Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка и стандартизация методов контроля качества разветвленного олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида

На правах рукописи—

ШАТАЛОВ ДЕНИС ОЛЕГОВИЧ

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА РАЗВЕТВЛЕННОГО ОЛИГОГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИН ГИДРОХЛОРИДА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

28 ОКТ 2015

Самара-2015

005563907

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Кедик Станислав Анатольевич

Официальные оппоненты: Петр Петрович Пурыгин - доктор химических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение «Самарский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, кафедра органической, биоорганической и медицинской химии, заведующий кафедрой. Ольга Георгиевна Потанина — доктор фармацевтических наук, федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации; Центр коллективного пользования (научно-образовательный центр); Центр научных исследований и разработок Центра коллективного пользования, директор Центра.

Ведущая организация: федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова», Федерального агентства научных организаций, г. Москва

Защита состоится «04» декабря 2015 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (443001, г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171) и на сайте (http://vvww.samsmu.ru/science/referats) государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат диссертации разослан «/3 » октября 2015 г Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент

Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционные болезни - одна из самых распространенных групп заболеваний человека в настоящее время (Покровский В.И, 2010). В первой половине XX века были достигнуты значительные успехи в борьбе с инфекционными болезнями, однако на сегодняшний день они по-прежнему играют существенную роль в патологии человека и наносят огромный экономический ущерб обществу. Во многих странах ситуация усугубляется неблагоприятной социально-экономической обстановкой; тем не менее, во всем мире, независимо от уровня экономического развития, отмечается рост заболеваемости инфекционными болезнями, и даже регистрируются эпидемии (\Veijia X., 2014).

Указанные факты свидетельствует о возрастающем распространении болезней, возбуждаемых патогенной микрофлорой. Одной из причин этой проблемы является приобретение микроорганизмами резистентности к существующим лекарственным препаратам (РаэЬе^-ОаиЫ С., 2014), что делает их малоэффективными, либо вызывает необходимость повышения дозы препарата. Все это обусловливает необходимость создания новых фармацевтических субстанций с широким спектром антимикробного действия.

В качестве действующего вещества новых лекарственных препаратов перспективно использовать олиго- и полимерные биоциды, которые обладают относительно низкой токсичностью и высокой эффективностью действия на микроорганизмы. Среди указанных биоцидов следует отметить полигуанидины - вещества, содержащие в своем составе гуанидиновые фрагменты (рис. 1).

| 12 2 субстанции, пригодной для создания

различных готовых лекарственных

Рис. 1. Структура гуанидинового фрагмента

форм на её основе.

Наиболее оптимально использовать существующее производство разветвленного ОГМГ гидрохлорида (ОГМГ-ГХ) (Кедик С.А., 2012), который обладает высокой эффективностью по отношению к широкому спектру патогенной микрофлоры и низкой токсичностью в отношении человека. Отметим, что серьезным препятствием для применения ОГМГ-ГХ и других полигуанидинов в качестве фармацевтической субстанции является недостаточно полный и точный контроль качества, осуществляющийся на производстве: он охватывает узкий перечень параметров, а аналитические методы не позволяют получать достоверных данных.

ын

Высокая эффективность действия полигуанидинов дает возможность предложить их использование в

качестве

фармацевтической

В связи с этим, разработка достоверных методов контроля качества разветвленного ОГМГ-ГХ по параметрам, регламентируемым нормативной документацией и необходимым для его применения в качестве фармацевтической субстанции, а также разработка методов для контроля препаратов на основе разветвленного ОГМГ-ГХ, является важной и актуальной задачей. Её решение позволит провести дальнейшие мероприятия по регистрации фармацевтической субстанции и созданных на ее основе эффективных препаратов для борьбы с инфекционными заболеваниями. Степень разработанности темы. Вопросами изучения полиалкиленгуанидинов занималось большое количество исследователей. Гембицкий П.А., Воинцева И.И. внесли огромный вклад в развитие направления синтетических биоцидных полимеров, разрабатывая условия синтеза, изучая их свойства и находя различные сферы применения. В работах Абрикосовой Ю.Е. и Ха К.А. отражены исследования в области применения различных солей полигуанидинов в качестве фармацевтических субстанций, создания и стандартизации на их основе лекарственных форм. Однако полученные результаты так и не нашли практического применения, а разработанные методы контроля качества не учитывают ряд особенностей строения используемых веществ, что в свою очередь является залогом определенной погрешности.

В то же время, существует реализованное производство разветвленного ОГМГ-ГХ данное соединение по многим характеристикам превосходит ряд существующих солей полиалкиленгуанидинов, но не применяется в фармации и не имеет достоверных методов контроля.

