Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Разработка и применение исследовательско- диагностического комплекса для изучения клеток крови на основе иммунологических биочипов

На правах рукописи

ООоОиэочи

УДК 57.083.3:576.3.08^2.11.681.3

шишкин

Александр Валентинович

«РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТОК КРОВИ НА ОСНОВЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ БИОЧИПОВ»

14.01.21 - Гематология и переливание крови 14.03.10-Клиническая лабораторная диагностика

1 6 ОЕВ Ш1

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт- Петербург 2012

005009846

Работа выполнена в Государственном образовательном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Ижевская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития РФ»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Бессмельцев Станислав Семенович

доктор медицинских наук, профессор Козлов Антон Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Зубаровская Людмила Степановна

доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Эмануэль Владимир Леонидович

Ведущая организация: Федеральное бюджетное государственное учреждение

«Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова» МЗСР

Защита состоится « »_________ 2012 г. в____часов на заседании диссертационного

совета Д 208.074.01 при ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико—биологического агентства России по адресу: 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научноисследовательского института гематологии и трансфузиологии

Автореферат разослан «______»______________________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В современной гематологии диагностика лимфо— и миелопролиферативных заболеваний, а также уточнение их варианта и прогноза немыслимы без иммунофенотипирования клеток крови, В настоящее время в клинической практике предпочтение отдается методу проточной цитометрии, поскольку он характеризуется высокой воспроизводимостью и использованием методик, поддающихся стандартизации (Льюис С.М., 2009; Кишкун A.A., 2007; Козинец Г.И., 2006; Тупицын H.H., 2006, 2010).

Определенными ограничениями данного метода являются небольшой набор одновременно определяемых антигенов, необходимость использования дорогостоящего оборудования (Козинец Г.И., 2006) и достаточно высокий расход антител. Все это приводит к высокой стоимости подобных исследований и ограничивает их проведение

Перспективным путем решения указанных проблем может стать разработка и внедрение новых диагностических in vitro тест-систем на базе иммунологических биочипов (иммунобиочипов). Их использование позволяет во много раз сократить расход каждого вида антител при проведении анализа и многократно снизить стоимость исследования. Как правило, биочип данного класса представляет собой подложку, на поверхности которой иммобилизованы молекулы антител, специфичных к поверхностным антигенам изучаемых клеток. С помощью подобных биочипов можно одновременно определить множество различных поверхностных антигенов на разных клетках. Возможно также определение коэкспрессии антигенов (Belov L. et al., 2003).

Представляется обоснованным использовать биочипы для одновременного определения антигенов, имеющих дифференциально-диагностическое значение, и множества других антигенов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и расселения клеток опухоли в тканях. В результате, появляется принципиальная возможность установления особенностей иммунофенотипа клеток опухоли у каждого пациента и индивидуализации прогноза течения заболевания.

Помимо гематологии биочипы данного класса могут быть использованы в других областях медицинской науки: клинической иммунологии, онкологии, клеточной биологии и многих других направлениях (Belov L., Christopherson R.I. et al„ 2001-2010; Liu A.Y., 2001)

Работы в области разработки иммунобиочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток, активно проводятся в Австралии (Belov L., Christopherson R.I. et al., 2001-2010), Японии (Ко l.K. et al., 2005.), Великобритании (Campbell C.J. et al., 2006) и ряде других стран.

В то же время, при анализе публикаций этих и других авторов, можно обнаружить ряд существенных недостатков описанных разработок, связанных с проблемой визуализации клеток, невозможностью проведения многих дополнительных исследований связанных клеток и необходимостью использования сложного оборудования для считывания результата.

Совершенствование аналитических систем данного типа, с целью повышения информативности получаемых результатов, снижения трудоемкости анализа, уменьшения расхода реактивов и биологического материала, снижения стоимости исследований представляется перспективным направлением современной медицинской науки. Для реализации всего перечисленного необходимо создание новых конструкций биочипов и вспомогательных устройств, а также разработка новых методов проведения анализа. Таким образом, речь идет о создании исследовательско-диагностического комплекса, основанного на технологии биочипов, и разработке набора методик проведения анализа с его использованием. Создаваемый комплекс должен быть недорогим и простым в использовании, а также пригодным для решения не только сугубо диагностических, но и намного более сложных научно-исследовательских задач.

Возможность одновременного определения множества различных антигенов может быть использована для решения ряда фундаментальных и практических задач, например, изучения особенностей иммунофенотипа клеток хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) и различных вариантов неходжкинских лимфом, а также прогнозирования течения этих заболеваний. Для ХЛЛ характерна неоднородность клинических (Воробьев А.И., Лорие Ю.Ю., 2007) и лабораторных показателей (Никитин Е.А., 2003), а также ответа на проводимое лечение у разных больных (Бессмельцев С.С., 2007). Представляет интерес изучение взаимосвязи между экспрессией на клетках данной опухоли некоторых антигенов и особенностями течения заболевания.

Цель работы:

Теоретическое обоснование, разработка и практическая апробация исследовательско-диагностического комплекса для изучения нормальных и опухолевых клеток крови на основе иммунобиочипов с возможностью одновременного проведения иммуноморфологических и иммуноцитохимических исследований клеток, пригодного для решения задач различного уровня сложности в лабораториях с разным уровнем оснащенности.

Задачи работы:

1. Разработать новые конструкции биочипов для определения поверхностных антигенов клеток крови.

2. Создать новые типы приспособлений, позволяющих оптимизировать выполнение различных этапов анализа с помощью биочипов.

3. Предложить и апробировать информативные, простые и доступные для широкой клинической практики методики проведения анализа с применением биочипов и установить возможность та использования для диагностики и оценки эффективности лечения больных с опухолевыми заболеваниями системы крови.

4. Оценить возможность использования разработки для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных для оптимизации лечения и определения прогноза течения заболевания.

5. Разработать рациональный алгоритм проведения анализа иммунологических, морфологических и цитохимических свойств клеток опухолей системы крови с помощью исследовательско-диагностического комплекса.

Научная новизна исследования

Впервые реализован ряд новых методичесюгх и конструкторских решений при создании биочипов, устройств, предназначенных для проведения анализа, и методик их использования. Предложены и апробированы новые конструкции биочипов в едином исследовательско-диагностическом комплексе.

Разработаны новые способы комбинированных исследований клеток, связавшихся с биочипом. Показано, что одновременно с оценкой имунофенотипических особенностей клеток крови можно определять морфологические, цитохимические и другие признаки одних и тех же клеток.

Впервые в разработку данного класса заложен модульный принцип, позволяющий сочетать различные варианты методик проведения анализа и используемых устройств, что дает возможность решать поставленные диагностические или исследовательские задачи наиболее оптимальным способом.

Установлена вариабельность экспрессии ряда адгезионно—активационных антигенов клетками больных ХЛЛ. Выявлена взаимосвязь между содержанием в крови больных ХЛЛ клеток, экспрессирующих некоторые антигены адгезии и активации и, таким важным для прогноза показателем, как время удвоения лимфоцитов, характеризующим скорость нарастания опухолевой массы, и определяющим тактику ведения больных.

Доказана важность и необходимость использования биочипов для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных и оценки прогноза течения заболевания.

Разработан рациональный алгоритм проведения анализа на основе комплексной оценки иммунологических, морфологических и цитохимических свойств опухолевых клеток крови.

Практическая ценность работы

Создан и апробирован исследовательско-диагностический комплекс, позволяющий проводить изучение нормальных и опухолевых клеток крови с помощью биочипов и определять множество поверхностных антигенов на разных типах клеток. Это дает возможность наряду с определением важнейших дифференциально-диагностических антигенов устанавливать индивидуальные особенности иммунофенотипа клеток пациента, имеющих прогностическое значение.

Показана перспективность применения предложенного исследовательско-диагностического комплекса в качестве важного дополнительного метода диагностики опухолевых заболеваний системы крови. Все элементы комплекса просты в использовании и имеют низкую себестоимость. Прогнозируемая стоимость проведения иммунофенотипирования клеток в 5 - 15 раз ниже по сравнению с применяемыми в настоящее время методами, что делает принципиально возможным проведение скрининговых исследований при профилактических осмотрах.

В процессе проведения исследования наряду с определением на клетках поверхностных антигенов возможно выполнение дополнительного окрашивания тех же клеток для их последующего морфологического или цитохимического исследования, что повышает информативность получаемых результатов.

Осповные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны и апробированы новые конструкции иммунологических биочииов и дополнительных устройств для изучения клеток крови.

2. Использование разработанных методик позволяет выполнять иммунологическое исследование клеток крови в сочетании с их морфологическим или цитохимическим исследованием, что повышает точность и информативность получаемых результатов.

3. Применение иммунофенотипирования клеток с применением биочипов в сочетании с морфологическими или цитохимическими исследованиями позволяет улучшить диагностику хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинских лимфом, острых лейкозов.

4. Анализ с применением биочипов не требует высокого расхода антител и использования дорогостоящего оборудования. Результаты иммунологического исследования клеток с использованием биочипов хорошо корреллируют с данными проточной цитофлуориметрии.

5. Показана перспективность определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток, что позволяет оценить течение и прогноз ХЛЛ.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу, учебный процесс и практическую деятельность ГБОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии (учебно-экспериментальной лаборатории, кафедры гистологии, кафедры патологической физиологии, Центра трансфера-технологий), в работу АНО «Центр наноивдустрии Удмуртской Республики», ООО ППО «Технолог». По результатам данной работы выпущено 5 информационных писем Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. За создание и применение разработки в клинической практике получена Государственная премия Удмуртской Республики в области науки и техники за 2010 год.

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на I, II, III Международных форумах по нанотехнологиям (Москва 2008, 2009, 2010), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (Москва 2008), на XII, XIII, XIV Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2008, 2009, 2010), на II Российском форуме «Российским инновациям - российский капитал» (Саранск 2009), на VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург 2009), на III инвестиционном Форуме «Удмуртия: курс на модернизацию» (Ижевск 2011), на Всероссийской научнопрактической конференции «Актуальные вопросы грансфузиологии и клинической медицины» (Киров 2010), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург 2011), на Всероссийской конференции с международным Интернет-участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий — к наноиндустрии» (Ижевск 2009), на научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Ижевск 2008), на Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии и восстановительной медицины» (Ижевск 2009), на Региональной научно-практической конференции «Клиническая биохимия. Единство фундаментальной науки и лабораторной диагностики» (Ижевск 2010), на конференции «Актуальные вопросы современной физиологии и медицины» (Ижевск 2010), на научной конференции, посвященной 75-летию службы крови Удмуртской Республики (Ижевск 2009).

