Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка и стандартизация сбора витаминного и экстракта сухого на его основе

005537964

На правах рукописи

РЕШЕТОВА ВАЛЕНТИНА ОЛЕГОВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СБОРА ВИТАМИННОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ - 2013

005537964

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Маркарян Артем Александрович - доктор фармацевтических наук, профессор.

Официальные оппоненты:

Николаева Галина Григорьевна - доктор фармацевтических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждения науки «Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН» / лаборатория химико-фармацевтических исследований, ведущий научный сотрудник.

Гармаева Елена Анатольевна - кандидат фармацевтических наук, Государственное предприятие Республики Бурятия «Бурят-Фармация» / информационный отдел, заместитель начальника.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ «ВИЛАР» Россельхозакадемии)

Защита состоится: « 29 » ноября 2013 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан «28» октября_ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

В. Б. Хобракова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время у большинства населения России отмечается поливитаминная и минеральная недостаточность. Даже при тщательно сбалансированном питании дефицит большинства витаминов в рационе может достигать 30 %. Периодические стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильное питание - эти и другие факторы способствуют снижению защитных сил организма и повышению заболеваемости населения.

По данным многих ученых, для решения проблемы гиповитаминозов, пониженного иммунитета целесообразным является применение сборов лекарственных растений, обеспечивающих комплексное воздействие за счет сочетания действий различных компонентов. Низкая токсичность извлечений из лекарственных растений позволяет назначать их длительными курсами (месяцы). Для растений характерно разнообразие химического состава, позволяющее мягко и безопасно воздействовать одновременно на многие системы организма, вовлеченные в патологический процесс. Одним из явных преимуществ фитотерапии является доступность и относительная дешевизна лекарственных растений (Зеликсон Ю.И., Кондратьева Т.С., 1999; Громовик Б.П., 2000; Адекенов С.М., 2004). Кроме того, весьма перспективным направлением является разработка на основе сборов -- экстрактов сухих, более рациональной формы, обеспечивающей высокий выход биологически активных веществ (БАВ), сохраняющей все заданные свойства сбора.

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что в России проводятся исследования по созданию новых лечебных и профилактических средств в форме сборов, в том числе адаптогенной и иммуностимулирующей направленностью действия, но внедрение поливитаминных сборов осуществляется крайне редко [Коровина H.A. и др., 2000; Студенкин В.М., 2002; Паутова Е., 2008; Уварова Ю., 2011].

Учитывая большой интерес населения к витаминным препаратам растительного происхождения, актуальна необходимость и целесообразность выполнения настоящего исследования.

Цель и задачи исследований

Целью диссертационной работы является разработка и стандартизация многокомпонентного сбора, обладающего витаминным, общеукрепляющим и иммуностимулирующим действием, и получение на его основе экстракта сухого.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

ДО'"

- обосновать разработку рациональной композиции сбора витаминного (качественный состав и количественное соотношение компонентов);

- провести фармакогностическое изучение исходной растительной композиции;

- разработать условия получения экстракта сухого на основе сбора витаминного, провести его химическое изучение;

- разработать и предложить показатели качественной и количественной стандартизации сбора витаминного и экстракта сухого на его основе;

- представить проекты нормативной документации на сбор виГаминный и экстракт сухой на его основе.

Научная новизна

Предложена концепция создания многокомпонентного сбора витаминного, включающая принципы и структурную модель разработки нового продукта с позиций системного подхода, обладающего витаминным, общеукрепляющим и иммуностимулирующим действием.

Установлены товароведческие показатели, диагностически значимые признаки входящих растительных компонентов методом микроскопии, определен качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ: витаминов, органических и аминокислот, флавоноидов; разрабо1аны методики количественного определения по сумме флавоноидов в пересчете на PCO лютеолина и полисахаридов в пересчете на PCO глюкозы.

Предложена рациональная лекарственная форма - экстракт сухой, установлены показатели его качества, установлено качественное и количественное содержание биологически активных веществ, подтверждающие рациональность технологического процесса; установлены условия хранения и сроки годности.

Разработаны проекты нормативной документации на биологически активную добавку (БАД) к пище «Арура Тан №11» и проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на экстракт сухой на основе данного сбора.

Практическая значимость работы

По результатам исследований разработаны и внедрены:

Биологически активная добавка к пшце «Арура Тан № 11» (Регистрационное удостоверение № RU.77.99.11.003.Е.004276.05.13 от 28.05.2013, ТУ 9370-011-03533369-11, ТИ, Рецептура);

- проект ФСП на экстракт сухой на основе сбора витаминного;

- методики контроля качества, технологическая схема получения БАД к пище «Арура-Тан № 11»; которые апробированы на ООО «Малое инновационное предприятие АРУРА» (акт о внедрении от 25.02.2013);

Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры фармации ФГБОУ ДПО ИПК ФМБА России (акт внедрения от 22.05.13), -кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России (акт внедрения от 25.04.13), - кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России (Акт внедрения от 24.04.13).