Таким образом, актуальным является изучение, разработка и стандартизация методов контроля качества разветвленного ОГМГ-ГХ для использования данного соединения в качестве фармацевтической субстанции. Цель и задачи исследования: Целью диссертационной работы является изучение, разработка и стандартизация методов контроля качества разветвленного ОГМГ-ГХ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• выявить связи и закономерности между химической структурой

(молекулярная масса и степень разветвления) и свойствами (показатель преломления, температура стеклования) ОГМГ-ГХ;

• предложить экспресс-метод оценки молекулярно-массовых характеристик

олигомера по его температуре стеклования;

• разработать:

о методику количественного определения основного действующего вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ и провести ее валидацию;

о методику количественного определения мономерной примеси ГТХ в

разветвленном ОГМГ-ГХ и провести ее валидацию; о методику количественного определения мономерной примеси ГМДА в

разветвленном ОГМГ-ГХ и провести ее валидацию; о методику количественного определения разветвленного ОГМГ-ГХ в препаратах на его основе, провести ее испытания и валидацию с использованием многокомпонентных модельных смесей;

• предложить программно-аппаратный комплекс, позволяющий проводить

количественное определение ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе;

• составить и апробировать нормативную документацию (проект НД) для

субстанции.

• разработать технические условия для осуществления производства субстанции.

Научная новизна. Научная новизна заключается в установлении корреляций между химической структурой и свойствами ОГМГ-ГХ, позволившими разработать новый экспресс-метод оценки молекулярно-массовых характеристик олигомера, а также новых методик определения содержания остаточных мономеров (гексаметилендиамина и гуанидингидрохлорида) в условиях их низких концентраций в субстанции и содержания основного вещества (разветвленного ОГМГ-ГХ) в субстанции. Разработано программное обеспечение, интегрированное в аналитический комплекс приборов, что позволяет проводить определение ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

• методы стандартизации субстанции «ДЕЗАПОЛ» (проект нормативной документации (НД) на субстанцию «ДЕЗАПОЛ», апробированный ЗАО «Институт фармацевтических технологий», 04.09.13; акт внедрения от 09.04.15; технические условия ТУ 9300-006-83188314-2013);

• аналитический комплекс приборов для определения ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе (заявка на патент на полезную модель, (регистрационный № 2015109857);

• основные положения и результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры биомедицинских и фармацевтических технологий МИТХТ имени М.В. Ломоносова (акт внедрения от 25.05.15).

Положения, выносимые на защиту:

• результаты экспериментальных исследований по выявлению связей и закономерностей между молекулярной структурой (молекулярная масса и

5

степень разветвления) и свойствами (показатель преломления, температура стеклования) ОГМГ-ГХ, и разработанный на их основе экспресс-метод оценки молекулярно-массовых характеристик вещества;

• результаты экспериментальных исследований по разработке и валидации методики определения основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ;

• результаты экспериментальных исследований по разработке и валидации методики определения мономерной примеси ГГХ в разветвленном ОГМГ-ГХ;

• результаты экспериментальных исследований по разработке и валидации методики определения мономерной примеси ГМДА в разветвленном ОГМГ-ГХ;

• результаты экспериментальных исследований по разработке и валидации методики определения разветвленного ОГМГ-ГХ в многокомпонентных лекарственных препаратах на его основе;

• результаты создания программного обеспечения, интегрированного в аналитический комплекс приборов, для определения разветвленного ОГМГ-ГХ в многокомпонентных лекарственных препаратах на его основе.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке и обсуждении основных идей диссертации, а также анализе экспериментальных результатов. Самостоятельно провел обзор и анализ литературы (в том числе, анализ требований нормативной документации, регламентирующей критерии, предъявляемые к разработке методов контроля качества фармацевтических субстанций), а также выполнил основной объем экспериментальных исследований, включая разработку чувствительных методик контроля качества фармацевтической субстанции на основе ОГМГ-ГХ. Диссертантом полностью выполнено оформление результатов диссертации в виде публикаций, научных докладов и рукописи диссертации.

Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертация. Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры биомедицинских и фармацевтических технологий федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» (НИР 2Б-18-357).

Диссертация соответствует паспорту специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 3 паспорта специальности «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Достоверность полученных результатов достигается благодаря использованию современных химических и физико-химических методов, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. Исследования по разработке и валидации методов контроля качества: примесные соединения, содержание основного вещества, экспресс-метод оценки молекулярно-массовых характеристик вещества, определение низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ и др. - производились с помощью ВЭЖХ-хроматографа, УФ-спектрофотометра, универсального лабораторного рефрактометра, фотоколориметра, ЯМР-спектрометра, дифференциального сканирующего калориметра, автоматического весового титратора-дозатора и специализированного программного обеспечения (Beckman Coulter LS, Хроматэк - Аналитик, Aquilon Control Center, UVWin). Результаты измерений обработаны математическим методом и являются статистически достоверными (Microsoft Excel 2010).

