учете результатов РПГА. Процент расхождений оценок операторов при визуальной оценке РПГА составил от 2% (отрицательные результаты) до 47% (результаты +/-). В отличие от визуальной оценки, программа «Эксперт-Лаб РПГА» полностью формализует представление результатов степени выраженности агглютинации, не меняющихся при повторных оценках планшетов, то есть позволяет объективизировать учет результатов.

Для регистрации результатов реакции агглютинации желатиновых частиц был разработан вариант программного обеспечения «Эксперт-Лаб БегоШа» и продемонстрирована возможность использования этой модификации программы для тест-систем на основе сенсибилизированных желатиновых частиц фирмы «ЗегосНа» для определения антител к вирусу гепатита С, ВИЧ 1 и 2, антител к Тг.раШёит (ТРРА), РФ, АСЛО, антистрептокиназы. Для таких и аналогичных тест-систем также важна объективизация результатов анализа.

На рис. 8 в качестве примера показаны лунки с положительными, сомнительными и отрицательными результатами реакции агглютинации при исследовании на антитела к Тг.раШёшп, к НСУ.

Определяемый аналит Результат реакции агглютинации желатиновых частиц.

+ +/- -

Антитела к Tr.pallidum ЕЙ:...: Щ С-Э id СВЕТ d

Антитела к HCV шт * С

Рис. 8. Изображения положительных (+), сомнительных (+/-) и отрицательных (-) результатов определения антител к Tr.Pallidum, HCV в тестах агглютинации желатиновых частиц фирмы «Serodia».

Для проверки совпадения результатов РПГА и ТРРА с применением ВЦР было параллельно исследовано 46 положительных и 46 отрицательных проб. Обработка результатов привела к регрессионной кривой: RPGA = 1,3381 + 0,94618 * Serodia, R Спирмена 0,93, что подтверждает соответствие результатов двух этих методов.

В. Применение и характеристики комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции латексной агглютинации.

Исследования латексной агглютинации в формате 96-луночного планшета проводили на прозрачных крышках 96-луночного планшета, где лунки отделены друг от друга бортиками (фирмы "Costar", США). Стандартный способ проведения реакции латексной агглютинации (ЛА) подразумевает использование непрозрачных карточек со специальными реакционными полями, на которых смешивается по 50 мкл латексного реагента и исследуемого образца, результат оценивается визуально через 2-3 минуты. Для ВЦР с комплексом «Эксперт-Лаб» использовалось измерение в режиме пропускания с проведением реакции в крышках планшетов. Расход реагентов и сывороток при этом составлял не более 10 мкл, то есть снизился в 4-5 раз по сравнению со стандартной методикой. Полученное первичное изображение всей крышки сохраняется в памяти компьютера и служит основой для последующих цифровых операций с конкретными «зонами интереса» (контрастирование, увеличение, математическая обработка). Основное рабочее окно программы «Эксперт-Лаб Агглютинация» показано ранее на рис.3.

В качестве модели для оценки характеристик реакции ЛА с видеоцифровой регистрацией было выбрано определение СРБ, РФ и АСЛО. На рис. 9 показаны увеличенные изображения лунок с наличием агглютинации при определении СРБ, РФ, АСЛО, причем видно, что морфология конгломератов различается для разных латексов.

Рис. 9. Изображения лунок с положительными образцами (наличием агглютинации) при определении СРБ, РФ, АСЛО, соответственно.

Разработанное ПО предоставляет возможности программной обработки полученного изображения для облегчения визуальной оценки степени выраженности ЛА, такие как контрастирование, одновременный анализ на экране увеличенных изображений отдельных лунок для тестируемой сыворотки и контролей, показ аналогового представления количества образовавшихся комплексов. На рис. 10 проиллюстрировано применение этих опций на примере определения СРБ.

I щ | :

ш

а б в

Рис.10. Изображения лунок с тестируемыми положительной (А8) и отрицательной (А9) сыворотками: (а) исходное, (б) после контрастирования, (в) результаты математической обработки, отражающие количество конгломератов.

Результаты расчета количества конгломератов в образцах выражаются числом, отражающим интенсивность реакции и, таким образом, дают возможность количественной оценки результата реакции агглютинации и

определения порогового значения для автоматической дискриминации положительных и отрицательных образцов, что снижает влияние случайных и системных ошибок на результат лабораторного исследования.

Аналитические характеристики разработанного метода ЛА с видеоцифровой регистрацией исследовали с использованием контрольных сывороток фирмы «Яапёох» трех уровней концентраций и латексов фирмы «Вю8у81е1Ш». Для расчета сходимости и воспроизводимости использовали численные значения интенсивности агглютинации, полученные в ходе программной обработки. Полученные данные представлены в табл. 3.

Таблица 3. Данные по сходимости и расчетные значения целевых значений

Концентрация CV20, CVbc, CV по Средние значения

по паспорту % % данным интенсивности по

Контролей произво- 1 дителя,% 20 определениям (Хср±т)

СРБ (мг/л) 25

Level 1 21,8-29,6 12,2 16,9 18257+686

Level 2 44,7 - 60,5 11,8 13,7 29242±892

Level 3 66,6-90,0 9,2 12,0 39060±1046

РФ МЕ/мл 25

Level 2 32,2-48,4 7,3 7,6 27996±476

Level 3 45,0-67,6 9,3 11,3 41802±1053

АСЛО МЕ/мл 20

Level 3 309 - 399 10,2 15,1 12451 ±416

Обращает на себя внимание, что для всех аналитов СУ2о меньше заявленного для полуколичественных латексных тест-систем. Наличие расчетных цифровых результатов агглютинационных тестов при видеоцифровой регистрации позволяет также проводить внутренний и внешний контроль качества при выполнении исследований методом латексной агглютинации, что, принципиально невозможно при визуальном учете.

Расчет минимальной определяемой концентрации исследуемых веществ (аналитическая чувствительность) метода ЛА с ВЦР, проводился методом двукратных разведений контрольных сывороток и составил для СРБ-6,7±2,3 мг/л, РФ-10,4+3,4МЕ/мл, АСЛО-268±79МЕ/мл. Оценку правильности метода проводили на положительных образцах сывороток при двукратных разведениях для получения значения концентрации

исследуемых аиалитов. Параллельно они исследовались на анализаторе Аи 640, фирмы «ОИтрш СогрогаНоп». При сравнении полученных данных для СРБ (п=28) и РФ (п=38) коэффициенты корреляции (Я) Спирмена составили 0,90 и 0,95 соответственно.

Результаты определения СРБ, РФ и АСЛО с помощью системы «Эксперт-Лаб-агглютинация и визуальной оценкой приведены в таб.4.

Таблица 4. Результаты определения СРБ, РФ и АСЛО с помощью системы «Эксперт-Лаб» в сопоставлении с данными визуальной регистрации._

Исследуемый аналит Регистрация результата Кол-во образцов % несовпадении

всего отрицат. положит.

