Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Разработка и исследование трансдермальных систем доставки инсулина

На правах

КУЗНЕЦОВА Евгения Геннадьевна

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСДЕРМАЛЬНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ИНСУЛИНА

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Центре по исследованию биоматериалов ГУ Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ

Научный руководитель:

Доктор биологических наук,

профессор Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, Тарабарко Николай Васильевич

профессор

Кандидат биологических наук Калянова Наталья Анатольевна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

фармакологии РАМН

Защита диссертации состоится « »_ 2005 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.208.055.01. при ГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д. 208.055.01. Доктор медицинских наук, профессор

Шевченко Ольга Павловна

k4â96

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и практическая значимость.

Сахарный диабет (СД) является одной из основных проблем современной медицины. Он стоит на третьем месте среди причин смертности на земле после сердечнососудистых и онкологических заболеваний (Дедов И.И., Шестакова М.В., 2003). Во всем мире на сегодняшний день насчитывается около 130 млн. больных сахарным диабетом. С каждым годом их число неуклонно растет и, по мнению экспертов, к 2025 году может достигнуть 300 млн. человек. В Российской Федерации сахарным диабетом страдает около 8 млн. человек. На долю диабета 1 типа (инсулинзависимого СД) приходится 10% -15% от всех заболевших диабетом. Оставшуюся часть (85% - 90%) составляют больные диабетом 2 типа (инсулиннезависимого СД).

Лечебный процесс при сахарном диабете в первую очередь должен быть направлен на максимально возможную компенсацию тех метаболических нарушений, которые возникают в организме вследствие абсолютной или относительной недостаточности выработки организмом гормона инсулина.

В норме у здорового человека различают базальную (фоновую) и болюсную (пищевую) секрецию инсулина. Базальная секреция гормона происходит непрерывно в течение суток. Во время еды отмечается дополнительная секреция инсулина, названная болюсной. Традиционные инъекционные формы инсулина не могут полностью компенсировать недостаток гормона в организме больного сахарным диабетом.

Для улучшения качества жизни больных сахарным диабетом разрабатываются неинъекционные способы доставки инсулина: оральные (Платэ H.A., Валуев И.Л., 2001), интраназальные (Kupila А., 2003), ингаляционные (Patton S.J., 1999) и трансбуккальные (Al-Achi А., 1993). Все эти системы могут заменить только инъекции инсулина короткого действия.

Особый интерес представляют трансдермальные терапевтические системы (TTC) доставки инсулина (Севастьянов В.И., 2001). Трансдермальные системы, являясь аналогом внутривенного капельного введения лекарственных веществ, обеспечивают постоянную скорость диффузии лекарства через неповреждённую кожу от нескольких часов до нескольких дней (Шумаков В.И., Севастьянов В.И. и др., 1995).

Было предположено, что чрескожное введение инсулина будет играть роль препаратов инсулина пролонгированного действия, связанную с поддержанием базального (фонового) уровня инсулина в крови. Кроме того, трансдермальное введение

РОС !

aeeÇpft

t. I.e.

инсулина, по сравнению с подкожными инъекциями, является безболезненным и более удобным в применении.

Основной трудностью в создании TTC инсулина является то, что большая молекулярная масса инсулина (5700 Да) препятствует его проникновению через кожу без какого-либо специфического переносчика. Несмотря на то, что многими фармацевтическими компаниями ведется интенсивный поиск химических, физических и биологических активаторов, которые позволили бы доставлять инсулин через неповреждённые участки кожи, в настоящее время не существует допущенных к клиническому применению TTC инсулина.

Цель работы состояла в создании и экспериментальном исследовании различных систем трансдермальной доставки инсулина.

Основные задачи работы:

1. Доказать возможность трансдермального переноса инсулина.

2 Разработать экспериментальные методики для оценки эффективности чрескожного переноса инсулина в условиях in vitro.

3. Найти биологически безопасные разрыхлители кожи и переносчики инсулина через кожу, позволяющие поддерживать постоянную концентрацию инсулина в крови в течение не менее 24 ч.

4. Исследовать функциональные свойства трансдермальных терапевтических систем инсулина различной конструкции в условиях in vitro и in vivo.

Научная новизна

Найдены составы инсулинсодержащих водно-спиртовых и эмульсионных растворов, обеспечивающие в модельных условиях трансдермальный перенос гормона.

Разработаны и исследованы три вида матричных TTC инсулина с использованием коллагеновой, коллагеновой армированной и синтетической матрицы, а также резервуарная TTC инсулина.

Найдены оптимальные составы и размеры TTC инсулина, которые позволяют достичь скорости переноса гормона, соизмеримые со средней скоростью секреции инсулина поджелудочной железой.

В условиях in vitro показано, что матричные и резервуарные TTC могут поддерживать постоянную концентрацию гормона в крови в течение 24 и 48 ч, соответственно.

В экспериментах на животных доказано сохранение биологической активности инсулина при его чрескожном переносе. На двух пациентах-добровольцах с сахарным диабетом подтверждена возможность трансдермальпой доставки биологически активного гормона.