Основные положения диссертационной работы доложены на I международной интернет-конференции «На стыке наук. Физико-химическая серия», (г. Казань, 2013), V молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2013» (г. Москва, 2013), III международной научно-практической конференции «Перспективы развития научных исследований в 21 веке» (г. Махачкала, 2013), Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Спектрометрические методы анализа» (г.Казань, 2013), международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» (г. Москва, 2014), научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» (г. Москва, 2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (г. Санкт-Петербург, 2014).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 работ, из них 4 - в научных изданиях, входящих в перечень ВАК министерства образования и науки Российской Федерации.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (объекты и методы), обсуждения результатов исследований, выводов, списка литературы, а также приложений. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель включает 112 источников, из них 78 на иностранных языках.

Во введении изложены актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы. Первая глава отражает информацию по основным классам веществ используемых длительное время в фармацевтике для борьбы с патогенной микрофлорой. В качестве перспективной субстанции обладающей широким спектром антимикробного действия предложен разветвленный ОГМГ-ГХ, обозначены проблемы связанные с его использованием. В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования. Глава 3 отражает результаты позволившие: выявить взаимосвязи между структурой и свойствами разветвленного ОГМГ-ГХ, разработать методы определения примесей исходных мономеров и содержания основного вещества. В главе 4 приведены результаты разработки методов контроля содержания разветвленного ОГМГ-ГХ во многокомпонентных препаратах на его основе.

В Приложение вынесены акты внедрения, проект НД «ДЕЗАПОЛ», протоколы валидации разработанных методов контроля, технические условия на сополимер гексаметилендиамина и гуанидин гидрохлорида «ДЕЗАПОЛ ГХ», уведомление о поступлении заявления о выдаче патента Российской Федерации, учебно-методическое пособие «Практикум по физико-химическим методам в биотехнологии».

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, в формулах, на рисунках, которые приведены в тексте диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Объекты и методы исследования

В работе использовали разветвленный ОГМГ-ГХ производства ЗАО «Институт Фармацевтических Технологий» (Россия). При разработке методов контроля примесных соединений использовали гексаметилендиамин (ГМДА) и гуанидина гидрохлорид (11X) (в качестве стандартов), 9-флуоренилметил хлорформиат (FMOC) и о-фталевый альдегид (в качестве флуоресцентных меток), пентадецилсульфонат натрия и октодецилсульфонат натрия (в качестве ион-парных реагентов).

Бензалкония хлорид, лидокаина гидрохлорид и ментол - основные компоненты, использованные для приготовления моделей препаратов на основе разветвленного ОГМГ-ГХ, которые применялись на этапе разработки метода и установки определения разветвленного ОГМГ-ГХ.

Для определения температуры стеклования промышленных серий разветвленного ОГМГ-ГХ использовали метод ДСК. Эксперимент проводили на высокоточном дифференциальном сканирующем калориметре Netzsch DSC

s

204F1 Phoenix 240-12-0070-L (диапазон температур 20-300 °C, при постоянной скорости нагрева 10 К/мин).

Для анализа структурных характеристик используемых промышленных серий разветвленного ОГМГ-ГХ использовали метод ЯМР 13С. Эксперимент проводили на ЯМР-спектрометре Bruker DPX-300 при рабочей частоте на протонах не менее 200 МГц и температуре 30 °С в режиме Inverse Gate. Определяли степень разветвления и среднечисловую молекулярную массу.

Разработку и валидацию метода определения мономерных примесей (ГТХ и ГМДА) проводили с использованием хроматографа «Стайер» (Аквилон, Россия), с колонкой Luna Cig(2), 250x4,6 мм, 5 мкм. Для оценки возможности осуществления прямого детектирования определяемых соединений применяли метод УФ-спектрофотометрии. Измерения проводились на спектрофотометре СФ-104 (толщина поглощающего слоя кюветы 1 см, диапазон длин волн: 190-540 нм) при 25°С.

При разработке метода определения основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ предварительно проводили оценку возможности использования существующих методов контроля с помощью ВЭЖХ (на оборудовании, использованном при контроле примесей исходных мономеров) и фотоколориметрии, на фотоэлектроколориметре ФЭК 03-01 (толщина поглощающего слоя кюветы 5 см, рабочая длина волны 540 нм) с использованием красителя Эозин Н. Исследования по дальнейшей разработке и валидации осуществлялись методом рефрактометрии, по традиционной методике, с помощью рефрактометра УРЛ-1 с термостатируемым блоком призм при 25 °С.

На этапе разработки и валидации метода контроля низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе в качестве анализируемых образцов использовались модельные смеси с содержанием ОГМГ-ГХ 1 мг/мл. Концентрацию вещества определяли через общее содержание азота в смеси с помощь метода Къельдаля, на приборе для сжигания Дигестор DKL 8 (VELP Scientifica) с набором колб для сжигания, с использованием прибора для перегонки: полуавтоматический дистиллятор UDK 139 (VELP Scientifica), титровальной бюреткой, автоматическим и весовым титратором-дозатором «Титрион-рН».