Апробация диссертации состоялась 14.12.2011 г. на объединенном заседании кафедр ГБОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии: кафедры факультетской терапии с курсами гематологии и эндокринологии, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, кафедры патологической анатомии, кафедры биохимии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры патологической физиологии, учебно-экспериментальной лаборатории.

Личный вклад соискателя в выполнение работы

Соискателем самостоятельно разработаны и изготовлены биочипы новых конструкций, разработаны методики комплексного исследования клеток крови. Самостоятельно спроектированы устройства для проведения анализа с использованием биочипов, разработаны методики их применения и изготовлены опытные образцы большинства данных устройств. Соискателем были отработаны методики совместного использования различных элементов созданного комплекса при изучении клеток крови. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован автором. Им проанализированы данные обследования больных, включая клиникогематологические и лабораторные признаки в сопоставлении с результатами исследований клеток с применением биочипов, оформлены результаты исследования.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 75 научных работ, в том числе 2 монографии, 1 глава в книге, 6 патентов РФ на изобретения, 25 патентов РФ на полезные модели, 13 публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, 19 публикаций в изданиях, содержащих материалы Всероссийских и международных конференций и форумов, 9 публикаций в прочих изданиях. Кроме того, по материалам диссертации подготовлено и опубликовано 5 информационных писем Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики.

Объем и структура диссертации

Текст диссертации включает разделы «Введение», «Обзор лигературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение» и «Приложения». Приводятся практические рекомендации по использованию предложенной разработки. Диссертационная работа изложена на 294 машинописных страницах, содержит 22 таблицы и 59 рисунков. Список цитируемой литературы, включает 295 источников, в том числе 145 отечественных и 150 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных больных

Под наблюдением находилось 105 пациентов с опухолевыми заболеваниями кроветворной и лимфатической ткани, в том числе, 75 больных ХЛЛ (36 мужчин, 39 женщин), 25 пациентов, страдающих различными вариантами неходжкинских лимфом (НХЛ) (11 мужчин, 14 женщин) и 5 больных острыми лейкозами (1 мужчина, 4 женщины). Контрольную группу составили 15 здоровых людей (7 мужчин и 8 женщин).

Больным опухолевыми заболеваниями кроветворной и лимфатической ткани диагноз устанавливали на основании общепринятых клинических и лабораторных критериев (картины крови и костного мозга, результатов иммунофенотипирования опухолевых клеток методом проточной цитофлуориметрии, цитологического и гистологического исследования).

Из 75 больных ХЛЛ 32 пациента по классификации Binet (1975) имели стадию - А, 30 пациентов - стадию В, 13 пациентов - стадию С. Возраст обследованных больных колебался в пределах 44 — 86 лет (в среднем — 67,3±1,2). У 41 пациента исследование выполнялось до начала проведения химиотерапии, а у 34 больных в процессе проведения терапии хлорамбуцилом или по программе СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон). Эффективность лечения оценивали согласно стандартным критериям, разработанным международной рабочей группой (International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia). На фоне проводимой терапии частичная клиникогематологическая ремиссия была получена у 7 (20,6%) больных, стабилизация у 13 (38,2%) пациентов, а у 14 (41,2%) - выявлена прогрессия лейкозного процесса. Случаев полной клинико-гематологической ремиссии зарегистрировано не было. У 43 больных ХЛЛ исходно и в процессе проводимого лечения определяли время удвоения лимфоцитов (ВУЛ) по Montserrat (1986). При этом у 16 (37%) больных ВУЛ было менее 12 месяцев, а у 27 (63%) пациентов - более 12 месяцев.

Из 25 пациентов, страдающих другими вариантами НХЛ, было 12 (48%) больных фолликулярной лимфомой (ФЛ), 7 (28%) пациентов с лимфомой маргинальной зоны селезенки (ЛМаргЗ), 4 (16%) - лимфомой из клеток мантийной зоны (ЛМЗ) и у 2 (8%) больных установлен диагноз волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ). Все больные НХЛ получали терапию по программам СОР (циклофосфан, випкристин, преднизолон) или CHOP (циклофосфан, винкристин, доксорубицин, преднизолон).

Из 5 пациентов, страдающих острыми лейкозами, было 2 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и 3 пациента с острыми миелоидными лейкозами (ОМЛ). В 1 случае ОЛЛ и 2 случаях ОМЛ исследование осуществлялось при впервые

выявленном заболевании, у 2 других больных при рецидиве лейкоза. Исследование клеток крови у больных выполнялось до начала проведения химиотерапевтического лечения.

Методы исследования

У всех гематологических больных и здоровых людей с помощью биочипов проводилось исследование мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности (фиколл-урографин, 1077 г/л). В отдельных экспериментах также выполнялось исследование эритроцитов периферической крови. Осуществлялось определение поверхностных антигенов клеток с применением биочипов, комбинированные иммуноморфологические и иммуноцитохимические исследования клеток больных и здоровых людей.

Результаты количественной оценки содержания клеток, экспрессирующих определяемые антигены, сопоставлялись с данными, полученными методом проточной цитофлуориметрии. Во всех случаях проводилось сопоставление полученных результатов с клинической картиной и течением опухолевого процесса.

В большинстве случаев при изучении клеток ХЛЛ, ОЛЛ и НХЛ применялись биочипы (рис. 1) с панелью из 32 различных антител, специфичных к различным поверхностным антигенам клеток. Использовались прозрачные и химически-стойкие подложки, что позволяло выполнять окрашивание и микроскопическое исследование связанных клеток. На подложки была нанесена разметка, облегчающая нахождение нужных тестовьк участков при выполнении неавтоматизированного или частично автоматизированного считывания результата анализа. Поверхность каждого биочипа была разделена на рабочую (функциональную) область, содержащую тестовые участки, и края, наличие которых облегчает выполнение различных манипуляций.

Кроме того, были разработаны биочипы и других конструкций, имеющие ряд существенных преимуществ.

При использовании биочипа (патент на полезную модель ЯII 86091) проведение анализа становится более удобным, исключается механическое повреждение рабочей поверхности, значительно снижается расход реактивов и исследуемого биологического

Биочипы

материала, исчезает необходимость выполнения точных манипуляций при приготовлении микропрепарата, становится более удобным выполнение микроскопического исследования связавшихся клеток.

Конструкция биочипа (патент на полезную модель Я и 86090) позволяет значительно упростить процесс контроля качества отмывки от не связавшихся клеток и оценки адекватности условий ее выполнения. За счет этого повышается точность результатов.

При использовании биочипа (патент на полезную модель ГШ 92964) или тест-системы, состоящей из биочипа и вспомогательного приспособления (патент на полезную модель Яи 103003) становится возможным одновременное определение на клетках большого числа комбинаций коэкспрессируемых антигенов.

Изготовление биочипов

Изготовление биочипов (см. рис. 1) осуществлялось путем нанесения в строго определенные участки подложки микрокапель растворов антител. В зависимости от целей проводимых исследований изготовлялись биочипы, панели которых включали от 3 до 32 антител. После нанесения капель биочипы инкубировали при 100% влажности в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем их высушивали на воздухе и помещали в герметичные контейнеры, в которых они могли храниться при -26°С в течение нескольких месяцев. Непосредственно перед использованием биочипов проводилось блокирование сайтов неспецифического связывания подложек белковым раствором.

Методика проведения исследования клеток с использованием биочнпов

Методика проведения исследования клеток с использованием биочипов построена по модульному принципу и включает базовую методику, которая в каждом конкретном случае может дополняться вспомогательными этапами при необходимости получения дополнительной информации. Таким образом, общая методика исследования, представляет собой комбинацию из нескольких отдельных элементов (рис. 2). Разные ее варианты, различаются по сложности исполнения и набору используемых вспомогательных устройств.

Базовая__методика проведения анализа позволяет установить содержание в

исследуемом образце клеток, имеющих определяемые антигены.

Биочип инкубируют с суспензией исследуемых клеток, которые оседают на его поверхность. Клетки, имеющие на своей поверхности определяемые антигены, связываются со специфичными к ним антителами, иммобилизованными в тестовых участках (пятнах) биочипа. Не связавшиеся с антителами клетки устраняют путем отмывки биочипа изотоническим раствором.

Далее осуществляют фиксацию специфически связанных клеток, оставшихся на поверхности биочипа, выполняют считывание и обработку результатов. Если инкубация биочипа с клетками осуществлялась без перемешивания, относительная плотность связывания оказывается пропорциональна содержанию в суспензии клеток, экспрессирующих определяемые антигены. Она может быть определена качественно, полуколичественно или количественно.

Варианты проведения отмывки биочипа

1) Отмывка биочипа может проводиться в емкости (инкубационно-отмывочной кювете). Данный способ является простым по исполнению и наименее трудоемким. Он применялся в большинстве проводимых исследований. 2) Отмывка биочипа может быть осуществлена с использованием установки, состоящей из насоса и проточной камеры. Основным элементом проточной камеры является капилляр прямоугольного сечения, в котором размещен биочип. С помощью данной установки можно с высокой точностью и в широком диапазоне задавать скорость потока отмывающей биочип жидкости. Это позволяет создать такие условия отмывки, при которых исключается отрыв клеток, связавшихся с биочипом специфически, но недостаточно прочно. Данный способ является более трудоемким, но обеспечивает более высокую чувствительность анализа и может применяться для определения слабо экспрессированных поверхностных антигенов клеток.

Выбор оптимального способа отмывки биочипа и используемых для этого приспособлений определялся задачами конкретного исследования.

Варианты считывания результата и оценки плотности связывания клеток

Считывание результата включает получение изображения тестовых участков со связавшимися клетками. Оно может быть осуществлено путем просмотра пятен биочипа под микроскопом или получения их изображений (например, с использованием микрофотографирования, сканирования или проецирования).

Было разработано несколько типов приспособлений для считывания результата различными способами (патенты на полезные модели 1Ш 94854,1Ш 97370,1Ш 97371,1Ш 101883), имеющих достаточно простую конструкцию и низкую себестоимость при высокой эффективности применения и универсальности.

Оценка результатов заключается в определении плотности связывания клеток. Количественная оценка результата может быть выполнена путем подсчета клеток связанных на участках пятен известной площади или путем компьютерной обработки изображений с определением этого же параметра. В наиболее простых вариантах при полуколичественной или качественной оценке результата увеличенные изображения

тестовых участков биочипа со связанными клетками сравниваются с наборами эталонных изображений с известной плотностью связывания клеток.