СРБ Визуально 237 174 63 9,7

ВЦР 237 193 44

РФ Визуально 174 94 52 1,1

ВЦР 174 95 51

АСЛО Визуально 77 60 17 6,5

ВЦР 77 61 16

Сопоставление визуальной и инструментальной оценки протекания реакции ЛА для 488 исследуемых образцов ЛА выявило 34 случая несовпадения полученных результатов из-за ошибок оператора.

Доступность объективного метода контроля качества лабораторных исследований при применении такого широко распространенного метода, как латексная агглютинация, имеет важное практическое значение.

Разработанная методика проведения реакции латексной агглютинации в формате 12-луночных микропланшетов позволяет еще более снизить количество реагентов и образцов, необходимое для проведения исследований этим методом. Для реализации этой задачи был разработан специальный планарный носитель - 12-луночный микропланшет для применения с системой ВЦР. Изображение такого микропланшета в исходном состоянии (а) и с нанесенными смесями латексного реагента и проб сыворотки (б) представлено на рис. 11.

Увеличенное изображение

зоны тестируемого образца

а б

Рис.11. Микропланшет формата 3x4 в исходном состоянии (а) и заполненного пробами и реагентами при проведении реакции латексной агглютинации (б).

Рабочее окно программы для исследований в 12-луночном микропланшете при проведении реакции латексной агглютинации показано на рис.12.

Сетке Порог (

А м

Численное представление результатов программной

обработки изображения

Рис. 12. Основное окно программы «Эксперт-Лаб Агглютинация» при регистрации результатов реакции в 12-луночном микропланшете (формат 3x4) с использованием 3 мкл латексной смеси.

Разработанные микропланшеты с лунками в формате матрицы 3x4, имеют дистанции между лунками, аналогичные 96-луночному планшету и глубину лунки, оптимальную для получения изображения в режиме пропускания в системе «Эксперт-Лаб» или «Рефлеком». Рабочий объем лунок составляет 10-15 мкл, что позволяет уменьшить объем реагента и проб до 2-3 мкл и 5-10 мкл при проведении реакции ЛА, соответственно. При проведении реакции в 12-луночных микропланшетах получены данные,

полностью совпадающие с результатами при проведении реакции в крышках 96-луночных микропланшетов. Снижение требуемого объема реагента в 1020 раз особенно важно для латексных тестов с дорогостоящими реагентами (например, теста для определения Д-димера).

4. Разработка комплексных систем проведения

иммунологических и клинических биохимических исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией

Видеоцифровая регистрация создает основу для развития принципиально новых методик исследований на основе применения микрометодов. 12-луночный микропланшет является полезным промежуточным форматом исследований. Он обеспечивает значительное снижение объемов реагентов и образцов и может быть использован с применением стандартного дозирующего оборудования с визуальной регистрацией. Дальнейшее снижение объемов реакционных смесей требует разработки полных специализированных систем, обеспечивающих как проведение анализа (дозирование, смешивание), так и регистрацию результатов, поскольку в диапазоне объемов менее 1 мкл обычные пипетки и традиционная фотометрия или визуальный учет результатов не применимы.

Для проведения различных лабораторных исследований в объемах реакционной смеси менее 1 мкл был разработан полный аналитический комплекс, применение и оценка эффективности которого для реализации различных лабораторных исследований описываются в данном разделе.

А. Разработка и характеристики систем позиционирования-смешивания матриц микрокапель на планарных носителях.

Была разработана простая, применимая в клинической лаборатории система серийного нанесения микроколичеств образцов в виде упорядоченной матрицы точек для любых планарных носителей. В системе использован принцип пинового нанесения исследуемых образцов. Этот метод основан на погружении в образец пина (микростержня) с последующим переносом формирующейся на пине микрокапли на мембрану. Очевидно, что объем микрокапли образца зависит от свойств анализируемой жидкости, материала и размера пина, типа мембраны, что определяет размер окрашенных точек на конечной фазе анализа.

Задача нанесения на планарный носитель воспроизводимых по объему капель образцов в виде упорядоченной матрицы была решена путем разработки многопиновых систем, включающих микропланшет для внесения образцов и соответствующий мультиаппликатор (Рис.13).

■, ■ .

,..............,,,„|,„т " ^{1Т!Щ!]ШрТ|ТПТПШр

0 12 3 0 12 3

а б

Рис. 13. Внешний вид разработанных нами многопиновых систем с аппликаторами различных форматов и планшетами для образцов: (а) -аппликатор формата 6x2 с шагом 2,4 мм; (б) - аппликатор формата 6x5 с шагом 4,4 мм. Приведены изображения нитроцеллюлозных мембран после нанесения модельного антигена в различных концентрациях после проявления конъюгатом моноклональных антител с пероксидазой.

Для систем пинов, формирующих матрицы с дистанциями между точками менее 3 мм, была разработана специальная конструкция микропланшета с лунками грушевидной формы. Аппликатор на рис. 13 (б) выполнен из нержавеющей стали и позволяет формировать матрицы точек с расстояниями между точками 4,4 мм. В комбинации с разработанным микропланшетом с 30-лунками (формат 5x6) аппликатор позволяет наносить на плоскую поверхность одновременно 30 образцов. Аппликатор на рис.13 (а), представляющий собой два ряда пинов в пластиковом держателе, позволяет создавать матрицы точек с расстоянием 2,4 мм между их центрами. Для дальнейших исследований использовалась система на основе 30-пинового аппликатора формата 5x6 с шагом 4,4 мм и толщиной пинов 1,0 - 1,5 мм. Объем капель, переносимых аппликатором, в зависимости от толщины пинов составляет 0,2- 0,5 мкл.

В результате исследований параметров пинового нанесения микрокапель нами были созданы системы позиционирования-смешивания, обеспечивающие жесткую фиксацию положения аппликатора по отношению к планарному носителю. Такая система обеспечивает быстрое и точное нанесение матриц микрокапель на носитель, а также возможность смешивания реагентов и образцов в каждой точке матрицы. Система позиционирования-смешивания представляет собой блок с тремя

шш

• » • '

отделениями, специальные микропланшеты с лунками объемом 10-15 мкл, предназначенные для образцов и реагентов и аппликаторы с тридцатью пинами (рис 14).

Рис. 14. Система позиционирования-смешивания - разработанное устройство для нанесения и смешивания реагентов и образцов.

Для проведения реакций со смешиванием компонентов в первые два отделения вставляются планшеты с образцами и реагентами, а в третье -предметное стекло, на котором производится смешивание микрокапель. Принцип использования системы для формирования матриц микрокапель и проведения реакций на планарном носителе в микроформате схематично показан на рис. 15.

Для формирования на носителе матрицы микрокапель исследуемых образцов сыворотки или мочи из микропланшета пинами аппликатора забирают капли жидкости (а-б), которые перемещают на носитель с помощью позиционера (в-г). Такой вариант используется при проведении исследований, не требующих смешивания реагентов в ходе анализа (иммунодот-тесты на мембране, тесты «сухой химии»).

