Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Иммунофлуоресцентный анализ общей и свободной форм простат-специфического антигена и других опухолевых маркеров в формате биочипа

00461

На правах рукописи

СОКОЛОВА ЗИНАИДА АЛЕКСАНДРОВНА

ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ОБЩЕЙ И СВОБОДНОЙ ФОРМ ПРОСТАТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА И ДРУГИХ ОПУХОЛЕВЫХ МАРКЕРОВ В ФОРМАТЕ БИОЧИПА

14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 ОКТ ?ою

МОСКВА 2010

004611601

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

Научные руководители: доктор биологических наук Рябых Татьяна Павловна доктор медицинский наук, профессор Матвеев Всеволод Борисович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Бухман Владимир Михайлович доктор биологических наук, профессор Киселев Сергей Львович

Ведущая организация:

ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится «//у> 10 г. в/Учасов

на заседании диссертационного Совета Д.001.017.01 РОНЦ им. Н.Н.Блохина

РАМН по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ диагноз «рак» ежегодно ставят более чем 11 млн. человек. Прогнозируется, что к 2020 году число раковых больных возрастет до 16 млн. в год. Смертность от рака непрерывно увеличивается и приближается к 10 млн. человек в год, что составляет 15% всех смертных случаев. Приоритетное значение в области онкологии имеют исследования, направленные на раскрытие молекулярных механизмов злокачественного роста, разработку чувствительных методов диагностики, позволяющих обнаружить появление опухоли на ранних стадиях. Важным информативным показателем наличия опухолевого процесса является уровень опухолевых маркеров в сыворотке крови (Е.Р. Diamandis et al, 2002; Белохвостое А.С. и соавт., 2003; Nakamura R.M. et al., 2004). В клинической онкологии онкомаркеры широко применяются для оценки эффективности терапии раковых больных, однако некоторые из них играют роль в ранней диагностике злокачественных новообразований. Развитие новых методов протеомики и создание технологий биочипов позволяет разрабатывать высокоинформапшные диагностические системы и внедрять их в клиническую онкологию (Cho W. 2007, Maurya P. et al., 2007, Xiao G. et al., 2008). Представленные исследования яеппотся частью проводимых в нашей стране работ по разработке и внедрению отечественных технологий биочипов для создания современных диагностикумов в онкологии.

Набор известных опухолевых маркеров (ОМ), обладающих достатчной специфичностью и чувствительностью при разных нозологических формал рака, ограничен. ПСА является общепризнанным опухолевым маркером и широко используется в клинической практике в целях ранней диагностики 1'ПЖ. Одновременное измерение концентрации ПСАобщ, ПСАсв и определение %1|С'Лсв способствует увеличению диагностической эффективности ПСА-теса в дифференциальной диагностике РПЖ и ДГПЖ (Gretzer М.В. & Partin A.W. 2005 Slev P. et al., 2008). Проблема увеличения диагностической эффективности можнбыть решена путем одновременного определения нескольких ОМ (Maruvada P. et Использование с этой целью нескольких иммуноферментных диагностических с"' трудоемко и дорого. Поэтому в настоящее время большие надежды связыв'** с мультиплексными системами, такими, как белковые микрочиш с иммобилизованными моноклональными антителами (МКА), позволяющи й образце сыворотки крови одновременно измерять уровень нескольких 0

расширенном линейном диапазоне концентраций (Haab В.В. 2005; Kingsmore S.F. 2006; Liao Q. et al„ 2007; Савватеева E.H., Рубина А.Ю. и др. 2009.). Биологические микрочипы (биочипы) - массивы индивидуальных микроэлементов, содержащих различные зонды (ДНК, РНК, олигонуклеотиды, белки, сахариды и др.) и позволяющие проводить многопараметрический анализ минимальных количеств образца. Отечественные диагностические тест-системы в формате биочипа являются экономичной, эффективной альтернативой традиционным ИФА-системам, и их внедрение в клиническую онкологию - актуальная задача современной медицины.

Цель и задачи исследования

Целью исследования была оценка возможности применения новых отечественных мультиплексных диагностических систем на основе белковых микрочипов в клинической практике. Для испытания были взяты следующие тест-системы, предназначенные для количественного определения в сыворотке крови человека набора опухолевых маркеров, значимых для диагностики онкологических заболеваний:

- диагностический набор для одновременного определения общей и свободной формы ПСА - «ОМ-Биочип (ПСА)» (ИМБ РАН).

- диагностический набор для одновременного определения шести опухолевых маркеров: общей и свободной форм ПСА, раковоэмбрионального антигена (РЭА), альфа-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), нейронспецифической енолазы (НСЕ) - «ОМ-Биочип» (ИМБ РАН).

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Сформировать банк образцов сыворотки крови больных со злокачественными и доброкачественными опухолевыми заболеваниями, неопухолевыми заболеваниями, а также здоровых доноров, необходимый для испытаний.

2. Изучить аналитические характеристики испытываемых тест-систем в варианте одностадийного иммунофлуоресцентного «сэндвич»-анализа, как наиболее простого и технологически приемлемого для клинического использования.

3. Оценить и сравнить диагностическую эффективность тест-систем «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ОМ-Биочип» с традиционными ИФА-системами «Fujirebio Diagnostics» (Швеция), применив современные статистические методы ROC-анализа и логистической регрессии.