Практическая значимость

Разработан и внедрен в программу доклинических испытаний трансдермальных терапевтических систем инсулина спектрофотометрический метод определения гормона, меченного флуоресцеин из отиоци анатом (ФИТЦ).

Матричные и резервуарные TTC инсулина могут быть использованы в качестве пролонгированной лекарственной формы гормона для больных сахарным диабетом.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межинститутских семинарах Центра по исследованию биоматериалов ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов (2002, 2003 , 2004, 2005 гг.), на К научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» 19-24 сентября 2004, Судак, Украина.

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 6 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и обьем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения, выводов и двух приложений.

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 30 рисунков, 25 таблиц, список литературы из 146 наименований, из них 51 российских и 95 иностранных.

Место выполнения работы

Работа выполнялась в Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (директор - академик РАМН и РАН В.И. Шумаков) в Центре по исследованию биоматериалов (руководитель - д.б.н., профессор В.И. Севастьянов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Материалы

В исследованиях in vitro и in vivo использовали свиной инсулин фирмы Sigma, США. Белок метили флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ), ММ 389, Serva, Швеция.

При изготовлении лабораторных партий TTC инсулина для исследования на пациентах-добровольцах использовали полусинтетический инсулин человека (ФС 42У-201-1103-01), синтезированный на Экспериментальном предприятии Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

В качестве переносчика инсулина использовали САФ-М-99 (синтетический аналог фосфолипидов липофильно-гидрофильной природы), Центр по исследованию биоматериалов ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. Дополнительными активаторами переноса были выбраны витамин Е в масле (ФС 42-164295) и этиловый спирт (ФСП 42-0035-0298-00).

В качестве исходных материалов при создании коллагенсодержащих TTC инсулина использовали:

• коллагеновые губки Гешиспон фирмы «РизаМед», Москва.

• коллаген склеры глаз крупного рогатого скота (тип VII), выделенный методом кислотно-щелочного гидролиза, и 7 видов нетканого материала от разных отечественных производителей для создания коллагеновой армированной матрицы для TTC инсулина:

1. «Фибрелла» Ф-22 (ОАО «Мастерица», Санкт-Петербург);

2. «Фибрелла» Ф-30 (ОАО «Мастерица», Санкт-Петербург);

3. «Фибрелла» Ф-40 (ОАО «Мастерица», Санкт-Петербург);

4. «Фибрелла» Ф-20 (ОАО «Мастерица», Санкт-Петербург);

5. МедП (ЗАО «Медполимер», Москва);

6. Пал (ЗАО «Пальма», Москва);

7. МедТ (ЗАО «Владеке», Москва).

При разработке резервуарной TTC инсулина были исследованы 4 гидрофильные мембраны (Объединенный институт ядерных исследований, Лаборатория ядерных реакций, г. Дубна и ООО «Владипор» г. Владимир).

При выделении коллагена и приготовлении растворов использованы следующие реактивы марки «Реахим»: NaOH «ч.д.а.», Na2S04 «ч.д.а.», Н3ВО3 «х.ч.», ВаСЬ «ч.д.а.», СН3СООН «х.ч.», НС1 «х.ч.».

Методы исследования

Исследование диффузии инсулина из TTC в условиях in vitro.

Образцы кожи взрослых кроликов (Шиншилла, масса 2-2,5 кг) готовили по стандартной методике.

Динамику выхода инсулина из TTC изучали в стеклянных диффузионных ячейках Франца, состоящих из верхней (донорской) и нижней (приемной) камер. На подготовленную кожу, обработанную спиртом, помещали TTC. Кожу вместе с трансдермальной формой фиксировали между фланцами донорской и приемной камер диффузионной ячейки. Приемную камеру заполняли физиологическим раствором (ФР). Инкубацию в течение 48 часов проводили в при t=32°C. Отбор проб проводили через определенные интервалы времени из стеклянного патрубка приемной камеры с последующей регистрацией их спектра поглощения на спектрофотометре CECIL СЕ 5502 (Великобритания).

Для отделения спектра поглощения инсулина от спектров поглощения собственных белков кожи в экспериментах in vitro в ячейках Франца была разработана методика мечения инсулина флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ). Максимум поглощения ФИТЦа 495 нм.

Исследование раздражающего действия TTC инсулина на кожу.

Оценку способности разработанных TTC инсулина оказывать раздражающее действие на кожу проводили согласно ГОСТ Р ИСО 10993.10-99 «Медицинские изделия. Оценка биологического действия медицинских изделий» совместно с сотрудниками испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (рук. лаб., д.б.н. Перова Н.В.).

Моделирование экспериментального сахарного диабета на крысах.

Опыты проводили на крысах-самцах линии Wïstai массой тела 250-300 г совместно с лабораторией культуры тканей НИИ трансплантологии и искусственных органов (рук. лаб. д.м.н. Н.Н. Скалецкий). Экспериментальный сахарный диабет вызывали

внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг. Уровень сахара в крови определяли с помощью портативного аппарата «Глюкохром».