Для проведения исследований со смешиванием реагентов и образцов в матричном формате сначала формируют на стекле матрицу микрокапель реагента (как на рис.16), а затем из микропланшета для образцов аппликатором забирают капли образца (шаги (д-е), рис.15), которые с помощью позиционера помещают на носитель так, чтобы каждая наносимая капля образца смешалась с каплей реагента, уже находящейся на носителе (шаг (ж) рис.15). В третьем отделении позиционера микрокапли тщательно перемешиваются с помощью аппликатора.

к

ЦПГТГ

/

/

/ г

_И/ ^

Рис. 15. Схема формирования матрицы микрокапель (а-г) и проведения реакции агглютинации со смешиванием компонентов в точках матрицы на носителе (а-ж).

Носитель (предметное стекло) с нанесенными с помощью позиционера микрокаплями, расположенными в виде матрицы 5x6, показан на рис. 16.

Рис. 16. Матрица микрокапель жидкости, созданная с помощью системы позиционирования-смешивания.

После прохождения соответствующих реакций на мембранах, тест-полосках или микрокаплях на стекле получают изображение объекта с помощью ВЦР системы, которое обрабатывается соответствующим ПО для получения результатов.

Применение системы позиционирования-смешивания с ВЦР позволило создать новые варианты проведения лабораторных исследований в матричном формате.

Б. Разработка мембранных тестов в микроформате с видеоцифровой регистрацией.

Серийное определение альбумина в моче в микроформате - тест на микроальбуминурию проводили по схеме прямого твердофазного иммуноферментного анализа. При этом пробы мочи наносили с помощью разработанного аппликатора на мембраны, а затем альбумин в пробах выявлялся с помощью конъюгата генно-инженерного рецептора альбумина или антител к альбумину с пероксидазой.

Были подобраны типы используемых нитроцеллюлозных мембран, параметры иммунологической системы детекции, такие как концентрация конъюгата, время и условия инкубации, состав блокирующего буфера и др. После формирования матрицы микрокапель образцов мочи на мембране и проведения всех процедур иммуноферментного анализа результаты анализировали с помощью разработанной и адаптированной к данному типу анализа программы «Видеодот».

На рис. 17 показаны результаты сопоставления данных определения альбумина в моче разработанным методом серийного дот-анализа и методом иммуноферментного анализа для 67 образцов мочи от здоровых людей и пациентов с сахарным диабетом. Данные демонстрируют удовлетворительное совпадение двух методов во всем диапазоне концентраций альбумина в моче у обследованного контингента больных.

Концентрация альбумина методом дот-анализа с ВЦР и ИФА дот-анализ с ВЦР = 0,4094+0,9535*ИФА; 0,95 ДИ

ИФА

Рис. 17. Сопоставление результатов определения альбумина методом дот-анализа с ВЦР (мембрана "Schleicher & Schull") и ИФА с использованием тест-систем фирмы «Orgentic» (Германия) и анализатора «VICTOR 1420».

Чувствительность определения альбумина в моче составляла 10-20 мг/л. Исходя из того, что признанное пороговое значение концентрации альбумина для выявления микроальбуминурии составляет 30 мг/л, можно сделать вывод, что тест на микроальбуминурию с ВЦР в этом формате обладает достаточной чувствительностью для использования на практике.

Серийное определение концентрации глюкозы в микроформате в цельной крови и сыворотке проводили с использованием мембран «сухой химии» «Меридиан» фирмы «ИОР» (Австралия). На мембрану с помощью описанной системы позиционирования наносили в виде упорядоченной матрицы микрокапли цельной крови с антикоагулянтом или сыворотки крови. Результаты измерений концентрации глюкозы в единицах ммоль/л получали с помощью модифицированной для этого типа анализа программы «Эксперт-Лаб Видео дот».

Так как с помощью аппликатора на мембрану переносятся сразу 30 образцов крови или сыворотки крови, а время проявления и анализа цветовых пятен на мембране составляет не более 90 секунд, предлагаемый метод отличается высокой производительностью. Вся процедура анализа 30 образцов (после заполнения планшета образцами) занимает не более 2-3 минут, причем результаты, представляются и сохраняются в электронной форме.

Были проведены исследования аналитических характеристик разработанного метода. Воспроизводимость метода изучали при повторных измерениях контрольных сывороток. Эти данные представлены в таблице 5. Таблица 5. Данные по воспроизводимости результатов определения

концентрация глюкозы в контрольных сыворотках, ммоль/л Внутрисерийная воспроизводимость Межсерийная воспроизводимость

Хер, ммоль/л 8 СУвс,% Хер, ммоль/л СУмс,%

4,13-5,7 4,85 0,13 2,79 4.82 0,19 3,86

5,30-7,16 6,15 0,19 2,99 6,11 0,25 4,01

13,1-17,7 15,36 0,47 3,08 15,36 0,68 4,45

Каждая из сывороток была измерена 10 раз в одной серии и 20 раз в различных сериях. После этого были рассчитаны серийный и межсерийный коэффициенты вариации для каждой выборки. Рассчитанный коэффициент вариации оказался меньше предельно допустимого его значения (СУ=5%), что доказывает хорошую сходимость и воспроизводимость результатов. Все

полученные результаты концентраций сывороток попали в интервалы, которые указаны в паспортах сывороток.

Минимально определяемая разработанным методом концентрация глюкозы составила 2,1 ммоль/л. При более низких концентрациях результаты были статистически недостоверны. Оценка чувствительности (разрешающей способности) методики, проведенная на контрольных сыворотках методом добавок показала, что она составляет от 0,1 до 0,3 ммоль/л для низких и высоких концентраций глюкозы.

На рис. 18 представлены данные сопоставления результатов определения глюкозы сыворотки крови методом серийного дот-анализа и референсным глюкозооксидазным методом на анализаторе «AU400» (Olympus, Япония). Очевидна низкая дисперсия результатов, что говорит о хорошем совпадении результатов.

Концентрация глюкозы методом дот-анализа с ВЦР и на Olympus AU-640

Olympus, ммоль/л

Рис. 18. Сопоставление результатов определения глюкозы крови методом дот-анализа и глюкозооксидазным методом на анализаторе «AU400» (Olympus, Япония).

Представленные данные показывают, что предлагаемый микроматричный метод серийного определения концентрации глюкозы по своим аналитическим характеристикам может применяться в практике лабораторных исследований.

В.Тесты со смешиванием образцов и реагентов в микроформате.

Тесты на основе реакции латексной агглютинации проводили по схеме, приведенной на рис. 15. Сначала пинами аппликатора из лунок планшета, содержащего латексную суспензию на носитель (обезжиренное предметное

стекло) переносили капли реагента объемом 0,5 мкл с формированием упорядоченной матрицы рис.15 (а-г). Затем такую же операцию проводили, погружая пины другого аппликатора в лунки планшета с образцами и контролями рис.15 (г-ж), и в каждой точке матрицы с помощью аппликатора латексный реагент смешивается с образцом рис.15 (з). Через 120-150 секунд получали изображение стекла с матрицей смеси реагентов и образцов в режиме пропускания с помощью системы «Эксперт-Лаб».