Валидацию разработанных методов контроля проводили по параметрам и критериям, приведенным в таблицах 1, 2.

2. Разработка методов контроля качества разветвленного ОГМГ-ГХ 2.1. Контроль молекулярно-массовых характеристик разветвленного ОГМГ-ГХ

Известно, что одним из свойств, чувствительных к измерению молекулярно-массовых характеристик аморфных олиго- и полимеров, является их температура стеклования (7^), которую в ряде случаев можно определить быстрее и проще, чем оценивать молекулярную структуру методом 13С ЯМР. Поэтому для нескольких серий опытных образцов ОГМГ-ГХ были проведены исследования, позволившие установить взаимосвязь с молекулярной массой ОГМГ и количеством разветвлений, приходящихся на его молекулу (рис. 2).

Для проведения дальнейших исследований были выбраны пять промышленных серий разветвленного ОГМГ-ГХ с наиболее отличающимися структурными

характеристиками. Для них методом ДСК определена температура стеклования (рис. 3).

юоо

800

600 -

400 -

200 -

1660,6х + 212,94

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 ^ разе

Рис. 2. Взаимосвязь между среднечисловой молекулярной

массой и количеством разветвлений, приходящихся на одну молекулу ОГМГ, определенными методом 13С ЯМР

ДСК/(мВт/мг) жю

>.1-

-0.5

Начала: ПО 'С 7~ & 'С Кэкви: ШЛ 'С

^49

150 200

Температура Г С

300

ДЯТМфЮМ : К.ваз Я 11'%» ЯЧщитШ 1

• Здщ 3355583_

8юв*г9*: гДОЗХДОммюЯЗЕ

Рис. 3. Типичная ДСК-термограмма разветвленного ОГМГ-ГХ

Сопоставление молекулярных характеристик выбранных образцов ОГМГ-ГХ и определенной для них температуры стеклования показало, что между Мп и существует определенная корреляция (рис. 4).

100 п Та

90

80

70

60

50

у = 0,0119х + 66,906

500

1000

М „

1500

Рис. 4. Корреляция между среднечисловой молекулярной массой и температурой стеклования в промышленных образцах ОГМГ-ГХ Исходя из полученных результатов, молекулярную массу ОГМГ можно выразить формулой 1, а среднее число разветвлений на молекулу ОГМГ формулой 2.

Т -66.91 - (1)

0.0119 Г-69.44

п,

(2)

19.76

Для ОГМГ с М„<800 Да ошибка определения обоих параметров не превышает 5%.

Таким образом, по значениям температуры стеклования ОГМГ-ГХ можно оценить их молекулярные характеристики: среднечисловую молекулярную массу и степень разветвления. Это быстрее, аппаратно доступнее и дешевле по сравнению с методом ЯМР 13С спектроскопии.

2.2. Разработка и валидация метода контроля мономерной примеси ГМДА в разветвленном ОГМГ-ГХ 2.2.1. Разработка метода контроля мономерной примеси ГМДА в разветвленном ОГМГ-ГХ

Предварительно был зарегистрирован УФ-спектр водного раствора стандарта вещества с концентрацией, соответствующей предельному значению содержания вещества в ОГМГ-ГХ (0,3 %). Отсутствие поглощения на нем свидетельствует о невозможности прямого детектирования примеси ГМДА в

анализируемом веществе. Поэтому было принято решение использовать ВЭЖХ-метод с модификацией искомого продукта с помощью оптической метки.

Для детектирования низких концентраций определяемого вещества при помощи УФ-детектора необходимо использование дериватизирующего агента. Из набора доступных дериватизаторов были выбраны о-фталевый альдегид и РМОС. Показано, что применение о-фталевого альдегида нецелесообразно из-за нестабильности образующегося комплекса. Поэтому были проведены эксперименты с использованием в качестве дериватизирущего агента РМОС. ВЭЖХ-хроматограммы свежеприготовленной пробы с РМОС и ее повторный анализ через 1 час (рис. 5). Хроматограммы свидетельствуют об идентичности отклика анализируемого вещества при первоначальном и повторном (через 1 час) анализе пробы: площади пика ГМДА равны 250,32 в обоих случаях. Таким образом, обеспечивается воспроизводимость количественного определения ГМДА на протяжении длительного времени.

«Г 5®!(а)

V1..........!.....

Ь *-Т"--:---Л

Рис. 5. ВЭЖХ-хроматограммы свежеприготовленного (а) раствора ГМДА в присутствии ИМОС и этого же раствора через 1 час (б).

2.2.2. Вачидация метода контроля мономерной примеси ГМДА в разветвленном ОГМГ-ГХ

Валидацию разработанного метода проводили по параметрам и критериям, указанным в табл. 1. Результаты, приведенные в табл. 1, полностью удовлетворяют предъявленным критериям приемлемости, что подтверждает валидацию методики контроля содержания мономерной примеси ГМДА в разветвленном ОГМГ-ГХ.