В качестве подопытных (п=6) и контрольных (п=6) животных использовали только тех крыс, у которых через 2 недели после инъекции стрептозотоцина уровень гликемии был не менее 25 мМ/л, что исключало в дальнейшем спонтанную реверсию диабета

На участок кожи, подвергнутый эпиляции (удаление волосяного покрова проводили, исключая повреждение и раздражение кожи) и обработанный спиртом, плотно прикрепляли образец TTC, содержащий инсулин в дозе 30 Ед (1,23 мг)/10 см2, и проводили дополнительную фиксацию с помощью лейкопластыря.

После аппликации TTC с инсулином уровень сахара у подопытных и контрольных (без применения TTC) животных измеряли ежедневно в течение 7 суток.

Методы статистической обработки.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартного пакета программ Microsoft Exel. Находили средние значения вариант и среднеквадратичные отклонения. Экспериментальные данные аппроксимировали с использованием программы TableCurve 2D.

Результаты и их обсуждение

Переносчик и активаторы переноса инсулина.

В Центре по исследованию биоматериалов был найден переносчик инсулина через кожу - синтетический аналог фосфолипидов липофильно-гидрофильной природы, названным САФ-М-99. САФ-М-99 является эмульгатором, склонным к спонтанному мицеллообразованию в водных и органических средах, а также способным менять свою пространственную ориентацию в зависимости от полярности растворителя. В качестве дополнительных активаторов переноса гормона через кожу использовали спирт и масляный раствор витамина Е (разрыхлитель кожи).

Предполагаемый механизм трансдермального переноса мицелл инсулина из водно-спиртового или эмульсионного раствора состоит в следующем. При контакте кожи в присутствии витамина Е с мицеллами САФ-М-99, содержащими водный раствор инсулина, происходит разрыхление кожи с одновременным растворением витамина Е в билипидных слоях гидрофобного рогового слоя. При прохождении мицеллы через роговой слой ее внешняя поверхность обогащена гидрофобными группами молекул САФ-М-99. При последующей диффузии мицелл через преимущественно гидрофильную дерму,

молекулы САФ-М-99 начинают разворачивать свои гидрофильные группы в сторону окружающей среды, высвобождая при этом молекулы инсулина, который затем диффундирует через стенки кровеносных сосудов в кровоток.

Все компоненты, используемые для создания трансдермальных терапевтических систем доставки инсулина, разрешены для клинического применения.

Конструкция и состав TTC инсулина.

В работе были предложены и исследованы четыре вида трансдермальных систем доставки инсулина, отличающихся конструкцией или составом. Три из них относятся к матричным TTC (коллагеновая, коллагеновая армированная и синтетическая), одна - к резервуарным TTC.

Активную (рабочую) часть матричной TTC одной стороной прикрепляли к нетканому бинту с клеевым слоем (НПО «Медполимер», Москва), другую сторону закрывали низкоадгезионной полимерной пленкой, которая удалялась перед аппликацией TTC на кожу. Все образцы TTC инсулина изготавливали и упаковывали в стерильной комнате в потоке обеспыленного воздуха.

Во всех четырёх видах TTC инсулина в качестве основного переносчика использовали САФ-М-99. Коллагеновая TTC

Трансдермальная терапевтическая система инсулина с матрицей из коллагеновой губки Гешиспон получила название коллагеновая TTC инсулина. Толщина коллагеновой губки (2,5 х 4,0 см) составляла 0,7-1,3 мм.

Инсулин (100 Ед) в коллагеновую TTC вносили в составе водно-спиртового раствора с различным соотношением спирта и воды. Коллагеновая армированная TTC

Для получения TTC инсулина с коллагеновой матрицей, армированной нетканым материалом, нетканый материал размером 5,0 см2 пропитывали 1,5 мл 1% раствора склерального коллагена, затем подвергали процессу лиофилизации в сублиматоре Ehrist, Германия. Толщина получаемых пористых матриц составила —1,3 мм.

В первой серии экспериментов на коллагеновые армированные TTC площадью 5 см2 наносили композицию, в состав которой входил водно-спиртовой раствор (спирт : вода 1:1), содержащий 100 Ед инсулина, переносчик инсулина и масляный раствор витамина Е. Во второй серии экспериментов на TTC наносили эмульсию, содержащую 100 Ед инсулин и эмульгатор на основе САФ-М-99.

Синтетическая TTC.

Трансдермальная терапевтическая система инсулина с матрицей из нетканого материала на основе вискозного волокна (ТОО «Пальма», Москва) была названа синтетической TTC инсулина. Эмульсию инсулина (100 Ед) наносили на синтетическую матрицу, размером 2,5 х 4 см2. Резервуарная TTC

Четвертая лекарственная форма инсулина, исследованная в работе, относится к резервуарной TTC В экспериментах по исследованию резервуарной формы использовали модель на основе блистеров для таблеток. К бортикам блистера медицинским клеем БФ-б приклеивали мембрану. Между непроницаемой подложкой и мембраной заливали эмульсию, которая содержала 100 Ед инсулина

Для создания резервуарной формы инсулина были исследованы 4 полимерные гидрофильные мембраны на основе композиции сополимера лактида с гликолидом и поливинилового спирта Из 4-х мембран, предназначенных для регулирования скорости диффузии инсулина из TTC, была выбрана мембрана, имеющая размер пор 3 мкм и толщину 25 мкм (рис. 1).