Дополнительные методы исследования клеток, связавшихся с биочипами

Связавшиеся с биочипами клетки могут быть подвергнуты дополнительным исследованиям: 1) окрашиванию и морфологическому исследованию; 2) различным видам цитохимических исследований; 3) определению коэкспрессии нескольких антигенов на каждой отдельно взятой клетке (путем обработки биочипа со специфически связавшимися клетками растворами антител, конъюгированных с флуоресцентными или ферментными метками). При этом повышается информативность анализа и появляется возможность одновременного определения нескольких признаков на одних и тех же клетках, что невозможно при использовании многих других методов.

Инкубация 6и»чип» с кп*точк»й суеп*ніи«й

&

Ошыокл ОИОЧИПЛ ОТ И« СПЯ!

Сфо' © .£> ©

Проведение дополнительных исследований связавшихся клеток

* *** а. 4.І. Р ШІк ДВъ. . Ир

> РЕЗУЛЬТАТ

Є ПЯ01М0СТИ связывания КЛвГйК в оилэсти 0Пр»Д6ЛЯеИЫ6 *НГ*ГвНЫ.

ПОСТАНОВКА

ДИАГНОЗА

Рис. 2. Схема проведения исследования клеток с использованием биочипа.

Инкубационно-отмывочные приспособления

При выполнении отмывки биочипов в емкостях существуют следующие проблемы. 1) Риск механического повреждения биочипа при его закреплении в инкубационноотмывочной емкости и последующем извлечении из нее. 2) Высокий расход исследуемого материала, обусловленный тем, что в процессе инкубации осаждение клеток происходит не только на поверхность биочипа, но и на незакрытую им поверхность дна емкости. 3) Высокий расход используемых отмывочных растворов, фиксирующей жидкости и

- 13-

красителей, обусловленный несоответствием формы и размеров биочипа и дна емкости, которые должны покрывать эти жидкости.

Для решения этих проблем была разработана инкубационно-отмывочная кювета (патент на полезную модель RU 91339) и планшет для одновременной работы с несколькими биочипами (патент на полезную модель RU 97372). Кроме того, было предложено приспособление (патент на полезную модель RU 90213), использование которого не только оптимизирует процесс инкубации и отмывки биочипа, но также исключает необходимость выполнения точных манипуляций при последующем приготовлении из него микропрепарата, а также делает более удобным дальнейшее выполнение микроскопического исследования связавшихся с биочипом клеток.

Все перечисленные приспособления также могут быть использованы в качестве функциональной упаковки для хранения биочипов перед их использованием.

Было разработано несколько типов инкубационно-отмывочных емкостей, обеспечивающих возможность ускоренного осаждения клеток на поверхность биочипа с использованием центрифугирования (патенты на полезные модели RU 87424, RU 88810)

Предложено несколько вариантов конструкций проточных камер (патенты на полезные модели RU 88674, RU 86750, RU 92196, RU 106378), применение которых обеспечивает более высокую чувствительность анализа. Использование новых технических решений сделало процесс работы простым и удобным, позволило выполнять исследования клеток с применением биочипов различных размеров, практически полностью исключило риск их механического повреждения, а также риск разгерметизации рабочего контура и попадания воздуха в капилляр.

Программное обеспечение

Для определения плотности связывания клеток в части экспериментов использовалась программа «Флексометр - версия 5.0», Для статистической обработки результатов применялась программа BioStat-2008 Professional Edition 5.2.5.О.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На начальном этапе данной работы проводилась разработка новых способов исследования клеток с применением биочипов.

Разработка способов комбинированного иммуноморфологнческого и иммуноцитохимического исследования клеток с использованием биочипов

Благодаря использованию подложек из материала, обладающего прозрачностью, оптической однородностью и слабо прокрашиваемому большинством цитологических красителей, стало возможным окрашивание и морфологическое исследование клеток,

связавшихся с биочипом. Это позволило установить, какие именно типы клеток экспрессируют определяемые антигены. При необходимости может быть определена доля клеток каждого типа от общего количества клеток, экспрессирующих каждый из антигенов.

Использование общепринятых протоколов окрашивания цитологических препаратов применительно к связанным с биочипом клеткам не всегда давало удовлетворительные результаты. Во многих случаях после проведения фиксации и окрашивания значительная часть клеток была деформирована или полностью разрушена. Часто отмечались деформация и фрагментация ядер, изменение видимой структуры хроматина.

Для решения данной проблемы был модифицирован протокол фиксации связавшихся клеток (патент на изобретение Я и 2433175). Это позволило добиться хорошего качества их окрашивания и сохранения привычных морфологических характеристик (рис. 3).

Рис. 3. Связавшиеся с биочипом клетки больных: а) ВКЛ; б) ХЛЛ; в) ОЛЛ. Окрашенные по Романовскому-Гимзе с использованием нового протокола фиксации. Увеличение в 900 раз (а,б) и в 1350 раз (в).

Проведение дополнительного морфологического исследования позволило четко отличать клетки ОМЛ, ОЛЛ, ВКЛ от нормальных клеток. Стало возможным определять, какие из антигенов присутствуют именно на опухолевых клетках.

Химическая стойкость использованных подложек также сделала возможным приготовление из биочипов микропрепаратов с использованием общедоступных композиций, содержащих органические растворители.

Связавшиеся с биочипами клетки могут быть подвергнуты различным вариантам окрашивания, позволяющим провести их цитохимическое исследование, что важно для дифференциальной диагностики различных форм острых лейкозов. Кроме того, подобный подход был успешно применен для точной идентификации клеток ВКЛ. Определение антигенов параллельно с цитохимическим исследованием тех же клеток исключает возникновение противоречий между результатами данных исследований.

На одном и том же биочипе может быть выполнен один вид (при необходимости -два вида) дополнительного исследования связавшихся клеток. Поэтому для исследования клеток больного может потребоваться использование не одного, а нескольких биочипов, на которых связавшиеся клетки будут подвергаться различным вариантам цитохимических исследований.

На рис. 4 представлены примеры микрофотографий клеток больного острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ-М4 по классификации ФАБ). Проведение цитохимического исследования в сочетании с определением поверхностных антигенов тех же клеток (рис. 4-а.) позволило четко определить вариант острого лейкоза у данного больного. Более подробное описание этого эксперимента, в котором выполнялось исследование клеток больных разными формами ОМЛ, приводится ниже.

•

ЩЗКР да

б.

Рис. 4. Микрофотографии клеток больной острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ, М-4), связавшихся на трех разных биочипах в области пятен с антителами анти-CD 13. Выполнены разные цитохимические реакции, а) Определение миелопероксидазы; б) определение липидов в реакции с Суданом черным-Б; в) положительная реакция на гликоген. Увеличение в 1350 раз (а) и в 1 ООО раз (б, в).

Совершенствование методов определения коэкспрессии антигенов клеток с использованием биочипов

Анализ с помощью биочипа позволяет одновременно определять на разных клетках множество различных поверхностных антигенов, но на каждой отдельно взятой клетке (по факту ее связывания в том или ином пятне биочипа) может быть определен только один антиген. Представляется возможной обработка связавшихся с биочипом клеток антителами, конъюгированными с флуоресцентной или ферментной меткой.

Определение коэкспрессии антигенов с использованием флуоресцентно-меченных антител при проведении анализа с применением биочипов было уже описано зарубежными исследователями (Belov L. et al., 2003). При этом появляется возможность определения на каждой отдельно взятой клетке на один антиген больше за счет ее связывания в том или ином пятне биочипа. В настоящей работе подобное исследование было дополнено проведением окрашивания и морфологического исследования тех же

клеток, которые выполнялись после завершения иммунофлуоресцентного исследования (патент на изобретение 1Ш 2389024). Кроме того, была показана возможность использования иммуноферментных методов для определения коэкспрессии антигенов на связанных с биочипом клетках (патент на изобретение 1Ш 2393216). Данный подход позволяет выполнять дополнительное окрашивание клеток и проводить не только определение коэкспрессии антигенов, но и оценку многих морфологических признаков (рис. 5-6). При этом не требуется использование люминесцентного микроскопа.

В качестве примера приводим результаты исследования клеток больного ХЛЛ. На связанных с биочипом клетках проводилось определение коэкспрессии антигена СО 19.

Отмечалось высокое содержание С05+, СО 19+, С020+, С022+, а также С023+ клеток (рис. 5—а). Помимо нормальных вариантов коэкспресси антигенов С019/С020, С019/С022, С019/С045 определялась коэкспрессия антигенов С05/С019 и С019/С023. Наличие коэкспрессии С05/С019 характерно для ХЛЛ. При микроскопическом исследовании четко выявлялось окрашивание мембран клеток продуктом реакции. Дополнительное окрашивание связавшихся с биочипом клеток гематоксилином позволило хорошо визуализировать ядра (рис. 5-6). По своим морфологическим признакам данные клетки соответствуют зрелым лимфоцитам.

CD4 CD5 CD16 CD19 CD20 CD22 CD23 CD44 CD45 CD56 Антиген

а Общее содержание кпегок г Содержание С019+ клеток

if i <# * « * #* -

Рис. 5. Пример результатов исследования клеток больного ХЛЛ. Для определения коэкспрессии антигена CD19 на связавшихся с биочипом клетках выполнено иммуноферментное исследование с использованием En Vision технологии, а) Результаты оценки содержания клеток, экспрессирующих определяемые антигены, б) Микрофотографии клеток, связавшихся на биочипе в области пятна с антителами специфичными к антигену CD23. Характер окрашивания клеток продуктом реакции свидетельствует о поверхностной локализации коэкспрессируемого антигена CD 19. Ядра клеток докрашены гематоксилином. Увеличение в 1000 раз

Разработка способа определения в исследуемом образце малых количеств клеток, экспрессирующих определяемые поверхностные антигены

Плотность заполнения тестовых участков биочипа специфически связавшимися клетками прямо пропорциональна их концентрации в исследуемой суспензии. Некоторые

типы клеток присутствуют в исследуемом образце в небольшой концентрации и заполняют соответствующие тестовые участки биочипа с низкой плотностью. Если искомые клетки имеют на своей поверхности какие-либо антигены, не экспрессируемые клетками других типов, может быть использован подход, который заключается в том, что этапы осаждения клеток на поверхность биочипа несколько раз чередуются со смыванием не связавшихся клеток (из фоновых участков) и их повторным осаждением. При каждом повторном осаждении, ранее не связавшиеся клетки с определенной вероятностью могут оказаться в области нужного тестового участка и связаться с антителами, специфичными к соответствующему поверхностному антигену. Каждый цикл осаждения и смывания клеток занимает от 30 до 60 минут. При этом требуется выполнение большого числа таких циклов, что неизбежно приводит к значительному увеличению продолжительности исследования. Проблема была решена за счет использования центрифугирования для ускоренного осаждения клеток.

