Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Разработка и применение гемостатических биологических клеев для имплантируемых медицинских изделий

На правах рукописи

Межнева Валентина Васильевна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕЕВ ДЛЯ ИМПЛАНТИРУЕМЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2009

О г ГХ'З

003460244

Диссертационная работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева РАМН.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Лео Антонович Бокерия

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук

Арнольд Арамович Адамян Виктор Алексеевич Иванов Надежда Викторовна Перова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский университет Дружбы Народов

* с

Защита диссертации состоится « года в </5 »1

► час на заседании

специализированного ученого совета Д.208.055.0] при ФГУ «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий» по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий»

Автореферат разослан «_»_;_ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д.208.055.01., доктор медицинских наук, профессор_

Ольга Павловна Шевченко

Актуальность проблемы

Кровотечение в раннем послеоперационном периоде при сложных оперативных вмешательствах (пересадка органов, имплантации протезов клапанов сердца, сосудов и т.д.) является одним из частых осложнений. Возникают проблемы в хирургии и с остановкой диффузных кровотечений, а также часто кровотечения связаны с нарушениями свертывающей системы крови. Для устранения кровотечения требуется трансфузия препаратов крови, дорогостоящих гемостатических средств и нередко реторакотомия.

Применение различных механических способов (ушивание, различные варианты электрической и инфракрасной коагуляции, применение лазеров), с одной стороны, и физических способов, способствующих нормальному свертыванию крови (переливание кровозамещающих средств (плазмы, криопреципитата и т.д.), лекарственных препаратов и т.п.), с другой стороны, не всегда достаточно надежно. Использование этих методов на измененных тканях аорты и сердца, к примеру, нередко вызывает прорезывание швов. Во многих случаях, применение таких гемостатических биоискусственных имгшантатов, как губки, клеи, пленки и т.д. может быть альтернативой для остановки кровотечения. Биоискусственные имплантаты в хирургии в последнее время занимают значительное место. Это стало возможным благодаря тому, что современное развитие науки позволяет сделать их применение безопасным и более приближенным по своим свойствам к естественным тканям и органам. Клеи, благодаря удобству их использования и скорости достижения остановки и предотвращения послеоперационных кровотечений, являются наиболее привлекательными в группе гемостатических имплантатов. При создании гемостатических имплантатов предъявляются высокие требования к их биодеградируемости, биосовместимости и гемостатической активности. К сожалению, современные гемостатические имплантаты полностью этим требованиям не удовлетворяют, поэтому работы по созданию новых имплантатов продолжаются.

Использование биоискусственных имплантатов на основе компонентов крови для остановки кровотечений известно давно. А с 60-х годов прошлого столетия появились синтетические клеи по использованию в целях гемостаза. Основой синтетического клея, чаще всего, являлись цианакрилат и полиметакрилат с различными модифицирующими добавками, улучшающими их биосовместимость. Отечественные синтетические клеи изготавливаются исключительно на цианакрилатной основе (циакрин, МК-7М, Сульфакрилат, Силакрилат, Аргакол). Эти клеи удобны в употреблении и обладают высокой скоростью полимеризации. Однако основными недостатками синтетических

клеев остаются отсутствие эластичных свойств после полимеризации, низкая адгезия на влажных поверхностях и некротическое воздействие, с развитием картины асептического воспаления биологических тканей с исходом в соединительно-тканный рубец.

Биологические клеи, в отличие от синтетических, обладают высокой эластичностью и биосовместимостью. Анализ зарубежных исследований по применению различных видов медицинских клеев показывает, что при сложных оперативных вмешательствах нашли распространение биологические клеи на основе белков животного происхождения - желатина или альбумина (полимеризация которых происходит за счет сшивающих агентов, например, ОЫЧЗ и Вю^ие), а также на основе компонентов крови (фибриногена, тромбина животного происхождения, например, Тюягсо!). Однако они тоже не лишены недостатков. В качестве недостатков этих клеев следует отметить возможную некротизацию тканей и пирогенность, а для фибриновых клеев возможное инфицирование, вследствие переноса инфицирующих агентов компонентов крови, их многокомпонентность и высокую стоимость. Общим недостатком синтетических и биологических хирургических клеев является их эффективность на «сухой» биоткани.

Анализ литературы по рассматриваемой проблеме - создание и применение гемостатических клеев в хирургии показал, что они не удовлетворяют полностью всем предъявляемым к ним требованиям, а именно: быстро останавливать кровотечение, легко рассасываться в организме, не вызывая побочных явлений, быть нетоксичными, апирогенными, не задерживать репаративные и регенеративные процессы, быть удобными в употреблении, отсутствие дефицита и высокой стоимости сырья и оборудования при изготовлении, постоянство качества. Все это создает объективные предпосылки как для разработки новых, так и усовершенствования существующих клеев в целях повышения эффективности борьбы с послеоперационными кровотечениями при сложных оперативных вмешательствах с их использованием.

Учитывая современные требования хирургии, можно заключить, что разработка и внедрение в клиническую практику эластичного биологического клея, сравнимого с лучшими зарубежными аналогами, доступного и лишенного их недостатков, а также эффективного при кровотечении, является актуальной задачей и в настоящее время.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось улучшение профилактики послеоперационных кровотечений при хирургических вмешательствах на внутренних органах использованием новых гемостатических биологических клеев

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Разработка биологических гемостатических клеев на основе различных природных материалов для применения в хирургии внутренних органов.

2. Изучение функциональных свойств разработанных клеев с целью выбора оптимальной рецептуры.

3. Экспериментальная оценка использования разработанных клеев для отработки технологии их нанесения на различные органы и ткани.

4. Разработка ускоренного способа оценки гемостатической активности клеевых композиций.

5 Клинические исследования и анализ опыта применения клея "Биоклей-ЛАБ" при имплантации кондуитов и механических и биологических клапанов из ауто-, алло-и ксеноткани.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1) Создание гемостатических биологических клеев, обладающих высокими адгезионно-когезионными, эластичными, репаративными и регенеративными свойствами, биосовместимостью, нетоксичностью и апирогенностью как на основе улучшения существующих клеев, так и путем разработки их новых рецептур для применения в хирургии.

2) Применение гемостатических клеев при хирургических операциях повышает эффективность профилактики кровотечений за счет снижения кровопотери и количества, переливаемых трансфузионных препаратов, сокращения времени оперативных вмешательств, количества повторных операций, времени реабилитации больных и летальности.

Научная новизна

В результате проведенных научных и экспериментальных исследований впервые доказана возможность получения устойчивого геля на основе желатина со спирализованной структурой молекулы и с разной степенью деструкции (низхой и высокой молекулярной массой), сшитого альдегидами в качестве основы биоискусственных медицинских клеев. Это позволило впервые получить желатино-резорциново-глутарово-формальдегидный клей, имеющий высокие прочностные, адгезионные и эластичные

свойства для применения в хирургии с целью профилактики и остановки кровотечений при имплантации медицинских изделий. Преимуществом разработанного клея (фирменное название «Биоклей-ЛАБ»), в отличие от зарубежных аналогов, является его низкая вязкость, позволяющая исключить стадию подогрева основы клея, улучшить смешивание компонентов, наносить клей тонким слоем в труднодоступные места и, самое главное, снизить количество токсичного компонента в клее - формальдегида.

Впервые подтверждена эффективность применения этого клея для профилактики послеоперационных кровотечений при сложных кардиохирургических операциях на корне и восходящем отделе аорты при имплантации механических и биологических клапанов из ауто-, алло- и ксеноткани. Показано, что клей в 1,5 раза сокращает кровопотерю, снижает количество переливаемых трансфузионных препаратов в среднем на 27%, сокращает время оперативного вмешательства и количество реопераций. Экспериментально доказано, что применение клея способствует повышению регенеративных и репаративных процессов в тканях за счет увеличения количества клеток и роста коллагена, а также, что он являетя биодеградируемым, биосовместимым, нетоксичным и апирогенным.

Впервые, учитывая высокие гемосгатические и адгезионные свойства феракрила и способность альгината натрия к набуханию и гелеобразованию, ускорению регенеративных и репаративных процессов, был создан биоискусственный Гемостатический клей нового типа. Отличительной особенностью разработанного клея является его способность останавливать кровотечение в условиях повышенной влажности без подготовки поверхности тканей перед его имплантацией. При экспериментальном изучении клея показана его высокая гемостатическая эффективность при различных оперативных вмешательствах (время остановки кровотечения на ранах различных органов, и биотканей 30 - 100 секунд) и подтверждено отсутствие токсичных свойств в ближайшем послеоперационном периоде.

Впервые, предложен экспресс-способ качественной оценки in vitro гемостатической эффективности разрабатываемых жидких гемостатиков. Применение способа для определения гемостатической активности новых гемостатиков значительно ускоряет их исследование, а использование крови человека, а не животного, делает его приближенным к естественным условиям, учитывая их разный биохимический состав.

Практическая значимость диссертации

Впервые разработаны технология получения отечественного биологического клея

«Биоклей-ЛАБ» и рекомендации по его использованию в хирургии для имплантируемых

медицинских изделий. Клей внедрен в клиническую практику для профилактики

6

послеоперационных кровотечений в хирургии. Применение клея экономически выгодно, поскольку стоимость «Биоклей-ЛАБ» выгодно отличает его от зарубежных аналогов.

Разработка клея, эффективного при кровотечении, позволит значительно повысить профилактику послеоперационных кровотечений. Оценка влияния разработанного Гемостатического клея на ткани в отдаленные послеоперационные сроки с положительными результатами будет способствовать его внедрению в клиническую практику.

Предложенный экспресс-способ качественной оценки in vitro гемостатической эффективности новых жидких гемостатиков представляет определенную технико-экономическую выгоду за счет значительного сокращения времени исследования по выбору оптимальной рецептуры клея и количества экспериментов на животных.

Реализация результатов работы

Освоен мелкосерийный выпуск биологического клея «Биоклей-ЛАБ» в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН и проведена клиническая оценка его использования при сложных кардиохирургических операциях для имплантируемых кондуитов и клапанов. Полученный положительный опыт использования клея позволил расширить область его применения в различных хирургических клиниках страны и ближайшего зарубежья при сложных хирургических вмешательствах, в том числе для имплантируемых медицинских изделий (протезов клапанов, сосудов и т.д.). Его ежегодное потребление только в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН составляет 1000-1200 упаковок.

Способ in vitro качественной оценки гемостатической активности жидких кровоостанавливающих средств применяется в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН при разработке новых гемостатических изделий и может быть рекомендован для использования в других организациях, занимающихся разработкой жидких гемостатиков.

Апробация работы

Апробация работы состоялась «19» сентября 2008 г. в НЦ ССХ им. А.Н.

Бакулева РАМН на заседании Ученого Совета по экспериментальным исследованиям. .

Результаты исследований докладывались на: Всероссийских съездах сердечно-сосудистых

хирургов НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2001-2007 г.г.), Всесоюзных ежегодных сессиях НЦ

ССХ им. А.Н. Бакулева (2001-2008 г.г.), Всероссийской конференции "Биопротезы в

сердечно-сосудистой хирургии", Кемерово (2001 г.), Научно-практической конференции

«Актуальные вопросы сердечгго-сосудистой хирургии», Нижний Новгород (2003 г.), 1-ой

Международной научно-практической конференции «Современные полимерные

7

материалы в медицине и медицинской технике», Санкт-Петербург (2005 г.), Всероссийских научных конференциях «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2003,2005,2007 г.г.).

Публикации в научных изданиях: по теме диссертации опубликовано 42 печатных работы, из них 13 - в центральной печати (получено 3 патента).

Объем и структура работы.

Общий объем работы - 192 стр., 20 таблиц и 34 рисунка. Состоит работа из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы из 256 наименований (64 отечественных и 192 зарубежных) и приложения на 12 стр.