Рис. 1. Микрофотография поверхности мембраны. Сканирующий электронный микроскоп .ГЕОЬ ^М-ТЗЗО ПЕОЬ", Япония). Ускоряющее напряжение 5 Кв. Ув. хЮОО.

Эмульсия инсулина для армированной коллагеновой, синтетической и резервуарной TTC

Для увеличения скорости диффузии инсулина через кожу был разработан состав эмульсионной композиции вода в масле (в/м), содержащей инсулин и активаторы чрескожного переноса (рис, 2).

Рис. 2. Микрофотография эмульсии Конфокальный микроскоп ConfoScan 3 (Nidek Technologies, Япония). Ув. х40.

Результаты исследования распределения частиц эмульсии по размерам представлены на рис. 3. Для построения гистограммы случайным образом было выбрано 10 нолей, каждое площадью 0,014 мм2.

Основную массу составляют частицы размером 4-6 мкм (около 47%) Диаметр частиц колеблется в районе от 4 до 9 мкм, средний размер частиц 5,5 ± 1,3 мкм.

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Диаметр частиц эмульсии, мкм Рис. 3 Распределение частиц эмульсии по размеру диаметра.

Исследование диффузии инсулина из коллагеновых TTC через кожу кролика в условиях in vitro.

В серии исследований первых образцов TTC инсулина с полимерной матрицей-адгезивом на основе акрилового сополимера нами была доказана принципиальная возможность трансдермального переноса инсулина в присутствии липофильно-гидрофильного эмульгатора САФ-М-99. Однако значения удельной скорости диффузии инсулина не превысили -0,002 ЕД/см2ч. То есть такой состав TTC обеспечивал бы скорость диффузии инсулина через кожу в терапевтических дозах (~ 1,0 Ед/ч), при площади не менее -500 см2.

Для уменьшения площади TTC инсулина необходимо было увеличить скорость диффузии гормона через кожу. Этого можно добиться, увеличивая концентрацию лекарственного вещества в матрице и (или) оптимизируя состав активаторов переноса лекарственного вещества через кожу, которые улучшают проницаемость кожи.

Кроме того, применение акрилового сополимера в качестве матрицы ограничивает спектр растворителей лекарственного вещества и активаторов переноса. Например, вода приводит к разрушению полимерной матрицы. Было предложено привлечь в качестве матрицы коллагенсодержащие системы, специфические свойства которых делают их привлекательными в качестве депо биологически активных веществ.

Исследование скорости диффузии инсулина из коллагенсодержащих трансдермалъных терапевтических систем.

Сравнительный анализ эффективности различных активаторов переноса инсулина через кожу проводили в условиях in vitro на коллагеновой TTC.

Наибольшее количество инсулина (4,5% с контактной площади 0,55 см2) прошло через кожу за двое суток эксперимента из TTC, содержащей водно-спиртовой раствор инсулина (соотношение спирта к воде 1:1), переносчик САФ-М-99 и масляный раствор витамина Е. Скорость диффузии инсулина через кожу вычисляли согласно уравнению Фика.

Значения скоростей диффузии инсулина из коллагеновой TTC составили (41 ± 12)-10'3 Ед/см2ч в первые сутки и (30 ± 9)-10'3 Ед/см2ч во вторые сутки. При использовании контрольных растворов, не содержащих САФ-М-99, инсулин в приёмной камере обнаружен не был.

Для исключения возможности неправильной трактовки результатов, получаемых в экспериментах по исследованию скорости диффузии инсулина, меченного ФИТЦ, через кожу кролика в условиях in vitro, были проведены дополнительные эксперименты, в

которых исследовалась возможность диффузии метки без инсулина. На протяжении этого эксперимента в приемных камерах диффузионных ячеек ФИТЦ обнаружен не был, что подтверждает правомерность расчета скорости диффузии инсулина по спектрам поглощения раствора коньюгата инсулин-ФИТЦ.

Увеличение содержания спирта в растворе инсулина в коллагеновых TTC не приводит к значительному увеличению потока гормона через кожу. Это было продемонстрировано в дополнительных экспериментах по исследованию диффузии инсулина через кожу кролика в условиях in vitro непосредственно из раствора.

Были исследованы вводно-спиртовые растворы инсулина в присутствии С АФ-М-99 и витамина Е с соотношением спирт:вода 1:1 и 2:1. Средние удельные скорости диффузии инсулина за первые и вторые сутки, достигнутые в данном эксперименте, составили (91,1 ± 27,6)-10"3 Ед/см2ч для состава № 1 и (105,8 ± 11,7)-Ю'3 Ед/см2ч для состава № 2 (п=6). Эти скорости равны в пределах ошибки метода.