Работа выполнена в рамках комплексной темы ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (рег. № 01.2.006 06 352)

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались и обсуждались

на:

- XXII Московской международной гомеопатической конференции (Москва, 2012);

- II Международном конгрессе "Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации" (Москва, 2012);

- Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых: «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013);

- Международной заочной научно-практической конференции: «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика» (Воронеж, 2013).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 11 научных работах из них 7 - в изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 168 страницах основного текста, состоит из введения, четырех глав теоретических и экспериментальных исследований, выводов и списка используемой литературы, включающего 166 источников, из которых 42 -на иностранных языках, и содержит 10 приложений. Работа иллюстрирована 60 рисунками и представлена 76 таблицами.

Во введении обоснована актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы, проанализированы современные тенденции в разработке и исследовании лечебно-профилактических лекарственных сборов.

Во второй главе содержится обоснование программы исследования, а также приводятся характеристики объектов и методов исследований.

Третья глава посвящена выбору рационального состава сбора витаминного, установлению макро- и микро- диагностических признаков, определению товароведческих характеристик; представлены результаты по идентификации основных БАВ сбора с применением методов хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), УФ-спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), проведена разработка методик количественного определения по сумме флавоноидов в пересчете на лютеолин-стандарт, Сахаров, в пересчете на РСО глюкозы.

Четвертая глава посвящена разработке условий получения экстракта сухого на основе сбора витаминного, приведено описание технологической схемы получения, проведена идентификация основных БАВ и разработка методик количественного определения по сумме флавоноидов и полисахаридов экстракта сухого.

На защиту выносятся:

- результаты разработки рецептуры сбора витаминного, характеристик подлинности и показателей его качества;

- методики и результаты качественного и количественного определения основных групп БАВ в сборе;

результаты исследований по получению и стандартизации экстракта сухого из сбора витаминного.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектом исследования служило растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации:

- плоды шиповника, шиповник майский (Ш. коричный) - Rosa majalis Herrm (Л cinnamomea), семейство Rosaceae Juss.; по ГФ XI изд., вып. 2, Ст. 38 или ГОСТ 1994;

- плоды рябины, рябина обыкновенная - Sorbus aucuparia L., семейство Rosaceae Juss.; по ГФ XI изд., вып. 2., Ст. 39; Изменения № 1 от 20.05.97 и № 2 от 25.06.97; ГОСТ 6714-74;

- плоды облепихи, облепиха крушиновидная — Hippophae rhamnoides L., семейство Elaeagnaceae Adans.; по ТУ 64-4-72-88;

- листья крапивы, крапива двудомная — Urtica dioica L., семейство Urticaceae Juss.; по ГФ XI изд., вып. 2, Ст. 25;

- трава мелиссы лекарственной, мелисса лекарственная — Melisa officinalis L., семейство Labiatae Juss. (Lamiaceae Lindl.); по ФС 42-3645-98.

Сбор как объект исследований готовили в соответствии с требованиями статьи «Сборы», ГФ XI, вып. 1, с. 266. При приготовлении образцов сбора использовали сырье, заготовленное или закупленное в 2010-2011 гг. Сырье было подвергнуто анализу на соответствие требованиям нормативной документации в соответствии со статьями ГФ XI для отдельных видов сырья. Сырье соответствовало требованиям НД, включая радиационный контроль.

Измельчение сухого сырья, отбор средней и аналитических проб проводили согласно ГФ XI изд., вып.1. Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 266-267. Микроскопические исследования сбора проводили по методике ГФ XI изд., вып.1, с.277. Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1.

Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ); использовали пластины «KIESELGEL» 60 F254 размером 20x20 см; «Силуфол УФ-360» размером 15x15 см; «Сорбфил» УФ-254 размером 15x15 см и следующие системы растворителей:

1) этилацетат : метилэтилкетон : муравьиная кислота: уксусная кислота: вода (50:30:7:3:10);

2) уксусная кислота : ацетон : метанол : бензол (5:5:20:70);

3) этилацетат : метилэтилкетон : муравьиная кислота :вода (50:30:10:10);

4) бензол : этанол 95 % (80:20);

5) пиридин : этилацетат: вода (20:60:40);

6) гексан : диэтиловый эфир (1:1);

7) н-бутанол : ледяная уксусная кислота : вода (40:40:10).

Хроматографирование выполняли в соответствующей системе растворителей

при температуре 19-23 0 С в герметически закрытых стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластины осуществляли при помощи микрошприцев.