Такая возможность может быть продемонстрирована на следующем примере (см. рис. 6), кода в ходе проведения анализа этапы осаждения клеток центрифугированием при 135,28 § в течение 1 минуты чередовались со встряхиванием емкости. После выполнения нескольких циклов осаждения и смывания удалось добиться практически предельного заполнения клетками всех тестовых участков биочипа.

I? Г

г

I * 40 Г 1 5 130Г

? | 20 Г О ° Ю (

Г

г

СЭЗ С04 С016 С019 С020 С041 С044 С045 С056 Антиген

Рис. 6. Заполнение связанными клетками тестовых участков биочипа: а) без выполнения концентрирования; б) после выполнения концентрирования с использованием центрифугирования. Выполнялось исследование клеток здорового человека.

Дальнейшим развитием подобного подхода может стать его использование, например, для определения минимальной остаточной болезни у гематологических и онкологических больных.

Исследования клеток с использованием проточной камеры

С помощью проточной камеры (патент на полезную модель 1Ш 88674) выполнялось исследование лимфоцитов здоровых людей и больных ХЛЛ. Высокая чувствительность анализа была показана в экспериментах с эритроцитами (с известным иммунофенотипом)

при определении слабо экспрессированных антигенов системы Резус (С, с, Е, е). Необходимо отметать, что данные поверхностные антигены удавалось определить на клетках даже при использовании биочипов, специально изготовленных с использованием сильно разведенных и неочищенных от примеси посторонних белков растворов моноклональных антител. При проведении анализа с помощью точно таких же биочипов, но без использования проточной камеры, данные антигены определить не удавалось.

Клиническое апробирование разработки

Следующим этапом работы стало использование биочипов при исследовании клеток крови здоровых людей и клеток опухолей кроветворной и лимфатической ткани.

Исследование с помощью биочипов клеток здоровых людей.

С помощью биочипов (рис. 1), содержащих антитела, специфичные к антигенам: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CDIO, CD1 la, CDUb, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, slgM, были изучены лимфоциты периферической крови 15 практически здоровых людей. Они составили контрольную группу. Полученные результаты оценки среднего содержания лимфоцитов, экспрессирующих определяемые поверхностные антигены, в дальнейшем сравнивались с результатами исследования клеток больных ХЛЛ (табл. 1).

Исследование с помощью биочипов клеток больных хроническим лимфоцитарным лейкозом

С помощью биочипов были исследованы лимфоциты периферической крови 75 пациентов, страдающих ХЛЛ. Выполнялось окрашивание и морфологическое исследование связавшихся с биочипами клеток. Оно подтвердило, что субстрат опухоли представлен морфологически зрелыми малыми лимфоцитами (рис. 3-6), которые экспрессировали антигены CD5, CD19, CD23.

При оценке среднего содержания субпопуляций клеток были получены следующие значения (М+т) (см. табл. 1). Как следует, из представленных в таблице 1 данных, у здоровых людей и больных ХЛЛ, содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CDIO, CD11 a, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD29, CD31, CD45RA, CD72, CD98, HLA-DR, достоверно отличалось.

Одновременно у 21 больного было проведено сопоставление результатов, полученных с использованием биочипов, с данными проточной цитофлуориметрии. При иммунофенотипировании методом проточной цитофлуориметрии проводилось одновременное определение только 3 — 4 антигенов. Поэтому анализ выполнялся в

несколько этапов. При использовании биочипов определялось значительно большее число антигенов, что позволило провести анализ в один этап.

Таблица 1

Содержание лимфоцитов (%), экспрессирующих определяемые поверхностные антигены,

у больных ХЛЛ и здоровых людей

Определяемые Больные ХЛЛ Контрольная группа Достоверность

антигены (n=75) (п=15) различий

CD2 14,4±1,3 79,7±1,9 р <0,001

CD3 15,5±1,4 68,2±1,7 р <0,001

CD4 8,4±0,8 44,7±2,3 р <0,001

CD5 85,6±1,7 71,7±2,8 р <0,001

CD7 10,5±1,1 74,1±2,5 р <0,001

CD8 7,6±0,8 26,9±1,3 р <0,001

CD9 46,7± 4,0 11,1±1,3 р <0,001

CD10 1,0±0,2 6,1±1,5 р <0,001

CDlla 41,3±3,7 94,0±1,6 р <0,001

CDllb 23,9±2,5 27,2±2,4 р >0,05

CD16 4,8±0,4 12,0±1,0 р <0,001

CD19 80,6±1,3 11,1±1,5 р <0,001

CD20 76,5±1,9 12,1±1,9 р <0,001

CD21 65,7±2,9 11,3± 1,5 р <0,001

CD22 53,2±3,4 11,7±1,7 р <0,001

CD23 68,7±2,2 2,2±0,4 р <0,001

CD27 60,2±3,9 56,2±1,8 р >0,05

CD29 83,2±2,2 59,3±3,0 р <0,001

CD31 77,6±2,5 23,2±3,8 р <0,001

CD36 16,2±2,6 7,7±1,9 р >0,05

CD38 35,1±3,6 33,7±3,5 р >0,05

CD44 98,4±0,5 99,3±0,3 р >0,05

CD45RA 84,4±1,5 71,7±2,8 р <0,001

CD56 2,3±0,5 9,8±1,0 р <0,001

CD71 12,2±2,9 3,4±0,4 р >0,05

CD72 50,3±4,0 9,2±1,7 р <0,001

CD95 28,3±3,5 39,0±5,8 р >0,05

CD98 67,7±3,8 39,0±6,6 р<0,05

HLA-DR 78,0±2,1 21,3±1,9 р <0,001

IgM 1,3±0,4 3,0±1,2 р >0,05

Различия между результатами, полученными с помощью биочипов и проточной цитофлуориметрии, были недостоверными (р>0,05). Исследование корреляционной зависимости результатов, полученных с помощью обоих методов у каждого пациента, выявило достоверную (р<0,01) прямую сильную взаимосвязь (Я = 0,8468- 0,97, уровень значимости (р = 0,000001- 0,016).

Содержание в крови С09+, С021+, С022+, С031+ и С038+ лимфоцитов было существенно (р<0,05) выше у больных в продвинутых стадиях ХЛЛ (стадия В и С), по сравнению с асимптоматической формой (ХЛЛ, стадия А).

В 43 случаях был проведен расчет времени удвоения лимфоцитов (ВУЛ) в периферической крови больных ХЛЛ. У обследованных больных ВУЛ варьировало в интервале 2,7 - 2378,0 месяцев (170,2±76,7). Существенно (р<0,05) более высокое содержание в крови С022+, С038+, С09+, С045ЯА+, С072+, С095+ и НЬА-ОЯ+ лимфоцитов отмечалось у пациентов с ВУЛ менее 12 месяцев (п = 16) по сравнению с пациентами, у которых с ВУЛ было более 12 месяцев (п = 27). Были выявлены достоверные реципрокные корреляции между значениями ВУЛ и содержанием в периферической крови С022+ (11= - 0,52; р<0,05), С038+ (Я= - 0,31; р<0,05), С045ЯА+ (Я- - 0,40; р<0,05), НЬЛ-1Ж+ (К= - 0,36; р<0,05) клеток.

Отмечалась отрицательная взаимосвязь между значениями ВУЛ и содержанием СЭ31+ (Я = - 0,47, р<0,05), С027+ (Я = - 0,32, р<0,05), С072+ (Я = - 0,45; р<0,05) и С098+ (Я = - 0,33 р<0,05) клеток, что может свидетельствовать о возможном участии этих рецепторов в процессах, связанных с пролиферацией опухолевых клеток. Менее достоверной была взаимосвязь между значениями ВУЛ и содержанием СБ71+ (Я = - 0,27 р = 0,09) и С095+ (Я = - 0,25, р = 0,10) клеток.

Таким образом, можно утверждать, что при неблагоприятном течении ХЛЛ, активации лейкозного процесса отмечается более высокое содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены С09, С021, С022, СЫ1, С038, С045ЯА, С071, С072, С095, С098, НЬА - ОЯ, что является основанием к изменению тактики ведения больных и подходов к лечению.

Среди пациентов, которым проводилось лечение хлорамбуцилом или по программе СОР не было получено полной клинико-гематологической и иммунофенотипической ремиссии. Это подтверждалось обнаружением С05+, С019+, С023+ клеток. У больных, достигших частичной ремиссии, отмечалось достоверное (р<0,05) повышение содержания Т-лимфоцитов (С02+, СОЗ+, С04+, С07+) и тенденция (р<0,10) к снижению содержания В-лимфоцитов.

Исследование с помощью биочипов клеток больных неходжкинскими лнмфомами

Кроме клеток больных ХЛЛ с помощью биочипов, содержащих такую же панель антител, были исследованы клетки 25 больных различными формами НХЛ, у которых отмечался опухолевый лимфоцитоз в периферической крови. Это было необходимо для того, чтобы продемонстрировать возможность дифференциальной диагностики различных

форм НХЛ. При проведении анализа с использованием биочипов заключения делались на основании данных об экспрессии клетками лимфатических опухолей дифференциальнодиагностических антигенов и морфологических характеристик клеток. Однако ввиду морфологического сходства клеток опухолей этой группы, основным дифференциальным признаком являлся их иммунфенотип. В большинстве экспериментов этой серии выполнялась качественная оценка результатов иммунофенотипирования клеток.

Клетки 4 пациентов имели морфологию малых лимфоцитов и иммунофенотип: CD5+, CD10-, CD19+, CD20+, CD22+, CD23-, IgM+, что характерно для лимфомы из клеток мантийной зоны. У 12 больных часть лимфоцитов имела расщепленные или неправильной формы ядра. Был определен иммунофенотип: CD5-, CD10+, CD19+, CD20+, CD22+, CD23-, lgM+, что позволило верифицировать фолликулярную лимфому.

У 7 больных многие клетки были крупнее обычных малых лимфоцитов. Часть из них имела ядра неправильной формы. Иммунофенотип клеток был представлен следующим образом: CD5-, CD10-, CD19+, CD20+, CD22+, CD23-, sIgM+, что подтвердило лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки.

У 2 пациентов преобладали клетки, которые были крупнее малых лимфоцитов и имели иммунофенотип: CD5-, CD10-, CD19+, CD20+, CD22+, CD23-, sIgM+. Многие из них имели выраженную «ворсинчатость» (рис. 3-а). Данные признаки позволяли предполагать, что пациенты страдают ВКЛ. Было выполнено определение в связавшихся клетках тартрат—резистентной кислой фосфатазы, что подтвердило правильность диагноза.