Фотография носителя с матрицей прореагировавших с латексной суспензией образцами показана на рис. 19. На увеличенном сканерном изображении двух рядов матрицы (на врезке на рис. 19) хорошо различима неоднородная структура положительных проб.

Рис. 19. Фотография носителя с проведенной на нем реакцией латексной агглютинации в разработанной нами системе позиционирования-смешивания. Обозначено стрелкой увеличенное сканерное изображение двух рядов матрицы с различимой неоднородной структурой положительных проб.

Для регистрации результатов агглютинационных тестов в микроформате использовали специально разработанное ПО «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро».

На рис. 20 представлено основное окно программы «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро», содержащее исходное изображение аналитических зон матрицы, с количественной оценкой результатов реакции агглютинации и протоколом анализа и дискриминацией положительных и отрицательных результатов по пороговому значению. Продемонстрирована имеющаяся для всех программ возможность анализа увеличенных изображений аналитических зон, соответствующих контролям и исследуемому образцу. Данный способ проведения реакции агглютинации позволяет избежать ошибок при серийных постановках, связанных с высокой скоростью

прохождения реакции, так как образцы и контроли наносятся одновременно и время инкубации строго одинаково на момент регистрации результатов.

Сопоставление результатов, получаемых с помощью разработанного микроматричного метода проведения исследований ЛА, с результатами традиционных макрометодов показало полное совпадение аналитических характеристик двух методов.

Предлагаемый новый способ постановки реакции ЛА обеспечивает одновременное проведение реакции для 30 образцов, в 10-30 раз снижает потребление латексных реагентов, предоставляет возможность объективной оценки и документирования результатов исследований.

Производительность и экономичность проведения определений разработанным методом может сделать доступными любые скрининговые обследования на основе реакции ЛА.

Увеличенное изображение зоны контрольного образца

Численное представление результатов программной

обработки изображения

Протокол анализа и компьютерная обработка результатов

¡Шт. Ш.

ш ш

Сохраняемое

первичное

изображение

т ш

Увеличеное изображение зоны тестируемого образца

Рис. 20. Основное окно и программы «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро».

Оценку характеристик серийных исследований методом латексной агглютинации в микроформате проводили на примере определения СРБ, РФ и АСЛО на контрольных сыворотках и клиническом материале. Для изучения воспроизводимости измерений метода были проведены реакции с контрольными отрицательными и положительными сыворотками с разными

концентрациями определяемых веществ. Коэффициенты вариации для определений аналитов для положительных сывороток представлены в таблице 6. Чувствительность разработанного метода составила, соответственно, 6,8±1,27 мг/л - для СРБ, 10,5±4,1 МЕ/мл - для РФ и 234±57 МЕ/мл - для АСЛО, что совпадает с паспортными данными латексных системы.

Таблица б.Данные по воспроизводимости результатов определения аналитов

Аналиты Концентрация аналита в контрольных сыворотках CV, %, данные производителя cv20, %

СРБ, мг/л 25,7+3,9 25 10

52,6±7,9 5

78,3±11,7 5

РФ, МЕ/мл 40,3±8,1 25 15

56,3±11,3 5

АСЛО, МЕ/мл 354±45 20 15

Для оценки правильности метода были проанализированы 345 образцов сывороток на наличие СРБ, РФ и АСЛО полуколичественными методами: классическим методом ЛА на слайдах с визуальной регистрацией, его модификацией в лунках крышек 96-луночных планшетов и микрометодом в матричном формате с ВЦР и количественным иммунотурбидиметрическим методом на анализаторе «AU640» («Olympus», Япония). Полученные данные представлены в таблице 7.

Таблица 7. Данные статистической обработки (коэффициенты корреляции Спирмана, при р<0,05) результатов, полученных в системах с реакцией ЛА на планарных объектах и иммунотурбидиметрическим методом._

Референс- методы Сравниваемые методы Иммунотурбидиметрия Классический метод ЛА с визуальной регистрацией

СРБ РФ АСЛО СРБ РФ АСЛО

ЛА в лунках крышки планшета с ВЦР 0,978 0,930 0,951 1,0 0,988 0,988

Микроматричный метод с жидким латексом с ВЦР 0,981 0,923 0,959 0,993 0,987 0,977

Классичесий метод ЛА с визуальной регистрацией 0,978 0,928 0,937 - - -

Для сравнения результатов, полученных количественным и полуколичественными методами, титры сывороток и соответствующие им концентрационные интервалы ранжировались, а так же учитывалось

количество сывороток, попадающих в тот или иной интервал, и в таблице 7 приведены рассчитанные коэффициенты корреляции Спирмана.

Статистические данные показывают высокую степень совпадения результатов, полученных разработанным микрометодом ЛА с видеорегистрацией, с результатами референсных методов.

Вариант тест-систем с высушенным латексным реагентом был также разработан и апробирован для реакции латексной агглютинации в микроформате. В этом случае латексный реагент в стабилизирующем буфере с помощью системы позиционирования наносили аппликатором на обезжиренное предметное стекло и высушивали при комнатной температуре. В результате этого на носителе формировалась матрица из тридцати зон, содержащих дозы сухого латексного реагента, в которых можно проводить реакцию ЛА с исследуемыми образцами. Носители с высушенными матрицами микрокапель реагентов хранили в пакетиках из фольги в присутствии силикагеля при комнатной температуре, и их стабильность составляла не менее полугода при комнатной температуре. Такая тест-система показана на рис. 21.

X Л

Рис 21 .Тест-система с высушенным латексным реагентом.

Процедура постановки реакции ЛА на системах с высушенным латексным реагентом аналогична методике для использования жидких реагентов, но нет стадии нанесения микрокапель латекса, что позволяет упростить проведение анализа. Результаты, получаемые с применением тестов с сухими и жидкими реагентами, полностью совпадают.

Разработанные тест-системы с сухим реагентом представляют собой аналитическую систему, сводящую к минимуму количество операций, проводимых непосредственно в КДЛ при проведении анализа. В данном случае операция нанесения латексного реактива выполняется при производстве тестов в стандартных условиях.

Применение разработанного метода исследований в микроформате с ВЦР обеспечивает минимизацию ошибок в процессе исследования, снижает количество требуемого биоматериала, уменьшает затраты времени на проведение анализа, то есть улучшает качество и повышает экономическую эффективность лабораторных исследований.

Определение групп крови системы ABO и резус-фактора в микроформате проводили по методике, аналогичной методике проведения реакции латексной агглютинации. С помощью описанной выше системы позиционирования-смешивания в каждой точке матрицы, формируемой на предметном стекле, смешивали суспензию исследуемых эритроцитов и цоликлоны, специфичные к соответствующим эритроцитарным антигенам.