Обнаружение пятен у-пироновых веществ производили после высушивания хромахограмм и просмотра в фильтрованном УФ-свете (фильтр Хщщ = 254 нм) до и после обработки 5 % раствором фосфорномолибденовой кислоты в абсолютном спирте. Флавоноиды дают желтое и синее окрашивание соответственно (до обработки -коричневое). Фенолкарбоновые кислоты обнаруживаются по их собственной флуоресценции голубого или фиолетового цвета.

Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из пяти измерений. Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки «хч» или «чда».

Электронные спектры соединений в УФ- и видимой областях записывали на приборе Gelios (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Для регистрации УФ-спекгров исследуемых веществ готовили 0,05-10 % растворы в абсолютном метаноле и абсолютном этиловом спирте, а также в 70 % спирте.

При разработке методик качественного и количественного определения БАВ были использованы следующие хроматографически чистые вещества и стандарты: арбутин - Fluka, кат. № 10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-048668-44-01);

галловая кислота - Fluka, кат. № 48630; кофейная кислота - Sigma, кат. № 0625; хлорогеновая кислота - Sigma, кат. № 3378; феруловая кислота СО - ТУ 9369-1430486244-01; апигенин - Fluka, кат. № 10748; гесперидин - Sigma, кат. № 04125, ВИЛАР ТУ 9369-148-04868244-02; лютеолин ГСО - ФС 42-3130-95; лютеолин-7-гликозид ГСО - ФС 42-3130-95; кверцстин ГСО - ФС 42-290-79, ВИЛАР ТУ 9369128-04868244-03; рутин ГСО - ФС 42-2508-87, ВИЛАР ТУ 9369-141-04866824402; гиперозид ГСО - ФС 42-0106-03, ТУ разработаны в ВИЛАР; кемпферол - Fluka, кат. № 60010; ß-каротин-ФС 42-3867-99; зеаксантин - Merck, кат. № 10248.

Исследование сбора витаминного методом ВЭЖХ проводили на приборе фирмы «GILSTON», Франция, модель 305; инжектор ручной модели RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследований с помощью программы «Мультихром» для Windows. В работе применялся обращенно-фазовый вариант метода, в качестве неподвижной фазы использовали металлические колонки Кромасил С18, размер частиц 5 микрон ALTECH OA-1000 Organic Acids, размером 6,5x300 мм. В качестве подвижной фазы использовали:

8) метанол : вода : фосфорная кислота (конц.) (40:60:0,5);

9) 0,01М раствор серной кислоты;

. 10) 0,005М раствор серной кислоты.

Исследования проводили при комнатной температуре, скорость подачи элюенга- 0,8 мл/мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора при длине волны - 254 нм; REFRACTOMETR, модель 131 «GILSTON». Метанол - ХЧ, ГОСТ 6995-77; фосфорная кислота - ОСЧ, ТУ 261201400203677-97; ацетонитрил -ЧДА, ТУ 6095497-91; вода очищенная по ФС 42-2619-89.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка состава и товароведческая характеристика сбора витаминного

Проблема изыскания новых высокоэффективных и безопасных средств остается актуальной, что решается разработкой новых эффективных и безопасных средств на основе растительного сырья. Целесообразно использовать эмпирический подход, который базируется на накопленном опыте медицинского применения лекарственных растений. В связи с необходимостью учета ряда других факторов, предложена концептуальная модель обоснования и разработки состава растительного сбора с позиций системного подхода. При этом, под системой подразумевалась взаимосвязанная совокупность базовых данных и ресурсов (вход системы) и методов преобразования этих ресурсов в новый продукт (выход системы). К основным, базовым блокам системы отнесено следующее:

* требования к планируемому продукту растительного происхождения; в этот блок входят элементы предназначения средства (лечебно-профилактическое средство), требуемого фармакологического действия (поливитаминное, адаптогенное, повышающее иммунитет), лекарственной формы (сбор);

* обеспечивающие требуемое фармакологическое действие, в данный блок на основании сведений включены элементы «витамины», «макро- и микроэлементы», «аминокислоты», «флавоноиды и вещества с антиоксидантным действием», «группы БАВ», содействующие основному фармакологическому эффекту;

* выбранное лекарственное растительное сырье;

* эмпирические данные о применении растений в медицине (важнейшие группы заболеваний).

Исходные данные и ресурсы преобразуются в новый продукт путем выполнения логически связанных стадий - выбора количественного состава сбора на основе фармакологического испытания нескольких вариантов модельных композиций с последующей диагностикой и стандартизацией сбора.

Сбор витаминный представляет собой многокомпонентную растительную композицию, содержащую 5 видов сырья: траву мелиссы лекарственной, листья крапивы, плоды рябины, шиповника, облепихи. Исходный состав данного сбора, доля каждого компонента выбраны и предложены с учётом данных о действии каждого компонента композиции на организм и группах БАВ, ответственных за определенное фармакологическое действие. С целью выбора оптимального соотношения входящих в сбор ингредиентов были изучены несколько вариантов соотношений (табл. 1).