Кроме того, полученные результаты сопоставлялись с результатами проточной цитофлуориметрии и другими лабораторными и клиническими показателями. Заключения, которые бьии даны в ходе проведенного исследования, совпадали, т.е. диагнозы описанных форм НХЛ сомнений не вызывали. Таким образом, анализ с применением биочипов позволяет проводить дифференциальную диагностику НХЛ.

Исследование с помощью биочипов клеток больных острыми лейкозами

С помощью биочипов было проведено исследование клеток периферической крови 5 больных острыми лейкозами. Первоначально клетки этих больных исследованы с помощью биочипов, содержащих антитела, специфичные к антигенам: CD2, CD3, CD5, CD7, CD 10, CD13, CD 14, CD15, CD19, CD34, £D44, CD45. Они предназначались для предварительной дифференциальной диагностики острых лейкозов. Полученные данные (рис. 7) показывают, что двое больных страдали ОЛЛ, а трое других - ОМЛ, что было подтверждено характерными клинико-гематологическими признаками.

В дальнейшем для исследования клеток больных ОЛЛ использовались биочипы, содержащие иммобилизованные антитела, специфичные к антигенам: CD2, CD3 CD4 CD5, CD7, CD8, CD9, CDIO, CDlla, CD1 lb, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 CD27, CD29, CD3 î, CD36, CD38, CD4I, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72 CD95 CD98, HLA-DR, slgM. Полученные результаты представлены на рис. 8.

На основании совокупности полученных данных (рис. 7-а, б и рис. 8) было установлено, что одна больная имеет пра-В вариант (CDIO-, CD19+, CD34+ CD38+ HLA-DR+, IgM-), а другая пре-пре-В (common) или пре-В вариант ОЛЛ (CD10+, CD19+, CD34+, CD38+, HLA-DR+, IgM-). Морфологическое исследование связавшихся с биочипом клеток (окрашенных по Романовскому-Гимзе) показало, что субстрат опухоли представлен бластными клетками (рис. 3-е).

Рис. 8. Результаты исследования с помощью биочипов клеток больных ОЛЛ: а) больная Б. 20 лет; б) больная М. 14 лет.

Клетки больных ОМЛ в дальнейшем были исследованы с помощью биочипов, содержащих антитела, специфичные к антигенам: CDllb, CD13, CDI4, CD15, CD33, CD34, CD3S, CD41, CD44, CD45, HLA-DR. Результаты представлены на рис 9.

Рис. 9. Результаты исследования с помощью биочипов клеток больных, страдающих различными формами ОМЛ: а) острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ, М-4); б) острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ,

М—3); в) острым миелобластным лейкозом (ОМЛ, М-2).

в.

Кроме того, было выполнено цитохимическое исследование клеток. При этом использовалось несколько биочипов, связавшиеся с которыми клетки подвергались исследованию на миелопероксидазу, кислую фосфатазу, липиды, гликоген, а-нафтилацетатэстеразу и нафтол-АБ-О-хлорацетатэстеразу. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты цитохимического исследования связавшихся с биочипами клеток трех больных ОМЛ

Цитохимические показатели Образцы клинического материала

Образец №1 Образец №2 Образец №3

Миелопероксидаза + + +

Липиды + + +

а-нафтилацетатэстер аза + - -

Нафтол-А8-0 хлорацетатэстераза + + -

ШИК-реакция + (диффузное) + (диффузное) + (диффузное)

Кислая фосфатаза + - -

Диагноз пациента ОМЛ, ОМЛ, М-3 ОМЛ, М-2

На основании совокупности иммунологических и цитохимических признаков было установлено, что данные больные страдают разными вариантами ОМЛ: острым миелобластным лейкозом с созреванием клеток (ОМЛ, М-2), острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ, М-3) и острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ М-4).

Таким образом, комбинированное исследование клеток с применением биочипов позволило дифференцировать различные варианты ОМЛ у обследованных больных. Алгоритм применения исследовательско-диагностического комплекса Созданный исследовательско-диагностический комплекс включает различные виды приспособлений, с помощью которых могут быть реализованы разные варианты проведения анализа с применением разработанных методик. Для того чтобы выбрать их

оптимальное сочетание при решении различных диагностических задач предлагаем следующий алгоритм (рис. 10).

Клетки крови пациента

...__________А______________

Иммунофенотипирование

Анализ с использованием проточной цитофлуориметрии

£

ч

Низкое относительное содержание опухолевых клеток

Высокое относительное содержание опухолевых клеток

Анализ с использованием биочипа без концентрирования клеток

дополнительное

определение

коэкспрессии

антигенов

і Клиническая [ картина |

РЕЗУЛЬТАТ

I

ди/

Рис. 10. Алгоритм применения исследовательско-диагностического комплекса.

Он позволяет в каждом конкретном случае оптимизировать процесс построения общей методики проведения анализа в зависимости от концентрации изучаемых клеток и промежуточных результатов выполняемого исследования. Использование алгоритма позволит сократить трудозатраты и время проведения исследования в сложных с лабораторно—диагностической точки зрения случаях.

ВЫВОДЫ

1. Предложенные методы иммунофенотигшрования, морфологических и цитохимических исследований клеток с применением биочипов расширяют возможности врача при дифференциальной диагностике гематологических заболеваний.

2. Разработаны новые конструкции биочипов и приспособлений, позволяющие оптимизировать выполнение различных вариантов исследования опухолевых клеток

крови, что обеспечивает обследование и лечение гематологических больных с учетом индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток.

3. Результаты иммунофенотипирования клеток крови с использованием биочипов хорошо коррелируют с данными проточной цитофлуориметрии. При этом анализ с применением биочипов имеет низкую себестоимость, требует малого расхода антител, а также обеспечивает возможность визуализации исследуемых клеток.

4. Сочетание различных аналитических подходов к анализу клеток с использованием биочипов, наряду с определением антигенов, позволяет оценивать у тех же клеток морфологические и цитохимические признаки, что повышает информативность и точность анализа и дает возможность изучения различных субпопуляций среди клеток, экспрессирующих одинаковые антигены.

5. Использование биочипов для определения особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных позволяет индивидуализировать оценку прогноза течения заболевания.

6. При изучении с помощью биочипов клеток больных ХЛЛ установлено, что высокое содержание в периферической крови клеток, экспрессирующих антигены С022, СО 27, СО38, СП45ПЛ, С071, С072, 0095, С098, НЬА-ГЖ характерно для неблагоприятного течения данного заболевания и указывает на необходимость начала проведения специфической терапии.

7. Разработан алгоритм анализа клеток крови, в основе которого лежит комплексная оценка иммунологических, морфологических и цитохимических свойств опухолевых клеток кроветворной и лимфатической ткани с помощью биочипов, который позволяет оптимизировать схемы обследования гематологических больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Диагностические исследования с использованием биочипов необходимо проводить при первичном обследовании больных с подозрением на опухолевые заболевания системы крови и в процессе проведения терапии для оценки ее эффективности.

2. Одновременно с определением поверхностных антигенов с применением биочипов целесообразно проведение морфологического и (или) цитохимического исследования опухолевых клеток крови.

3. При изучении клеток больных ОМЛ и ВКЛ целесообразно выполнять исследование с использованием нескольких биочипов, на которых связавшиеся клетки будут подвергаться различным видам цитохимических исследований

4. Если клетки опухоли имеют высокое морфологическое и иммунологическое сходство с нормальными клетками, и присутствуют в исследуемом образце в небольших количествах, то необходимо дополнительное определение' коэкспрессии антигенов с использованием антител, конъюгированных с флуоресцентными или ферментными метками.

5. Для дифференциальной диагностики разных групп опухолевых заболеваний системы крови целесообразно использовать биочипы с различными панелями антител.

6. Диагностические исследования с применением биочипов, содержащих большие панели антител, целесообразно осуществлять для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток, имеющих прогностическое значение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов

различных типов клеток / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина // 12-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века»: сб.

тезисов. - Пущино, 2008. - С. 245- 246

2. Иммунологические биочипы для определения антигенов I класса системы HLA/ А.В. Шишкин [и др.] // 12-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука XXI века»: сб. тезисов. — Пущино, 2008. — С. 246— 247

3. Разработка иммунологических биочипов для определения поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток крови / А.В. Шишкин [и др.] // Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии-2008»: сб. тезисов.-М., 2008-С. 112-113.

4. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы в диагностике хронического лимфоцитарного лейкоза/ А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, Е.Н. Никитин II Совремешме методы диагностики и лечения злокачественных опухолей: сб. статей. - Ижевск, 2008. -С. 69-72.

5. Н.А. Кирьянов Разработка экспериментальных тест-систем для исследования поверхностных антигенов клеток на основе иммунологических биочипов/ Н.А. Кирьянов, А.В. Шишкин [и др.] // Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей: сб. статей. - Ижевск, 2008-С. 106-108.

6. Immunological biochips for studies of human erythrocytes / A.V. Shishkin [et al.] II Biochemistry (Moscow) Supliment Series A: Membrane and Cell Biology. - 2008. - Vol. 2, №

3.-P. 217-224.

7. Immunological biochips for parallel detection of surface antigens and morphological analysis of cells/A.V. Shishkin [et al.]// Biochemistry (Moscow) Supliment Series A: Membrane and Cell Biology. - 2008. - Vol. 2, №3. - P. 225-230.

8. Шишкин A.B. Исследование с помощью иммунологических биочипов клеток хронического В-клсточного лимфолейкоза / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчннина // 12-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века»: сб. тезисов. - Пущино, 2008,- С. 246

9. Разработка иммунологических биочипов для определения поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток крови/ А.В. Шишкин [и др.] // 1-й Международный форум по нанотехнологиям: сб. тезисов. - Москва, 2008, - Т 2. - С. 396.