Научная новизна

Впервые на большом клиническом материале проведены испытания отечественных диагностических наборов «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ОМ-Биочип» (Центр биологических микрочипов ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН) в сравнении с наборами ИФА «Fujirebio Diagnostics». С применением методов ROC-анализа и логистической регрессии получены положительные оценки диагностической эффективности испытанных тест-систем. Практическая значимость

Показана применимость первых отечественных диагностических систем «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ОМ-Биочип» в формате биочипа в диагностике злокачественных новообразований, начиная с ранних стадий опухолевого процесса. Преимуществами тест-систем в формате биочипа перед традиционными системами ИФА являются: 1) одновременное определение спектра информативных онкомаркеров; 2) расширение линейного диапазона определяемых концентраций онкомаркеров; 3) проведение анализа с микроколичествами образца и реагентов; 4) автоматизированный режим компьютерной регистрации и обработки результатов. Информативность и экономичность биочипов открывает для медицины возможность проведения массовых скрининговых обследований населения с целью ранней диагностики онкологических заболеваний. Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась 6 мая 2010 года на совместной научной конференции лабораторий Экспериментальной диагностики и биотерапни опухолей, Медицинской биотехнологии, Фармакоцитокинетики, Фармаколсим и токсикологии, Лучевых методов лечения опухолей НИИ экспериментглмюи диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и урологического отделения НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Резу;ьтагы работы были доложены на VIII Международном конгрессе «Здоровье и Образсшле в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (14-17 ноября 2007, Мскы). Международном форуме по нанотехнологиям (3-5 декабря, 2008 Москва), На"'1" конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля М' Москва), Международном форуме по нанотехнологиям (6-9 октября 2009, Москв

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи и 13 тезисов. Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 27 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов исследования, обсуждения результатов, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 22 отечественных и 138 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Образцы сыворотки крови онкологических больных были предоставлены Отделением урологии и Отделом клинической иммунологии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Образцы сыворотки крови здоровых доноров и больных неонкологическими заболеваниями получены из ГУ РГНЦ РАМН и ГКБ №60 г. Москвы. Общее количество исследованных образцов сыворотки крови для испытаний диагностической системы «ОМ-Биочип (ПСА)» составило 223 и диагностической системы «ОМ-Биочип» на шесть опухолевых маркеров (ПСАобщ, ПСАсв, РЭА, АФП, ХГЧ и НСЕ) - 85. В таблицах 1 и 2 представлены исследуемые группы пациентов и их численность.

Таблица 1. Образцы сыворотки крови для испытаний в системе «ОМ-Биочип ПСА»

№ п/п Исследуемые группы Средний возраст (лет) Муж. (чел.) Кол-во образцов сыворотки

1 Здоровые доноры 30,0±8,0 28 28

2 Больные раком предстательной железы 67,0±7,0 87 87

3 Больные с доброкачественной гиперплазией предстательной железы 66,0±8,0 54 54

4 Больные злокачественными урогенитальными заболеваниями 53,0± 11,0 54 54

ВСЕГО 223

Таблица 2. Образцы сыворотки крови для испытаний в системе «ОМ-Биочип»

№ группы Исследуемые группы* Численность

Больные со злокачественными новообразованиями 55

1 РПЖ 13

2 Рак кишечника 14

3 Трофобластическая болезнь 9

4 Нейробластома 5

5 Карциноид 2

6 Рак яичника 3

7 Герминогенная опухоль 4

8 Рак печени 2

9 Злокачественное новообразование переднего средостения 1

10 Лимфома 1

11 Саркома Юинга 1

Больные с доброкачественными новообразованиями 6

12 Полипоз кишечника 4

13 ДГПЖ 1

14 Фибрознокистозная мастопатия 1

Больные с неонкологическими заболеваниями 11

15 Хронический панкреатит 5

16 Цирроз печени 4

17 Хронический колит 1

18 Дивертикулез 1

Здоровые доноры 7

Пациенты с неустановленным диагнозом 6

ВСЕГО: 85

*Возраст пациентов составлял от 1 года до 87 лет, количество мужчин было 38 (44,7%), женщин - 47 (55,3%).

«Трехмерные» гидрогелевые белковые микрочипы для

иммунофлуоресцентного анализа опухолевых маркеров.

Объектом данного исследования были диагностические наборы для одновременного количественного определения ПСАобщ и ПСАсв «ОМ-Биочт (ПСА)», регистрационное удостоверение № ФСР 2007/01418 (ИМБ РАН) и шести опухолевых маркеров: ПСАобщ и ПСАсв, РЭА, АФП, ХГЧ, НСЕ «ОМ-Биочш», регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03415 (ИМБ РАН). В набо;м входили: реагенты для постановки иммуноанализа и биологические «трехмерны>>

гидрогелевые микрочипы

антителами (МКА) (рис.1 и 2). Общий вид и структура «ОМ-Биочип (ПСА)»

Иммобилизованный

с иммобилизованными моноклональными

антиген ПСА

иммобилизованные пустой антитела гель ПСАсв ПСАоб

75" ----- » ----:--, %

\О' ч Э : > э >

ь* 1 > »

к* '( э » 1 *

Рис. 1. Биочип для анализа ПСАобщ и ПСАсв. Биочип содержит гелевые элементы с иммобилизованными моноклональными антителами к двум формам ПСА (общ и св), по 4 параллели в каждом ряду, а также элементы с иммобилизованным антигеном и пустые гелевые ячейки. Фотография в проходящем свете.

Общий вид и структура «ОМ-Биочип»

иммобилизованные иммобилизованные

ЮАр антигены антитела ¡г» 1 > » »1 » хгч

псаК- Г, - ~ "I »1 ¡АФП

хгч^"" флф хр' г> Г> ■ > '•> »1 РЭА

АФПр,, ',*>•,»<» » ПСАсв

пустой|(Л,- С»". {» 6. X» ■Г» ; » » » ' 'ПСАобщ

{£». _ .. ■ . ;{» 11 » »¡.» нсе

Рис. 2. Биочип для анализа шести онкомаркеров. Биочип содержит гелевые элементы с иммобилизованными моноклональными антителами к шести онкомаркерам, по 4 параллели в каждом ряду, а также элементы с иммобилизованными антигенами и пустые гелевые ячейки. Фотография в проходящем свете.

Для определения онкомаркеров выбран вариант одностадийного прямого «сэндвич»-иммуноанализа, при котором стадии инкубации и проявления объединены. Раствор смеси проявляющих антител, меченных флуоресцентным красителем Су-5, добавляли к анализируемому образцу (или калибровочным пробам) и затем наносили на биочип. Отмывку биочипа проводили после инкубации.