Анализ литературных данных по проблеме борьбы с послеоперационными кровотечениями и, в частности, с использованием гемостатических имплантатов -хирургических клеев показал три их основных направления исследований, их достоинства и недостатки. Одно из направлений - создание биологических многокомпонентных фибриновых клеев на основе компонентов крови, другое - биохимических двухкомпонентных клеев, содержащих природные материалы и химические - сшивающие добавки, и, третье - синтетических клеев - чаще всего однокомпонентных цианакрилатных, получивших наибольшее распространение в этой группе клеев.

Двухкомпонентные клеи среди хирургических клеев занимают промежуточное положение. Наличие в их составе природных материалов и химических сшивающих добавок выгодно отличает их от других клеев и позволяет им сохранить высокую эластичность, присущую фибриновым клеям и достаточно хорошую адгезионно-когезионную прочность, сравнимую с синтетическими клеями. Однако, при нарушении технологии получения и применения двухкомпонентных клеев, возможны и недостатки, присущие тем и другим клеям. Анализ клинического применения двухкомпонентных клеев в хирургии показал их преимущества для остановки кровотечений и упрочнения измененных тканей (высокая эластичность и прочность пленки). Но вместе с тем были отмечены возможные недостатки при нарушении технологии их применения (некроз и стенозирование тканей). Оценка влияния этих клеев на биоткани и возможных причин их негативного воздействия, позволили разработать практические рекомендации для устранения этих недостатков.

Учитывая огромный положительный опыт применения зарубежного аналога клея бЫТ) в хирургии, экономические и технологические аспекты производства медицинских клеев, определяющими условиями для проведения исследований по разработке двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея явились доступность и достаточно невысокая стоимость исходных компонентов, возможность изменения структуры желатина и сравнительно несложная технология его получения.

Общим недостатком всех известных в настоящее время клеев является их эффективность на «сухой» поверхности биоткани. По этой причине разработка клея, эффективного при кровотечении, требовала особого подхода для решения этой проблемы.

Материалы и методы исследования

В работе исследовали различные рецептуры клеев как в лабораторных условиях, так и в экспериментах на животных. После завершения комплекса необходимых исследований и выбора оптимальной рецептуры клея исследование проводили в клинике на однородной группе пациентов.

Для разработки рецептуры желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея «Биоклей-ЛАБ» использовали следующие материалы: желатин пищевой марки П-11 ГОСТ 11293-89 и 10%-ный раствор желатина ТУ 9365-001-00480359-98; резорцин марки «ч» или «о.с.ч.»; глутаровый альдегид 25%-ный раствор марки «о.с.ч.»; формалин 37%-ный раствор марки «о.с.ч.»; дистиллированная вода.

При разработке Гемостатического клея использовали: натрия альгинат ФС 42-338397; феракрил; дистиллированная вода.

Оценку функциональных свойств опытных рецептур клеев проводили при использовании различных методов исследования: физико-химических, физико-механических и биологических, причем применяли как стандартные, так и нестандартные методы, разработанные в процессе выполнения исследования.

Физико-химические методы исследования использовали для определения: внешнего вида компонентов клея «Биоклей-ЛАБ», вязкости, плотности и молекулярных . масс желагино-резорциновой основы и используемого желатина, толщины клеевой пленки, содержания альдегидов и резорцина в вытяжках, жизнеспособности и времени полимеризации клеев, условий стерилизации сырья и компонентов биологических клеев.

Физико-механическими методами исследования оценивали влияние клея «Биоклей-

ЛАБ» на упруго-прочностные свойства нативной ткани и ксеноперикарда,

стабилизированного глутаровым альдегидом, а также прочность на разрыв для склеенных

9

образцов ткани (нестандартным методом). Использовали стандартные методы испытаний образцов биоткани ксеноперикарда с клеем и без клея на растяжение и определения модулей упругости при растяжении (ГОСТ 9550-81, ГОСТ 11262-80). Эти испытания проводили на стенде фирмы «Instron 1112» с регулируемым усилием закрепления образцов в пневмозажимах.

Биологическими методами исследования определяли:

- In vitro - гемостатические и антимикробные свойства клея, цитотоксичность экстрактов на культуре фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ и гемолитическое действие экстрактов на изолированных эритроцитах кролика и человека;

- In vivo - гемостатические свойства клея, его воздействие на ткани аорты, легкого, печени, кишечника, желудка (гистологические исследования), раздражающее действие при внутрикожном введении, сенсибилизирующее действие вытяжки по реакции дегрануляции тучных клеток и провокационной кожной пробе, острую токсичность на мышах при внутрибрюшинном введении, пирогенность при внутривенном введении вытяжки кроликам.

Гемостатические свойства клеев определяли двумя способами: общепринятым в экспериментах на животных и новым разработанным способом в лабораторных условиях на стабилизированной крови больных после проведения необходимых для пациента коагулологических анализов.

Для этого к 1 мл стабилизированной крови прикапывали 0,1 - 0,2 мл биологического клея, все смешивали, включали секундомер и отмечали, в случае наличия гемостатического эффекта клеевой композиции, образование сгустков крови за время в течение 1 минуты. Чем выше гемостатические свойства клея, тем быстрее происходило образование кровяного сгустка. По виду получаемого сгустка (эластичный или рыхлый) судили о наличии или об отсутствии эластичных свойств у клея.

Антимикробные свойства биологических клеев оценивали по методике, аналогичной дискодиффузионному методу определения активности антибиотиков. Использовали как референтные штаммы, так и клинические штаммы, выделенные при раневой инфекции.

Экспериментальные методы исследования биологических клеев проводили на

различных группах животных: беспородных белых крысах, кроликах породы

«Шиншилла» и беспородных собаках. Эксперименты на животных проводили с целью

оценки гемостатической активности клеев, воздействия клеев на различные ткани

(гистологические исследования),.их нетоксичности, апирогенности и выбора оптимальной

Ю

рецептуры и отработки технологии их применения при различных типах хирургических вмешательств.

Разработка двухкомпонентных хирургических клеев

Огромный опыт применения в различных областях хирургии зарубежного аналога двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея СИРО показал эффективность его использования, в том числе при имплантации клапанов сердца и лечения аневризмы аорты, для профилактики кровотечений и упрочнения измененной стенки аорты. Однако были выявлены возможные негативные воздействия клея на ткани и причины, способствующие этому воздействию, которые настораживали хирургов. В качестве основной причины негативного воздействия клея на ткань указывали большое содержание формальдегида. Учитывая все эти факты, разработку рецептуры клея проводили с целью устранения известных недостатков, характерных для клея 01?Р0. Полагали, что высокая вязкость желатино-резорциновой основы, обусловленная ее высокой концентрацией, и структура молекул желатина, находящихся в состоянии «клубка», затрудняют смешивание компонентов клея и их сшивку альдегидами, которые частично могли оставаться в свободном состоянии, что приводило к некрозам ткани.

В научно-производственном отделе Медицинской биотехнологии в научно-производственной группе по разработке медицинских клеев НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН при выборе оптимальной рецептуры клея разработали и исследовали более 60 рецептур желатино-резорциновой основы и 20 рецешур глутарово-формальдегидного отвердителя.

Учитывая анализ литературных данных о структуре желатина и условиях его гелеобразования, разработка рецешур клея проводили исходя из следующих положений:

1) Образование упорядоченного состояния спиральных молекул желатина при гелеобразовании происходит при температуре ниже 35°С;

2) Снижение исходной концентрации геля желатина способствует увеличению набухаемости полученной пленки при ее попадании снова в растворитель;

3) Спирализованное состояние молекул желатина увеличивает количество сшивок формальдегидом главным образом за счет межмолекулярных взаимодействий, но при этом возрастает вероятность и внутримолекулярных связей.

Таким образом, концентрация разработанной рецептуры клея должна быть близкой к 20% (оптимальная, степень- набухания-пленки), -температура гелеобразования около 25°С (исключение стадии нагрева). Это, полагали, позволит снизить вязкость желатино-

11

резорциновой основы и количество формальдегида, при повышении прочности и эластичности пленки и увеличению сшивок альдегидами.

При выборе оптимальной рецептуры клея руководствовались следующими критериями: наличие гемостатических, эластичных и хороших адгезионных свойств, отсутствие токсичных и пирогенных свойств, биодеградируемосгь клея и биосовместимость продуктов биодеградации, жизнеспособность более 30 секунд, время полимеризации - не более 3-5 минут, удобство в применении, доступность и невысокая стоимость исходного сырья, воспроизводимость клея и сохранность свойств клея после стерилизации его компонентов и хранения клея в течение срока его годности. При разработке отвердителя исходили из того, что содержание формальдегида в рецептуре должно быть минимальным, при сохранении всех выше перечисленных свойств.

При использовании высокомолекулярного желатина не удавалось значительно снизить вязкость основы клея, а - низкомолекулярного желатина ухудшалась адгезия. Для достижения поставленной цели, автор предположила, что использование монопептидов и полипептидов желатина (молекулярная масса 14680±68 и 96270±145) в определенной пропорции за счет применения желатина с разной степенью денатурации при его сшивке альдегидами позволит получить клей с низкой вязкостью и сниженным содержанием альдегидов. Получили 3 рецептуры желатино-резорциновой основы, которые при комнатой температуре имели низкую вязкость и сохраняли способность к гелеобразованию, их время полимеризации «до отлипа» было в интервале 3-5 минут, а жизнеспособность не менее 40 секунд. Оптимальную рецептуру клея из трех выбирали в эксперименте ка животных по ее максимальной эффективности. Клей получил фирменное название «Биоклей-ЛАБ».

Таблица 1

Концентрация основы клея и содержание альдегидов в 1 мл отвердителя.

Марка клея, страна Биоклей-ЛАБ, Россия СИРО, Франция ОКТО, Япония

Количество, мг формальдегида 123 166,5 333

глутаральдегида 41 25 « 50

Концентрация основы, % желатино-резорциновой -20 -50-60 -70

Первый компонент (молекулярная масса 44580±139) клея состоял из высоко- и низкомолекулярного желатина (~ 6-7 % и 8,5-9,5 % соответственно), резорцина (~ 4,5 %) и остальное - дистиллированная вода (~ 80 %). В состав второго компонента входили глутаровый альдегид, формальдегид и дистиллированная вода в соотношении 1:2:3. Следует отметить, что, как и ожидали, низкая вязкость желатино-рсзорциновой основы (33±0,1спз) позволила не только исключить необходимость подогрева основы до 45°С, в отличие от зарубежных аналогов, но и улучшить смешивание компонентов, снизить содержание альдегидов (табл. 1), наносить клей в виде тонкой пленки в труднодоступные места, легко удалять его избыток.

Результаты исследования физико-химических свойств клея и упруго-прочностных свойств ксеноперикарда до и после нанесения на него клея показали, что клеевая пленка обладает высокой эластичностью и оказывает незначительное влияние на упруго-прочностные свойства ксеноперикарда, которые полностью восстанавливаются после ее удаления. Испытания проводили на четырех группах образцов (в каждой по 5 штук).

Таблица 2

Влияние двухкомлонентного биологического клея «Биоклей-ЛАБ» на упруго-прочностные характеристики биоткани (п=5)

№п/п группы Предел прочности, МПа Максимальные деформации Модуль упругости, МПа

гг рал СТпч Брад вое -р рад А-'кас р М ^кас

1 11,13+2,32 16,25+1,76 0,47±0,01 0,40±0,01 56,0+4,0 83,0+4,0

2 15,52+1,25 22,08+2,09 0,21 ±0,01 0,19+0,01 81,0±7,42 118,8±11,7

3 13,64+0,89 16,27±1,62 0,16+0,01 0,18±0,01 75,0+6,63 75,2±7,72

4 11,53+0,97 28,05+2,47 0,23±0,01 0,24+0,01 40,2+3,31 89,2±5,33

Примечание: рад. - радиальное направление; ос. - осевое направление; кас. - касательное направление;

В таблице 2 показано, что нанесение хирургического шва (группа образцов №2) на ксеноперикард несколько увеличило, а его обработка клеем (группа №3) практически не оказало влияния на предел прочности ксеноперикарда. Одновременное применение хирургического шва и клеевого покрытия (группа №4) на биоткани достоверно увеличило предел прочности ксеноперикарда в осевом направлении (р < 0,05). Контроль (группа №1) -

13

ксеноперикард, стабилизированный глутаровым альдегидом по стандартной методике, разработанной в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева.