Примеры интерпретации результатов исследования эритроцитов по системе группы ABO и Резус-фактору приведены на рис.22.

Цоликлоны Группа, Резус-фактор

анти А анти В анти D . Г) анти анти А анти В

1 Щ :sW ú © j #§§§§• ШчШЧЪ . i # ■ ш § Щ w ■. % W Ш 4 : í* Щ W w W ( Ь , гУ' ' '¿Ш У'Л- ik & Ш íi ш ш Ф р х i , '^-Щ ж А (II), Rh+

2 3 4 5 АВ (IV), Rh- В (III), Rh+ АВ (IV), Rh+ O(I), Rh+

Рис. 22. Пример интерпретации результатов изосерологического исследования (слева контрастированное изображение аналитических зон, справа - визуальное представление математической обработки изображения).

Для повышения надежности определения для каждого образца крови использовали два разведения эритроцитарной массы. В рамках одного нанесения в формате 5x6 исследовали одновременно 5 образцов крови. Визуальное аналоговое представление математической обработки изображения помогало объективно оценить результаты реакции агглютинации. Получаемые нами результаты полностью совпадали с

данными референс-метода прямого и перекрестного определения эритроцитарных антигенов на плоскости, что доказывает возможность использования разработанного нового способа определения групп крови ABO и резус-фактора в микроформате.

Проведение исследований в микроформате с ВЦР позволяет одновременно анализировать до 30 образцов на один или несколько параметров. При этом используется минимальное количество образца и реагентов, сокращается время проведения анализа. Видеорегистрация дает возможность повысить объективность оценки результата реакции за счет средств компьютерной обработки изображений. При необходимости оценку результатов реакции можно повторить, данные распечатать или передать с помощью сетевых технологий в центральную лабораторию. Таким образом, приспособления для позиционирования-смешивания в сочетании с системами видеорегистрации представляют полную аналитическую систему для достоверного, производительного проведения иммунологических исследований в микроформатах, как в условиях оснащенной лаборатории, так и во внелабораторных условиях.

Заключение.

Проведенные исследования подтверждают эффективность использования программно-аппаратных комплексов «Эксперт-Лаб» и «Рефлеком» для широкого спектра иммунологических и биохимических лабораторных исследований. Система «Эксперт-Лаб» при использовании для регистрации результатов иммуноферментных, лактекс- и гем-агглютинационных исследований в формате 96-тилуночного планшета имеет аналитические характеристики, не уступающие современным традиционным регистрирующим приборам, при наличии значительных преимуществ, обеспечиваемых возможностью сохранения первичного документа теста.

Комплекс «Эксперт-Лаб» и комплекс «Рефлеком» позволяют регистрировать результаты иммунохроматографических тестов и тестов, проводимых с помощью полосок «сухой химии». Оба комплекса используются в качестве систем регистрации для разработанных нами микротехнологий проведения иммунологических лабораторных исследований, позволяющих снизить используемые объемы реагентов и проб в 10-50 раз, (от рабочего объема 100 мкл для 96-тилуночного микропланшета до объема реакционных смесей 1-2 мкл для проведения реакции в микроматричном формате).

43 I

С учетом универсальности и единого принципа построения, выдачи и обработки информации разработанные системы ВЦР могут рассматриваться как основа комплексного оснащения широкопрофильных лабораторий различной специализации и уровня.

Однако перечисленные выше возможности не исчерпывают потенциал данных комплексов и систем на основе видеоцифровой регистрации и микротехнологий.

Разработанные подходы к созданию систем ВЦР, принципы построения программного обеспечения, использование матричных форматов являются универсальными и весьма гибкими. Они применимы практически ко всем сферам и задачам лабораторной диагностики, от интегрирования в лабораторные информационные сети крупных лабораторных центров, до использования в полевых условиях с передачей аналитической информации по мобильной связи.

Наиболее перспективными направлениями развития описанных разработок и научно-обоснованных подходов видеоцифровой регистрации являются:

-Для сканерных систем - биохимические, иммунотурбидиметрические, микробиологические исследования в формате 96-луночного планшета;

-Для систем на основе цифровых видеокамер - исследования на тестах сухой химии в кинетическом режиме, исследования в микроматричных форматах.

Таким образом, научно обоснованное разрабатываемое направление совершенствования методов клинических лабораторных исследований, базирующееся на применении видеоцифровой регистрации и использовании микрометодов, открывает новые возможности повышения качества, доступности, создания гибких вариантов и расширения спектра приложений лабораторной диагностики.

Широкому практическому применению этих систем может способствовать и их легкая адаптация к любым системам передачи цифровой информации через Интернет или по мобильной телефонной связи.

Передача информации в цифровом виде может быть неоценимым преимуществом для решения таких задач, как организация профильных лабораторных сетей с вертикально интегрированной системой контроля качества, организация дистанционного получения результатов анализов и консультативная помощь из единого центра при полевых лабораторных исследованиях или тестах «в месте оказания медицинской помощи».

Выводы.

1 .Разработаны алгоритмы обработки изображений аналитических объектов для компьютерных видеоцифровых систем «Эксперт-Лаб» и «Рефлеком» и универсальное программное обеспечение (ПО) для регистрации результатов распространенных лабораторных исследований, проводимых в матричных форматах (96- луночные планшеты, планарные носители для микрометодов) и исследований на планарных носителях (иммунохроматографические тесты, тесты «сухой химии»).

2.Доказана возможность повышения качества проводимых анализов за счет документирования, объективизации, автоматической оценки результатов при регистрации агглютинационных исследований: экспресс тестов латексной агглютинации, РПГА, агглютинации желатиновых частиц, изосерологических исследований на разработанном программно-аппаратном комплексе «Эксперт-Лаб».

3.Предложена система внутрилабораторного контроля качества для агглютинационных тестов, повышающая аналитическую надежность получаемых данных.

4.Применение разработанной системы видеоцифровой регистрации результатов иммуноферментного анализа обеспечивает выявление и исключение ошибок, связанных с артефактами при проведении исследований (выпадение субстрата в осадок, посторонние включения, дефекты планшета).

5.Разработано гибкое программное обеспечение для регистрации, автоматической оценки, документирования результатов иммунохроматографических тестов, применимое к любым типам тестов горизонтального потока. На примере иммунохроматографических тестов для определения простатического специфического антигена с видеоцифровой регистрацией показана возможность получения полуколичественных результатов с эффективной дифференциацией диагностически значимых диапазонов концентраций.

6.Разработаны 12-луночные микропланшеты для проведения латексных агглютинационных и изосерологических исследований с видеоцифровой регистрацией, позволяющие снизить в 5-10 раз расход реагентов с сохранением всех аналитических характеристик методик.

7.Предложена система формирования упорядоченных матриц микрокапель на планарных носителях и разработаны специализированные программы, составляющие полную аналитическую систему для проведения

лабораторных иммунологических и биохимических исследований с использованием объемов проб и реагентов менее 1 мкл.