Для дальнейших экспериментов был выбран следующий состав активаторов переноса: вводно-спиртовой раствор с соотношением спирт:вода = 1:1 и витамин Е в присутствии переносчика САФ-М-99.

Скорости, достигнутые в экспериментах по исследованию диффузии инсулина черсо кожу ((ролика в условиях in vitro из раствора в 3 раза больше, чем скорости диффузии инсулина из коллагеновых TTC. Можно предположить, что в матрице происходит частичное связывание лекарственного вещества с коллагеном, лимитирующее скорость диффузии гормона. Следовательно, для того, чтобы увеличить скорость переноса гормона через кожу нужно либо подбирать дополнительные переносчики инсулина, либо новую матрицу с меньшим содержанием коллагена.

Оптимизация процесса диффузии инсулина из TTC.

С целью оптимизации процесса диффузии инсулина и для уменьшения содержания коллагена были исследованы TTC на основе коллагеновых армированных матриц.

Одним из важных параметров при выборе состава матриц была их сорбционная емкость - величина насыщения определенным количеством раствора того или иного растворителя лекарственного вещества. Емкость лиофилизованных коллагеновых армированных матриц оценивали по степени их набухания в водно-спиртовом растворе (растворитель инсулина при изготовлении TTC) с соотношением спирт:вода =1:1. Для изготовления коллагеновых армированных TTC из 7 нетканых материалов были отобраны нетканые материалы Ф-22, Ф-31 и МедП. Армированный этими неткаными материалами

коллаген отличался эластичностью и имел достаточную емкость относительно водно-спиртового раствора инсулина (до 70 мкл/см2), соизмеримой с коллагеновой TTC.

Значения удельных скоростей диффузии инсулина через кожу в условиях in vitro из коллагеновых армированных матриц с вводно-спиртовым раствором инсулина представлены в таблице 1 (п=18). В таблице 1 также приведены данные по количеству инсулина, прошедшему через кожу за 45 часов. Площадь контакта TTC с кожей составляла 0,55 см2.

Таблица 1.

Скорость диффузии инсулина из коллагеновых армированных матриц через кожу кролика

в условиях in vitro в зависимости от используемых нетканых материалов.

№ Нетканые материалы Скорость диффузии инсулина (хЮ'3 Ед/ см2ч) Количество инсулина, прошедшее через кожу за 45 часов

Первые сутки Вторые сутки

1 Ф-22 64 + 4 28 ±1 12%

2 Ф-31 67 ±9 30 ±5 11%

3 МедП 92 ±13 20 ±9 8,6%

Как следует из таблицы 1, скорость диффузии инсулина в первые сутки из TTC на основе коллагена, армированного МедП, достаточно велика, в то время как на вторые сутки эксперимента резко понижается в 4,5 раза. Скорость диффузии инсулина из TTC, армированных материалами Ф-22 и Ф-31, на вторые сутки уменьшается в меньшей степени по сравнению с первыми сутками. Тем не менее, в первые сутки эксперимента значения удельных скоростей диффузии инсулина через неконсервированную кожу кролика из коллагенсодержащих TTC на основе материалов Ф-22 и Ф-31 превышают значения аналогичного параметра для коллагеновой TTC. К тому же использование армированных матриц предпочтительнее, так как такая конструкция TTC позволяет:

- увеличить прочность коллагеновых матриц,

- снизить связывание инсулина с материалом матрицы,

- значительно уменьшить количество коллагена и энергозатраты, необходимые для его лиофшшзации, и тем самым снизить себестоимость изготовления TTC инсулина.

Учитывая преимущества коллагеновых армированных TTC по сравнению с коллагеновыми, для проведения экспериментов в условиях in vivo была выбрана коллагенсодержащая TTC, а именно, армированная нетканым материалом Ф-22.

Отсутствие раздражающего действия армированных коллагеновых TTC на кроликах в условиях in vivo позволяет говорить о безопасности их применения.

Исследование TTC инсулина на животных с экспериментальным сахарным диабетом.

Для доказательства сохранения биологической активности инсулина при его чрескожном переносе и для оценки функционального действия образцов TTC инсулина в условиях in vivo совместно с лабораторией культуры тканей ГУ НИИТиИО МЗ РФ (рук. д.м.н. Скалецкий H.H.) были проведены эксперименты на крысах с экспериментальным сахарным диабетом.

К моменту аппликации коллагеновых армированных TTC инсулина у подопытных крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом отмечались ярко выраженные признаки тяжелого диабетического статуса: сильная жажда, полиурия, выпадение шерсти, гиподинамия, значительная потеря массы тела. Гликемия составляла от 28,0 до 40,6 ммоль/л. После применения коллагеновых армированных TTC с инсулином было отмечено снижение уровня гипергликемии (таблица 2), в то время как у контрольных крыс с экспериментальным сахарным диабетом гипергликемия оставалась стабильно высокой (в таблице не представлены).

Таблица 2.