Таблица 1 - Варианты сбора витаминного по содержанию растительных

компонентов

№ п/п Наименование ингредиентов сбора Варианты сбора по количеству входящих ингредиентов (г)

1 2 3 4

1 Трава мелиссы лекарственной 150 100 100 100

2 Листья крапивы 150 100 100 200

3 Плоды облепихи 200 200 150 150

4 Плоды рябины 250 300 300 200

5 Плоды шиповника 250 300 350 350

Для оценки содержания действующих веществ в исходной композиции из растительного сырья разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сборе в пересчёте на лютеолин методом УФ- спектрофотометрии. Содержание суммы флавоноидов в извлечении из сбора определяли при максимуме поглощения комплекса лютеолина с алюминия хлоридом при длине волны 390±5 нм.

Установлено, что наибольшее количество экстрактивных веществ и флавоноидов содержится в сухом концентрате, полученном экстракцией 1-го варианта сбора (табл. 2).

Таблица 2 - Содержание действующих и экстрактивных веществ в различных вариантах сбора витаминного

Объект исследования, варианты сбора Содержание экстрактивных веществ, % Содержание аскорбиновой кислоты, % Содержание суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин, %

1 вариант 21,50 0,52 0,47

2 вариант 9,26 0,48 0,37

3 вариант 11,52 0,52 0,41

4 вариант 13,71 0,53 0,35

Фармакологическими исследованиями, проведёнными в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН, доказано, что при повышении содержания основных компонентов сбора (плоды шиповника, рябины) не наблюдается увеличение его активности, т.е. имеет место плато. Выбранная композиция сбора, обладая поливитаминной активностью, проявляет заданные фармакологические свойства и оказывает на организм общеукрепляющее, иммуностимулирующее действие при практически отсутствующей токсичности.

Разработана технологическая схема получения сбора витаминного, включающая основные стадии:

ТП. 1. Измельчение и просеивание растительного сырья;

ТП.2. Получение готового продукта;

УМО.1. Фасовка и упаковка.

По данной технологической схеме наработано 5 серий сбора витаминного.

В результате определения внешних признаков сбора выявлены следующие его характеристики: внешние признаки: смесь неоднородных частиц измельченного растительного сырья зеленого цвета, с желтым оттенком и красными вкраплениями; запах: ароматный, своеобразный, пряный; вкус водного извлечения: пряно-сладковатый.

Методом микроскопического анализа были выявлены важнейшие морфолого-диагностические признаки сбора, соответствующие ГФ XI изд., из них наиболее значимыми являются: 1) плоды шиповника — обрывки мякоти плода, состоящего из тонкостенных паренхимных клеток, содержащие оранжево-красные глыбки каротиноидов и многочисленные друзы оксалата кальция; 2) плоды рябины - обрывки мякоти плода и

семенных гнезд, красно-оранжевые глыбки каротиноидов; 3) плоды облепихи - обрывки оранжево-красных многоугольных клеток; 4) листья крапивы - наличие одноклеточных ретортовидных волосков в сочетании с цепочками друз оксалата кальция; 5) трава мелиссы лекарственной -рассеянные на поверхности листа многочисленные сосочковидные и конусовидные волоски с бородавчатой поверхностью, наличие эфирномасличных железок.

При анализе порошкованной смеси проведено разделение по частоте встречаемости: наиболее часто встречаемые виды сырья - плоды шиповника, облепихи и рябины- около 70 %, менее встречаемые - листья крапивы и трава меллисы - около 30 %.

Проведен товароведческий анализ сбора витаминного и установлены следующие нормы по показателям: содержание общей золы - не более 8,0%, золы, нерастворимой в 10 % хлористоводородной кислоте, - не более 3%; массовая доля влаги - не более 14%; степень измельчения: частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм — не более 3%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм - не более 25%. Зараженность амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы не допускаются. Содержание радионуклидов регламентируется нормами СанПиН 2.3.2.560-96.

Определен коэффициент водопоглощения сбора витаминного, Кв- .

3,2±0,32.

Идентификация основных биологически активных веществ сбора витаминного

Качественный анализ сбора витаминного базировался на изучении в компонентах сбора основных групп БАВ, ответственных за его фармакологическое действие. Прежде всего, с использованием общих химических реакций было установлено в сборе и приготовленном из него (по инструкции) в настое наличие таких соединений как аскорбиновая кислота, аминокислоты, каротиноиды, органические кислоты, свободные сахара и полисахариды, флавоноиды, дубильные вещества. Предложены соответствующие качественные реакции, позволяющие установить подлинность сбора витаминного.