10. Овчинина Н.Г. Применение иммунологических биочипов в диагностике хронического лимфоцитарного лейкоза/ Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин, Е.Н. Никитин // Вестник гематологии. -2009. -T.V, №2. - С.28

11. Овчинина Н.Г. Иммунодиагностика хронического лимфоцитарного лейкоза с помощью иммунологических биочипов / Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин, Е.Н. Никитин // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10 - № 2. - С. 255

12. Клиническое значение антигена CD9 при хроническом лимфоцитарном лейкозе / Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин [и др.] // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии и восстановительной медицины», Ижевск

2009.-С. 121-124

13. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы для исследования клеток / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина // Всероссийская конференция с меадународшлм Интернет- участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий — к наноиндустрии»: сб. тезисов. — Ижевск, 2009.-С.133

14. Шишкин Л.В. Опыт практического использования биочипов для иммунодиагностики хронического лимфоцитарного лейкоза и других опухолей системы крови/ Шишкин A.B., Овчинина Н.Г., Никитин Е.Н. // Всероссийская конференция с международным Интернет-участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий- к наноиндустрии»: сб. тезисов. - Ижевск, 2009. - С. 129

15. А.В. Шишкин Комплексное исследование клеток с помощью иммунологических биочипов// 13-я Международная Пущинская школа—конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века»: сб. тезисов. - Пущино, 2009. - С. 188

16. Шишкин А.В. Биочипы для определения антигенов I класса системы HLA / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, Ю.А. Леднев // Материалы научно-практической конференции,

поев. 75-летию службы крови Удмуртской Республики и 50-летию ГУЗ «Республиканская станция переливания крови МЗСР Удмуртской Республики». - Ижевск 2009. -С. 123-127.

17. Исследование эритроцитов с помощью иммунологических биочипов / А.В. Шишкин [и др.]// Материалы научно-практической конференции, поев. 75-летию службы крови Удмуртской Республики и 50-летию ГУЗ «Республиканская станция переливания крови МЗСР Удмуртской Республики». - Ижевск 2009. - С. 127-131.

18. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов клеток [Электронный ресурс] /А.В. Шишкин, Н.А. Кирьянов // Федеральный Интернет-портал «Нанотехнологии и наноматериалы». - 2009. - Режим доступа: http://portalnano.ru/iead/prop/pro/part6/med/immunological_biochips - загл. с экрана

19. А.В. Шишкин Модифицированный образец иммунологического биочипа для исследования клеток // 14-я Международная Пущинская школа конференция молодых ученых «Биология наука 21 века»: сб. тезисов. - Пущино, 2010. - С. 96

20. А.В. Шишкин Новая конструкция иммунологического биочипа для исследования клеток // 14-ая Международная Пущинская школа конференция молодых ученых «Биология наука 21 века»: сб. тезисов. - Пущино, 2010. - С.97

21. Никитин Е.Н. Клиническое значение некоторых мембранных антигенов при хроническом лимфоцитарном лейкозе/ Е.Н. Никитин, Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», Киров. - 2010. - С. 261-262

22. Никитин Е.Н. Иммуноморфологический анализ клеток лимфатических лейкозов с использова!шем иммунологических биочипов / Е.Н. Никитин, Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин II Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», Киров. - 2010. - С. 265-266

23. Шишкин А.В. Комплекс устройств для проведения исследований клеток с помощью иммунологических биочипов / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, А.В. Гагарин // Материалы региональной научно-практической конференции «Клиническая биохимия. Единство фундаментальной науки и лабораторной диагностики», Ижевск. - 2010. - С. 220-222.

24. Иммунологические биочипы для комбинированного исследования клеток / А.В. Шишкин [и др.] // Материалы III Международного форума по нанотехнологиям. - М. 2010,- 1 электрон, опт. диск (CD-R).

25. Разработка способа комбинированного иммунологического и цитохимического исследования клеток с помощью биочипов / А.В. Шишкин [и др.] // Материалы конференции «Актуальные вопросы современной физиологии и медицины». - Ижевск,

2010. -С. 86-88

26. Шишкин AB. Иммунологические биочипы для исследования клеток. Собственный опыт разработки. Некоторые новые подходы к проведению анализа. - Saarbrücken: Lambert Academic Publishing & Co. KG. - 2010. - 158 c.

27. Овчинина Н.Г. Иммунодиагностика хронического лимфоцитарного лейкоза с использованием иммунологических бночипов / Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2010. - Т. 149, №2. - С 184-186

28. Никитин Е.Н. Иммунофенотип опухолевых клеток и его клиническое значение при хроническом лимфоцитарном лейкозе / Е.Н. Никитин, Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин, Н.А. Кирьянов // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2010. -№7. - С. 19-22

29. Никитин Е.Н. Исследование иммунофенопша лимфоцитов при хроническом лимфоцитарном лейкозе с помощью иммунологических биочипов / Е.Н. Никитин, Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин // Бюллетень федерального центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова. -2010. — №2. — С 153

30. Овчинина Н.Г. Исследование иммунофенотипа опухолевых клеток больных хроническим лимфоцитарным лейкозом с помощью иммунологических биочипов / Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин [и др.] // Здоровье, экология и демография финно-угорских народов. - 2010. - №2. - С. 45^9

31. Ovchinina N.G., Immunodiagnosis of Chronic Lymphocytic Leukemia Using

Immunological Chips/ N.G. Ovchinina, A.V. Shishkin, E. N. Nikitin, S. A. Suhanov, E. A. Lozhkin // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. - Vol. 149, № 2. - P. 223 -226 > • ■

32. Шишкин A.B. Биочипы для иммуноморфологического исследования клеток // Материалы XIII Московского международного салона изобретений и инновационных технологий «Архимед». - Москва, 2010. - С. 148 - 162

33. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы для исследования клеток: концепция разработки, перспективы внедрения и дальнейшего совершенствования / А.В. Шишкин,

Н.Г. Овчинина. - Ижевск: РИО ГОУ ВПО ИГМА, 2011. - 98 с.

34. Овчинина Н.Г. Иммунологические биочипы для определения поверхностных

антигенов клеток в диагностике лимфатических опухолей/ Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин

// Гериатрическая гематология. Заболевания системы крови в старших возрастных

группах- Т.1 / под ред. Л.Д. Гриншпун, А.В. Пивника. - М.: Медиум, 2011. - С 162-166 -312с. ’ ' '

35. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы для исследования клеток / А.В. Шишкин,

Н.Г. Овчинина//Вестник гематологии. -2011. -T.VII, №1. - С 79-80

36. Шишкин А.В. Совершенствование методики комбинированного иммунологического

и морфологического исследования клеток с использованием биочипа [Электронный ресурс] / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Medline.ro. -2011. -Т. 12. -С. 69-81. - Электрон. дан. - 2011. - Режим доступа:

http://medline.ru/public/art/tom 12/art7.htral. -загл. с экрана.

37. Шишкин А.В. Использование иммуноферментного метода для определения коэкспрессии антигенов клеток при проведении анализа с помощью иммунологических биочипов [Электронный ресурс] /А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Medline.ru. - 2011. - Т.12. - С.82 - 92. - Электрон, дан,- 2011. - Режим доступа: http://medline.ru/public/art/toml2/art8.html. — загл. с экрана.

38. Шишкин А.В. Новый подход к определению коэкспрессии антигенов клеток при проведении анализа с использованием иммунологического биочипа/ А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Онкогематология. - 2011. -№2. - С. 23-30

39. Шишкин А.В. Новые конструкции иммунологических биочипов для исследования клеток [Электронный ресурс] / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Medline.ru. - 2011. - Т.12. - С. 522-535. - Электрон, дан. - 2011. - Режим доступа: http://www.medline.ru/public/art/toml2/art44.htinl. — загл. с экрана.

40. Шишкин А.В. Оценка возможности использования цешрифугирования для ускоренного проведения анализа с использованием иммунологических биочипов для исследования клеток крови / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Онкогематология. — 2011. —№3. — С.76—81

41. Шишкин А.В. Разработка инкубационно-отмывочных приспособлений для проведения анализа с использованием иммунологических биочипов, предназначенных для исследования клеток крови/ А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Вестник гематологии. - 2011. -Т.VII, №3. - С.35-39

42. Шишкин А.В. Разработка иммунологических биочипов для исследования клеток крови, создание методик проведения анализа и необходимых устройств / А.В. Шишкин, С.С. Бессмельцев // Вестник гематологии. - 2011. - Т. VII, №4. - С.53-54

43. Шишкин А.В. Комбинированное иммунологическое и цитохимическое исследование клеток крови при проведении анализа с использованием иммунологических биочипов / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев // Вестник Российской Военномедицинской академии. — 2011. — №3. — С. 177-180

44. Шишкин А.В. Комбинированное иммунологическое и цитохимическое исследование клеток острых миелоидных лейкозов с использованием иммунологических биочипов /

А. В. Шишкин, Н. Г. Овчшгана, С. С. Бессмельцев // Вестник РОНЦ им. H. Н. Блохина РАМН. — 2011. — Т. 22, №3. — С. 34—38

Патенты па изобретения и полезные модели.

1. Шишкин А.В. Способ исследования клеток с помощью иммунологического биочипа: пат. на изобр. 2389024 Россия : МП К G01N 33/53 / А.В. Шишкин, В.А. Шишкин, H.H. Шишкина; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2008147279; заявл 02.12.2008; опубл. 10.05.2010. - бюл. №13.

2. Шишкин А.В. Способ комбинированного иммунологического исследования клеток с помощью биочипа: пат. на шобр. 2393216 Россия: МПК C12N 5/00, C12N 5/09, G01N 33/53, G01N 33/543 / А.В. Шишкин, В.А. Шишкин, H.H. Шишкина; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин,- № 2009103895; заявл. 06.02.2009; опубл. 27.06.2010 бюл. №18.

3. Шишкин А.В. Способ комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток: пат. на изобр. 2430163 Россия: МПК C12Q 1/68, G01N 33/544, G01N 33/549 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2010115448; заявл. 19.04.2010; опубл. 27.09.2011. - бюл. №27.

4. Шишкин А.В. Способ исследования клеток с помощью биочипа: пат. на изобр. 2433175 Россия. МПК C12N 5/07, G01N 33/53, С07К 17/14 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009144005; заявл. 30.11.2009; опубл. 10.11.2011. - бюл. №31.

5. Камера для одновременного проведения серии экспериментов методом микроэлектрофореза: пат. на изобр. 2335763 Россия: МПК G01N 27/447 / А.В. Шишкин [и др.]; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин.- № 2007105835; заявл. 16.02.2007; опубл. 10.10.2008. - бюл. №28.

6. Шишкин А.В. Камера для электрофореза клеток: пат. на изобр. 2314521 Россия МПК G01N 27/26, G01N 27/28, G01N 33/483, А61В 5/00 / А.В. Шишкин, A.A. Соловьев, Е.Н. Никитин; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2005139533- заявл 19.12.2005; опубл. 10.01.2008. - бюл. №1.

7. Шишкин А.В. Еиочип для определения поверхностных молекул клеток: пат. на полезную модель 86090 Россия: МПК А16В 10/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин.- № 2009114758; заявл. 20.04.2009; опубл. 27.08.2009. - бюл. №24.