Получение герметизирующего покрытия клея «Биоклей-ЛАБ» происходило при смешении 2 мл желатино- резорциновой основы (компонент №1 - флакон) клея (рис. 1J и 4-5 капель (0,05 мл) глутарово-формальдегидного отвердителя (компонент №2 - шприц-тюбик). Клей наносили на швы и анастомозы при тщательном осушении ткани салфетками и предварительной обработке 2-3 каплями отвердителя.

а) б)

Рис. I Подготовка клея к работе: а) - набор желатино-резорциновой основы в одноразовый шприц; б) - введение отвердителя в одноразовый шприц с желатино-резорциновой основой клея.

Оценку физико-химических показателей компонентов клея и самого клея проводили поэтапмо: во время изготовления компонентов и после их получения. Характеристика клея: Компонент №1 (желатино-резорциновая основа) - однородная, вязкая жидкость светло-желтого цвета, стерильная; Компонент №2 (отвердитель) -прозрачная, бесцветная жидкость с содержанием альдегидов не более (16±1) %. Жизнеспособность клея более 30 секунд, время полимеризации клея на биологической ткани или стекле не более 3-5 минут. Срок хранения клея в условиях склада не менее З5 лет при температуре (0-8)°С.

Санитарно-химические исследования экстрактов клеевой пленки «Биоклей-ЛАБ» показали, что изменение значения рН вытяжки различных партий клея (п=5) в сравнении с контролем составило 0,32-0,48 ед. рН при допустимом - ±1,00 ед. рН. Методом жидкостной хроматографии установили, что содержание резорцина в вытяжке не более 0,0046 мг/л, а оксида этилена не обнаружили в пределах чувствительности определения - 0,1 мг/л при допустимом - 2 мг/л. Содержание альдегидов в вытяжке по данным ацидометрического метода составило не более 0,0038 мг/л.

При ускоренном методе экстракции (время экспозиции через 0,30, 60,120,180,240 мин, 24 час, до разрушения пленки, в отличие от стандартной методики, где рекомендуемая экспозиция 7, 14, 21, 30, 60 суток) оценки содержания продуктов в вытяжке из клеевой пленки обнаружили, что в течение 3 часов после склеивания весь резорцин выделился из нее, а альдегидов - их максимальное количество. Изучение деструкции клеевой пленки в дистиллированной воде может указать на возможные пути метаболических превращений клея в живом организме. Эти данные показали, что вначале происходит разрушение резоршшо-формальдегидного олигомера, а затем уже полипептидов желатина, сшитых альдегидами. Как и ожидали, чем больше время отверждения клея, тем медленнее происходила деструкция клеевой пленки (при отверждении в течение 5 мин. - через 4 суток, а 10 мин. - через 6 суток).

Окончательный выбор оптимальной рецептуры клея и отработку технологии его применения проводили в экспериментах на животных. Для этого под наркозом у животного выполняли хирургическую операцию, обеспечивающую доступ к внутренним органам (печени, аорте, легкому и т.д.), затем наносили кровоточащую рану и после наложения негерметичных швов или без швов производили остановку кровотечения при помощи исследуемого клея или тампона, в случае контроля.

Качественную оценку in vitro гемостатического эффекта клеев проводили разработанным лабораторным способом, который отличался как гуманными соображениями, так и технико-экономическими от эксперимента на животных. При его выполнении, не требовалось содержание большого количества животных (приобретение, уход, кормление и т.п.), подготовки операционных, наркотизирующих и другие лекарственных препаратов, необходимых при проведении эксперимента на животных. Хирургическая операция - это стрессовая ситуация для животного, что может повлиять на достоверность получаемых результатов. Использование нового способа позволило значительно сократить количество опытов на животных и ускорить исследования по отбору оптимальной рецептуры (10-15 минут для 5-10 новых рецептур клея).

Использование крови человека (после проведения обязательных коагулологических анализов, не производя при этом ее специальный забор), а не животного позволило исследование оценки гемостатического эффекта клея сделать более приближенным к естественным условиям. На рис. 2 представлены результаты оценки гемостатического эффекта феракрила, как известно, обладающего высоким гемостатическим эффектом.

Рис. 2 1 мл стабилизированной 3,8%-ным раствором цитрата натрия крови больных с 0,1 мл 1%-ного раствора феракрила (эластичный сгусток образовался в течение 5 секунд).

I? ходе экспериментов установили, чем выше гемостатическая активность разрабатываемого средства, тем выше скорость образования кровяного сгустка. Вид образующегося сгустка (эластичный или рыхлый) позволял судить о наличии или об отсутствии эластичных свойств клея.

После предварительного выбора 3-х рецептур клея «Биоклей-ЛАБ», обладающих наилучшими показателями, дальнейшее исследование их эффективности для остановки кровотечения и отработки технологии их применения проводили в эксперименте на животных на артериях, венах, аорте и легком. Эксперименты на беспородных собаках (п=!0) обоего пола, массой 12-18 кг, проводили под тиопенталовым наркозом (вначале в/в вводили 400 мг тиопентала, затем по 50 мг через каждые 20 минут и вводя в/в Гепарин в дозе 15 ЕД/кг/ч). Выполняли разрез грудной клетки в области сердца, затем выделяли аорту и проводили разрез аорты. На место разреза накладывали кетгутовые швы и восстанавливали общий кровоток. При изучении влияния клеевой композиции на ткань легкого проводили интубацию животного, подключали к аппарату искусственного дыхания, выделяли легкое и на нем проводили разрез ткани 2.5x1 см, затем наносили 1 мл клея на рану, укрывая всю ее поверхность. Легкое при этом выполняло свою физиологическую функцию.

Имплантация третьей рецептуры клея на хирургические швы на артерии, аорте и легком показали лучший гемостатический эффект по сравнению с другими рецептурами клея. При использовании рецептуры №3 клея время остановки кровотечения на бедренной артерии составило 60 сек., на аорте -100 сек., легком - 150 сек., тогда как при применении рецептур №1

и №2 это время составило 100 и 120 сек. - на артерии, 150 и 210 сек. - на аорте и 230- и 280 сек. - на легком соответственно. В контроле, где место разреза ушивали без применения клея, кровотечение прекратилось через 250 сек. на бедренной артерии, а на аорте и легком через 400 и 450 сек. Это оказалось достоверно больше, чем при применении рецептуры № 3 (р<0.05). Именно третья рецептура клея получила фирменное название «Бноклен-ЛАБ».

Эксперимент на животных показал, что при неглубоких ранах легкого г! 1 мм, после нанесения клея на место разреза для достижения гемостаза и аэростаза, достаточно было прижать эту область в течение 2-3 мин. без ушивания. При глубине ран более 1 мм, необходимо вначале наложить хирургический шов, а затем на него нанести клей.

Гистологическое исследование влияния клея "Биоклей-ЛАБ" на ткани показало, что при его подкожной имплантации белым крысам (группа по 3 особи, массой 250-300 г, наркоз внутрибрюшинно кетамин 15 мг/кг, тиопентал - 30-40 иг/кг) тканевая реакция не выявила агрессивного изменения тканей по истечению 21 суток (рис. 3). В опытном образце лейкоцитарная инфильтрация выражена незначительно, в основном в глубоких слоях дермы. В контрольном образце, напротив, видны обширные участки выраженной инфильтрации дермы и подкожной клетчатки лейкоцитами; сосуды расширены и полнокровны, с развитием стаза.

а) б)

Рис. 3. Гистологический срез тканей кожи и подкожной клетчатки в области разреза у белых крыс на 21 сутки: а) контроль - без нанесения клея, б) опыт - после нанесения клея. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

Оценка антимикробных свойств клея, проведенная для референтных штаммов Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus АТСС 25923 и клинических штаммов Acinetobacter baumannii', Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, выделенных при раневой инфекции, показала наличие

устойчивых зон задержки роста микроорганизмов вокруг капли клея, несмотря на ужесточение условий эксперимента. Концентрация микробных тел была увеличена с 103 кое/мл до (1-2)107 кое/мл. Диаметр зоны лизиса составлял 11-12 мм для всех штаммов, как это показано на рис. 4.

Рис. 4. Зона задержки роста референтного штамма Escherichia coli АТСС 25922 вокруг капли биологического клея «Биоклей-ЛАБ» (показано стрелкой).

Образовавшиеся зоны лизиса вокруг капли клея сохранялись при термостатировании препаратов при 37°С в течение 3-х суток наблюдения. Этот факт подтверждает наличие антимикробных свойств у биологического клея "Биоклей-ЛАБ".

Разработка однокомпонентного Гемостатического клея

Разработку Гемостатического клея проводили в соответствии с такими требованиями, как наличие адгезионно-когезиопных, эластичных и гемостатических свойств, биосовместимости, стерильности, низкой вязкости, отсутствие токсичности и пирогенности. В основу создания клея на основе полисахарида - альгината натрия ФС 423383-97 и феракрила (моножелезная соль полиакриловой кислоты), были положены такие свойства как набухание и гелеобразование, высокие репаративные и регенеративные свойства с одной стороны, и наличие адгезионно-когезионных и гемостатических свойств, с другой стороны, соответственно. Наличие ионов железа в рецептуре клея способствует образованию нерастворимого комплекса с альгиновыми кислотами. Эта работу проводили совместно с сотрудниками лаборатории патологии и фармакологии гемостаза Гематологического Научного Центра РАМН (рук.- д.м.н., проф. В. А. Макаров).

Характеристика клея: Гемостатический клей представляет собой высоковязкий водный раствор, содержащий 5 - 20% альгината натрия и 15-30% феракрила, рН 4,0-6,0. Для его приготовления расчетные количества исходных компонентов после набухания и растворения подвергают радиационной стерилизации. Полученный клей по внешнему виду представляет собой неоднородный с отдельными включениями, высоковязкий, водный раствор светло-коричневого цвета. При его нанесении на кровоточащую рану в течение 30-45 сек образуется эластичный кровяной сгусток.

Клей, наносили на рану из одноразового шприца, удалив иглу и равномерно заполняя раневую поверхность, без ее осушения. После остановки кровотечения его избыток осторожно удаляли, а на поверхности раны образовывалась тонкая пленка. Клей может храниться при температуре (0-8)°С в течение 3 лет, что подтвердили результаты оценки сохранности его свойств после хранения в условиях склада.

Оценку функциональных свойств гемостатического клея проводили в эксперименте на животных. В экспериментах на кроликах породы «Шиншилла», массой 3-4 кг под тиопенталовым наркозом (2-4 мл 0,1% раствор внутривенно, а затем до 6-10 мл внутрибрюшинно) выполняли лапаротомию, используя продольный разрез по белой линии живота. В рану выводили переднюю поверхность печени. Затем на печень наносили поверхностную рану площадью около 1,5 см2 и глубиной около 0,1 см. Оценку гемостатической активности клея, проводили путем остановки развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения при нанесении клея на всю площадь раневой поверхности, перекрывая ее края. Эксперимент проводили в условиях гипокоагуляции, вводя в/в капельной инфузией Гепарин в дозе не менее 15 ЕД/кг/ч.

Таблица 3.

Гемостатическая активность Гемостатического клея в условиях эксперимента на кроликах (п=3).