Для подтверждения подлинности сбора витаминного далее были использованы следующие методы: ТСХ - фенольных соединений, свободных Сахаров, свободных аминокислот, фитостеринов, каротиноидов; УФ-спектрофотометрия - фенольных соединений и каротиноидов; ВЭЖХ - органических кислот, Сахаров, фенольных соединений.

Исследование фенольных соединений проводилось методом ТСХ (сист.1). На хроматограммах в исследуемом растворе после проявления 5

% раствором фосфорномолибденовой кислоты в 95 % этаноле обнаружено 7 зон, которые идентифицированы со стандартами: 1^-0,13 (танин), ^ ~ 0,57 (рутин), и 0,69 (хлорогеновая кислота), ~ 0,82 (галловая кислота), Яг-0,95 (розмариновая кислота).

Кроме того, с применением метода ТСХ проведена идентификация БАВ из следующих групп:

- флавоноиды (система 3), идентифицированы 5 флавоноидных веществ, которых соответствует: рутину (0,45), гиперозиду (0,68), лютеолин-7-гликозиду (0,74), лютеолину (0,82), кверцетину (0,87);

- каротиноиды (спиртовое извлечение, система 4), идентифицирован Р-каротин — обнаружена соответствующая зона, окрашенная в синий цвет, с ~ 0,53;

- стерши (эфирные извлечения, система 6), идентифицирован р-фитостерин - зона, окрашенная в синий цвет, с 0,47;

- свободные сахара (водно-спиртовое извлечение, система 5). На хроматограмме испытуемого раствора выявлено 8 красно-фиолетовых зон, идентифицированы: ^ ~ 0,26 (галактоза); Я* = 0,30 (глюкоза); « 0,32 (фруктоза); 0,74 (рамноза);

- свободные аминокислоты (водное извлечение, система 7). На хроматограммах в исследуемых растворах после проявления 0,2 % раствором нингидрина обнаружены 9 окрашенных зон. Идентифицированы: зона с ~ 0,20 (аспарагиновая кислота); = 0,48 (глицин); ^~ 0,55 (глутаминовая кислота); Иг- 0,67 (метионин); 0,70 (фенилаланин); ^~ 0,72 (триптофан).

В результате изучения сбора витаминного методом УФ-спектрофотометрии на наличие каротиноидов обнаружены: р-каротин (цвет фракции - желтый; максимумы поглощения - 448,0 нм, 476,0 нм) и лютеин (цвет фракции желто-оранжевый, максимумы поглощения 445,5 нм, 473,0 нм)

С целью получения более полных данных о составе БАВ в сборе витаминном был применен метод ВЭЖХ. Для идентификации фенолъных соединений в сборе в качестве подвижной фазы использовали систему 8. Установлено, что метод ВЭЖХ позволяет идентифицировать 18 соединений, в том числе таких как: аскорбиновая, галловая, цикориевая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, неохлорогеновая, коричная, розмариновая кислоты, ЭГКГаллат, дикумарин, апигенин, эпикатехин, лютеолин-7-гликозид, гесперидин, изорамнетин, рутин, лютеолин (рис. 1).

И5ГП-1 | I-Г 1 I.....»--I-1-I-1-1—1-1-1-"I-Г—I-Г—

■ 1 4 в « 10 12 14 1« 1* 20 22 14 2« 21 30 32 34 36 шп

Рис. 1 - ВЭЖХ основных соединений в сборе витаминном

1 - аскорбиновая к-та, 2 - готовая к-та, 3 - ЭГКГаллат, 4-дикумарин, 5 -цикориевая к-та, 6 - не идентифицировано, 7 - хлорогеноеая к-та, 9 - кофейная к-та, 10 - феруловая к-та, 11 - не идентифицировано, 12 - не идентифицировано, 13 - неохлорогеновая к-та, 14 - апигенин, 15 - эпикатехин, 16 - лютеолин-7-гликозид, 17 - гесперидин, 18 - изорамнетин, 19 - рутин, 20 - лютеолин, 21 - коричная к-та, 22 - не идентифицировано, 23 - розмариновая к-та.

Кроме того, с применением метода ВЭЖХ проведена идентификация БАВ, относящихся к следующим группам:

- органические кислоты, в качестве подвижной фазы использовали систему 10. Идентифицированы 9 органических кислот: щавелевая, лимонная, винная, аскорбиновая, яблочная, янтарная, фумаровая, хлорогеновая, розмариновая кислоты, го них преобладающими являются винная, розмариновая и янтарная кислоты;

- сахара, в качестве подвижной фазы использовали систему 9. Установлено наличие свободных Сахаров: мальтоза, глюкоза, фруктоза и рамноза, преобладающими компонентами являются глюкоза и рамноза.