[I - иммобилизованное антитело

- исследуемый антиген ^ - проявляющее флуоресцентно-меченное антитело

Рис. 3. Схема «сэндвич»- варианта иммуноанализа на биочипе Регистрация и обработка флуоресцентных изображений. Флуоресцентные сигналы регистрировали с помощью анализатора биочипов УАПК (ИМБ РАН), снабженного компьютером и программным обеспечением для обработки флуоресцентных изображений «1таОе1Аззау». Интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых элементов. На основе изображений, соответствующих калибровочным пробам, с помощью программы «1таОе1Аззау» (ИМБ РАН) строили калибровочные кривые. Программа автоматически определяла концентрации опухолевых маркеров в анализируемых образцах сыворотки по калибровочным кривым, измеряя сигналы флуоресценции ячеек с иммобилизованными МКА.

Сокращение времени проведения иммуноанализа на биочипе получали за счет перемешивания образца в тонком слое жидкости на приборе 8Нс1еВоо81ег 8В 1800 (Аёуа1уйх Ав, Германия), которое осуществлялось с помощью электронного микрочипа, генерирующего поверхностные акустические волны. Применение этой системы позволило сократить время проведения иммуноанализа и увеличить интенсивность сигналов на биочипе. Перемешивание проводили в течение 1, 3 и б часов. К 6 часам величина сигнала возрастала до максимальных уровней. Таким образом применение прибора 8Пс1еВооз1ег ЭВ 1800 приводило к увеличению флуоресцентного сигнала и позволяло сократить время проведения иммуноанализа с 20 до 3-х часов. На рис. 4 показано, как происходит нарастание флуоресцентного сигнала во времени для ПСАобщ.

в

Рис. 4. Кинетические кривые нарастания флуоресцентного сигнала с перемешиванием (ПСАобщ).

Твердофазный иммуноферментный анализ на 96-луночном планшете (ИФА-наборы). Концентрации опухолевых маркеров (ПСАобщ, ПСАсв, АФП, РЭА, НСЕ) в исследуемых образцах сыворотки крови измеряли методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы «Fujirebio Diagnostics» (Швеция) ПСАобщ (кат. № 340-10), ПСАсв (кат. № 350-10), АФП (кат. № 600-10), РЭА (кат. №401-10), НСЕ (кат. № 420-10) и «DRG Diagnostics» (Германия) 0-ХГЧ (кат. № EIA-1911) согласно прилагающимся инструкциям. Концентрации опухолевых маркеров в исследуемых образцах сыворотки крови, измеренные на биочипе, сопоставляли с концентрациями, измеренными методом ИФА

Статистическую обработку результатов измерения концентрации опухолевых маркеров, полученных в тест-системах в формате биочипа (ИМБ РАН) и ИФА «Fujirebio Diagnostics» (Швеция) проводили с использованием пакетов статистических программ «BIOSTAT» (Version 5.7.4), MedCalc (версия 9.3.5.0). Статистическую значимость межгрупповых различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Для установления связи между результатами измерений уровней опухолевых маркеров в сравниваемых тест-системах применяли регрессионный анализ и коэффициент корреляции. Для оценки диагностической

эффективности тест-систем в формате биочипа и сравнения с эффективностью стандартных ИФА-систем, применяли ROC-анализ.

Многофакторные модели строили на основе множественной логистической регрессии, коэффициенты для которой рассчитывали методом Ньютона. Математический анализ результатов с помощью логистической регрессии был проведен к.т.н. Н.Б.Паклиным. Результаты исследования и их обсуждение

Аналитические характеристики тест систем «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ОМ-Биочип»

В наших исследованиях по оценке качества новых тест-систем в формате биочипа мы руководствовались рекомендациями CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) и протоколами стандартных диагностических ИФА тест-систем в формате 96 - луночного планшета. Исследованные аналитические характеристики включали: изучение стабильности (воспроизводимости) калибровочной кривой, проведение специальных тестов на точность и надежность определения ОМ (тесты на «открытие» и линейность), определение аналитической чувствительности.

Воспроизводимость калибровочной кривой оценивали внутри одного и того же эксперимента (intra-assay), а таюке от эксперимента к эксперименту (inter-assay). Оценка воспроизводимости осуществлялась с помощью коэффициента вариации (KB), равного отношению стандартного отклонения к средней величине, выраженному в процентах.

В серии экспериментов были получены калибровочные кривые на ПСАобщ и ПСАсв в тест-системе «ОМ-Биочип (ПСА), демонстрирующие зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации антигена. Линейный диапазон калибровочных кривых составлял для ПСАобщ (0 нг/мл - 117 нг/мл), для ПСАсв (О нг/мл - 100 нг/мл). В наших исследованиях в подавляющем большинстве опытов КБ значений флуоресценции для каждой точки калибровочной кривой не превышал 10% (рис. 5).

О 20 40 60 80 100 120 140 [ПСАобщ), иг/мл

О 20 40 60 80 «О 120 [ПСЛсв], нг/мл

Рис. 5. Воспроизводимость в тест-системе «ОМ-Биочип(ПСА)». Калибровочные кривые на ПСАобщ и ПСАсв, полученные в серии экспериментов на разных партиях биочипов. Каждая точка калибровочной кривой - среднее значение 8 измерений. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений.

Воспроизводимость измерений уровня ПСА в образцах сыворотки крови.

Из таблицы 3 видно, что имеется вполне удовлетворительная воспроизводимость значений ПСАобщ и ПСАсв внутри одного эксперимента (¡пЬта-аввау) на одной партии биочипов. КВ не выходил за пределы допустимых 10% при концентрациях ПСАобщ 0.49 - 68.1 нг/мл и ПСАсв 0.99 - 9.1 нг/мл.