Исследуемый орган кролика Время остановки кровотечения, секунды Достоверность показателей

Контроль Опыт

Печень 320±19 30±15 р<0.05

Желудок 240±21 23±7 р<0.05

Толстая кишка 240±21 15±5 р<0.05

Аналогичным образом проводили эксперимент на желудке (гастротомическое отверстие ушивали двурядными швами с последующим нанесением 0,1 мл клеевой

композиции) и кишечнике (после выполнения разреза на двух сегментах толстой кишки и наложения анастомоза бок в бок, герметизацию анастомоза проводили 0,1 мл Гемостатического клея). Полученные результаты исследования представлены в таблице 3.

а) б)

Рис. 6 Структура ткани печени кролика: а) - контроль (операционная

рана - интактная); б) опыт (операционная рана с воздействием клея в течение 60 минут). Окрашено - гемотоксилин-эозином. При имплантации Гемостатического клея на анастомоз на аорте у беспородной собаки остановка кровотечения произошла в течение 20-30 секунд, контроль - более 300 секунд (рис.7).

а) б)

Рис. 7 Анастомоз на аорте собаки: а) - до нанесения и б) - после нанесения Гемостатического клея. Гистологическое исследование по оценке влияния нового Гемостатического клея на печень кролика после его воздействия в течение 30 и 60 минут (рис.6) показало, что структура ткани печени в опыте полностью сохранена. Вся поверхность операционной

раны покрыта эритроцигарно - фибриновым тромбом, в синусоидных капиллярах вблизи раневой поверхности - агглютинированные эритроциты. Признаков токсического воздействия в виде дистрофических изменений гепатоцитов не выявлено, также отсутствовало накопление какого-либо субстрата в клетках Купфера. Контролем служили интактные кусочки печени.

При имплантации Гемостатического клея на ушитую рану легкого собаки (глубина раны 1 см, длина 3 см), легкое при этом выполняло свою физиологическую функцию, кровотечение было остановлено через 60 секунд, контроль - 400 секунд (рис. 8).

а) б)

Рис. 8 Операция на легком у беспородной собаки: а) - хирургический швов на ране легкого; б) - шов после его герметизации клеем Результаты гистологического исследования ткани аорты после применения клея, при выполнении хронического эксперимента в течение 3 месяцев на собаке, представлены на рисунке 9.

Опыт Контроль

Рис. 9 Результаты хронического эксперимента (в течение 3 месяцев) после

операции с использованием Гемостатического клея на аорте собаки. 21

В контроле в области лигатуры наблюдали единичные клетки инородных тел, петрификацию, фиброз наружных отделов медии. В опыте в области подшивания двух фрагментов был отмечен фиброз ткани и крупноочаговая петрификация. Полученные результаты не показали негативного влияния клея на ткани, поскольку петрификация возможна в результате наложения швов. Однако необходимо продолжить исследования по изучению влияния клея на ткани в отдаленные послеоперационные сроки.

Для разработанного Гемостатического клея оценивали влияние паровой (120° С — 20 минут) и радиационной (однократной и дробной) стерилизации на его функциональные свойства. Основным критерием работоспособности разработанной Гемостатической композиции после стерилизации считали сохранность гемостатической активности, как сразу же после нее, так и при длительном хранении (не менее 6-12 месяцев). Приемлемой оказалась радиационная (0,5 рад/час - 2 часа) стерилизация.

Клинические испытания клея «Биоклей-ЛАБ»

Исследование проводили у пациентов, которым выполняли сложные хирургические вмешательства на восходящем отделе и корне аорты с имплантацией кондуитов и клапанов. Эти операции проводили с наложением нескольких анастомозов, длительным ИК и пережатием аорты и, как правило, сопровождались большой кровопотерей в послеоперационном периоде. Для наблюдения выбрали две однородные группы пациентов, перенесших операции: Бенталл - Де Боно (протезирование восходящего отдела аорты кондуитом, содержащим механический' протез и ксеноперикардиальную ткань), Росса (в аортальную позицию имплантировали легочный аутографт, а в выводной тракт правого желудочка - легочный алло- или ксенографт) и протезирование аортального клапана криосохраненным аортальным аллографтом свободным корнем. При выполнении этих операций устья коронарных артерий выделяли на площадках и реимплантировали в стенку кондуита.

Все операции с искусственным кровообращением выполняли в режиме умеренной гипотермии при 26-28°С. Кардиоплегию проводили кристаллоидными кардиоплегическими растворами калиевый, Кусгодиол или кровяная по Бакбергу в устья обеих коронарных артерий и/или ретроградно через коронарный синус. Во время операции использовали наружное охлаждение сердца «ледяной кашицей» из физиологического раствора. Пациентам проводили многокомпонентную анестезию по методике, принятой в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН с учетом характера патологии.

Клиническая характеристика пациентов (группа 1 - операции с применением клея, группа 2 - контроль, без имплантации клея) представлена в таблице 4.

У всех пациентов было поражение аортального клапана. У большей части 1-ой и 2-ой групп больных был выявлен инфекционный эндокардит 22 (52,4%) и 20 (51,3%) случаев соответственно. Возраст наблюдаемых больных колебался от 6 до 66 лет в 1-ой и от 4 до 64 лет во 2-ой группах.

Таблица 4 Клиническая характеристика больных.

Характеристика групп Группа 1(%) Группа 2 (%)

Число больных: 42 39

- мужчин 23(54,7) 28(71,8)

- женщин 19(45,3) 11(28,2)

Средний возраст, годы 32,6 ± 14,7 34,6 ±15,1

Недостаточность кровообращения

1 7 (16,7) 8 (20,5)

2А 20 (47,6) 21 (53,8)

2Б 15 (35,7) 10 (25,7)

Функциональный класс по N¥1^:

2 9 (21,4) 8 (20,5)

3 18(42,9) 17(43,6)

4 15 (35,7) 14(35,9)

Типы перенесенных операций и сопутствующая кардиальная патология прооперированных пациентов представлена в таблице 5.

Имплантацию клея, пациентам 1 группы, проводили в условиях «сухого» сердца: при пережатой аорте и опорожненных камерах сердца. После имплантации клапанов, перед нанесением клея «Биоклей-ЛАБ», поверхность операционного шва тщательно осушали салфетками. Несколько капель отвердителя добавляли на биоткань и сразу же осушали поверхность. В шприце смешивали оба компонента клея, в необходимой пропорции, встряхивали и сразу же тонким слоем наносили на линию шва анастомозов аорты, легочной артерии и места реимплантадии коронарных артерий, как показано на рисунке 10.

Таблица 5

Типы перенесенных операций и сопутствующая кардиальная патология.

Типы операций и Группа 1 (%) Группа 2(%)

сопутствующая патология п = 42 п = 39

Операции:

- Росса 23 (54,7) 15 (38,4)

- Бенгалл - Де Б оно 9(21,5) 12 (30,8)

- протезирование корня аорты аллографтом 10(23,8) 12(30,8)

Сопутствующая патология:

- Ишемическая болезнь сердца 1(2,4) 2(5,1)

- Митральная недостаточность 2(4,8) 3(7,7)

- Трикуспидальная недостаточность 1(2,4) 1 (2,6)

- Дефект межжелудочковой перегородки 3(7,1) 1 (2,6)

- Открытый аортальный проток 2 (4,8) -

Выжидали 3-5 минут, это время, необходимое для полимеризации клея «до отлипа». После пуска кровотока и восстановления адекватной гемодинамики, оценивали герметичность анастомозов. При необходимости, накладывали дополнительные швы прямо по отвержденному клею, так как "Биоклей-ЛАБ" после отверждения дает прочную и эластичную пленку.

Рис. 10. Нанесение клея "Биоклей-ЛАБ" на дистальный шов аорты во время операции.

Сравнивая показатели температуры тела больных в течение 10 суток после операции, не получили достоверной разницы в двух группах. Причем в течение первых 45 суток средние цифры температуры держались до субфебрильных цифр: в 1-ой группе -(37,6 ± 0,4)°С, во 2-ой - (37,5 ± 0,35)°С. Далее температура у больных снижалась, и всех больных выписывали с нормальной температурой.

Анализ результатов наблюдений показал, что среднее время пережатия аорты в исследуемых группах не отличалось (в 1-ой группе - 147,8 ± 39,4, во 2-ой группе - 148,3 ± 43,8 мин), однако время искусственного кровообращения хоть и недостоверно, но больше в контрольной группе (в 1 группе - 211,3 ± 53,4 мин., а во 2-ой группе 247,4 ± 148,4 мин.). По-видимому, после снятия зажима с аорты, при кровотечении из аортальных швов, требуется больше времени для гемостаза.

Объем кровопотери в раннем послеоперационном периоде (в течение 24 ч.) в 1-ой группе пациентов варьировал от 100 до 1500 мл, в среднем (397,9 ± 38,3) мл, причем кровопотеря до 500 мл (32 случая, 76,2%), от 500 до 1000 мл у 9 пациентов (21,4%) и 1 больной (2,4%) потерял более 1000 мл. Тогда как во 2-ой группе пациентов потери крови по дренажам составили от 150 до 2000 мл, в среднем (579,5 ± 70,4) мл: у 22 пациентов (56,4%) - менее 500 мл, у 12 пациентов (30,8%) - от 500 - 1000 мл и у 5 больных (12,8%) - более 1000 мл. В группе пациентов с применением клея достоверно меньше кровопотеря в течение первых суток после операции (р = 0,02).

Для устранения гиповолемических состояний у прооперированных больных использовался трансфузионный метод. Средний объем перелитой СЗП оказался достоверно меньше в 1-ой группе (708 ±46,1) мл, чем во 2-ой - (950 ± 86,8) мл, (р < 0,05).

При показаниях уровня фибриногена в крови менее 1 г/л, а также при необходимости продолжения заместительной терапии факторов свертывания на фоне ограничивающих факторов для трансфузий СЗП, применяли криопреципитат. В 1-ой группе пациентов в среднем было перелито (43,7 ± 4,3) мл криопреципитата, а во 2-ой группе - (59,6 ± 5,3) мл, (р = 0,02).

В исследовании 4-м пациентам (9,5%) из 1-ой группы и 11-ти (28,2%) - из второй группы в раннем послеоперационном периоде провели реинфузия отмытых аутоэритроцитов с помощью аппарата Cell Saver 5 (р = 0,03).

Повторные операции, по поводу массивного кровотечения в раннем послеоперационном периоде, провели 6-ти больным. Среди них оказались: 2 пациента (4,8%) из группы с применением клея и 4 больных (10,3%) из контрольной группы.

Дифференцированный источник кровотечения был найден в только 3 случаях: в двух случаях надкостница грудины, в одном - аортальный анастомоз.

В результате проведенных исследований получили достоверную разницу в трансфузии свежезамороженной плазмы и криопреципитата, а также при проведении реинфузии отмытых аутоэритроцитов с помощью аппарата Cell Saver 5 в раннем послеоперационном периоде. Это подтверждает экономическую эффективность применения клея «Биоклей-ЛАБ» при сложных кардиохирургических операциях за счет сокращения переливаемых объемов трансфузионных препаратов.