Таблица 1.

Результаты валидации разработанных методов контроля

мономерных примесей ГМДА и ГГХ в разветвленном ОГМГ-ГХ

Параметр валидации Критерии приемлемости Результаты

ГМДА ГГХ

Специфичность Должны отсутствовать пики, мешающие определению, в том числе, пик растворителя. ГМДА имеет четкий пик в области времени удерживания 14,015,0 минут, который не перекрывается с пиками, других компонентов. Пик растворителя в этой области времен отсутствует. ГГХ имеет четкий пик в области времени удерживания 4,04,5 минут, который не перекрывается с пиками, других компонентов. Пик растворителя в этой области времен отсутствует.

Диапазон применения Линейность Коэффициент корреляции >0,990 1.0 0,9998

Правильность Фактор отклика: среднее значение 97,5-102,5% 100,14 100,2

Относительное стандартное отклонение < 5,0% 0,17 0,35

доверительный интервал должен включать 100% 100,00-100,30 99,95-100,49

Прецизионность по параметру сходимость Серия 1: относительное стандартное отклонение <4,0% (количество измерений п>6) 0,449 2,91

та параметру промежуточная прегртюнность Серия 2: относительное стандартное отклонение <4,0% (количество измерений п>б)С15 0,884 2,47

критерий Фишера Р < Р табл (5,05%) 3,93 1,37

Предел количественного определения < 1,560 мкг/мл для ГМДА < 70,0 мкг/мл для ГГХ 0,056 14,97

2.3. Разработка и валидация метода контроля мономерной примеси ГГХ в разветвленном ОГМГ-ГХ

2.3.1. Разработка метода контроля мономерной примеси ГГХ в разветвленном ОГМГ-ГХ

Предварительно полученный УФ-спектр водного раствора стандарта вещества (ГГХ) свидетельствует, о том что максимум поглощения у раствора с концентрацией 17,5 мкг/мл наблюдается при длине волны 195 нм. Это означает возможность прямого детектирования анализируемого вещества. Наиболее оптимально проводить анализ ГГХ в разветвленном ОГМГ-ГХ на том же оборудовании, которое применяется для разработанного ранее метода определения ГМДА, исходя из чего, использовали ВЭЖХ.

Так как определяемое вещество в нормальной и кислой среде находится в ионной форме, которая обусловливает нестабильное состояние ГТХ во время проведения ВЭЖХ анализа, при разработке метода использовался ион-парный реагент. Он переводит анализируемое вещество в гидрофобный комплекс, который является более стабильным. Данное решение позволит обеспечить приемлемую воспроизводимость разрабатываемого метода. В связи с этим были проведены эксперименты с использованием в качестве ион-парных реагентов пентадецилсульфоната натрия и октодецилсульфоната натрия. Оказалось, что при использовании пентадецилсульфоната натрия время выхода пика ГГХ меньше, по сравнению с октодецилсульфонатом натрия (рис. 6). Также в пользу выбора пентадецилсульфоната натрия свидетельствует то, что его углеводородная цепь и молекулярная масса меньше, чем у октодецилсульфоната натрия. Это обеспечит более быструю и полную регенерацию хроматографической колонки от ион-парного реагента.

В техническом отношении разработанный метод позволяет проводить анализ на оборудовании и условиях, которые используются при определении примеси ГМДА, что обеспечивает удобство воспроизведения методов контроля.

2.3.2. Валидация метода контроля мономерной примеси ГГХ в разветвленном ОГМГ-ГХ

Валидацию разработанного метода проводили по параметрам и критериям, указанным в табл. 1 Результаты, приведенные в табл. 1, полностью удовлетворяют предъявленным критериям приемлемости, что подтверждает валидацию методики контроля содержания мономерной примеси ГТХ в разветвленном ОГМГ-ГХ.

Рис. 6. ВЭЖХ-хроматограммы раствора ГГХ с использованием октодецилсульфоната натрия (а) и пентадецилсульфоната натрия (б)

2.4. Разработка и валидация метода определения основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ

2.4.1. Разработка метода определения основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ

В качестве метода контроля предложено использовать рефрактометрическое определение содержания разветвленного ОГМГ-ГХ. Экспериментально определены зависимости показателя преломления растворов ряда промышленных серий ОГМГ-ГХ от их концентрации (рис. 7).

1,42 п„(25 °С) Установлено, что фракционный состав

1,40 ■ ОГМГ-ГХ разных серий практически не влияет на

1,38 *1 концентрационную зависимость показателя

1,36 □ 2 преломления, что дает

АЗ 01 05 Мб основание использовать ее

1,34 в качестве калибровочной зависимости для

1,32 д7 количественного

10 20 30 40 50 [огмг-гх], мас.% определения ОГМГ-ГХ в образцах.