Таблица 3. Воспроизводимость данных, полученных на биочипах для уровней ПСАобщ и ПСАсв внутри одного эксперимента

ПСАобщ, нг/мл ПСАсв, нг/мл

среднее 8Б кв% среднее 8Б КВ%

И01 0.49 0.05 112 024 0.06 20.8

И02 12.1 122 10.1 3.7 033 8.8

ИОЗ 24.9 21 8.6 4.7 0.42 8.9

ИСМ 68.1 53 7.7 9.1 0.89 9.8

И05 0.13 0.04 28.6 0 - -

ИОб 9.1 0.7 7.8 3.9 033 8.5

И07 4.8 032 6.7 0.99 0.09 9.9

И08 1.8 0.15 8.6 029 0.08 282

В серии экспериментов были получены калибровочные кривые на шесть исследуемых маркеров в тест-системе «ОМ-Биочип». Линейный диапазон калибровочных кривых составлял для ПСАобщ (0 нг/мл - 70 нг/мл), ПСАсв (0 нг/мл -69 нг/мл), РЭА (0 нг/мл - 95 нг/мл), АФП (0 нг/мл - 577 нг/мл), ХГЧ (0 МЕ/л - 517 МЕ/л) и НСЕ (0 нг/мл - 144 нг/мл). КВ для калибровочных кривых на АФП, ПСАсв, НСЕ и ХГЧ не превышал 8,2%, 10%, 9,4% и 10% соответственно, для ПСАобщ - 11%,

для РЭА - 12,5%. Средние КВ для всех шести опухолевых маркеров изменялись в пределах от 3,7 до 10,4%. На рис. 6 представлены данные, иллюстрирующие воспроизводимость калибровочных кривых для тест-системы «ОМ-Биочип» внутри одного эксперимента (в качестве примера показаны графики воспроизводимости для АФП и ПСАобщ). Видно, что калибровочные кривые в пределах одного опыта достаточно хорошо воспроизводятся. Т.о., воспроизводимость калибровочных кривых, полученных одновременно для шести опухолевых маркеров, следует рассматривать, как высокую.

(intra-assay) для АФП и ПСАобщ.

Далее была оценена воспроизводимость калибровочных кривых для шести маркеров, полученных в трех независимых экспериментах (inter-assay) на разных партиях чипов. Полученные графики для АФП и ПСАобщ показаны на рис. 7.

[АФП], нг/мл

Рис. 7. Воспроизводимость калибровочных кривых АФП и ПСАобщ в трех независимых экспериментах (Inter-assay) на разных партиях биочипов. Каждая точка калибровочной кривой - среднее значение 5 измерений. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений.

Наилучшая воспроизводимость калибровочных кривых была получена для АФП, ПСАобщ и ПСАсв. Средние КВ для пяти опухолевых маркеров изменялись в пределах от 2% до 11% и, следовательно, воспроизводимость тест-системы «ОМ-Биочип» для ПСАобщ, ПСАсв, РЭА, АФП и ХГЧ высокая. Однако, воспроизводимость калибровочной кривой для НСЕ в трех независимых экспериментах была неудовлетворительной, КВ варьировал от 9 до 32%. По результатам наших исследований из 6-ти объединенных на одном носителе диагностических систем необходимую воспроизводимость имели только пять.

Тест на «открытие» показал соответствие (в %) измеренной концентрации определяемого антигена его расчетной концентрации. В тесте на «открытие» системы «ОМ-Биочип (ПСА)» использовали сыворотки крови человека с разными концентрациями ПСА, которые предварительно были измерены на чипе. Из них были приготовлены образцы для постановки теста на «открытие» путем смешивания в равных соотношениях. Образцы смесей измеряли на чипах и вычисляли процент «открытия» для ПСАобщ и ПСАсв. В экспериментах были использованы три серии биочипов, на которых сравнивали ожидаемую концентрацию с реально измеренной на чипе. Средний процент «открытия» составил для ПСАобщ 101,98% и ПСАсв 107,11%.

В тесте на «открытие» системы ОМ-Биочип использовали калибровочные пробы КП2 и КП4 и контрольные сыворотки (КС1 и КС2) из набора реагентов, содержащие смесь антигенов (ПСА, РЭА, АФП, ХГЧ и НСЕ) с известными концентрациями. В первом варианте смешивали в равных объемах калибровочные пробы КП2 и КП4, во втором варианте - контрольные сыворотки. Образцы смесей измеряли на чипах и сравнивали ожидаемую концентрацию смешанных образцов с полученной на чипе. В таблице 4 представлены данные % «открытия» полученные для образцов, приготовленных с использованием КП2 и КП4.

Таблица 4. Тест на «открытие» ОМ-Биочип с использованием калибровочных проб

Концентрации опухолевых маркеров, нг/мл

ХГЧ АФП РЭА ПСАсв ПСАобщ НСЕ

расчетная 151,8 99,8 17,3 16,9 19,2 28,7

измеренная 178,15 92,4 15,25 18 17,85 13,7

% открытия 117 93 88 107 93 48

Близкое к 100% «открытие» имели АФП, ПСАсв и ГТСАобщ (отличия в пределах 10%), удовлетворительное - ХГЧ и РЭА (отличия в пределах 17 и 12%, соответственно), неудовлетворительное НСЕ - 48%. Т.о., испытанная диагностическая система «ОМ-Биочип» показала удовлетворительные результаты теста для пяти опухолевых маркеров.

Тест на линейность подтвердил правильность работы тест-систем в формате биочипа на всех участках калибровочной кривой. Содержание анализируемого антигена, измеренное в тест-системе «ОМ-Биочип (ПСА)» не отличалось от расчетной более, чем на 10%. Для ПСАобщ и ПСАсв линейность наблюдалась вплоть до разведения в 160 раз.

В тест-системе «ОМ-Биочип» исследовали 3 образца сыворотки крови с высоким содержанием 1) АФП; 2) РЭА; 3) ПСА. Отклонение измеренной концентрации о* расчетной величины выражали в % (таблица 5).

Таблица 5. Результаты теста на линейность с использованием образцов сыворотки крови

Совпадение измеренной концентрации с расчетной в %

Разведение 4* 8 16 32 64 128

Антиген V

ПСАобщ 100 92 99 101 105 170

ПСАсв 100 88 73 72 78 60

РЭА 100 95 75 64 27 58

АФП 100 144 91 81 88 116

*за 100% была принята концентрация при разведении образца в 4 раза

Результаты проведенных тестов на линейность показали, что мультиплексная тест-система «ОМ-Биочип», позволяла с достаточной надежностью определять одни опухолевые маркеры (например, ПСА) и значительно менее надежна в отношении определения других маркеров (например, РЭА).