Обсуждение результатов

Необходимо отметить, что для клея «Биоклей-ЛАБ» был проведен целый комплекс экспериментальных исследований, соответствующий требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия». Не проявлялась токсичность клея при действии его экстрактов на культуру фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ (морфология клеток оказалась аналогичной контролю, количество клеток отличалось от контроля в пределах допустимой погрешности <10%). Степень гемолиза экстрактов разных партий клея на изолированных эритроцитах кролика составила 0,06%, а человека - 0,02% (допустимое - 2%). Не было обнаружено раздражающего действия клея на ткани, при его внутрикожном введении. Сенсибилизирующее действие вытяжек, о котором судили по реакции дегрануляции тучных клеток, показало отрицательную реакцию. Острая токсичность клея не определялась при провокационной кожной пробе и оценке острой токсичности на мышах, при его вкутрибрюшинном введении, макроскопически не было выявлено патологических изменений внутренних органов и тканей, коэффициенты масс внутренних органов опытных животных не имели статистически достоверных отличий от контрольных животных. Отсутствовали пирогенные реакции при внутривенном введении вытяжки кроликам, суммарное повышение температуры не превысило 1,4°С и составило 1,1±0,1°С. Результаты других исследований указывали на наличие хороших адгезионно-когезионных, высоких эластичных, умеренных гемостатических и антимикробных свойств клея. Клей «Биоклей-ЛАБ», по полученным результатам, был признан медицинским изделием, который может длительно контактировать с внутренней средой организма (заключения ГУП ВНИИИМТ МЗ РФ и ФГУ «НИИТ и ИО Росмедтехнологий»).

Клинический анализ применения клея «Бноклен-ЛАБ» проводился на схожих по патологии группах больных, перенесших сложные операции с наложением нескольких анастомозов при имплантации кондуитов и клапанов, с длительным ИК, пережатием аорты и сопровождающиеся большой кровопотерей в послеоперационном периоде. Особенностью проведенного исследования, было выполнение всех операций в одном периоде времени одним хирургом (заведующим отделением неотложной хирургии ППС, профессором Муратовым P.M.). Решение о применении клея принимали во время операции и оно не носило направленного характера.

Среднее время пережатия аорты в наблюдаемых группах не отличалось, однако время искусственного кровообращения хоть и недостоверно, но больше в контрольной группе (опыт - 211,3 ± 53,4 мин., контроль - 247,4 ± 148,4 мин.). После снятия зажима с аорты в связи кровотечением из аортальных швов потребовалось больше времени для гемостаза. Объем кровопотери в раннем послеоперационном периоде (24 ч.) оказался в 1,5 раза меньше в группе с применением клея. Аналогичные результаты были получены и у французских хирургов (Bachet J., 1982), использующих клей GRFG при расслоении аорты.

При устранении гиповолемических состояний снизилось количество переливаемой СЗП в группе с применением клея «Биоклей-ЛАБ» (708 ± 46,1 мл), в сравнении с контрольной группой (950 ± 86,8 мл, р < 0,05). Не было отмечено достоверной разницы между группами в уровне гемоглобина как до, так и после операции (в первой - снизился в среднем на 28 г/л, а эритроцитов на 1,0 х 10 г/л, в контрольной группе - на 30 г/л и на 1,1 х 10 г/л соответственно).

При коррекции послеоперационной анемии переливание донорской эритроцитной массы проводили 39 пациентам (92,8%) в первой группе и 38 пациентам (97,4%) в контрольной группе, при этом средние объемы составили 462 ± 35,2 мл и 590,3 ± 59,8 мл соответственно. Из полученных данных, можно видеть, что в контрольной группе больше перелито эритроцитной массы, но это статистически недостоверно.

Средние значения уровня тромбоцитов до операции в 1-ой и во 2 -ой группах были в пределах нормы. Существенное снижение уровня тромбоцитов выявлено в двух группах в послеоперационном периоде, тогда как достоверной разницы между группами не обнаружено (в 1-ой группе - 42,7 ± 3,7 мл, во 2-ой группе - 50,1 ± 4,8 мл).

При использовании криопреципитата для трансфузий так же его объемы были несколько снижены в группе пациентов с применением клея (в 1-ой группе - 43,7 ± 4,3 мл, а во 2-ой группе - 59,6 ± 5,3 мл, р = 0,02).

Аутогемотрансфузия (отмытых аутоэрнтроцнтов с помощью аппарата Cell Saver 5) потребовалась 4-м пациентам (9,5%) в группе с применением клея «Биоклей-ЛАБ» и 11 больным (28,2%) из второй группы в раннем послеоперационном периоде. Это различие статистически существенно (р = 0,03) и экономически выгодно, учитывая, что применение аппарата Cell Saver 5 на одну операцию обходится в 500 долларов США. Не следует забывать, что аппаратная реинфузия аутоэритроцитов призвана вернуть больному только аутоэритроциты (для их сохранения) и не является средством лечения кровотечения.

Необходимо отметить снижение повторных операций по поводу массивного кровотечения в раннем послеоперационном периоде - у 2s пациентов (4,8%) из группы с применением клея и у 4- больных (10,3%) из контрольной группы.

По литературным данным (Kirsch М. et al., 2002), известен факт наблюдения некроза стенки аорты при введении большого количества клея GRFG в ложный просвет расслоенной аорты. Однако в нашем исследовании, при реоперации на корне аорты, через 10 месяцев, связанной с инфекционным эндокардитом, не было обнаружено некротических изменений стенки аорты в месте наложения клея. Полагаем, что это связано, во-первых, со сниженным содержанием альдегидов в составе "Биоклей-ЛАБ", во-вторых, клей был использован для наружной герметизации швов и, в-третьих, клей, вследствие низкой вязкости, наносили более тонким слоем.

Следует отметить, что в исследовании применение клея не вызывало выраженной общей и местной воспалительной реакции в послеоперационном периоде. У наблюдаемых больных, не было отмечено случаев длительной лихорадки, а выраженность послеоперационной экссудации из полости перикарда практически не отличалась от больных, у которых клей не применялся.

Наблюдали один случай, подтверждения антимикробных свойств клея. В сентябре 2002 г. пациентке С. 40 лет с кальцинированным аортальным стенозом было выполнено протезирование корня аорты криосохраненным аллографтом, на дистальные и проксимальные анастомозы был имплантирован «Биоклей-ЛАБ». В связи с развитием протезного эндокардита, в мае 2003 г. больная успешно реоперирована. Гистологическое исследование биотканей показало гнойное расплавление створок и стенки эксплантированного аллографта, тогда как в месте применения клея - отмечалась незначительная воспалительная реакция и фиброз ткани (рис. 12).

Известен случай, сужения коронарных артерий после реконструкции корня аорты с

применением клея GRFG (Martinelli L. el al., 2000). В нашем наблюдении аналогичный

случай наблюдали у пациента Ч., 50 лет с инфекционным эндокардитом аортального

¿tí

клапана, который перенес 4 операции в условиях искусственного кровообращения. На 3-ей операции, больному был имплантирован бескаркасный ксенографт с реимплантацией устьев коронарных артерий. В связи с кровотечением из мест вколов, на участки реимплантации, дистапьные и проксимальные анастомозы имплантировали «Биоклей-ЛАБ». Через 14 месяцев больной вновь реоперирован, по поводу протезного эндокардита.

Рис. 12 Гистологический срез аллографта у больной С., возраст 41 г., через 6 месяцев после операции, а) - створки эксплантированного аллографта; б) - участок шва аорты, обработанный клеем. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

На операции у больного отмечается муфтообразный стеноз и гиперплазия устья левой коронарной артерии (рис. 13).

Рис. 13. Ангиографическое исследование больного Ч., 50 л., после 4-~ операций. Стрелкой указан стеноз устья левой коронарной артерии.

Можно предположить, что применение клея способствовало этому стенозу. Но, несомненно, перенесенные три операции с ИК, потребовавшие введение кардиоплегических растворов в устье коронарных артерий, могли вызвать!гиперплазию интимы с последующим сужением этих артерий. Больше аналогичных случаев стеноза артерий у больных с применением клея «Биоклей-ЛАБ» в клинике не наблюдалось.

Оценивая экономическую эффективность клея «Биоклей-ЛАБ», необходимо помнить следующие факты. Использование любого гемостатического клея приводит к экономии средств: за счет сокращения времени оперативного вмешательства, уменьшения переливаемых объемов трансфузионных средств, лекарственных препаратов и т.п., отсутствие необходимости использования дорогостоящей аппаратуры, способствующей восстановлению кровопотери. Что касается клея «Биоклей-ЛАБ», то он еще и выгодно отличается от зарубежных аналогов свой стоимостью (25 долларов США за 2 мл, против стоимости 1 мл фибринового клея «Т^исо!» от 300 долларов США и 5 мл клея ЕНо01ие -от 500 долларов США).

Заключение

Диссертационная работа посвящена улучшению результатов профилактики послеоперационных кровотечений в хирургии для имплантируемых медицинских изделий использованием разработанных биологических клеев, обладающих высокой эластичностью, прочностью пленки и гемостатическими свойствами. Она выполнена на стыке нескольких наук: медицины, биологии и химии. Такое слияние наук позволило разработку медицинских клеев вести целенаправленно и более эффективно результаты экспериментальных исследований доводить до клинического внедрения. Практически на стадии разработки рецептуры клея стало возможным провести ее доработку в соответствии с требованиями хирургов.

С целью обеспечения потребности Центра в биологических гемостатических клеях, в НЦ ССХ им. Бакулева А.Н. РАМН в мае 2001 года была начата разработка медицинского клея. В ходе экспериментальных исследований был разработан новый биологический двухкомпонентный клей «Биоклей-ЛАБ» (аналог зарубежного клея ОЙТО, имеющий огромный опыт применения). Оригинальность разработанного клея заключается в использовании желатина со спирализованной структурой молекулы и различной степенью денатурации. Это позволило снизить концентрацию желатина в растворе и тем самым повысить гидрофильность клеевой пленки, что весьма необходимо при биодеградации клея, а также вязкость клея при комнатной температуре, позволившее исключить стадию его

30

подогрева перед применением. Низкая вязкость клея при комнатной температуре обеспечила равномерное перемешивание обоих его компонентов, и сделало более доступным сшивку спиралнзованных молекул желатина за счет межмолекулярных связей, а также увеличило возможность внутримолекулярных связей. По этой причине стало возможным снижение концентрации альдегидов в сравнении с зарубежными аналогами (табл. 1). При этом адгезионно-когезионные и эластичные свойства клеевой пленки оставались высокими.

Высокая эластичность и прочность клеевой пленки облегчает наложение хирургических швов, способствует упрочнению измененных тканей к при этом исключает их деформацию. Применение клея способствует остановке кровотечения из мест вколов, ускорению репаратнвных и регенеративных процессов тканей, а также сокращает общее время оперативного вмешательства и, как следствие, уменьшает послеоперационную легальность. «Биоклей-ЛАБ» выгодно отличается своей стоимостью от стоимости известных зарубежных аналогов.

Об отсутствии аллергической реакции на клей, может свидетельствовать показатели температуры тела в двух однородных группах больных в течение 10 суток после операции, поскольку не наблюдалось достоверной разницы в их значении (в течение первых 4-5 суток в 1-ой группе - (37,6 ± 0,4)°С, а во 2-ой - (37,5 ± 0,35)°С).

Кровопотеря у прооперированных больных снизилась практически в 1,5 раза. Как следствие этого факта, снизились объемы трансфузий, например, объем СЗП в группе с применением клея «Биоклей-ЛАБ» (708 ± 46,1) мл, в контрольной группе - (950 ± 86,8) мл. Было снижено время проведения операции с искусственным кровообращением (211,3 ± 53,4 мин. в 1-ой группе и в контрольной группе 247,4 ± 148,4 мин.). Количество реопераций снизилось практически вдвое (2 пациента (4,8%) из группы с применением клея и 4 больных (10,3%) из контрольной группы).

Гистологические исследования тканей после применения клея как в эксперименте, так и в клинике, не показали их некротических изменений и выраженного воспалительного процесса, наоборот, клей способствовал более быстрому заживлению раны, а ткани были устойчивы к инфекции (рис.3 и рис.12). Выраженность послеоперационной экссудации из полости перикарда практически не отличалась от больных, у которых клей не применялся. В месте применения клея отмечается увеличение количества клеток и рост коллагена, что хорошо согласуется с литературными данными (Nomori Н., 2000 и Walker J., 1997). Этот клеточный инфильтрат, в месте применения клея, имеет фибробластическую морфологию. После резорбции клея, в месте его применения, огмечаеюя образование не_шачшс;1ьно! и уплотнения.