8. Шишкин А.В. Биочип: пат. на полезную модель 86091 Россия: МПК А61В 10/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009114759; заявл.20.04.2009; опубл.

27.08.2009. -бюл. №24.

9. Шишкин А.В. Проточная камера для инкубации и отмывки биочипа: пат. на полезную модель 86750 Россия: МПК G01N 33/537 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин,-№ 2009119880; заявл. 27.05.2009; опубл. 10.09.2009. - бюл. №25.

10. Устройство для инкубации биочипа с клеточной суспензией и его отмывки: пат. на полезную модель 87165 Россия: МПК C12Q 1/00 / А.В. Шишкин [и др.]; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009119879; заявл. 27.05.2009; опубл. 27.09.2009. -бюл. №27.

11. Шишкин А.В. Устройство для инкубации и отмывки биочипа: пат. на полезную модель 87424 Россия: МПК C12Q 1/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009119694; заявл. 26.05.2009; опубл. 10.10.2009. - бюл. №28.

12. Шишкин А.В. Биочип для исследования клеток: пат. на полезную модель 88550 Россия: МПК А61К 48/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009130448; заявл. 07.08.2009; опубл. 20.11.2009. - бюл. №32.

13. Шишкин А.В. Тест-система для исследования клеток: пат. на полезную модель 88551 Россия: А61К 48/00 / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. -№ 2009130459; заявл. 07.08.2009; опубл. 20.11.2009. - бюл. №32.

14. Шишкин А.В. Проточная камера для инкубации и отмывки биочипа: пат. на полезную модель 88674 Россия: МПК C12Q 1/68 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009130647; заявл. 10.08.2009; опубл. 20.11.2009. - бюл. №32.

15. Шишкин А.В. Контейнер для инкубации и отмывки биочипа: пат. на полезную модель 88810 Россия: МПК G01N 33/531 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. -№ 2009129291; заявл. 29.07.2009; опубл. 20.11.2009. -бюл. №32.

16. Шишкин А.В. Биочип для исследования клеток: пат. на полезную модель 89893 Россия: МПК G01N 33/554 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009131137; заявл. 14.08.2009; опубл.20.12.2009. - бюл. №35.

17. Шишкнн А.В. Биочип: пат. на полезную модель 89894 Россия: МПК G01N 33/554 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009130660; заявл.10.08.2009; опубл.20.12.2009. - бюл. №35..

18. Шишкин А.В. Платформа для размещения биочипа: пат. на полезную модель 90213 Россия: МПК G01N 33/53 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009131136; заявл. 14.08.2009; опубл. 27.12.2009. - бюл. №36.

19. Шишкин А.В. Устройство для инкубации и отмывки биочипа: пат. на полезную модель 91339 Россия: МПК C12Q 1/68/ А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. — № 2009125643; заявл. 06.07.2009; опубл. 10.02.2010. -бюл. №4.

20. Шишкин А.В. Проточная камера для инкубации и отмывки биочипа: пат. на полезную модель 92196 Россия: МПК G01N 33/531 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. -№ 2009135960; заявл. 28.09.2009; опубл. 10.03.2010. - бюл. № 7.

21. Шншкин А.В. Биочип для исследования клеток: пат. на полезную модель 92964 Россия: МПК G01N 33/554 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2009144004; заявл. 30.11.2009; опубл. 10.04.2010. - бюл. №10.

22. Устройство для получения изображения биочипа: пат. на полезную модель 94854 Россия: МПК А61Н 99/00 / А.В. Шишкин [и др.]; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин.-№2010103194; заявл. 01.02.2010; опубл. 10.06.2010.-бюл. №16.

23. Шишкин А.В. Устройство для получения увеличенного изображения биочипа и оценки результатов анализа: пат. на полезную модель RU 97370 Россия: МПК С12М 1/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2010114623; заявл. 12.04.2010; опубл.

10.09.2010. - бюл. № 25.

24. Шишкин А.В. Устройство для получения увеличенного изображения биочипа: пат. на полезную модель RU 97371 Россия: МПК С12М 1/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2010114649; заявл. 12.04.2010; опубл. 10.09.2010. - бюл. №25.

25. Приспособление для инкубации и отмывки биочипов: пат. на полезную модель 97372 Россия: МПК С12М 1/00, C12Q 1/00 / А.В. Шишкин [и др.]; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2010114636; заявл. 12.04.2010; опубл. 10.09.2010. -бюл. №25.

26. Шншкин А.В. Биочип для исследования клеток: пат. на полезную модель RU 97373 Россия: МПК С12М 1/00, C12Q 1/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2010114648; заявл. 12.04.2010; опубл. 10.09.2010. - бюл. №25.

27. Устройство для проецирования изображения биочипа: пат. на полезную модель 101883 Россия: МПК H04N 1/00 / А.В. Шишкин [и др.]; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин.-№2010135986; заявл. 27.08.2010; опубл. 27.01.2011. - бюл. №3

28. Устройство для проведения анализа с использованием биочипа: пат. на полезную модель 103003 Россия: МПК G01N 33/554 / А.В. Шишкин [и др.]; заявотель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2010139760; заявл. 27.09.2010; опубл.20.03.2011. -бюл. №8.

29. Шишкин А.В. Устройство для проведения анализа с применением биочипа: пат. на полезную модель 106378 Россия: МПК G01N 33/00 / заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин.-№2010143058; заявл. 20.10.2010; опубл. 10.07.2011. - бюл. №19.

30. Шишкин А.В. Тест- система для исследования клеток: пат. на полезную модель 106618 Россия: МПК С12М 1/00, C12Q 1/00 / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, Н.А.

Кирьянов; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2011107711; заявл. 28.07.2011; опубл. 20.07.2011. - бюл. №20.

31. Шишкин А.В. Устройство для перемещения биочипа относительно объектива микроскопа, снабженного фотокамерой: пат. на полезную модель, Россия / А.В. Шишкин, С.С. Бессмельцев, А.В. Козлов [и др.]; заявитель и патентообладатель А.В. Шишкин. - № 2011142339; заявл. 21.10.2011.; решение о выдаче патента 19.12.2011.

Информационные письма Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики

1. Е.Н. Никитин, Н.Г. Овчинина, А.В. Шишкин, ТВ. Бесогонова, Н.С. Щуклна, Е.А. Ложкин, С.А. Суханов Оптимизация диагностики и лечения хронического лимфоцитарного лейкоза // Информационное письмо Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. Ижевск, 2009. - 10 с.

2. А.В. Шишкин Иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов клеток и методика их использования И Информационное письмо Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. Ижевск 2010. - 16 с.

3. А.В. Шишкин Устройства, предназначенные для проведения анализа с помощью иммунологических биочипов // Информационное письмо Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. Ижевск, 2010. -12 с.

4. А.В. Шишкин Новые разработки в области создания иммунологических биочипов для определеши поверхностных антигенов клеток // Информационное письмо Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. Ижевск 2010. -16 с.

5. А.В. Шишкин Комплексные исследования клеток с помощью иммунологических биочипов // Информационное письмо Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. Ижевск, 2010. -15 с.

Отпечатано с оригинал-макета заказчика

Подписано в печать 10.01.2012. Формат 60x84 '/,6.

Тираж 120 экз. Заказ № 64.

Типография ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Ижевск, ул. Университетская, 1, корп. 4.

Актуальность проблемы

В современной гематологии диагностика лимфо- и миелопролиферативных заболеваний, а также уточнение их варианта и прогноза немыслимы без иммунофенотипирования клеток крови [59, 75, 83, 99]. В настоящее время в клинической практике предпочтение отдается методу проточной цитометрии, поскольку он характеризуется высокой воспроизводимостью и использованием методик, поддающихся стандартизации [18, 57, 59, 67, 75, 76, 140].

Определенными ограничениями данного метода являются небольшой набор одновременно определяемых антигенов, необходимость использования дорогостоящего оборудования и достаточно высокий расход антител [218, 248, 257]. Все это приводит к высокой стоимости подобных исследований и ограничивает их проведение. Метод проточной цитофлуориметрии также не обеспечивает возможность визуализации исследуемых клеток и не позволяет оценивать их «тонкие» морфологические признаки [66].

Перспективным путем решения указанных проблем может стать разработка и внедрение новых диагностических in vitro тест-систем на базе иммунологических биочипов (иммунобиочипов). Их использование позволяет во много раз сократить расход каждого вида антител при проведении анализа и многократно снизить стоимость исследования. Как правило, биочип данного класса представляет собой подложку, на поверхности которой иммобилизованы молекулы антител, специфичных к поверхностным антигенам изучаемых клеток. С помощью подобных биочипов можно одновременно определить множество различных поверхностных антигенов на разных клетках [145, 178,

206, 216, 218, 219, 236, 267]. Возможно также определение коэкспрессии антигенов [184, 188, 214, 257, 276].

Представляется обоснованным использовать биочипы для одновременного определения антигенов, имеющих дифференциально-диагностическое значение, и множества других антигенов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и расселения клеток опухоли в тканях. В результате, появляется принципиальная возможность установления особенностей иммунофенотипа клеток опухоли у каждого пациента и индивидуализации прогноза течения заболевания.

Помимо гематологии биочипы данного класса могут быть использованы в других областях медицинской науки: клинической иммунологии, кардиологии [215, 272, 286], онкологии [148, 164, 188, 226, 244, 250, 276], клеточной биологии [219], микробиологии [153, 236] и многих других направлениях, где используется иммунофенотипирование клеток.

В то же время, при анализе существующих публикаций можно обнаружить ряд существенных недостатков описанных разработок, связанных с проблемой визуализации результатов, невозможностью проведения многих дополнительных исследований связанных клеток, а также необходимостью использования сложного оборудования для считывания результата [149, 155, 184, 190, 201,213,214, 257].

Совершенствование аналитических систем данного типа, с целью повышения информативности получаемых результатов, снижения трудоемкости анализа, уменьшения расхода реактивов и биологического материала, снижения стоимости исследований представляется перспективным направлением современной медицинской науки. Для реализации всего перечисленного, прежде всего, необходимо создание новых конструкций биочипов, вспомогательных устройств, разработка новых методов проведения анализа. Таким образом, речь идет о создании исследовательскодиагностического комплекса, основанного на технологии биочипов, и разработке набора методик проведения анализа с его использованием. Создаваемый комплекс должен быть недорогим и простым в использовании, а также пригодным для решения не только сугубо диагностических, но и намного более сложных научно-исследовательских задач.

Возможность одновременного определения множества различных антигенов может быть использована для решения ряда фундаментальных и практических задач, например, изучения особенностей иммунофенотипа клеток хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза (XJIJ1), а также прогнозирования течения этого заболевания.