8.Предложенные варианты проведения серийного дот-анализа в матричном формате для определения глюкозы в сыворотке крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов: С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-0 и определения групп крови системы ABO и резус-фактора в микрообъемах с видеоцифровой регистрацией обеспечивают получение достоверных результатов исследования аналитов.

9.Разработаны тесты с сухими реагентами для проведения латекс-агглютинационных тестов и изосерологических исследований в формате 12-луночных микропланшетов и микроматричном формате, аналитические характеристики которых не уступают системам с жидкими реагентами и могут быть рекомендованы к использованию в клинической лабораторной практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Созданная многофункциональная видеоцифровая система «Эксперт-Лаб» может быть рекомендована для малых и средних клинико-диагностических лабораторий как базовый комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра проводимых иммунохимических исследований.

Предложенные инструментальные методики проведения латекс- и

гемагглютинационных тестов в формате 96-луночного планшета могут применяться для использования в клинико-диагностических лабораториях вместо традиционных тестов с визуальной регистрацией результатов, обеспечивая документирование, объективизацию и повышая аналитическую надежность исследований.

Серийный латексагглютинационный метод определения содержания С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-0 в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией может быть рекомендован для внедрения в практику клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений здравоохранения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Старовойтова Т.А., Зайко В.В., Волощук С.Г., Стериополо H.A., Мартынкина Л.П., Савина М.И., Зайцева H.A., Тогузов Р.Т., Венгеров Ю.Ю. Иммунохроматографический анализ простатического

специфического антигена с видеоцифровой регистрацией // Клиническая лабораторная диагностика. - М.- 2005. - №9 - С. 24-25.

2. Зайко В.В., Старовойтова Т.А., Волощук С.Г., Стериополо H.A., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е.,. Тогузов Р.Т., Венгеров Ю.Ю. Системы регистрации и анализа изображений для задач клинической лабораторной диагностики // Клиническая лабораторная диагностика. - М,- 2005. - №10. - С. 25-26.

3. Старовойтова Т.А., Зайко В.В., Стериополо H.A., Калачева О.С., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Егоров Е.Е., Волощук С.Г., Тогузов Р.Т., Венгеров Ю.Ю. Видеоцифровой анализ для лабораторной диагностики: комплекс «Эксперт-Лаб» на основе сканера для документирования, объективизации и регистрации результатов латекс-агглютинационных, гемагглютинационных тестов, изосерологических и иммуноферментных исследований // Лаборатория. -М.-2006.-№1.-С. 19-22.

4. Стериополо H.A., Зайко В.В., Калачева О.С., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Тогузов Р.Т., Старовойтова Т.А., Венгеров Ю.Ю. Применение сканера для регистрации результатов иммуноферментного анализа в стандартных микропланшетах // Клиническая лабораторная диагностика. - М.- 2006. -№11 .-С. 44-46.

5. Старовойтова Т.А., Стериополо H.A., Зайко В.В., Калачева О.С., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Егоров Е.Е., Волощук С.Г., Тогузов Р.Т., Венгеров Ю.Ю. Видеоцифровой анализ для лабораторной диагностики: комплекс «Эксперт-Лаб» на основе сканера для документирования и регистрации результатов латекс-агглютинационных тестов и иммуноферментных исследований // Материалы докладов семинаров и конференции в рамках выставки «AnalyticaExpo-2006».- М. - 2006. - С. 42-43.

6. Зайко В.В., Стериополо H.A., Калачева О.С., Старовойтова Т.А., Ротанов

B.C., Фриго Н.В., Венгеров Ю.Ю. Видеоцифровая система «Эксперт-Лаб» для лабораторной диагностики сифилиса // Материалы научных работ X Всероссийской конференции дерматовенерологов «Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях». - М.-2006. -

C. 74.

7. Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Стериополо H.A., Калачева О.С., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Егоров Е.Е., Волощук С.Г., Тогузов Р.Т., Старовойтова Т.А., Венгеров Ю.Ю. Система на основе сканера для

документирования, объективизации и регистрации результатов тестов латексной агглютинации // Клиническая лабораторная диагностика. - М,-2006.-№ 12.-С. 18-21.

8. Венгеров Ю.Ю., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Старовойтова Т.А., Стериополо H.A. Свидетельство №2007613095 «Пакет программ для лаборатории «Эксперт-Лаб» - заявка №2007612576, 26.07.2007; Зарегистр. в Реестре программ для ЭВМ 20.07.2007.

9. Старовойтова Т.А., Стериополо H.A., Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Калачева О.С., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Венгеров Ю.Ю., Тогузов Р.Т. Видеоцифровая система «Эксперт-Лаб» для регистрации и объективизации результатов латекс-агглютинационных тестов в формате 96-луночного планшета // Клиническая лабораторная диагностика. - М.- 2007. - № 9. - С. 37.

10. Старовойтова Т.А., Стериополо H.A., Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Калачева О.С., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Венгеров Ю.Ю., Тогузов Р.Т. Исследование характеристик сканерной видеоцифровой системы Эксперт-Лаб для регистрации результатов иммуноферментного анализа // Клиническая лабораторная диагностика. -М.-2007. -№ 9. - С. 30-31.

11.Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Стериополо H.A., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Егоров Е.Е., Волощук С.Г., Старовойтова T.A., Венгеров Ю.Ю., Тогузов Р.Т. Мультиплексная аналитическая система для проведения тестов латексной агглютинации в микроформате с видеоцифровой регистрацией // Клиническая лабораторная диагностика.-М. - 2007. - № 9, С. 39.

12. Венгеров Ю.Ю., Барский В.Е., Волощук С.Г., Егоров Е.Е., Туголуков А.Е., Кутвицкий В.А., Мартынкина Л.П., Зайко В.В., Черных B.C., Старовойтова Т.А., Стериополо H.A., Калачева О.С. Пат. 2325644 Рос. Федерация, МПК G 01N 33/48, G 01N 33/53. Способ проведения клинического и биохимического анализа биологических жидкостей - № 2005123717/15; заявл. 26.07.2005; опубл. 27.05.2008, Бюл. №15.

13. Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Стериополо H.A., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Егоров Е.Е., Волощук С.Г., Старовойтова T.A., Венгеров Ю.Ю., Тогузов Р.Т. Аналитические характеристики микроматричного полуколичественного метода проведения серийных латексных тестов с

видеоцифровой регистрацией // Клиническая лабораторная диагностика. -М.-2008.-№6.-С. 17-20.

14.Zaiko V., Martinkina L., Steriopolo N., Kutvitsky V., Tugolukov A., Egorov E., Voloshchuk S., Starovoitova T., Toguzov R., Vengerov Yu. Microarray Method for Multiplex and Sériai Latex Agglutination Tests with Digital Image Registration // ClinLab. - H. - 2008. - N 54. - P. 273 -279.