Рис. 7. Концентрационные зависимости показателя преломления

растворов промышленных серий разветвленного ОГМГ-ГХ

В соответствии с полученной калибровочной прямой, содержание основного вещества (Р) в образцах ОГМГ-ГХ следует определять по формуле 3.

р (п%-п»)-т ■а-

где "о - показатель преломления анализируемого раствора при 25 °С;

и25

00 - показатель преломления дистиллированной воды при 25 °С,т - масса раствора, г;

а - масса анализируемого образца, г;

/<"- инкремент показателя преломления раствора ОГМГ-ГХ при увеличении концентрации на 1%. Для ОГМГ-Гх Р=0,00205.

2.4.2. Вачидация метода определения основного вещества в фармацевтической субстанции ОГМГ-ГХ

Валидацию разработанного метода проводили по параметрам и критериям, указанным в табл. 2 Результаты, приведенные в табл. 2, полностью удовлетворяют предъявленным критериям приемлемости, что подтверждает валидацию методики контроля содержания основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ.

Таблица 2

Результаты валидации разработанных методов количественного определения разветвленного ОГМГ-ГХ

Параметр валидации Критерии приемлемости Результаты

1* | 2** 3***

Специфичность Интенсивность сигналов спектра ЯМР "С испытуемого образца должна соответствовать интенсивности сигналов типичного спектра ЯМР 13С разветвленного ОГМГ-ГХ Интенсивность сигналов спектра ЯМР 13С испытуемого образца совпадает с интенсивностью сигналов типичного спектра ЯМР "С разветвленного ОГМГ-ГХ —

Линейность Коэффициент корреляции >0,990 0,9996 0,995 —

Правильность Фактор отклика: среднее значение 97,5-102,5% 101,2 101,2 100,04

Относительное стандартное отклонение < 5,0% 3,2 1,43 1,88

Доверительный интервал должен включать 100% значение 99,2-103,3 100,0102,2 100,0100,1

Прецизионность по параметру сходимость Серия 1: относительное стандартное отклонение <4,0% (количество измерений п>6) 0,53 0,77 0,05

по параметру промежуточна прецизионность Серия 2: относительное стандартное отклонение <4,0% (количество измерений п>6) 0,61 0,55 0,06

критерий Фишера Р < Р табл.(5,05%) 0,75 1,78 1,61

*- метод определения содержания основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ

**- метод определения содержания разветвленного ОГМГ-ГХ

***- метод определения низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ, в многокомпонентных препаратах, на его основе

3. Разработка метода и установки определения разветвленного ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе

3.1. Разработка и валидация метода определения низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ

Проведена экспериментальная работа по адаптации метода Кьельдаля для количественного определения сравнительно низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ (1мг/мл). Установлено, что на стадии титрования оптимально использовать автоматический весовой титратор-дозатор «Титрион-рН», который обеспечивает шаг дозирования титранта (10 мкл) меньше, чем для бюретки (50 мкл). Применение в качестве сенсора стеклянного электрода исключает субъективный фактор индивидуальных особенностей цветовосприятия.

В качестве моделей препаратов на основе разветвленного ОГМГ-ГХ использовали составы, приведенные в табл. 3.

Таблица 3

_Составы модельных смесей

№ п/п Вещество Концентрация азотсодержащего соединения в смеси, мг/мл Молекулярная масса азотсодержащего соединения, г/моль Молекулярная масса атомов Ы, г/моль

Состав 1

1 Разветвленный ОГМГ-ГХ 1 177 42,0

Состав 2

1 Разветвленный ОГМГ-ГХ 1 177 42,0

2 Бензалкония хлорид 0,5 357 14,0

Вспомогательные вещества: ФБР, вода

Состав 3

1 Разветвленный ОГМГ-ГХ 1 177 42,0

2 Бензалкония хлорид 0,5 357 14,0

3 Лидокаина гидрохлорид 1,5 228,8 28,0

Вспомогательные вещества: ментол, глицерин, этанол, вода

1№*ИШ1 НЕСЯ □¡I 0

1.

Результат 1/1 х 1

Рис. 8. Кривая титрования Состав № 1 (интерфейс прибора)

Г.] \ ^ гл *о > : .1.1; £ [ш В г ¿а £ Л ,

8нутрвнм4Й (*) Внеъ

:52 : А5а=0г001

Рис. 9. Кривая титрования Состав № I (при синхронизации с ПК)

18

После подбора оптимального шага дозирования титранта при анализе Состава №1 были зарегистрированы кривые титрования, кривые отображались как на самом приборе (рис. 8), так и при последующей обработке полученных данных при синхронизации прибора с ПК (рис. 9).

Полученные данные наглядно характеризуют точку перегиба волнообразного участка кривой титрования (рН=5,4), которая является точкой эквивалентности и позволяет точно фиксировать объем титранта.