Изменения гликемии (ммоль/л) у крыс с экспериментальным сахарным диабетом после

аппликации TTC с инсулином.

№ крысы Перед аппликацией TTC Сутки после аппликации

1 2 3 4 7

1 34,3 28,1 28,9 20,0* 22,3* 19,4*

2 40,6 34,0 32,6 28,4* 16,9* 17,6*

3 29,6 28,9 33,3 е.1.

4 29,7 20,4» 15,5* 16,6* 24,9 25,5

5 28,0 25,6 22,0* 18,0* 21,9* 19,8*

6 41,9 28,1* 24,5* 31,2 34,5 36,1

Примечания.

1 Жирным шрифтом выделены данные об уровне гликемии у крыс после открепления TTC инсулина.

2. e.l. (exitus letalis) - гибель животного.

3. * - достоверное снижение гликемии (р < 0.05).

Как следует из приведенных в таблице 2 данных, уже через сутки после аппликации TTC с инсулином у 4 из 6 крыс с тяжелым сахарным диабетом произошло выраженное снижение уровня гипергликемии (уровень глюкозы в крови снизился на 21,4±10,4 %). Через 3 суток у 5 животных гликемия оказалась достоверно сниженной -уровень глюкозы в крови снизился на 37,9±13,8 %.

Подтверждением гипогликемизирующего действия TTC инсулина являются факты рецидива очень высокой гипергликемии у подопытных контрольных крыс (№ 4 и № 6) после открепления трансдермальной формы.

Полученный гипогликемизируюпдай эффект in vivo свидетельствует о сохранении биологической активности инсулина как в процессе изготовления трандермальной формы, так и при чрескожном переносе гормона в присутствии переносчика САФ-М-99.

Однако в ходе экспериментов in vivo оказалось, что спирт, входивший в состав композиции, разрушает материал матрицы, что негативно сказывается на ее прочностных свойствах.

В качестве раствора инсулина, не содержащего спирт, был предложен и разработан эмульсионный раствор инсулина типа в/м (см. раздел автореферата «Конструкция и состав TTC»), приемлемый для внесения, как в резервуарвые, так и в матричные TTC.

Исследование диффузии инсулина из матричных эмульсионных систем доставки.

На рисунке 4 представлена диффузия инсулина из коллагеновой армированной матрицы с нетканым материалом Ф-22, содержащей в первом случае водно-спиртовой раствор инсулина (100 Ед), во втором - эмульсионный раствор инсулина (100 Ед) (п = 14).

Из рисунка 4 видно, что количество инсулина, диффундировавшее за двое суток из TTC, содержащей эмульсию, почти в два раза больше, чем количество инсулина, вышедшее из TTC, содержащей водно-спиртовой раствор гормона. Удельная скорость диффузии инсулина из TTC с эмульсией составила в первые сутки (105,2 ± 8,9)-10"3 Ед/см2час, а во вторые сутки - (58,7 ± 9,5)-10'3 Ед/см2час, в то время как удельная скорость диффузии из TTC с вводно-спиртовым раствором в первые сутки равна (64 ± 4)-10'3 Ед/см2час, а во вторые - (28 ± 1)-10'3 Ед/см2час.

Время, ч

Рис. 4. Диффузия инсулина из коллагеновой армированной матрицы через неконсервированную кожу кролика в условиях in vitro в зависимости от способа введения инсулина в матрицу:

1. водно-спиртовой раствор инсулина,

2. эмульсия инсулина.

Высокая удельная скорость диффузии инсулина из коллагеновых армированных матриц, содержащих эмульсию, позволила расширить ряд используемых матриц. Так как коллагенсодержащие армированные матрицы являются дорогостоящими и сложными в изготовлении, было решено заменить коллагеновую матрицу на синтетическую (нетканую).

На рис. 5 представлена диффузия инсулина через неконсервированную кожу кролика в условиях in vitro из коллагеновой армированной и синтетической матриц, которые содержали равное количество инсулина (100 Ед). Инсулин в матрицы вносили в составе эмульсионного раствора. Кривая 2, которая отображает диффузию инсулина из синтетической матрицы, построена по усреднённым данным 23 экспериментов.

В результате экспериментов по исследования диффузии инсулина из синтетических матриц была определена величина латентного периода инсулина. Она составила 10 часов.

Время, час

Рис. 5. Диффузия эмульсии инсулина из коллагеновой армированной и синтетической

матриц через неконсервированную кожу кролика в условиях in vitro:

1. коллагеновая армированная матрица,

2. синтетическая матрица

Удельная скорость диффузии инсулина из коллагеновой армированной матрицы через кожу составила в первые сутки (105,2 ± 8,9)-10'3 Ед/см2час, а во вторые сутки (58,7 ± 9,5)-10"3 Ед/см2час, в то время как удельная скорость диффузии инсулина из синтетической матрицы в первые сутки равна (81,9 + 14,8)-10'3 Ед/см2час, а во вторые -(34,9 ± 5,2) 10"3 Ед/га^час.

Выход инсулина из армированной коллагеновой матрицы за двое суток эксперимента оказался равным 22%, в то время как выход из синтетической матрицы -13%.