15. Старовойтова T.A., Зайко B.B., Стериополо H.A., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В. A., Туголуков A.E., Волощук С.Г., Венгеров Ю.Ю. Комплекс «Эксперт-Лаб» для регистрации тестов латексной агглютинации и иммуноферментного анализа // Материалы 6-ой Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» Астраханский медицинский журнал. - А,- 2008. - Т. 3. - №3 (приложение). - С. 190-194.

16.Венгеров Ю.Ю., Старовойтова Т.А., Тогузов Р.Т. Видеоцифровая регистрация и миниатюризация как высокотехнологичные подходы к усовершенствованию клинических лабораторных исследований.// Лаборатория,- М.- 2009.-№2.- С 10.

17. Старовойтова Т.А., Стериополо Н.А., Зайко В.В., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Тогузов Р.Т., Венгеров Ю.Ю. Видеоцифровая регистрация: новые перспективы лабораторной диагностики //Клинико-лабораторный консилиум. - С - П.- 2009. - №5. -С .44-55.

18.Старовойтова Т.А., Зайко В.В., Стериополо Н.А., Мартынкина Л.П., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Тогузов Р.Т., Венгеров Ю.Ю. Аналитическая платформа для проведения биохимических и иммунологических исследований в микроматричном формате ,с видеоцифровой регистрацией // Медлайн.РУ: Российский биомедицинский журнал. - С - П.- 2009. - №12,- С.

19. Мартынкина Л.П., Старовойтова Т.А., Стериополо Н.А., Зайко В.В., Кутвицкий В.А., Туголуков А.Е., Волощук С.Г., Венгеров Ю.Ю. Информативность экспресс-латекс-тестов при использовании видеоцифровой регистрации // Клинико-лабораторный консилиум. - С -П.- 2009. - №6. С.56-62.

Список сокращений.

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В ТРНА - Treponema pallidum hemagglutination - агглютинация сорбированных антигенами возбудителя сифилиса эритроцитов ТРРА - Treponema pallidum particle agglutination — агглютинация с сорбированных антигенами возбудителя сифилиса частиц АГ - антиген

ACJIO - антистрептолизин - О AT - антитело

АТТГ - антитела к тиреоглобулину АТТПО - антитела к тиреоидной пероксидазе

BJIK - внутрилабораторный контроль качества

ВЦР - видеоцифровая регистрация

ДЭА-Б - дегидроэпиандростерон -сульфат

ИФА - иммуноферментный анализ ИХ - иммунохроматографические тесты

ЛА - латексная агглютинация ОП - оптическая плотность ПДТ - первичный документ теста ПЗС - прибор с зарядовой связью ПО - программное обеспечение ПСА - простатспецифический антиген

РФ - ревматоидный фактор РИГА - реакция пассивной гемагглютинации СРВ - С-реактивный белок СТ4 - свободный тироксин ТМБ - тетраметилбензидин ТТЗ - общий трийодтиронин ТТГ - тиреотропный гормон

Актуальность проблемы

Важнейшая роль лабораторной диагностики в медицине является общепризнанным фактом, в связи с чем усовершенствование имеющихся и разработка новых вариантов аналитических лабораторных методов на основе использования современных и постоянно развивающихся компьютерных технологий является весьма актуальным. Очевидна направленность этих усовершенствований, призванных обеспечить повышение достоверности, точности, снижение времени выполнения и трудоемкости проведения анализов. («Концепция развития службы клинической лабораторной диагностики Министерства здравоохранения Российской Федерации на 20042010 годы») [26].

Одной из важных зон внедрения новых лабораторных методик, основанных на использовании современных информационных технологий регистрации и обработки результатов, представляются малые и средние лаборатории, где и в настоящее время большое количество лабораторных исследований проводится на основе визуальной интерпретации. К таким исследованиям относятся иммунологические агглютинационные и преципитационные анализы, тесты «сухой химии», иммунохроматографические тесты, иммунодот- и иммуноблот-анализы.

Важным технологическим направлением развития этих и других лабораторных методов являются подходы видеоцифрового компьютерного анализа. Применение видеоцифрового анализа к традиционным тестам с визуальной регистрацией решает задачу документирования и объективизации результатов анализа, что поднимает эти тесты на принципиально более высокий уровень достоверности и аналитической ценности. Видеоцифровой анализ открывает принципиально новые возможности и для усовершенствования методов, где применяются обычные варианты фотометрии и рефлектометрии, таких как иммуноферментный анализ, турбидиметрические исследования, тесты «сухой химии».

Другим перспективным направлением усовершенствования лабораторных методик является внедрение микрометодов, подразумевающее проведение исследований с использованием минимальных количеств реагентов и образцов. Существенные преимущества дает сочетание подходов видеоцифровой регистрации с миниатюризацией аналитических процедур, которое обычно реализуется в виде полных аналитических систем, включающих приспособления для проведения реакций в минимальных объемах в матричном формате и видеоцифровые системы регистрации. Такие аналитические системы со специализированным программным обеспечением дают возможность создания принципиально новых вариантов методик, отличающихся высокой производительностью и экономичностью.

В связи с этим исследования, направленные на разработку и внедрение высокотехнологичных аналитических систем на основе видеоцифрового анализа, а также систем сочетающих видеоцифровую регистрацию и микрометоды, обеспечивающих экономичное проведение распространенных клинико-диагностических определений на высоком уровне достоверности можно считать весьма актуальными.

Цель исследования

Создать новые и усовершенствовать имеющиеся методы проведения распространенных клинико-диагностических исследований с применением видеоцифровой регистрации и оценить на клиническом материале аналитические характеристики созданных лабораторных комплексов и методов.

Задачи исследования:

1 .Разработать лабораторные видеоцифровые системы для регистрации результатов латексной агглютинации, пассивной гемагглютинации, изосерологических исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа и биохимических тестов «сухой химии».

2.Сформулировать медико-технические требования к программному обеспечению видеоанализаторов и обосновать алгоритмы оценки результатов специфических аналитических реакций с учетом особенностей их прохождения.

3.Создать стандартизованные методики проведения агглютинационных тестов с документированием, автоматической оценкой результатов, обеспечивающие возможность внутрилабораторного контроля качества исследований.

4.Разработать систему регистрации результатов и планшеты для проведения латексных агглютинационных и изосерологических исследований со сниженным расходом реагентов.

5.Сконструировать приспособления формирования матриц микрокапель на планарных носителях и создать полные аналитические системы, включающие эти приспособления и программно-аппаратные комплексы для регистрации и интерпретации результатов иммунологических и биохимических исследований в микроматричном формате.

6.Провести расширенную апробацию разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными лабораторными системами и подготовить научно обоснованную методическую базу для внедрения этих методов в практику клинической лабораторной диагностики.

Научная новизна работы

Разработана не имеющая аналогов многофункциональная система регистрации результатов иммунологических исследований на основе сканера.

Впервые разработано программное обеспечение для регистрации результатов латекс-агглютинационных исследований на планарных носителях с количественной оценкой реакций для любых латекс-агглютинационных тестов.