Для XJIJI характерна неоднородность клинических и лабораторных показателей [8, 60, 114, 122, 129], а также ответа на проводимое лечение у разных больных [10, 11]. Представляет интерес изучение взаимосвязи между экспрессией на клетках данной опухоли некоторых антигенов и особенностями течения заболевания.

Актуальность подобного исследования обусловлена также высокой частотой встречаемости (22-30/100.000 у лиц старше 65 лет) [172, 192] и ростом заболеваемости XJIJI как в России, так и в других странах.

Цель работы:

Теоретическое обоснование, разработка и практическая апробация исследовательско-диагностического комплекса для изучения нормальных и опухолевых клеток крови на основе иммунобиочипов с возможностью одновременного проведения иммуноморфологических и иммуноцитохимических исследований клеток, пригодного для решения задач различного уровня сложности в лабораториях с разным уровнем оснащенности.

Задачи работы:

1. Разработать новые конструкции биочипов для определения поверхностных антигенов клеток крови.

2. Создать новые типы приспособлений, позволяющих оптимизировать выполнение различных этапов анализа с помощью биочипов.

3. Предложить и апробировать информативные, простые и доступные для широкой клинической практики методики проведения анализа с применением биочипов и установить возможность их использования для диагностики и оценки эффективности лечения больных с опухолевыми заболеваниями системы крови.

4. Оценить возможность использования разработки для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных для оптимизации лечения и определения прогноза течения заболевания.

5. Разработать рациональный алгоритм проведения анализа иммунологических, морфологических и цитохимических свойств клеток опухолей системы крови с помощью исследовательско—диагностического комплекса.

Научная новизна исследования

Впервые реализован ряд новых методических и конструкторских решений при создании биочипов, устройств, предназначенных для проведения анализа, и методик их использования. Предложены и апробированы новые конструкции биочипов в едином исследовательско-диагностическом комплексе.

Разработаны новые способы комбинированных исследований клеток, связавшихся с биочипом. Показано, что одновременно с оценкой имунофенотипических особенностей клеток крови можно определять морфологические, цитохимические и другие признаки одних и тех же клеток.

Впервые в разработку данного класса заложен модульный принцип, позволяющий сочетать различные варианты методик проведения анализа и используемых устройств, что дает возможность решать поставленные диагностические или исследовательские задачи наиболее оптимальным способом.

Установлена вариабельность экспрессии ряда адгезионно-активационных антигенов клетками больных ХЛЛ. Выявлена взаимосвязь между содержанием в крови больных ХЛЛ клеток, экспрессирующих некоторые антигены адгезии и активации, и таким важным для прогноза показателем, как время удвоения лимфоцитов, характеризующим скорость нарастания опухолевой массы, и определяющим тактику ведения больных.

Доказана важность и необходимость использования биочипов для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных и оценки прогноза течения заболевания.

Разработан рациональный алгоритм проведения анализа на основе комплексной оценки иммунологических, морфологических и цитохимических свойств опухолевых клеток крови.

Практическая ценность работы

Создан и апробирован исследовательско-диагностический комплекс, позволяющий проводить изучение нормальных и опухолевых клеток крови с помощью биочипов и определять множество поверхностных антигенов на разных типах клеток. Это дает возможность наряду с определением важнейших дифференциально-диагностических антигенов устанавливать индивидуальные особенности иммунофенотипа клеток пациента, имеющих прогностическое значение.

Показана перспективность применения предложенного исследовательско-диагностического комплекса в качестве важного дополнительного метода диагностики опухолевых заболеваний системы крови. Все элементы комплекса просты в использовании и имеют низкую себестоимость.

Прогнозируемая стоимость проведения иммунофенотипирования клеток в 5 — 15 раз ниже по сравнению с применяемыми в настоящее время методами.

Это делает принципиально возможным проведение скрининговых исследований при профилактических осмотрах. При этом необходимо отметить, что разработка может применяться не только в гематологии, но и во многих других областях медицины.

В процессе проведения исследования наряду с определением на клетках поверхностных антигенов возможно выполнение дополнительного окрашивания тех же клеток для их последующего морфологического или цитохимического исследования, что повышает информативность получаемых результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны и апробированы новые конструкции иммунологических биочипов и дополнительных устройств для изучения клеток крови.

2. Использование разработанных методик позволяет выполнять иммунологическое исследование клеток крови в сочетании с их морфологическим или цитохимическим исследованием, что повышает точность и информативность получаемых результатов.

3. Применение иммунофенотипирования клеток с применением биочипов в сочетании с морфологическими или цитохимическими исследованиями позволяет улучшить диагностику хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинских лимфом, острых лейкозов.

4. Анализ с применением биочипов не требует высокого расхода антител и использования дорогостоящего оборудования. Результаты иммунологического исследования клеток с использованием биочипов хорошо корреллируют с данными проточной цитофлуориметрии.

5. Показана перспективность определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток, что позволяет оценить течение и прогноз хлл.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу, учебный процесс и практическую деятельность ГБОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии (учебно-экспериментальной лаборатории, кафедры гистологии, кафедры патологической физиологии, Центра трансфера-технологий), в работу АНО «Центр наноиндустрии Удмуртской Республики», ООО ППО «Технолог». По результатам данной работы выпущено 5 информационных писем Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики. За создание и применение разработки в клинической практике получена Государственная премия Удмуртской Республики в области науки и техники за 2010 год.

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на I, II, III Международных форумах по нанотехнологиям (Москва 2008, 2009, 2010), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (Москва 2008), на XII, XIII, XIV Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2008, 2009, 2010), на II Российском форуме «Российским инновациям - российский капитал» (Саранск 2009), на VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург 2009), на III инвестиционном Форуме «Удмуртия: курс на модернизацию» (Ижевск 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров 2010), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург 2011), на Всероссийской конференции с международным Интернет-участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий - к наноиндустрии» (Ижевск 2009), на научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Ижевск 2008), на Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии и восстановительной медицины» (Ижевск 2009), на Региональной научно-практической конференции «Клиническая биохимия. Единство фундаментальной науки и лабораторной диагностики» (Ижевск 2010), на конференции «Актуальные вопросы современной физиологии и медицины» (Ижевск 2010), на научной конференции, посвященной 75-летию службы крови Удмуртской Республики (Ижевск 2009).

Апробация диссертации состоялась 14.12.2011 г. на объединенном заседании кафедр ГБОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии: кафедры факультетской терапии с курсами гематологии и эндокринологии, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, кафедры патологической анатомии, кафедры биохимии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры патологической физиологии, учебно-экспериментальной лаборатории.

Личный вклад соискателя в выполнение работы

Соискателем самостоятельно разработаны и изготовлены биочипы новых конструкций, разработаны методики комплексного исследования клеток крови. Самостоятельно спроектированы устройства для проведения анализа с использованием биочипов, разработаны методики их применения и изготовлены опытные образцы большинства данных устройств. Соискателем были отработаны методики совместного использования различных элементов созданного комплекса при изучении клеток крови. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован автором. Им проанализированы данные обследования больных, включая клиникогематологические и лабораторные признаки в сопоставлении с результатами исследований клеток с применением биочипов, оформлены результаты исследования.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 75 научных работ, в том числе 2 монографии, 1 глава в книге, 6 патентов РФ на изобретения, 25 патентов РФ на полезные модели, 13 публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, 19 публикаций в изданиях, содержащих материалы Всероссийских и международных конференций и форумов, 9 публикаций в прочих изданиях. Кроме того, по материалам диссертации подготовлено и опубликовано 5 информационных писем Министерства здравоохранения и социального развития Удмуртской Республики.

Объем и структура диссертации

ВЫВОДЫ

1. Предложенные методы иммунофенотипирования, морфологических и цитохимических исследований клеток с применением биочипов расширяют возможности врача при дифференциальной диагностике гематологических заболеваний.

2. Разработаны новые конструкции биочипов и приспособлений, позволяющие оптимизировать выполнение различных вариантов исследования опухолевых клеток крови, что обеспечивает обследование и лечение гематологических больных с учетом индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток.

3. Результаты иммунофенотипирования клеток крови с использованием биочипов хорошо коррелируют с данными проточной цитофлуориметрии. При этом анализ с применением биочипов имеет низкую себестоимость, требует малого расхода антител, а также обеспечивает возможность визуализации исследуемых клеток.

4. Сочетание различных аналитических подходов к анализу клеток с использованием биочипов, наряду с определением антигенов, позволяет оценивать у тех же клеток морфологические и цитохимические признаки, что повышает информативность и точность анализа и дает возможность изучения различных субпопуляций среди клеток, экспрессирующих одинаковые антигены.

5. Использование биочипов для определения особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток у гематологических больных позволяет индивидуализировать оценку прогноза течения заболевания.

6. При изучении с помощью биочипов клеток больных ХЛЛ установлено, что высокое содержание в периферической крови клеток, экспрессирующих антигены СВ22, СЭ27, СЭ38, С045ЯА, СЭ71, СБ72, СБ95, СБ98, НЬА-ОЛ характерно для неблагоприятного течения данного заболевания и указывает на необходимость начала проведения специфической терапии.

7. Разработан алгоритм анализа клеток крови, в основе которого лежит комплексная оценка иммунологических, морфологических и цитохимических свойств опухолевых клеток кроветворной и лимфатической ткани с помощью биочипов, который позволяет оптимизировать схемы обследования гематологических больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Диагностические исследования с использованием биочипов необходимо проводить при первичном обследовании больных с подозрением на опухолевые заболевания системы крови и в процессе проведения терапии для оценки ее эффективности.

2. Одновременно с определением поверхностных антигенов с применением биочипов целесообразно проведение морфологического и (или) цитохимического исследования опухолевых клеток крови.

3. При изучении клеток больных ОМЛ и ВКЛ целесообразно выполнять исследование с использованием нескольких биочипов, на которых связавшиеся клетки будут подвергаться различным видам цитохимических исследований.

4. Если клетки опухоли имеют высокое морфологическое и иммунологическое сходство с нормальными клетками, и присутствуют в исследуемом образце в небольших количествах, то необходимо дополнительное определение коэкспрессии антигенов с использованием антител, конъюгированных с флуоресцентными или ферментными метками.

5. Для дифференциальной диагностики разных групп опухолевых заболеваний системы крови целесообразно использовать биочипы с различными панелями антител.

6. Диагностические исследования с применением биочипов, содержащих большие панели антител, целесообразно осуществлять для определения индивидуальных особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток, имеющих прогностическое значение.