При площади TTC 10 см2 скорости диффузии инсулина через кожу составят 1,0 ± 0,1 Ед/час и 0,8 ± 0,1 Ед/час для коллагеновой армированной и синтетической матриц соответственно. Хотя скорость диффузии инсулина из синтетической матрицы ниже, ее величина соответствует физиологическим значениям секреции гормона (0,25 - 1,5 Ед/час) поджелудочной железой здорового человека.

По результатам исследования раздражающего действия синтетической TTC на кроликах в условиях in vivo было сделано заключение о ее биологической безопасности.

Разработка и исследование резервуарных TTC инсулина.

Во всех экспериментах с матричными трансдермальными системами доставки в условиях in vitro процентный выход инсулина оказался достаточно низким (12-22%). Поэтому встал вопрос о продлении срока действия системы.

Было высказано предположение, что резервуарная форма сможет поддерживать скорость диффузии инсулина постоянной в течение большего времени, по сравнению с матричными формами. Эта гипотеза основывалась на следующих соображениях.

При одинаковой начальной концентрации ЛВ и его переносчиков в матричных и резервуарной формах, скорость диффузии ЛВ из резервуарной формы регулируется только проницаемостью мембраны. Диффузия же лекарственного вещества из матричных форм зависит от свойств самой матрицы (биодеградируемость, гидрофильность), степени распределения ЛВ в матрице, сил взаимодействия частиц ЛВ и материала матрицы.

Было проведено 10 экспериментов по исследованию скорости диффузии инсулина через неконсервированную кожу кролика из модели резервуарной формы.

Средняя удельная скорость диффузии в первые сутки составила (86,4 ± 24,7)-10"3 Ед/см2час, а во вторые сутки (86,2 ± 30,2)-10'3 Ед/см2час, т.е. для TTC с площадью 10 см2 скорость диффузии инсулина через кожу составит 0.9 ± 0,3 Ед/час. Данное значение скорости соразмерно со скоростью диффузии инсулина из матричных TTC при той же площади, но использование резервуарной формы позволило избежать снижения скорости диффузии инсулина через кожу на вторые сутки эксперимента, рис. 6.

коллагенова армированная синтетическая матрица резервуарная форма матрица

Рис. 6. Скорости диффузии инсулина из матричных и резервуарной TTC через кожу в условиях in vitro.

Разница удельных скоростей диффузии инсулина из коллагеновой армированной и синтетической матриц в первые и вторые сутки составляет 44% и 57% соответственно, в то время как для резервуарной формы значения скоростей диффузии остаётся постоянной в течение 48 ч.

Биологическая безопасность резервуарной TTC инсулина была доказана на трех кроликах в условиях in vivo. j>

Сравнительный анализ разработанных TTC инсулина,

«

Общие характеристики разработанных четырех видов TTC инсулина представлены в таблице 3. В таблице суммированы значения удельных скоростей диффузии инсулина в условиях in vitro, терапевтически эффективные площади и выход гормона из TTC за двое суток.

Таблица 3.

Характеристические параметры разработанных трансдермальных терапевтических систем

инсулина.

Параметры системы Тип матрицы

коллагеновая коллагеновая армированная синтетическая резервуарная

Скорость диффузии, инсулина 10"3 Ед/см2час водно-спирт. раствор 1-ые сутки 41 ±12 64±4 - -

2-ые сутки 30 ±9 28 ±1 - -

эмульсия 1-ые сутки - 105,2 ± 8,9 81,9 ±14,8 86,4 ±24,7

2-ые сутки - 58,7 ±9,5 34,9 ±5,2 86,2 ±30,2

терапевтически эффективная площадь, см2* 24 10 12 12

Выход инсулина (%) за 48 ч. 4,5 22 13 -

* Терапевтически эффективная площадь - площадь TTC, необходимая для поддержания скорости диффузии гормона через кожу равную ~ 1,0 Ед/час, что соответствует средней скорости секреции инсулина поджелудочной железой здорового человека.

В экспериментах in vitro было показано, что использование чисто коллагеновой матрицы в качестве депо инсулина не целесообразно, так как, вероятно, происходит взаимодействие молекул коллагена и лекарственного вещества. Это объясняет наименьшие значения скорость диффузии гормона через кожу для этих систем по сравнению с другими предложенными нами TTC инсулина (см. таблицу 3). Действительно, при переходе к матрице с меньшим содержанием коллагена, (коллагеновая армированная TTC инсулина) скорость диффузии увеличивается (см. таблицу 3).

Замена водно-спиртового раствора инсулина на эмульсионный приводит к существенному увеличению скорости диффузии инсулина из TTC, что дало нам возможность исключить из состава матрицы коллаген и перейти к матрице только из нетканого материала. Однако использование эмульсионной формы инсулина не позволило избежать уменьшения скорости диффузии гормона из TTC на вторые сутки эксперимента в диффузионных камерах. Для решения данной задачи и была предложена резервуарная форма TTC, средняя скорость диффузии инсулина из которой постоянна в течение не менее 2 сут. и составляет ~ 0,086 Ед/см2 ч.