Валидацию метода контроля низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ проводили с использованием в качестве анализируемого образца Состав №1, по параметрам и критериям, указанным в табл. 2. Результаты, приведенные в табл. 2, полностью удовлетворяют предъявленным критериям приемлемости, что подтверждает валидацию методики.

3.2. Разработка установки определения разветвленного ОГМГ-ГХ во многокомпонентных препаратах на его основе

Предложенный выше метод определения актуален, если в препарате кроме ОГМГ-ГХ не присутствует других азотсодержащих органических веществ. Для осуществления анализа многокомпонентных препаратов с несколькими азотсодержащими соединениями необходимо ввести поправку с учетом их концентраций, определенных ранее другими специфическими методами. Так как при воспроизведении метода Кьельдаля (из результатов титрования) мы получаем суммарное количество азота, содержащееся в анализируемом образце, а при наличии других азотсодержащих компонентов необходимо учитывать вклад каждого из них, для определения количества азота, приходящегося именно на долю ОГМГ-ГХ, предлагается использование формулы 4.

с=фг-а~<*>к (4)

1=1 Мп

где К - коэффициент пересчета для ОГМГ-ГХ; - общее количество азота в мг/мл; 14 - молекулярная масса азота, г/моль; - количество атомов азота в молекуле азотсодержащего компонента препарата; $ - концентрация азотсодержащего компонента препарата, мг/мл; Мц - молекулярная масса молекулы азотсодержащего компонента препарата, г/моль

Разработанная методика расчета содержания ОГМГ-ГХ была интегрирована в виде программного обеспечения автоматического весового титратора-дозатора «Титрион-рН». Алгоритм работы установки при определении концентрации разветвленного ОГМГ-ГХ в модельной смеси Состав№3 показан на рис. 10.

КОЛЛИЧЕ ст во КОМПОННЕНТОВ СОДЕРЖАЩИХ АЗОТ

Ср0,5

Мг1=357 Мг г=228,8 01=1

УпробЫ=Ю

АВТОМАТИЧЕСКОЕ ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

ГРАФИЧЕСКОЕ ОТОБРАЖЕНИЕ КРИВОЙ ТИТРОВАНИЯ

Результат 1/1

АВТОМАТИЧЕСКОЕ ПРОВЕДЕНИЕ РАСЧЕТОВ

(2 _ _ Мг*гСш> _ МгхуС.Ш-^ ^

Мгш Мг. 1ГУ с _ ,(3,35-0,05>1,4 14-0,5 28,014-1,5. ^ 2]43 10 357 228,8

утш?=3,35 мп Ч(в= 0,«2 мг/ил Г^огмг- 0,2587 мг/мл Согыг-гх = мг/мл

Рис. 10. Алгоритм работы установки для титрования «Титрион-рН» при определении разветвленного ОГМГ-ГХ

Для проверки адекватности результатов, получаемых при анализе препаратов, в состав которых входит несколько азотсодержащих веществ, была проверена валидация по параметрам правильность и прецизионность с использованием в качестве анализируемых образцов Состав 2 и Состав 3, результаты приведены в табл.2.

Полученные данные свидетельствуют, о том что разработанный аналитический комплекс позволит проводить контроль достаточно низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе с достаточной степенью точности и прецизионности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

1. Проведенная работа позволила выявить связи и закономерности между молекулярной структурой (молекулярная масса и степень разветвления) и

свойствами (показатель преломления, температура стеклования) разветвленного ОГМГ-ГХ.

2. Предложен экспресс-метод оценки молекулярно-массовых характеристик (молекулярная масса и степень разветвления) олигомера по его температуре стеклования.

3. Разработан метод количественного определения основного вещества в разветвленном ОГМГ-ГХ и проведена его валидация, полученные экспериментальные значения удовлетворяют критериям приемлемости.

4. Предложены ВЭЖХ-методики количественного определения мономерных примесей 11 X и ГМДА в разветвленном ОГМГ-ГХ и проведена их валидация; полученные экспериментальные значения удовлетворяют критериям приемлемости. Установлено, что пределы количественного определения составляют 1,560 мкг/мл и 70,0 мкг/мл для ГГХ и ГМДА соответственно.

6. Обоснована методика количественного определения низких концентраций разветвленного ОГМГ-ГХ, проведены ее испытания и валидация с использованием многокомпонентных модельных смесей, полученные экспериментальные значения удовлетворяют критериям приемлемости.

4. Предложен программно-аппаратный комплекс, позволяющий проводить количественное определение низких концентраций ОГМГ-ГХ в многокомпонентных препаратах на его основе, подана заявка на патент на полезную модель (регистрационный № 2015109857).

5. Составлена и апробирована нормативная документация (проект НД) для лекарственной субстанции «Дезапол» (разветвленный ОГМГ-ГХ).

6. Разработаны и зарегистрированы технические условия для осуществления производства субстанции (ТУ 9300-006-83188314-2013).