Вышеизложенное, указывает на целесообразность сочетания общих химических реакций с инструментальными методами для полноты идентификации БАВ в сборе витаминном.

Количественное определение основных БАВ проводили с использованием химических и физико-химических методов: для суммы свободных органических кислот, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ - титриметрия; для аминокислот, суммы фенольных соединений, Р-каротина и лютеина - УФ-спектрофотометрия; розмариновой кислоты -метод ВЭЖХ; эфирного масла - метод IГФ XI изд., вып.1.

Результаты проведенных исследований и данные статистической обработки приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты количественного определения БАВ в сборе витаминном

БАВ I Хср.,% в1 в Р,% АХ Е,%

свободные органические. кислоты 4 1,27 0,0001 0,007 95 2,78 0,008 0,63

аскорбиновая кислота 4 0,52 0,0002 0,015 95 2,78 0,020 4,41

дубильные вещества 4 2,37 0,0016 0,040 95 2,78 0,050 2,11

аминокислоты 4 0,67 0,0001 0,010 95 2,78 0,012 1,85

оксикоричные кислоты 4 17,40 0,4050 0,636 95 2,78 0,790 4,54

Р-каротин 4 1,20 0,0025 0,050 95 2,78 0,062 5,17

лютеин 4 1,50 0,0050 0,071 95 2,78 0,088 5,86

эфирное масло 4 0,11 0,0001 0,010 95 2,78 0,012 10,90

розмариновая кислота 4 1,00 0,0025 0,050 95 2,78 0,062 3,10

На основании проведенных исследований составлены нормативные документы ТУ, ТИ и Рецептура на БАД к пище «Арура Тан №11».

Разработка методик количественного определения основных групп действующих веществ в сборе витаминном

Количественное определение проводили по сумме флавоноидов и сумме полисахаридов, принимая во внимание данные о широком спектре фармакологической активности и о их наличии в сборе. Определение суммы флавоноидов основано на спектрофотометрировании водно-спиртового извлечения из сбора. Для разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на

лютеолин подобраны условия анализа (кратность экстракции, выбор экстрагента, температура, степень измельченности).

Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальное содержание суммы флавоноидов в спиртовом извлечении наблюдается при двукратном экстрагировании сбора, предварительно измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито - 1 мм, экстрагентом - 70 % спиртом этиловым, на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч при соотношении сырья и экстрагента 1:20. Установлено, что комплексы стандартного образца лютеолина и извлечения го сбора с алюминия хлоридом демонстрируют аналогичные кривые поглощения, а также максимумы поглощения - при длине волны для лютеолина 390±5 нм, для извлечения сбора - 394±5 нм. В связи с этим для аналитических целей была выбрана длина волны 390 нм (рис. 2,3).

Рис.2 УФ-спектр 70 % спиртового извлечения

Рис. 3 УФ спектр стандарта - лютеолина

Согласно полученным результатам проведенных исследований, количественное содержание суммы флавоноидов в сборе витаминном колеблется в пределах 0,45 % (табл. 4).

Таблица 4 - Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения флавоноидов в сборе витаминном в пересчете на лютеолин-стандарт

п f Р,% Х.р.,% в2 в АХ Е,%

5 4 95 2,78 0,45 0,004 0,02 0,048 5,5

Достоверность предложенной методики спектрофотометрического определения суммарного содержания флавоноидов в сборе подтверждена опытами с добавками лютеолина.

Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе витаминном в пересчете на лютеолин — стандарт с 95 % вероятностью составляет ± 5,5 %. Результаты опыта с добавками лютеолина указывают на отсутствие систематической ошибки предложенной методики.

В связи с тем, что в водном извлечении содержатся также полисахариды и свободные сахара, предложена вторая методика их количественного определения.

Для количественной оценки полисахаридов использован метод спектрофотометрического определения полисахаридов, используемый при количественной оценке полисахаридов алтея лекарственного, основанный на реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде, после кислотного гидролиза и использовании глюкозы в качестве стандартного образца. Оптическую плотность испытуемого раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 460 ± 2 им.

Установлено, что продукт взаимодействия извлечения из сбора с пикриновой кислотой имеет спектральную кривую, идентичную спектральной кривой комплекса глюкозы с пикриновой кислотой. Достоверность предложенной методики определения содержания полисахаридов в сборе проверялась опытами с добавками глюкозы. В среднем содержание полисахаридов в сборе витаминном составило 5,34 % в пересчете на глюкозу (табл. 5).

Таблица 5 — Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения полисахаридов в сборе, в пересчете на PCO глюкозы

п f Р,% t(P,f) V/o S1 S АХ E,%

5 4 95 2,78 5,34 0,023 0,15 0,188 3,52

Относительная ошибка методики количественного определения полисахаридов в сборе витаминном в пересчете на глюкозу с 95 % вероятностью составляет ± 3,52 %. Результаты опыта с добавками глюкозы свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предложенной методики.