В нашем наблюдении, не было отмечено значительных изменений гематологических, гемостазиологических, биохимических показателей у пациентов двух групп.

Один случай, наблюдения стеноза коронарной артерии (рис. 13) у тяжелейшего пациента, перенесшего 4 операции по замене клапанов сердца, не может дать однозначного утверждения, что это произошло из-за негативного влияния клея на биоткань артерии. Возможная причина может быть в большом количестве реопераций или в нарушении технологии применения клея (его избыток). Необходимо продолжить наблюдения за прооперированными больными для получения объективного ответа.

Изучение функциональных свойств клея «Биоклей-ЛАБ», показало, что он, так же как и другие известные хирургические клеи, максимально эффективен на «сухой» поверхности биоткани. В этой связи, была предпринята попытка создания клея, работающего на влажных поверхностях.

Совместные исследования ГНЦ РАМН и НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН позволили разработать и получить однокомпонентный Гемостатический клей. Достоинством этого клея является остановка кровотечения без специальной подготовки поверхности перед его нанесением. Гемостатический клей сочетает в себе хорошую адгезию, высокую прочность - синтетического клея и способность к набуханию и гелеобразованию и наличию высоких репаративных и регенеративных свойств -биологического клея. Проведение экспериментальных исследований Гемостатического клея на животных на органах желудочно-кишечного тракта, сердце, аорте, артериях, венах и легком показали эффективность его использования (время остановки кровотечения составляло 30—100 секунд). Гистологические исследования различных тканей после воздействия клея на них указывали на отсутствие его негативного влияния. Однако, для внедрения клея в клиническую практику, необходимо продолжение исследований для оценки его воздействия на биоткани в отдаленные сроки.

Отсутствие экспресс-методов, для оценки свойств разрабатываемых клеев, позволили впервые разработать лабораторный способ для качественной оценки in vitro гемостатических свойств жидких гемостатиков. Применение этого способа позволило ускорить проведение оценки гемостатической активности опытных рецептур клеев без особых затрат на проведение этого исследования и сделало исследование более приближенным к реальным условиям (использование крови человека).

Оценка антимикробных свойств клея «Биоклей-ЛАБ» показала, что дискодиффузионный метод определения активности антибиотиков может использоваться и для клеев и клей обладает , антимикробными свойствами. Наличие антимикробных

¿2

свойств выгодно отличает клей от фибриновых имплантатов и позволяет его использовать в условиях инфицированной раны, что и было подтверждено у больной с инфекционным эндокардитом (рис. 12).

Клеи в хирургии применяются для наружной герметизации анастомозов, фиксации и склеивания тканей. Непосредственно в кровотоке они не используются. Изучение деструкции клея в ускоренном режиме при (26±1)°С, в отличие от стандартного исследования, показала, что в течение первых трех часов может произойти максимальное выделение резорцина и альдегидов (первым разрушается резорцино-формальдегидный олигомер), и это время можно считать негативным по его влиянию на живой организм. В результате экспериментально-клинического наблюдения, негативного влияния клея «Биоклей-ЛАБ» не отмечалось.

Таким образом, клинический анализ применения клея "Биоклей-ЛАБ" при кардиохирургических операциях при имплантации кондуитов, содержащих механический протез клапана и ксеноперикардиальную ткань, и клапанов из ауто-, алло- и ксеноткани показал хирургическую и экономическую целесообразность его использования для профилактики послеоперационных кровотечений. А использование клея при наложении анастомозов на органах желудочно-кишечного тракта, приведенное в приложении к диссертации, указывает на расширенные возможности применения клея в других областях хирургии.

Выводы.

1) Получены одно- и двухкомпонентные гемостатические клеи на основе гелеобразующих природных материалов: полисахарида (альгината натрия) и природного белка (желатина) для применения в хирургии с целью остановки и профилактики послеоперационных кровотечений.

2) Показана возможность использования желатина со спирализованной структурой молекулы и различной степенью денатурации (в определенной пропорции 6-7% низкомолекулярный' и 8,5-9,5% высокомолекулярный), низкой концентрацией раствора (-20%), низкой вязкостью, сниженной температурой сшивки до 25±2°С для получения желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея.

3) Изучены т лг^-функщюнальньк-свойства. разработанных клеев, подтверждающие их гемостатическую эффективность, высокую эластичность и адгезионно-когезионную

33

прочность. Клеи, при их применении in vivo для имплантируемых медицинских изделий, не вызывают деформацию биоткани и не затрудняют наложение дополнительных швов при их необходимости.

4) Оценена безопасность применения разработанных клеев в эксперименте. Оценка биосовместимости клеев проводилась в соответствии с национальным стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия».

i

5) Выбрана оптимальная рецептура желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея с низкой вязкостью (не более 33 спз при комнатной температуре) и сниженным содержанием альдегидов (1б±1%), обеспечивающая жизнеспособность клея не менее 30 секунд, время полимеризации «до отлипа» 3-5 минут. Клей получил фирменное название «Биоклей-ЛАБ».

6) Проведена в эксперименте отработка технологии применения разработанных клеев на различных тканях и органах. Оценка прочностных показателей склеенных образцов in vitro показала необходимость тщательного осушения поверхности ткани перед нанесением клея «Биоклей-ЛАБ» для повышения адгезионной прочности. В 1 экспериментах in vivo было показано, что время отверждения клея различно в зависимости от вида ткани: на аорте, венах, артериях - 3-5 минут, а на легком - 7-10 минут в зависимости от глубины раны.

Гемостатический клей может наноситься непосредственно на рану, исключая подготовку поверхности. В экспериментах in vivo время отверждения клея на аорте, венах, артериях, печени, желудке, толстой кишке - 30-60 секунд, а на легком - 60-100 секунд в зависимости от глубины раны.

7) Предложен новый способ качественный оценки in vitro гемосгатической активности жидких кровоостанавливающих средств, который позволяет сократить время исследования (до 1 минуты) и затраты на проведение экспериментальных исследований на животных для разрабатываемых композиций, а также проводить более приближенную к естественным условиям оценку гемостатической активности на крови человека.

8) Клей «Биоклей-ЛАБ» внедрен в клиническую практику и организовано его мелкосерийное производство. Анализ четырехлетнего опыта клинического использования клея «Биоклей-ЛАБ» при операциях на корне и восходящем отделе аорты при имплантации кондуитов, содержащих механический протез клапана и ксеноперикардиальную ткань, и клапанов из

ауто-, алло- и ксеноткани подтвердил клиническую безопасность и показал, что профилактическое применение клея в клинике позволяет снизить кровопотерю в 1,5 раза, количество переливаемых трансфузионных препаратов на 27%, время оперативного вмешательства на 33% и количество реопераций вдвое.

Практические рекомендации.

1. Основным показанием к применению двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея «Биоклей-ЛАБ» при сложных хирургических операциях является профилактика послеоперационной кровопотери. Герметизация швов, анастомозов и упрочнение несостоятельных тканей может привести к сокращению продолжительности оперативного вмешательства и экономии кровозаменяющих средств.

2. Необходимо помнить, что перед применением клея «Биоклей-ЛАБ» целесообразно тщательно осушить место его нанесения, добавить несколько капель отвердителя на ткани (кроме ксеноперикарда) и сразу же осушить их салфеткой, нанести тонкий слой клея (смесь обоих компонентов), избыток клея необходимо удалить марлевой салфеткой и выждать 3-5 минут. В случае необходимости возможно наложение дополнительных швов прямо по отвержденному клею, т.к. "Биоклей-ЛАБ" после отверждения дает эластичную и прочную пленку.

3. Следует отказаться от применения большого количества клея «Биоклей-ЛАБ» в замкнутом пространстве и с большой осторожностью использовать его дня гемостаза сосудов малого диаметра до получения новых результатов по этой проблеме.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

1. Межнева В.В., Костава В.Т., Муратов P.M., Бакулева Н.П., Кондратенко Ж.Е., Ефимов A.B., Новикова С.П. Влияние белкового биологического клея на упруго-прочностные характеристики стабилизированного ксеноперикарда. // Материалы Всероссийской конференции "Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии", Кемерово,- 2001.- С. 58.

2. Межнева В.В., Бакулева Н.П., Керимов Б.Ч., Колосков И.О., Кондратенко Ж.Е., Соколов М.В., Муратов P.M., Костава В.Т.Изучение возможностей применения нового желатино-резорцинового клея в сердечно-сосудистой хирургии.// Сборник тезисов 7-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦ ССХ.- 2001,-т.2. - №6. - С. 248.

3. Межнева В.В., Бакулева Н.П., Керимов Б.Ч., Муратов P.M., Кондратенко Ж.Е., Соколов М.В., Костава В.Т., Колосков И.О.Экспериментальная оценка вариантов применения желатино-резорцинового клея при хирургической травме магистральных сосудов и легкого. // Сборник тезисов 7-го Всероссийского съезда сердечнососудистых хирургов, Бюллетень НЦССХ. - 2001. - т.2. - №6. - С. 256.

4. Межнева В.В., Муратов P.M., Костава В.Т., Серов P.A., Баранова М.В., Керимов Б.Ч. Новый желатино-резорциновый клей обладает высокой степенью биосовместимостиУ/ Сборник тезисов 6-ой ежегодной сессии НЦ ССХ, Бюллетень НЦ ССХ. - 2002. - т.З,-№5.- С. 180.

5. Межнева В.В., Костава В.Т., Баранова М.В. Желатино-резорциновый клей "Биоклей-ЛАБ" - безопасный биодеградируемын клей.// Сборник тезисов 8-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦССХ. - 2002. - т. 3,-№11.- С. 324.

6. Межнева В.В., Костава В.Т., Баранова М.В., Лютова И.Г., Белобородова Н.В., Анучина Н.М. Антимикробность желатино-резорцинового клея "Биоклей-ЛАБ». // Сборник тезисов 8-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2002.- т. 3.- №11.- С. 256.

7. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Костава В.Т., Межнева В.В. Первые результаты клинической апробации двухкомпонентного желатино-резорцинового клея "Биоклея-ЛАБ". //Сборник тезисов 8-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦ ССХ. -2002,- т. 3.- №11. - С. 318.

8. Бокерия. Л. А., Межнева В. В., Муратов Р. М., Костава В. Т., Серов Р. А. Новый желатино-резорциновый биологический клей «Биоклей-ЛАБ» для профилактики

кровотечений при оперативных вмешательствах. // «Тромбоз, гемостаз и реология».-2002. -№4.-С. 39-42.

9. Межнева В.В., Костава В.Т., Баранова М.В., Белобородова Н.В., Анучина Н.М. Метод оценки антимикробных свойств биологического клея «Биоклей-ЛАБ». //Материалы 1-ой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосудистой хирургии», НЦ ССХ. - 2003. - С. 37.

10. Бокерия Л.А., Межнева В.В., Муратов P.M., Скопин И.И., Костава В. Т. Первый опыт применения биологического клея «Биоклей-ЛАБ». // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы сердечно-сосудистой хирургии», Нижний Новгород. - 2003. - с. 137.

И. Межнева В.В., Муратов P.M., Керимов Б.Ч., Бакулева Н.П., Костава В.Т., Кондратенко Ж.Е., Соколов М.В., Серов P.A., Анучина Н.М., Белобородова Н.В. Экспериментальное изучение нового биологического желатино-резорцинового клея «Биоклей-ЛАБ». // Бюллетень НЦ ССХ. - 2003. - т.4. - № 2. - С. 45-50.

12. Межнева В.В., Гончарова Е.В., Костава В.Т., Анучина Н.М. Выбор метода стерилизации для нового медицинского клея «Биоклей-ЛАБ».// Сборник тезисов 7-ой ежегодной сессии НЦ ССХ. Бюллетень НЦССХ. - 2003. - т. 4. - №6. - С.210.

13. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Межнева В.В., Костава В.Т. Результаты использования биологического клея «Биоклей-ЛАБ» при сложных операциях на корне аорты.// Сборник тезисов 9-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2003. - т. 4. - №11. - С. 348.

14. Макаров В.А., Белозерская Г.Г., Малыхина Л.С., Жидков Е.А., Межнева В.В., Муратов P.M., Костава В.Т., Крестинич И.М., Абасов М.М. Экспериментальные исследования гемостатической герметизирующей композиции. //Сборник тезисов 9-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦССХ.-

2004. - т. 5. - №5. - С. 347.

15. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Межнева В.В., Костава В.Т., Крестинич И.М., Абасов М.М. Клиническое применение нового биологического клея "Биоклей-ЛАБ" при операциях на сердце в условиях искусственного кровообращения. //«Хирургия». -

2005.-№1.-С. 18-20.

16. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Жидков Е.А., Межнева В.В., Муратов P.M., Крестинич И.М., Абасов М.М. Экспериментальное исследование специфической активности новой клеевой гемостатической композиции. //Бюллетень НЦССХ.- 2005. - т. 6. - №2. - С. 17-21.

17. Муратов P.M., Межнева В.В., Крестинич И.М., Абасов М.М., Макаров ВА., Белозерская Г.Н., Мапыхина JI.C., Жидков Е.А. Биологическая характеристика новой гемостатической композиции. // Сборник тезисов 10-ого Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2004. - т.5.- № 11. -С.342.

18. Межнева В.В., Ковбасенко О.М., Солонцова Н.В. Качественный метод оценки гемостатического эффекта в клеевых гемостатических композициях.// Сборник тезисов 10-ого Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2004.- т.5. - № 11. - С. 343.

19. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Жидков Е.А., Межнева В.В., Муратов P.M., Крестинич И.М., Абасов М.М. Новая клеевая гемостатическая композиция. // Материалы 2-ой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» НЦ ССХ. - 2005. -С. 31.

20. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Межнева В.В., Хаджабет Х.Ф., Абасов М.М. Гемостатический эффект «Биоклея-ЛАБ» при сложных операциях на корне аорты Л Материалы 2-ой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» НЦ ССХ. - 2005. - С. 41.

21. Межнева В.В., Солонцова Н.В. Оценка гемостатического эффекта медицинских клеев.// Материалы 2-ой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» НЦ ССХ. - 2005. -С. 220.

22. Абасов М.М., Межнева В.В., Мелконян P.M., Муратов P.M., Серов P.A., Бокерия Л.А. Предварительные результаты гистологического исследования биологических тканей после применения «Биоклея-ЛАБ». // Сборник тезисов 9-ои ежегодной сессии НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2005. - т.6.- №3,- С.194.

23. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Межнева В.В., Костава В.Т., Серов P.A., Абасов М.М. «Биоклей-ЛАБ» - биосовместимый герметизирующий имплантат при кардиохирургических операциях. // Материалы 1-ой Международной научно-практической конференции «Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике». Санкт-Петербург. - 2005. - С. 154.

24. Межнева В.В. Опыт применения двухкомпонентных желатинно-резорциновых глутарово-формальдегидных клеев в кардиохирургии. // Сборник тезисов 11-го

Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ,-2005,- Т.6.- №5.- С. 311.

25. Абасоа М.М., Межнева В.В. Экспериментально-клиническая оценка «Биоклея-ЛАБ».// Сборник тезисов 11-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2005. - т.6. - №5. - С. 313 .

26. Бокерия Л.А., Муратов P.M., Межнева В.В., Абасов М.М. Сравнительный анализ использования клеев GRF и «Биоклея-ЛАБ» в кардиохирургии. // Бюллетень НЦ ССХ.-2005. - т.6. - №4.-С. 59-66.

27. Абасов М.М., Муратов P.M., Межнева В.В., Бокерия Л.А. Вопросы применения различных видов медицинского клея в кардиохирургии. // Информационный сборник НЦ ССХ, серия Медицина, «Сердечно-сосудистая хирургия». - 2005. - №4.- С. 20-27.

28. Муратов P.M., Межнева В.В., Абасов М.М. Сравнительные результаты применения «Биоклея-ЛАБ» при операциях на корне и восходящем отделе аорты. // Сборник тезисов 10-ой ежегодной сессии НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ.- 2006.- т.7.- №3.- С. 35.

29. Межнева В.В., Костава В.Т. Изучение клеевых свойств различных биоматериалов. // Сборник тезисов 10-ой ежегодной сессии НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2006. - т.7. -№3,- С. 231.

30. Межнева В.В., Костава В.Т. Медицинские клеи в кардиохирургии. // Сборник тезисов 12-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых, хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2006. - т.7. - №5. - С. 289.

31. Муратов P.M., Межнева В.В., Абасов М.М. Гемостатическая и экономическая эффективность применения клея «Биоклей-ЛАБ». // Сборник тезисов 12-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. - Бюллетень НЦ ССХ.- 2006. - т.7. - №5. - С. 39.

32. Межнева В.В., Муратов P.M., Абасов М.М. Оценка гемостатаческой эффективности применения клея «Биоклей-ЛАБ» при операциях на корне и восходящем отделе аорты.// Материалы 3-ей Всероссийской науч. конф. «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» НЦ ССХ.- 2007.- С. 155.

33. Межнева В.В., Межнев В.В., Костава В.Т. Изучение гемостатических свойств различных клеевых композиций. // Сборник тезисов 11-ой ежегодной сессии НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ,- 2007,- т. 8.- № З.-С. 203.

34. Муратов P.M., Межнева В.В., Абасов М.М., Бокерия Л.А. Гемостаз с применением клея- «Биоклей-ЛАБ»— лри-операциях—на корне и восходящем отделе аорты. //

Бюллетень НЦ ССХ. - 2007. - т.8. - №2,- С. 66-71.

39

35. Межнева В.В., Самсонова H.H., Плющ М.Г., Костава В.Т., Межнев В.В. Экспериментальные исследования гемостатической активности жидких кровоостанавливающих средств. // Бюллетень НЦ ССХ. - 2007. - т. 8, №2. - С.71 -75.

36. Муратов P.M., Межнева В.В., Абасов М.М., Бокерия JI.A. 4х-летний опыт применения клея «Биоклей-ЛАБ» при операциях на корне и восходящем отделе аорты. // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. - 2007,- №3.-С.41-46.

37. Патент RU 02236260 Россия, МКИ A61L24/10. Хирургический клей - «Биоклей-ЛАБ. Бокерия Л.А., Межнева В.В., Муратов P.M., Костава В.Т (Россия) - №122996/15; Заявл.28.08.02; Опубл. 20.09.04, Бюл. №24.

38. Патент RU 2270016 Россия, МКИ А61К 31/734 (31/78, 31/225), А61Р 7/04. Гемостатический клей. Белозерская Г.Г., Малыхина Л.С., Макаров В.А., Межнева В.В., Костава В.Т. (Россия) - №106691/15; 3аявл.09.03.04; Опубл. 27.08.06, Бюл. №5.

39. Патент RU 2286569 Россия, МКИ G01N 33/48, 33/49. Способ оценки гемостатического эффекта жидких кровоостанавливающих средств. Бокерия ЛА., Межнева В.В., Самсонова H.H., Плющ М.Г. (Россия)- №108926/15; 3аявл.30.03.05; Опубл. 27.10.06 , Бюл.№30.

40. Межнева В.В., Межнев В.В., Костава В.Т. Санитарно-химические исследования клея «Биоклей-ЛАБ» в модельной среде. // Сборник тезисов 13-го Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов НЦ ССХ. Бюллетень НЦ CCX.-2007.-t. 8.- № 6.-С. 313.

41. Межнева В.В., Муратов P.M., Костава В.Т., Суходоев Ю.А. Шприц-пистолет для нанесения хирургического клея «Биоклей-ЛАБ» // Сборник тезисов 12-ой ежегодной сессии НЦ ССХ. Бюллетень НЦ ССХ. - 2008. - т.9. - №3. - С.ЗЗ.

42. Межнева В.В. Экспериментально-клиническая оценка биосовместимости клеев «Биоклей-ЛАБ» и GRFG . //Бюллетень НЦ ССХ. - 2008. - т.9. - №4. - С. 67-76.

Актуальность исследования

В хирургии среди проблем, заслуживающих постоянного внимания, всегда была и остается профилактика послеоперационных осложнений. Среди них кровотечение в раннем послеоперационном периоде при сложных оперативных вмешательствах (пересадка органов, имплантация протезов клапанов сердца, сосудов и т.д.) является одним из грозных осложнений, которое требует трансфузии препаратов крови, дорогостоящих гемостатических средств и нередко реторакотомии для его остановки. Немало трудностей в хирургии возникает и с остановкой диффузных кровотечений. При этом кровотечения нередко связаны с нарушениями свертывающей системы крови.

В качестве методов местной остановки кровотечения существуют различные механические и физические способы. Из известных механических способов гемостаза раневых поверхностей можно привести: ушивание, различные варианты электрической и инфракрасной коагуляции, применение лазеров, а из физических - переливание кровозамещающих средств (плазмы, криопреципитата и т.д.), введение антикоагулянтов и других лекарственных средств, влияющих на повышение свертываемости крови. Однако эти способы не всегда достаточно надежны и нередко сопровождаются нежелательными побочными эффектами, в особенности при их использовании на ткани сердца (прорезывание швов). В этой связи все большее внимание привлекают местные фармакологические средства, такие как гемостатические губки, клеи, пленки, тампоны с лекарственным средством и т.п. Клеи в этом ряду, благодаря удобству их использования и скорости достижения желаемого эффекта, являются наиболее привлекательными.

К сожалению, ни один из известных в настоящее время гемостатических клеев не удовлетворяет в полной мере всем предъявляемым к ним требованиям. Идеальным может считаться такой кровоостанавливающий клей, который обеспечивает быструю остановку кровотечения, легко рассасывается в организме, не вызывая побочных явлений, и не требует для своего изготовления дефицитного и дорогостоящего сырья и оборудования.

В 60-е годы прошлого столетия появились первые работы по использованию в целях гемостаза синтетического клея, являющегося соединением цианакрилата и полиметакрилата, с различными модифицирующими добавками. Отечественные хирургические клеи изготавливаются исключительно на цианакрилатной основе (клеи серии циакрин, МК-7М, Сульфакрилат, Силакрилат, Аргакол). Главным недостатком этих клеев является отсутствие эластичных свойств после полимеризации. Клеи могут оказывать некротическое воздействие с развитием картины асептического воспаления биологических тканей с исходом в соединительнотканный рубец. Зона некроза может достигнуть глубины до 1 мм, что может приводить к нагноению раны.

Несомненный интерес представляют биологические клеи, благодаря биологической совместимости и эластичности, в сравнении с жесткими синтетическими цианакрилатными. Создание таких клеев успешно ведется за рубежом. Анализ опыта зарубежных исследований по разработке и применению медицинских клеев показывает, что при сложных оперативных вмешательствах в хирургии нашли распространение клеи на основе белков животного происхождения - желатина или альбумина, а также клеи на основе компонентов крови (фибриногена, тромбина животного происхождения). Полимеризация клеев на основе желатина и альбумина происходит за счет химических сшивающих агентов. Клеи на основе компонентов крови запускают финальные стадии механизма свертывания крови.