Аналитическая чувствительность - наименьшее количество вещества, определяемое с помощью данного теста. Нами проведена серия экспериментов, в которых проверяли аналитическую чувствительность тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» для ПСАобщ и ПСАсв. Её рассчитывали как концентрацию, соответствующую среднему значению флуоресценции 10-кратно измеренной нулевой калибровочной пробы КП0 + 2 стандартных отклонения. По нашим данным для двух

форм ПСА аналитическая чувствительность тест-системы «ОМ-

Биочип (ПСА)» составляла 0,2 нг/мл, что сопоставимо с чувствительностью ИФА тест-систем.

В таблице 6 приведены данные по аналитической чувствительности тест-системы «ОМ-Биочип», полученные разработчиками - ИМБ им.В.А.Энгельгардта РАН.

Таблица 6. Данные аналитической чувствительности тест-системы «ОМ-Биочип»

Маркер Чувствительность

хгч З.ОМЕ/л

АФП 1.0 нг/мл

РЭА 0.5 нг/мл

ПСАсв 0.2 нг/мл

ПСАобщ 0.3 нг/мл

НСЕ 2 нг/мл

Диагностические характеристики тест-систем «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ОМ-Биочип». Регрессионный анализ.

Диагностические характеристики двух отечественных мультиплексных тест-систем «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ОМ-Биочип» мы сравнивали с характеристиками ИФА тест-систем «Fujirebio Diagnostics» на образцах сывороток крови различных исследуемых групп.

Сравнивали группу больных РПЖ с группой больных ДГПЖ по уровням ПСАобщ, ПСАсв и %ПСАсв. Это имеет значение для дифференциальной диагностики таких больных. В качестве контрольных групп для испытаний тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» были взяты больные с иными урогенитальными формами рака (рак мочевого пузыря, рак яичка, рак почки) и здоровые доноры-мужчины (см. табл.1). На большом клиническом материале (239 образцов сыворотки крови) показана высокая степень корреляции данных, полученных в тест-системах «ОМ-Биочип (ПСА)» и в традиционной ИФА «Fujirebio Diagnostics» (рис. 8 а, б). Коэффициенты корреляции г составляли 0.96 для ПСАобщ и 0.94 для ПСАсв соответственно. Уровень значимости корреляции высокий, р<0.0001.

а)

б)

Рнс. 8. Линии регрессии уровней ПСАобщ (а) и ПСАсв (б), измеренных в тест-

системах «ОМ-Биочип (ПСА)» и ИФА- «Fujirebio Diagnostics»

Следовательно, тест-система «ОМ-Биочип (ПСА)» позволяет одновременно проводить измерения обеих форм антигена и получать результаты, сопоставимые с данными, полученными в традиционных ИФА тест-системах «Fujirebio Diagnostics», предназначенных для определения одного опухолевого маркера.

Средние значения уровней ПСАобщ и ПСАсв, установленные в исследованных группах мужчин в тест-системе «ОМ-Биочип (ПСА)», графически представлены в виде гистограммы на рис. 9. Группа доноров имеет показатели ПСАобщ и ПСАсв не превышающие общепринятые пороговые уровни нормы (4 нг/мл и 1.1 нг/мл, соответственно). Не наблюдается превышения этих уровней и в группах больных такими злокачественными урогенитальными заболеваниями, как рак почки, мочевого пузыря и яичка. Самый низкий уровень обеих форм ПСА наблюдается в сыворотках крови больных раком почки. Уровень ПСАобщ в группе ДГПЖ незначительно превышает верхнюю границу нормы и составляет 5,2 нг/мл. В исследуемой группе РПЖ средний уровень ПСАобщ повышается до 36,8 нг/мл, что позволило выделить группу мужчин со злокачественными опухолями. В исследованных группах выявлены значительные индивидуальные колебания уровней двух форм ПСА у больных РПЖ (ПСАобщ от 0 до 167 нг/мл и ПСАсв от 0 до 43 нг/мл).

40 35 30 25 20 15 10' 5-

Ы ПСАобщ □ ПСАсв

. а. I

.О* .J?

V/

Рис. 9. Средние уровни ПСАобщ и ПСАсв в исследованных группах мужчин, измеренные в тест-системе «ОМ-Биочип(ПСА)»

На основании непараметрического критерия Манна-Уитни группа больных РПЖ по уровню ПСАобщ достоверно отличалась от групп здоровых доноров (р=0,0001), больных раком почки (р=0,0001), раком яичка (р=0,0001), раком мочевого пузыря (р=0,005). При сравнении больных РПЖ и ДГПЖ по уровню ПСАобщ достоверных отличий не найдено (р=0,195).

Общее количество отобранных образцов сыворотки крови для испытаний диагностической системы «ОМ-Биочип» для одновременного определения шести опухолевых маркеров (ПСАобщ, ПСАсв, РЭА, АФП, ХГЧ и НСЕ) составило 85. Для лабораторной апробации были собраны образцы сыворотки крови больных со злокачественными и доброкачественными опухолевыми заболеваниями, неопухолевыми заболеваниями, а также здоровых доноров (см. табл. 2). В каждом образце сыворотки на биочипе одновременно определяли шесть опухолевых маркеров (ПСАобщ, ПСАсв, РЭА, АФП, ХГЧ и НСЕ). В тех же образцах определяли каждый опухолевый маркер в отдельности, используя коммерческие ИФА наборы «Fujirebio Diagnostics» и «DRG Diagnostics». Результаты определения 6-ти опухолевых маркеров: ГЧ, РЭА, НСЕ, АФП, ПСАобщ и ПСАсв в тест-системе «ОМ-Биочип» сопоставлены с данными, полученными в ИФА системах «Fujirebio Diagnostics» и «DRG Diagnostics» с применением регрессионного анализа. Полученные линии регрессии представлены на рис. 10 (а, б) (показаны для РЭА и АФП).