Все методики количественного определения указанных БАВ валидированы.

Разработка способа получепия и стандартизация экстракта сухого на основе сбора витаминного

Для определения оптимальных условий экстракции сырья, характеризующихся максимальным содержанием экстрактивных веществ и флавоноидов, изучены влияние выхода их от экстрагента, температурного режима, соотношения массы сырья и объема экстрагента, времени и кратности экстракции.

Установлено, что оптимальными условиями являются: экстрагент спирт этиловый 50 %, обеспечивающий выход 98,0 % суммы флавоноидов, содержащихся в исходном сырье; размер частиц - 2-3 мм; температура -60±5 °С; данный температурный режим обеспечивает высокий выход экстрактивных и биологически активных веществ при относительно невысоких затратах электроэнергии; соотношение фаз (сырье -экстрагент) - 1:5; время экстракции - 2 часа, кратность - 3; при этом при первом контакте в извлечение переходит 79 ± 5 % экстрактивных веществ и флавоноидов, при втором - 15 % и 2-3 % - при третьем контакте.

На основании вышеизложенного была разработана технологическая схема производства экстракта сухого из сбора витаминного (рис. 4).

Рис. 4 - Технологическая схема производства экстракта сухого из сбора

витаминного

Анализ готового продукта и отходов производства (шрот) осуществляли спектрофотометрическим методом по сумме флавоноидов, в пересчёте на лютеолин. Экстракт сухой, полученный из сбора витаминного представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до коричневого цвета со специфическим запахом, гигроскопичен, насыпная масса экстракта при свободном падении - 0,48 г/см3, при уплотнении - 0,76 г/см3, сыпучесть — 1,90 г/сек, угол естественного откоса 35-37 Потеря в массе при высушивании при 100-105 °С не должна превышать - 5 %.

Наличие основных групп БАВ в экстракте сухом было подтверждено качественными реакциями (флавоноиды, полисахариды, дубильные вещества, сахара, аскорбиновая кислота), физико-химическими методами: УФ-спектрофотометрия - фенольные соединения, каротиноиды; ТСХ — фенольные соединения, свободные сахара, свободные аминокислоты, фитостерины, каротиноиды; ВЭЖХ - органические кислоты, сахара, фенольные соединения. Результаты количественного содержания основных БАВ в экстракте сухом сбора витаминного представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Количественное содержание и метрологические характеристики биологически активных веществ в экстракте сухом

БАВ { Хер.» % Б2 в Р,% t (Р,0 ДХ Е,%

1 2 3 4 5 6 7 8 9

флавоноиды 4 1,43 0,0038 0,060 95 2,78 0,076 5,30

полисахариды 4 13,02 0,2570 0,507 95 2,78 0,629 4,80

органические кислоты 4 3,49 0,0025 0,050 95 2,78 0,060 1,72

дубильные вещества 4 5,34 0,1444 0,380 95 2,78 0,470 8,80

Р-каротин 4 0,72 0,0009 0,030 95 2,78 0,037 5,14

лютеин 4 0,91 0,0011 0,033 95 2,78 0,041 4,51

аминокислоты 4 1,68 0,0006 0,025 95 2,78 0,031 1,86

розмариновая кислота 4 7,08 0,0320 0,179 95 2,78 0,223 3,15

оксикоричные кислоты 4 26,01 0,9520 0,976 95 2,78 1,210 4,65

аскорбиновая кислота 4 1,40 0,0016 0,040 95 2,78 0,050 3,57

Состав экстракта сухого по полученным результатам исследований близок исходной композиции сбора витаминного. Исходя из полученных

данных, можно сделать вывод, что по качественному составу происходит переход основных БАВ из сбора в экстракт сухой, что, в свою очередь, подтверждает рациональность разработанной технологии его получения.

Для количественной стандартизации экстракта сухого из сбора витаминного предлагается использовать разработанные ранее методики количественного определения по сумме флавоноидов и полисахаридов в сборе.

Относительная ошибка единичного определения суммы флавоноидов в экстракте сухом не превышает 5,3 %, для суммы полисахаридов — 4,83 %. Для проверки отсутствия систематической ошибки проведены эксперименты с добавками PCO лютеолина - стандарта и PCO глюкозы.

Проведены исследования по установлению сроков годности экстракта сухого. При хранении в обычных условиях показатели качества определялись через каждые 6 месяцев, установлен предварительный срок годности — 2 года.

На основании полученных данных составлен проект Фармакопейной статьи предприятия на экстракт сухой.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Экспериментально обоснован состав многокомпонентного растительного витаминного сбора для получения экстракта сухого с учетом вклада входящих ингредиентов в проявлении фармакологического действия.