Оба типа клеев позволяют получать эластичное герметизирующее покрытие, обладающее гемостатическими свойствами. Но вместе с тем они также не лишены недостатков. Так клеи на основе животных белков обладают побочными эффектами, такими как возможная пирогенность и некротизация тканей, вызванная присутствием химических сшивающих агентов, а для фибриновых клеев отмечается - инфицирование, вследствие переноса инфицирующих агентов компонентов крови, невысокая прочность клеевой пленки, их многокомпонентность и высокая стоимость. Общим недостатком всех известных в настоящее время хирургических клеев является их максимальная эффективность только на «сухой» биоткани, то есть в условиях искусственного кровообращения и тщательного осушения поверхности ткани перед нанесением клея.

Несмотря на разнообразие предлагаемых гемостатичсеких средств, отечественные клиники нередко испытывает в них нужду, обусловленную нерегулярным обеспечением, малым объемом выпуска отечественных гемостатиков и высокой стоимостью импортных образцов.

Таким образом, анализ литературы по рассматриваемой проблеме демонстрирует постоянное внимание как к изучению опыта применения значительного количества гемостатических изделий, предложенных для местной остановки кровотечения, так и к новым разработкам, ведущимся в этом направлении. Именно детальный теоретический и экспериментально-клинический анализ применения этих изделий подтверждает, что они не в полной мере удовлетворяют требованиям практической хирургии: максимально высокой скорости достижения остановки кровотечения, высоких адгезионно-когезионных свойств в условиях высокой влажности, высокой эластичности и высокой биосовместимости. Это как раз и создает объективные предпосылки как для разработки новых, так и усовершенствования существующих кровоостанавливающих средств.

Создание клея, работающего в условиях активного кровотечения, одна из самых трудно решаемых задач. Совместные исследования ГНЦ РАМН и НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН были посвящены именно этой проблеме. Создание однокомпонентного гемостатического клея на основе природных материалов, эффективно работающего на влажных поверхностях биоткани в условиях кровотечения и обладающего биосовместимостью и высокой эластичностью является важнейшей проблемой, требующей скорейшего решения.

Таким образом, учитывая современные требования хирургии, можно заключить, что разработка и внедрение в клиническую практику эластичных биологических клеев, сравнимых с лучшими зарубежными аналогами, доступных и лишенных их недостатков и эффективных в условиях активного кровотечения является актуальной задачей для предотвращения послеоперационных кровотечений при сложных хирургических операциях.

Цель исследования.

Целью настоящего экспериментально-клинического исследования явилось улучшение результатов профилактики послеоперационных кровотечений использованием новых гемостатических биологических клеев для имплантируемых медицинских изделий

Задачи исследования.

1. Разработка биологических гемостатических клеев на основе различных природных материалов для применения в сердечно-сердечной хирургии и клинической трансплантологии.

2. Изучение функциональных свойств разработанных клеев с целью выбора оптимальной рецептуры.

3. Оценка экспериментального использования разработанных клеев для отработки технологии их нанесения.

4. Разработка ускоренного способа экспериментальной оценки гемостатической активности разработанных клеевых композиций.

5. Анализ клинического опыта применения клея "Биоклей-ЛАБ" при имплантации клапанов из ауто-, алло- и ксеноткани.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1) Создание отечественных гемостатических биологических клеев, обладающих высокими адгезионно-когезионными, эластичными, репаративными и регенеративными свойствами, биосовместимостью, нетоксичностью и апирогенностью как на основе улучшения существующих клеев, так и путем разработки их новых рецептур.

2) Применение разработанных клеев при хирургических операциях повышает эффективность профилактики кровотечений за счет снижения кровопотери и количества переливаемых трансфузионных препаратов, сокращения времени оперативных вмешательств, количества повторных операций, времени реабилитации больных и летальности.

Научная новизна и практическая значимость диссертации

Современное развитие хирургии и отсутствие отечественных, серийно выпускаемых, эластичных клеев явились предпосылкой для проведения исследований по разработке биологических хирургических клеев в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН.

В результате проведенных научных и экспериментальных исследований было впервые доказана возможность получения устойчивого геля на основе желатина со спирализованной структурой молекулы и с разной степенью деструкции (низкой и высокой молекулярной массой), сшитого альдегидами. На основе этих данных, впервые создан и изучен желатино-резорциново-глутарово-формальдегидный клей, имеющий высокие прочностные, адгезионные и эластичные свойства. Преимуществом разработанного клея, получившего фирменное название «Биоклей-ЛАБ», в отличие от зарубежных аналогов, является его низкая вязкость, позволяющая исключить стадию подогрева основы клея, улучшить смешивание компонентов, наносить клей тонким слоем в труднодоступные места и, самое главное, снижено количество токсичного компонента в клее — формальдегида.

Впервые проведена клиническая оценка и показана эффективность применения этого клея для профилактики послеоперационных кровотечений при выполнении сложных кардиохирургических операций на корне и восходящем отделе аорты при имплантации механических и биологических клапанов из ауто-, алло- и ксеноткани. Показано, что клей в 1,5 раза сокращает кровопотерю, снижает количество переливаемых трансфузионных препаратов в среднем на 27%, сокращает время оперативного вмешательства и количество реопераций. Применение клея способствует повышению регенеративных и репаративных процессов за счет увеличения количества клеток и роста коллагена. Он нетоксичен, апирогенен, обладает биосовместимостью.

Разработаны технология получения клея и рекомендации по его использованию. Клей внедрен в клиническую практику и освоено его мелкосерийное производство в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН.

Впервые, учитывая высокие гемостатические и адгезионные свойства феракрила и способность альгината натрия к набуханию и гелеобразованию, ускорению регенеративных и репаративных процессов, был создан I

Гемостатический клей - клей нового типа. Преимуществом разработанного клея, в отличие от других клеев, является его способность останавливать кровотечение в условиях повышенной влажности без подготовки поверхности тканей перед его применением. Показана высокая эффективность клея при выполнении различных оперативных вмешательствах (время остановки кровотечения на ранах различных биотканей 30 - 100 секунд) и отсутствие токсичных свойств в ближайшем послеоперационном периоде в результате экспериментального изучения. Оценка влияния Гемостатического клея на ткани в отдаленные послеоперационные сроки с положительными результатами позволит внедрить клей в клиническую практику.

Впервые, разработан экспресс-способ качественной оценки in vitro гемостатической эффективности новых жидких гемостатиков. Разработанный способ позволяет значительно ускорить исследование новых гемостатиков, а использование крови человека, а не животного, сделать его приближенным к естественным условиям, учитывая их разный биохимический состав. Способ успешно применяется в лаборатории клеев НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН при оценке гемостатической активности новых рецептур клеев и может быть использован другими заинтересованными организациями.

Работа выполнена в научно-производственной группе по разработке медицинских клеев научно-производственного отдела медицинской биотехнологии (руководитель отдела - к.б.н. В. Т. Костава), совместно с отделением неотложной хирургии приобретенных пороков сердца (руководитель - проф., д.м.н. Р. М. Муратов) и с отделом экспериментальных исследований (руководитель - д.м.н. М. В. Соколов) НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН. При разработке гемостатического клея исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ГНЦ РАМН (руководитель - проф., д.м.н. В. А. Макаров).

Автор выражает глубокую благодарность директору Научного Центра сердечно - сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН, академику РАМН JL А. Бокерия за предоставленную возможность выполнения работы и общее руководство исследованиями; заведующему отделением неотложной хирургии приобретенных пороков сердца, профессору, д.м.н. Р. М. Муратову за помощь в проведении экспериментально-клинической апробации клеевых композиций; заведующему научно-производственным отделом Медицинской биотехнологии, к.б.н. В. Т. Костава за помощь в организации группы клеев, ценные советы и замечания в процессе работы, сотрудникам отдела за их участие в выполнении настоящего диссертационного исследования.

Автор также выражает глубокую благодарность всем сотрудникам НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН и сотрудникам ГНЦ РАМН профессору В. А. Макарову, старшим научным сотрудникам Г. Г. Белозерской и JL С. Малыхиной, принявшим участие в проведении представленных экспериментально-клинических исследований.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

7. ВЫВОДЫ.

1) Получены одно- и двухкомпонентные гемостатические клеи на основе гелеобразующих природных материалов: полисахарида (альгината натрия) и природного белка (желатина).

2) Показана возможность использования желатина со спирализованной структурой молекулы и различной степенью денатурации (в определенной пропорции 6-7% низкомолекулярный и 8,5-9,5% высокомолекулярный), низкой концентрацией раствора (-20%), низкой вязкостью, сниженной температурой сшивки до 25±2°С для получения желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея.

3) Изучены in vitro функциональные свойства разработанных клеев, подтверждающие их гемостатическую эффективность, высокую эластичность и адгезионно-когезионную прочность. Клеи не вызывают деформацию биоткани и легко прокалываются иглой не нарушая целостности всей клеевой пленки.

4) Выбрана оптимальная рецептура желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея с низкой вязкостью (не более 33 спз при комнатной температуре) и сниженным содержанием альдегидов (16±1%), обеспечивающая жизнеспособность клея не менее 30 секунд, время полимеризации 3-5 минут. Клей, получивший фирменное название «Биоклей-ЛАБ», внедрен в клиническую практику и организовано его мелкосерийное производство.

5) Оценена безопасность применения разработанных клеев в эксперименте и подтверждена безопасность клея «Биоклей-ЛАБ» при его клиническом применении для имплантируемых клапанов из ауто-, алло- и ксеноткани. Оценка биосовместимости клеев проводилась в соответствии с национальным стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия».

6) Проведена в эксперименте отработка технологии применения разработанных клеев на различных тканях. Оценка прочностных показателей склеенных образцов in vitro показала необходимость тщательного осушения поверхности ткани перед нанесением клея «Биоклей-ЛАБ» для повышения адгезионной прочности. В экспериментах in vivo было показано, что время отверждения клея на различных тканях различно: на аорте, венах, артериях -3-5 минут, а на легком - 7-10 минут в зависимости от глубины раны. Гемостатический клей может наноситься непосредственно на рану, исключая подготовку поверхности. В экспериментах in vivo время отверждения клея на аорте, венах, артериях, печени, желудке, толстой кишке - 30-60 секунд, а на легком - 60-100 секунд в зависимости от глубины раны.

7) Предложен новый способ качественный оценки in vitro гемостатической активности жидких кровоостанавливающих средств, который позволяет сократить время исследования (до 1 минуты) и затраты на проведение экспериментальных исследований на животных для новых разрабатываемых композиций, а также проводить более приближенную к естественным условиям оценку гемостатической активности на крови человека.

8) Проанализирован четырехлетний опыт клинического использования клея «Биоклей-ЛАБ» при операциях на корне и восходящем отделе аорты при имплантации кондуитов и клапанов из ауто-, алло- и ксеноткани и показано, что профилактическое применение клея в клинике позволило снизить кровопотерю в 1,5 раза, количество переливаемых трансфузионных препаратов на 27%, время оперативного вмешательства на 33% и количество реопераций вдвое.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Основным показанием к применению двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея «Биоклей-ЛАБ» при сложных хирургических операциях является его использование для профилактики и остановки послеоперационной кровопотери. Герметизация швов, анастомозов и укрепление несостоятельных тканей может привести к сокращению продолжительности оперативного вмешательства и экономии кровозаменяющих средств.

2. Необходимо помнить, что перед применением клея «Биоклей-ЛАБ» целесообразно тщательно осушить место его нанесения, добавить несколько капель отвердителя на ткани (кроме ксеноперикарда) и сразу же осушить их салфеткой, нанести тонкий слой клея (смесь обоих компонентов), избыток клея необходимо удалить марлевой салфеткой и выждать 3-5 минут. В случае необходимости возможно наложение дополнительных швов прямо по отвержденному клею, т.к. "Биоклей-ЛАБ" после отверждения дает эластичную и прочную пленку.

3. Следует отказаться от применения большого количества клея «Биоклей-ЛАБ» в замкнутом пространстве и с большой осторожностью использовать его для гемостаза сосудов малого диаметра до получения новых результатов по этой проблеме.