а) б)

Рис. 10. Линии регрессии уровней РЭА (а) и АФП (б) измеренные в тест-системах «ОМ-Биочип» и ИФА- системе «Fujirebio Diagnostics».

Коэффициенты корреляции г результатов измерений в двух системах составили: ля АФП - 0.97(р<0.001), для РЭА - 0.95(р<0.001), для ПСАобщ и ПСАсв - 0.94 и 0.91, соответственно (р<0.001), для ХГЧ - 0.91(р<0.001). Для НСЕ коэффициент корреляции составил 0.71(р<0.001). Следовательно, тест-система позволяет проводить измерения шести опухолевых маркеров и получать результаты, сопоставимые с данными, полученными в традиционных ИФА тест-системах «Fujirebio Diagnostics» и «DRG Diagnostics».

В отобранных образцах сыворотки крови для испытаний диагностической системы «ОМ-Биочип» наиболее многочисленными были группы больных РПЖ (13), раком кишечника (14) и с трофобластической болезнью (9). Проведенный анализ экспрессии опухолевых маркеров в этих группах представлен на рис. 11,12. Процент больных с повышенными уровнями ОМ определяли, используя известные из литературы пороговые уровни: для ПСАобщ - 4 нг/мл; для ПСАсв - 1нг/мл; для АФП - 6 нг/мл; для РЭА - 5 нг/мл; для НСЕ - 12 нг/мл; для ХГЧ - 5 МЕ/л. В тест-системах «ОМ-Биочип» и ИФА были получены согласующиеся результаты. У 80-90% исследуемых больных с РПЖ наблюдалось превышение уровня главного маркера -двух форм ПСА, но в отдельных случаях повышались уровни РЭА, НСЕ и АФП. У 90 % больных раком кишечника наблюдалось повышение уровня РЭА и отмечался прирост уровней 5 других опухолевых маркеров: ХГЧ, АФП, НСЕ, ПСАобщ и ПСАсв.

рак кишечника

□ йючип ВИФА

Рис.11. Процент больных с повышенным уровнем опухолевых маркеров в группе больных РПЖ и раком кишечника.

трофобластическая болезнь

Рис. 12. Процент больных с повышенным уровнем опухолевых маркеров в группе больных трофобластической болезнью

В группе с трофобластической болезнью главным образом повышался уровень ХГЧ, из них у 20 % исследуемых наблюдалось повышение уровня НСЕ. Уровни остальных маркеров ни в одном случае не были повышены. В 16 % случаев уровень НСЕ был выше нормы в группе пациентов с доброкачественными новообразованиями, неонкологическими заболеваниями и доноров (24 человека).

Из результатов, полученных для опухолей трех локализаций (РПЖ, рак кишечника и трофобластическая болезнь) в двух типах диагностических систем, следует, что в исследованных группах при раке каждой локализации может увеличиваться экспрессия не одного, а нескольких маркеров. Увеличения уровня опухолевых маркеров в исследованных группах имели определенную специфичность,

и отличались как друг от друга, так и от уровня маркеров при доброкачественных заболеваниях.

Определение диагностической эффективности тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)».

Диагностическую эффективность тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» оценивали с помощью ROC-анализа по следующим параметрам: диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность системы, а также площадь под ROC - кривой AUC (Area Under Curve). Определена способность диагностической системы «ОМ-Биочип (ПСА)» дифференцировать по уровням ПСАобщ и ПСАсв 1) группу больных РПЖ от группы здоровых доноров; 2) группу больных РПЖ от группы больных злокачественными урогенитальными заболеваниями и 3) группу больных РПЖ от группы больных ДГПЖ, что имеет большое значение в с крининговых об следованиях мужчин старше 45 лет.

Перечисленные группы в ROC-анализе рассмотрены как три клинические модели. Для каждой модели были построены ROC-кривые (рис.14).

ПСАобщчил ПСАсвчип

100-8рес№№у 1ОО-Эреайс^

Рис. 14. ROC-кpивыe ПСАобщ и ПСАсв для диагностической системы «ОМ-Биочип (ПСА)». Модель больные РПЖ / здоровые доноры.

ROC-aнaлиз показал, что при пороговом значении уровня ПСАобщ 1.16 нг/мл диагностическая система «ОМ-Биочип (ПСА)» позволяет дифференцировать больных РПЖ от здоровых доноров с чувствительностью 69% и специфичностью 96%. При общепринятом пороге - 4 нг/мл, соотношение чувствительность/специфичность составляла 47%/100%, соответственно. Для ПСАсв ЯОС-анализ давал оптимальный порог 0.69 нг/мл и соотношение чувствительность/специфичность 44.4%/100%, при повышении порога ПСАсв до 1.1 нг/мл соотношение было равно 42%/100%. Площади под ROC-кpивoй (АиС) составляли 0.7-0.8, что свидетельствовало о хорошем

качестве диагностической модели. Таким образом, тест-система «ОМ-Биочип (ПСА)» позволяла отличать больных РПЖ от здоровых доноров с высокой специфичностью. ЯОС-анализ показал высокие показатели диагностической эффективности тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» на модели больные РПЖ/ больные злокачественными урогенитальными заболеваниями (рак почки, рак мочевого пузыря, рак яичка): соотношение 50-70% чувствительность и 80-98% специфичность) (рис. 15).

ПСАобщчип 1

ПСАсвчип 1

100 100

80 J ^ 80

60 tivity СП о

40 / / (Л S 40 со

20 / 20

0 0

20 40 60 80 100 100-Specificity

0 20 40 60 80 100 100-Specificity

Рис. 15. ROC-анализ ПСАобщ и ПСАсв для тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)».

Модель больные РПЖ/больные иными злокачественными урогенитальными заболеваниями.