2. Установлены диагностически значимые признаки сбора витаминного, характеризующиеся в особенностях клеток эпидермы плодов, наличием эфирномасличных железок, наличием обрывков ретортовидных волосков, цепочек друз оксалата кальция и многочисленных обрывков сосочковидных и конусовидных волосков; определены его товароведческие показатели, проведена качественная и количественная оценка содержания основных групп БАВ в сборе: аскорбиновой кислоты - 0,52 %, розмариновой кислоты - 1,00 %, аминокислот - 0,67 %, эфирного масла - 0,11 %, ß-каротина и лютеина -1,20 и 1,50 % (соответственно), органических и оксикоричных кислот -1,27 и 17,40 % (соответственно), дубильных веществ - 2,37 %.

3. Разработан способ получения и составлена технологическая схема производства экстракта сухого на основе сбора витаминного: установлено, что выход продукта на заключительной стадии производства составляет 90,44 %, выход от начала процесса - 86,98 %.

4. Определен качественный и количественный состав БАВ в экстракте сухом: аскорбиновой кислоты - 1,40 %, розмариновой кислоты -

7,08 %, аминокислот - 1,68 %, ß- каротина и лютеина - 0,72 и 0,91 % (соответственно), органических и оксикоричных кислот - 3,49 и 26,01 % (соответственно), дубильных веществ - 5,34 %. Разработаны показатели стандартизации сбора и экстракта сухого по доминирующим биологически активным веществам; разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на PCO лютеолина (0,45 % в сборе и 1,43 % в экстракте сухом), суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу (5,34 % в сборе и 13,02 % в экстракте сухом).

5. Разработаны и внедрены проекты нормативной документации на сбор витаминный, на экстракт сухой составлен проект ФСП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Решетова, В.О. Лекарственное растение мелисса лекарственная в гомеопатии и народной медицине, изучение морфолого-анатомических признаков /В.О. Решетова, A.A. Маркарян, Т.Д. Даргаева // Гомеопатический ежегодник. - М., 2011. - С. 226-227.

2. Решетова, В.О. ВЭЖХ анализ пятикомпонентного сбора витаминного /В.О. Решетова, A.A. Маркарян // Традиционная медицина. -2012.-№5.-С. 291-296.

3. Решетова, В.О. Обзор витаминно-минеральных комплексов и биологически активных добавок к пище на фармацевтическом рынке /' И,Ю. Глазкова, М.А. Ярошенко, В.О. Решетова, И.А. Тарраб, О.В. Евдокимова // Традиционная медицина. - 2012. —№ 5. - С. 17-25.

4. Решетова, В.О. Идентификация фенольных соединений в сборе витаминном методом тонкослойной хроматографии /В.О. Решетова, Я.В. Пешкова, A.A. Маркарян // Естественные и технические науки. — 2012. — № 1.-С. 145-148.

5. Решетова, В.О. Пищевые растения как источник средств для снижения риска развития заболеваний желудочно-кишечного тракта /Л.В. Пешкова, О.В. Евдокимова, И.А. Тарраб, В.О. Решетова // Естественные и технические науки. - 2012. - №1. - С. 142-143.

6. Решетова, В.О. Количественное определение содержания ß-каротина и лютеина в сборе витаминном /В.О. Решетова, A.A. Маркарян // «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика»: Материалы международной заочной научно-практической конференции. - Воронеж, 2013. № 2 (2) - С. 85-90.

7. Решетова, В.О. Разработка технологии получения сухого экстракта на основе сбора витаминного /В.О. Решетова, A.A. Маркарян // «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и

практика»: Материалы международной заочной научно-практической конференции. -Воронеж, 2013. № 2 (2) - С. 91-100.

8. Решетова, В.О. Разработка состава пятикомпонентного витаминного сбора / В.О. Решетова // «Проблемы разработки новых лекарственных средств»: Материалы Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - М., 2013. - С. 99.

9. Решетова, В.О. Характеристика состояния и динамика ассортимента лекарственных сборов /В.О. Решетова, А.А. Маркарян // Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. - 2013. - Т. 8., № 2. - С. 80-84.

10. Reshetova, V.O. "The influence of complex phytotherapeutic agent on respiratory function in patients with chronic bronchitis" /A.G. Barsegyan, V.O. Reshetova, L.N. Shantanova // Обзоры по клинической фармакологии и . лекарственной терапии. -2013.-Т. 11.-С. 13.

11. Reshetova, V.O. "The influence of complex phytotherapeutic agent on the immune status of patients with chronic bronchitis" /A.G. Barsegyan, V.O. Reshetova, L.N. Shantanova // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2013. - Т. 11. - С. 14.

Подписано в печать 28.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ № 44.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.