Практические рекомендации

Результаты диссертационной работы позволяют зарегистрировать разветвленный ОГМГ-ГХ в качестве фармацевтической субстанции на территории Российской Федерации, а так же проводить достаточно точный и достоверный контроль качества указанного вещества.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования имеют важное научно-практическое значение для фармацевтической химии с целью дальнейшей разработки на основе разветвленного ОГМГ-ГХ новых эффективных фармацевтических препаратов, а также разработки отвечающих современным требованиям методов их стандартизации с применением новых методик анализа и приборной базы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Кедик, С.А. Разработка и валидация метода контроля мономерной примеси гидрохлорида гуанидина в фармацевтической субстанции «разветвленный гидрохлорид олигогексаметиленгуанидина» / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, С.Г. Бексаев, И.П. Седишев, Е.С. Жаворонок, В.В. Суслов, A.B. Панов // Вестник МИТХТ. - 2014. - Т.9, №2. - С. 32-36.

2. Кедик, С.А. Методика количественного определения основного действующего вещества в фармацевтической биоцидной субстанции «разветвленный олигогексаметиленгуанидин гидрохлорид» / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, Д.В. Еремин, A.B. Панов, В.В. Суслов, И.П. Седишев, Е.С. Жаворонок // Биофармацевтический журнал. - 2014. - Т.6, №4. -С. 31-36.

3. Шаталов, Д.О. Разработка и валидация метода контроля «разветвленного олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида» в глазных каплях на его основе / Д.О. Шаталов, С.А. Кедик, A.B. Панов, И.П. Седишев, В.В. Суслов, Ю.А. Котова, Д.В. Александрова, И.С. Иванов // Бутлеровские сообщения. - 2014. - Т.38, №4. - С. 53-57

4. Кедик, С.А. Разработка и валидация метода контроля мономерной примеси гексаметилендиамина в разветвленном гидрохлориде олигогексаметиленгуанидина / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, С.Г. Бексаев, И.П. Седишев, Е.С. Жаворонок, В.В. Суслов, A.B. Панов, Нгуен Тхи Тхань Там // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2014. - № 9 (80). - С. 2226.

5. Кедик, С.А. Альтернативный метод определения разветвленного олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида. / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, Д.В. Еремин, И.П. Седишев, В.В. Суслов, A.B. Панов // «Наукоемкие химические технологии-2013». Тезисы докладов V молодежной научно-технической конференции. - Москва, 2013. - С. 54.

6. Кедик, С.А. Разработка метода количественного определения содержания гексаметилендиамина в полигексаметиленгуанидин гидрохлорде./ С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, А.В.Панов, В.В.Суслов, Ха Кам Ань, И.П.Седишев, С.Г.Бексаев // «На стыке наук. Физико-химическая серия». Материалы I международной интернет-конференции. - Казань, 2013. - С.143-144.

7. Кедик, С.А. Разработка перспективных фармацевтических препаратов для предупреждения и лечения венерических и лор-заболеваний / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, И.П. Седишев, A.B. Панов, В.В. Суслов, Д.В. Александрова // «Перспективы развития научных исследований в 21 веке». Сборник материалов III международной научно-практической конференции. - Махачкала, 2013. - С. 198-201.

8. Кедик, С.А. Альтернатива спектрофотометрической методике определения основного действующего вещества в биоцидной фармацевтической субстанции разветвленном олигогексаметиленгуанидин гидрохлориде / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, Д.В. Еремин, И.П. Седишев, В.В. Суслов, A.B. Панов // «Спектрометрические методы анализа». Материалы всероссийской научной интернет-конференции с международным участием. -Казань, 2013.-С. 40-42.

9. Кедик, С.А. Новое биоцидное средство — разветвлённый олигогексаметиленгуанидин. / С.А.Кедик, Панов A.B., Шаталов Д.О., И.П. Седишев, В.В. Суслов // Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни». - РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2014.-С. 495-496

10. Кедик, С.А. Разработка лекарственных препаратов на основе «разветвленного олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида» и методов его контроля. / С.А. Кедик, Д.О. Шаталов, A.B. Панов, И.П. Седишев, В.В. Суслов, Ю.А. Котова, Д.В. Александрова, И.С. Иванов // «Новые химико-фармацевтические технологии». Сборник тезисов под общей редакцией Г.В. Авраменко, А.Е. Коваленко. РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2014 - С. 129-131

11. Шаталов, Д.О. Разработка способа получения разветвленного олигогексаметиленгуанидин гидрохлорида, для использования в качестве фармацевтической субстанции / Д.О. Шаталов, С.А. Кедик, A.B. Панов, И.П. Седишев, И.С. Иванов, O.E. C.B. Сиситкина, Беляков // «Инновации в здоровье нации». Сборник материалов II всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2014. - С. 664-668.

Подписано в печать: 16.10.2015 Объем 1,0 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 468 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д.39 +7(495)363-78-90, www.reglet.ru