ROC-анализ позволяет не только оценить диагностическую эффективность той или иной системы, но также сравнить тест-системы на основании оценки площади под ROC-кривой (AUC). На рис. 16. сопоставлены ROC-кривые для модели РПЖ/ДГПЖ при сравнительном измерении %ПСАсв в 2-х системах. В этом случае площадь под кривой ИФА «Fujirebio Diagnostics» составляла 0.629, а для биочипа -0.725. Суммарные показатели AUC, полученные при сравнении двух диагностических систем на всех изученных моделях, представлены в таблице 7. Как видно, диагностическая эффективность тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» не уступала диагностической эффективности стандартной ИФА тест-системе «Fujirebio Diagnostics». Показатели двух тест-систем достоверно не отличались (р>0.05).

• ПСА%чип

flCA%Fujirebio Diagnostics

20 40 60 80 100 100-Specificity

Рис. 16. Сопоставление ROC-кривых для уровней %ПСАсв. Тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» и «ИФА-система Fujirebio Diagnostics». Модель больные РПЖ/ДГПЖ

Таблица 7. Результаты сравнения диагностической эффективности тест-системы ОМ-Биочип (ПСА) и ИФА тест-системы «Fujirebio Diagnostics».

группы Измеряемый параметр Тест-система Р

ОМ-Биочип (ПСА) Fujirebio Diagnostics

AUC AUC

РПЖ/ДОНОРЫ ПСАобщ 0.776 0.790 0.688

ПСАсв 0.745 0.726 0.655

%ПСАсв 0.875 0.869 0.931

РПЖ / ЗЛ. УРОГЕНИТАЛЬНЫЕ ОПУХОЛИ ПСАобщ 0.800 0.820 0.240

ПСАсв 0.748 0.760 0.709

%ПСАсв 0.701 0.599 0.401

РПЖ/ДГПЖ ПСАобщ 0.646 0.582 0.08

ПСАсв 0.554 0.526 0.257

%ПСАсв 0.725 0.629 0.154

Оценка диагностической эффективности моделей, основанных на комбинации опухолевых маркеров при помощи логистической регрессии.

Вторым математическим подходом, применяемым в настоящее время для анализа мультиплексных систем, является применение множественной логистической регрессии. Этот метод позволяет оценить влияние сразу нескольких параметров (уровней опухолевых маркеров) на конечный результат (диагноз). Анализ результатов с помощью логистической регрессии проведен к.т.н Н.Б.Паклиным. Для тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА) был взят массив данных больных старше 45 лет, включающий образцы сыворотки крови больных РПЖ, иными злокачественными урогенитальными

заболеваниями и ДГПЖ. Выбрана группа со значениями ПСАобщ и ПСАсв меньшими 25 нг/мл. В итоге исследуемая группа составила п=89.

На рис. 17 представлены ЯОС-кривые тест-системы «ОМ-Биочип (ПСА)» для однофакторной модели и 4-факторной модели логистической регрессии (1Л4). Видно, что наибольшая площадь под ЯОС-кривой соответствует модели логистической регрессии, то есть многофакторная модель обладает большей эффективностью по сравнению с однопараметрическими моделями.

Рис.17. Сравнение площади под ROC-кривыми для ПСАобщ, ПСАсв, %ПСАсв и для модели логистической регрессии (LR4), учитывающей 4 фактора, для системы «ОМ-Биочип (ПСА)».

С помощью моделей логистической регрессии было показано, что тест-система в формате микрочипа имеет диагностическую эффективность, сопоставимую с эффективностью ИФА-систем «Fujirebio Diagnostics» на ПСАобщ и ПСАсв. Значения площадей под ROC-кривыми для модели логистической регрессии составили 0,719 (Fujirebio Diagnostics) и 0,749 (ОМ-Биочип (ПСА)).

выводы

1. Тест-система в формате микрочипа «ОМ-Биочип (ПСА)» на две формы ПСА (общую и свободную) имеет аналитические характеристики, сопоставимые с характеристиками традиционных ИФА систем «Fujirebio Diagnostics»: аналитическая чувствительность 0.2 нг/мл, воспроизводимость KB <10%, процент «открытия» 102% и 107%. Полученные в тесте на линейность величины находятся в пределах ±10% от ожидаемых величин.

2. На большом клиническом материале (239 сывороток крови) показана высокая степень корреляции уровней ПСАобщ и ПСАсв, измеренных в системе «ОМ-Биочип (ПСА)» и в традиционной ИФА системе «Fujirebio Diagnostics».

3. Показано, что система «ОМ-Биочип (ПСА)» для одновременного определения двух форм ПСА и их соотношения имеет диагностическую эффективность, позволяющую достаточно надежно дифференцировать исследуемую группу больных РПЖ от группы здоровых доноров, больных ДГПЖ и иными злокачественными урогенитальными заболеваниями. Диагностическая эффективность новой системы не уступает эффективности традиционных ИФА систем Fujirebio Diagnostics и может быть использована для своевременной диагностики РПЖ в группе высокого риска (мужчины старше 45 лет).

4. Результаты одновременного определения уровней шести опухолевых маркеров в системе «ОМ-Биочип» хорошо коррелируют с результатами, полученными при их индивидуальном определении в традиционных ИФА-системах Fujirebio Diagnostics и DRG Diagnostics (АФП г=0.97 (р<0.001), РЭА г=0.95 (р<0.001), ПСАобщ и ПСАсв г=0.94 и г=0.91, соответственно (р<0.001), ХГЧ г=0.91 (р<0.001), НСЕ г=0.71 (р<0.001)).

5. Применение систем в формате биочипа позволяет одновременно измерять уровень нескольких ОМ, использовать минимальные количества образца и реагентов, расширить линейный диапазон определяемых концентраций ОМ. Информативность испытанных мультиплексных систем в формате микрочипа не уступает монодиагностическим наборам ИФА и в перспективе позволит улучшить диагностику злокачественных новообразований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Osipova Т., Ryabykh Т., Sokolova Z., Sawateeva Е., Dementieva Е., Darii Е., Karaseva V., Rubina A., Baryshnikov A., Zasedatalev A. The elaboration of biochip-based test-system for prostate cancer diagnostics. // 17th International Congress on Anti-cancer Treatment, Paris, France, January 30 - February 2. - 2006. Abstract book P. 287.