С применением разработанных подходов видеоцифровой регистрации и использования микрометодов предложены новые, эффективные варианты проведения серийных исследований латексной агглютинации, изосерологических тестов в различных форматах, позволяющие снизить необходимые для анализов объемы реагентов и проб в 10-30 раз.

Разработана, защищенная патентом РФ, полная аналитическая система для проведения матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате, включающая приспособления нанесения микрокапель образцов и реагентов на планарные носители, видеоанализатор и специализированное программное обеспечение.

Практическая ценность работы

Разработана лабораторная многофункциональная регистрирующая система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа. Эта универсальная видеоцифровая система с пакетом программ «Эксперт-Лаб» (Свидетельство о регистрации № 2007613095 в Реестре программ для ЭВМ от 20.07.2007) может рассматриваться как основной лабораторный комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра иммунологических исследований.

За разработку и внедрение системы комплекса «Эксперт-Лаб» присужден Диплом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007). Разработка видеоцифровых систем для лабораторной диагностики отмечена золотой медалью «Международного салона инноваций и инвестиций» (Москва, 2009).

На основе разработанного аналитического комплекса для матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате с видеоцифровой регистрацией предложены методы серийного дот - анализа альбумина в моче, глюкозы крови, латекс-агглютинационного метода определения содержания аналитов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, АСЛО) и изосерологических исследований, позволяющие в десятки раз снизить объемы реагентов и проб и повысить производительность.

Внедрение результатов работы

Разработанная лабораторная система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа внедрена в серийное производство на предприятии ОАО «ЛОМО» (Санкт-Петербург) (Регистрационное удостоверение № ФС 02012006/3617-06 от 10.08.2006). Системы «Эксперт-Лаб» используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в практике работы КДЛ ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова», НУЗ «ЦКБ №1 ОАО «РЖД», ГУЗ «Московский областной перинатальный центр», ГУЗ ДЦ № 1 УЗ ЮЗАО.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные и научно обоснованные подходы усовершенствования лабораторных методов с видеоцифровой регистрацией реализованы и внедрены в практику в виде многофункциональных программно-аппаратных комплексов, обеспечивающих получение объективных и достоверных результатов широкого спектра биохимических и иммунологических лабораторных исследований.

2. На основе сочетания подходов видеоцифровой регистрации и применения микрометодов создана и реализована в виде полного аналитического комплекса технология проведения биохимических и иммунохимических исследований в матричных форматах в микрообъемах реагентов и образцов.

3. Использование разработанных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологических и биохимических исследований повышает качество и достоверность лабораторных данных за счет объективизации их оценки, сохранения первичного документа теста для ретроспективного контроля.

Личный вклад автора

Автор лично принимала участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: разрабатывала медицинские требования к приборным и аппаратным компонентам программно-аппаратных комплексов и приспособлений для проведения исследований в микроформатах, критерии для алгоритмов регистрации и дискриминации результатов иммунологических исследований, осуществляла оценку разработанных лабораторных методов в сопоставлении с референсными вариантами, сформулировала рекомендации для использования результатов исследований в клинико-диагностических лабораториях.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на совместной научно-практической конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и проблемной научно-исследовательской лаборатории нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 06 октября 2009 года.

Печатные работы

По теме диссертации опубликовано 19 публикаций в отечественной и зарубежной печати, из них в изданиях, рекомендуемых ВАК- 9 работ. Получены патент на изобретение «Способ проведения клинического и биохимического анализа биологических жидкостей» №2325644, Рос. Федерация, МПК в 0Ш 33/48, й 0Ш 33/53 ; завл.26.07.2005, опубл. 27.05.2008 бюлл. №15 и свидетельство №2007613095 «Пакет программ для лаборатории «Эксперт-Лаб»; Зарегистр. в реестре программ для ЭВМ 20.07.2007.

Выводы

1. Разработаны алгоритмы обработки изображений аналитических объектов для компьютерных видеоцифровых систем «Эксперт-Лаб» и «Рефлеком» и универсальное программное обеспечение (ПО) для регистрации результатов распространенных лабораторных исследований, проводимых в матричных форматах (96- луночные планшеты, планарные носители для микрометодов) и исследований на планарных носителях (иммунохроматографические тесты, тесты сухой химии).

2. Доказана возможность повышения качества проводимых анализов за счет документирования, объективизации, автоматической оценки результатов при регистрации агглютинационных исследований: экспресс тестов латексной агглютинации, РПГА, агглютинации желатиновых частиц, изосерологических исследований на разработанном программно-аппаратном комплексе «Эксперт-Лаб».

3. Предложена система внутрилабораторного контроля качества для агглютинационных тестов, повышающая аналитическую надежность получаемых данных.

4. Применение разработанной системы видеоцифровой регистрации результатов иммуноферментного анализа обеспечивает выявление и исключение ошибок, связанных с артефактами при проведении исследований (выпадение субстрата в осадок, посторонние включения, дефекты планшета).

5. Разработано гибкое программное обеспечение для регистрации, автоматической оценки, документирования результатов иммунохроматографических тестов, применимое к любым типам тестов горизонтального потока. На примере иммунохроматографических тестов для определения простатического специфического антигена с видеоцифровой регистрацией показана возможность получения полуколичественных результатов с эффективной дифференциацией диагностически значимых диапазонов концентраций.

6. Разработаны 12-тилуночные микропланшеты для проведения латексных агглютинационных и изосерологических исследований с видеоцифровой регистрацией, позволяющие снизить в 5-10 раз расход реагентов с сохранением всех аналитических характеристик методик.

7. Предложена система формирования упорядоченных матриц микрокапель на планарных носителях и разработаны специализированные программы, составляющие полную аналитическую систему для проведения лабораторных иммунологических и биохимических исследований с использованием объемов проб и реагентов менее 1 мкл.

8. Предложенные варианты проведения серийного дот-анализа в матричном формате для определения глюкозы в сыворотке крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов: С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О и определения групп крови системы ABO и резус-фактора в микрообъемах с видеоцифровой регистрацией обеспечивают получение достоверных результатов исследования аналитов.

9. Разработаны тесты с сухими реагентами для проведения латекс-агглютинационных тестов и изосерологических исследований в формате 12-луночных микропланшетов и микроматричном формате, аналитические характеристики которых не уступают системам с жидкими реагентами и могут быть рекомендованы к использованию в клинической лабораторной практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Созданная многофункциональная видеоцифровая система «Эксперт-Лаб» может быть рекомендована для малых и средних клинико-диагностических .лабораторий как базовый комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра проводимых иммунохимических исследований.

Предложенные инструментальные методики проведения латекс- и гемагглютинационных тестов в формате 96-луночного планшета могут применяться для использования в клинико-диагностических лабораториях вместо традиционных тестов с визуальной регистрацией результатов, обеспечивая документирование, объективизацию и повышая аналитическую надежность исследований.

Серийный латексагглютинационный метод определения содержания С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией может быть рекомендован для внедрения в практику клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений здравоохранения.