2. Рябых Т.П., Осипова T.B., Дементьева Е.И., Соколова З.А., Савватеева Е.Н., Коновалова Е.В., Рубина А.Ю., Барышников А.Ю., Заседателев А.С. Разработка диагностической тест-системы на основе биочипа на простатический специфический антиген (общую и свободную формы). // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 21-24 марта 2006. Российский Биотерапевтический Журнал. - 2006 -Т.5, №1. - С. 10.

3. Рябых Т.П., Осипова Т.В., Дементьева Е.И., Соколова З.А., Савватеева Е.Н., Коновалова Е.В., Рубина А.Ю., Барышников А.Ю., Заседателев А.С. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простат-специфического антигена в сыворотке крови. // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2006 - Т.5, №2. - С.49-57.

4. Осипова Т.В., Рябых Т.П., Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Соколова З.А., Матвеев В.Б., Савватеева Е.Н., Барышников А.Ю., А.С. Заседателев. Тест-системы на основе биочипа для диагностики рака простаты. // Материалы Московской Международной конференции «Биотехнология и медицина» Москва, 14-17 марта 2006 - С. 103.

5. Рябых Т.П., Осипова Т.В., Дементьева Е.И., Савватеева Е.Н., Соколова З.А., Филиппова М.И., Коновалова Е.В., Рубина А.Ю., Барышников А.Ю., Заседателев А.С. Применение технологии белковых микрочипов для диагностики рака предстательной железы. // Материалы VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» Москва, 23-26 ноября 2006 - С. 432.

6. Osipova Т., Ryabykh Т., Rubina A., Dementieva Е., Sawateeva Е., Konovalova Е., Sokolova Z., Matveev V., Baryshnikov A., Zasedatelev A. Biochip - based testsystem for prostate cancer diagnostics. // In: New aspects of biotechnology and medicine. Nova Science Publishers, Inc. New York, 2007. - P. 15-28.

7. Соколова 3.A., Рябых Т.П., Осипова Т.В., Матвеев В.Б., Модорский М.И., Барышников А.Ю. Использование микрочипов для диагностики рака предстательной железы. // Материалы VIII Международного конгресса «Здоровье и Образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» Москва, 14-17 ноября 2007 - С. 584-585.

8. Sokolova Z., Ryabykh Т., Osipova Т., Karaseva V., Modorsky М., Matveev V., Baryshnikov A. The diagnostic performance of biochip-based test system for simultaneous quantitation of total and free forms of prostate-specific antigen. // 19th International Congress on Anti-cancer Treatment, Paris, France, February 5-8. -2008. Abstract book. P. 137.

9. Соколова 3.A., Осипова T.B., Рябых Т.П., Карасева В.И., Матвеев В.Б., Модорский М.И., Барышников А.Ю. Применение ROC-анализа для оценки диагностической эффективности тест-системы в формате биочипа для определения общей и свободной форм простат-специфического антигена. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные

противоопухолевые препараты» Москва, 17-19 марта 2008. Российский Биотерапевтический Журнал - 2008 - Т.7, №1. - С.59.

lO.Osipova Т., Sokolova Z., Ryabykh Т., Karaseva V., Modorsky М., Matveev V., Baryshnikov A. Simultaneous quantitation of total and free forms of prostate-specific antigen. // Nanotechnology, Boston, CRC Press., 2008 - Vol. 1-3. P. 30-33.

11.Соколова 3.A., Рябых Т.П., Осипова Т.В., Карасева В.И., Матвеев В.Б., Модорский М.И., Барышников А.Ю. Клинические испытания диагностической тест-системы в формате микрочипа для определения общей и свободной форм простат-специфического антигена. // Материалы IX Международной научно-практической конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» Киев, 23-24 апреля 2008. С. 105.

12.0sipova Т., Sokolova Z., Ryabykh Т., Karaseva V., Modorsky М., Matveev V., Baryshnikov A. Biochip-based test system for cancer diagnostics. Simultaneous quantitation of total and free forms of prostate-specific antigen. // NSTI Nanotech, Boston, USA, June 1-5. - 2008. Abstract book. P. 1029.

13.Соколова 3.A., Рябых Т.П., Осипова Т.В., Карасева В.И., Матвеев В.Б., Барышников А.Ю. Диагностические системы для выявления онкологических заболеваний на основе технологии биологических микрочипов. // Сборник тезисов докладов научно-технологических секций Международного форума по нанотехнологиям RusNanoTech Москва, 3-5 декабря - 2008. Т. 2. С.418-420.

14. Sokolova, Z. Osipova Т., Paklin N., Ryabykh Т., Baryshnikov A. Biochip-based systems for simultaneous quantitation of tumor markers. // 20th International Congress on Anti-cancer Treatment, Paris, France, February 3-6. - 2009. Abstract book P. 121.

15.Соколова 3.A., Рябых Т.П., Осипова Т.В., Карасева В.И., Матвеев В.Б., Модорский М.И., Барышников А.Ю. Разработка диагностических систем для выявления онкологических заболеваний на основе технологии биологических микрочипов. // Материалы научной конференции с международным участием «Наноонкология» Москва, 18-19 февраля 2009. Российский Биотерапевтический Журнал - 2009 - Т.8, №2, С. 19-20.

16. Соколова З.А., Рябых Т.П., Осипова Т.В., Карасева В.И., Матвеев В.Б., Барышников А.Ю. Диагностические системы на основе технологии белковых микрочипов для одновременного количественного определения опухолевых маркеров. // Тезисы Международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech Москва, 6-8 октября - 2009. Т.1, С. 909- 911.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФА - иммуноферментный анализ

ПСА - простат-специфический антиген

ПСАсв - свободная форма простат-специфического антигена

ПСАобщ - общая форма простат-специфического антигена

АФП - альфа-фетопротеин

РЭА - раково-эмбриональный антиген

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

НСЕ - нейрон-специфическая енолаза

РПЖ - рак предстательной железы

ДШЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы

Подписано в печать о 2. о 8.1 о Формат 60 х 84/16 Бумага офисная «8уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 750 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24