К наиболее близким исследованиям по созданию TTC на основе инсулинсодержащих эмульсий, относится разработанный канадскими учеными раствор Biphasix, содержащий водную и масляную фазы. Сведения о данной работе в открытой печати появились в 2002 г. [90, 91]. При использовании Biphasix с инсулином в экспериментах на крысах (авторы не указывают конструкцию системы доставки), уже через 2 суток происходит снижение уровня глюкозы в крови на 43,7%. Эти данные практически совпадают с результатами, полученными нами в экспериментах in vivo по исследованию эффективности коллагеновых армированных TTC инсулина на крысах. Однако в нашем случае коллагенсодержащая армированная матрица содержала 1,2 мг инсулина в отличие от 10 мг в системе Biphasix, что свидетельствует о большей эффективности разработанных TTC инсулина.

Для демонстрации возможности трансдермальной доставки биологически активного инсулина были проведены предварительные исследования функциональных свойств синтетической TTC инсулина на двух пациентах-добровольцах с сахарным диабетом.

Разрешение на проведение данных исследований было получено с согласия этического комитета ГУ НИИТиИО МЗ (протокол заседания № 4 от 14 октября 2004 г.) на Ученом совете ГУ НИИТиИО МЗ (протокол заседания № 6 от 5 ноября 2004 г.).

Способ применения заключался в аппликации TTC на внутреннюю поверхность плеча пациента. Уровень сахара в крови регистрировался пациентами самостоятельно с помощью глюкометров. Во время испытаний TTC инсулина пациенты соблюдали рекомендуемую врачом-эндокринологом диету.

По сравнению с обычной утренней дозой пролонгированного инсулина, принимаемой первой пациенткой, на время аппликации исследуемых TTC она была снижена в два раза. У второй больной была снижена в два раза как утренняя, так и вечерняя доза пролонгированного инсулина Во время аппликации TTC инсулина сниженная доза пролонгированного инсулина была скомпенсирована как в первом, так и во втором случае в течение 48 ч.

Таким образом, полученный эффект снижения дозы пролонгированного инсулина у пациента с сахарным диабетом I типа и у пациента с инсулинпотребным диабетом II типа при аппликации синтетической TTC инсулина, демонстрирует возможность трансдермального переноса биологически активного гормона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования функциональных свойств предложенных TTC инсулина в условиях in vitro и in vivo, проведенные испытания биологической безопасности образцов TTC, полученные доказательства возможности трансдермального переноса инсулина с сохранением его биологической активности свидетельствуют о перспективности применения этой неинвазивной системы доставки в клинической практике.

Из разработанных трансдермальных систем наиболее перспективными для клинического применения могут быть матричная синтетическая или резервуарная форма TTC, содержащая эмульсионный раствор инсулина.

К достоинствам матричной TTC с предполагаемой длительностью терапевтического эффекта не менее 2 суток относится простота технологии изготовления.

Несомненным преимуществом резервуарной TTC является возможность варьирования скорости диффузии инсулина через кожу за счет увеличения в жидкой фазе TTC содержания переносчика инсулина - эмульгатора САФ-М-99 и витамина Е. Это позволяет увеличить длительность функционирования TTC инсулина с одновременным уменьшением количества инсулина, остающегося в TTC после окончания терапевтического эффекта К основному недостатку данной конструкции относится сложность технологии изготовления, в частности, необходимость применения дополнительного компонента - пористой мембраны.

Учитывая, что все компоненты разработанных трансдермальных терапевтических систем инсулина известны и применяются в лекарственных средствах и медицинских изделиях при оценке биологической безопасности мы ограничились исследованием раздражающего действия. Полный спектр доклинических испытаний будет проведен для образцов TTC, предназначенных для клинических исследований.

Окончательный вывод о терапевтической эффективности и об удобстве использования матричной и резервуарной TTC может быть сделан только после клинических исследований.

Есть все основания предположить, что разработанные трансдермальные терапевтические системы на основе эмульсионного раствора инсулина могут явиться новой лекарственной формой пролонгированного инсулина. Заметим, что речь не идет о замене инъекционной формы гормона. Только комплексное применение TTC инсулина вместе с имеющимися традиционными лекарственными формами гормона позволит улучшить качество жизни больным сахарным диабетом.

В дальнейшем для повышения эффективности TTC с переносчиком САФ-М-99 для переноса не только инсулина, но и других высокомолекулярных лекарственных веществ,

предполагается использовать оригинальную конструкцию TTC, состоящую из матричной и жидкой составляющей. Решение проблемы увеличения проницаемости кожи для веществ с большой молекулярной массой позволит перейти к созданию TTC целого ряда высокомолекулярных препаратов, таких как циклоспорин, моноклональные антитела и их производные.

ВЫВОДЫ

1. В модельных условиях спектрофотометрическим методом доказан трансдермальный перенос инсулина из водно-спиртовых и эмульсионных растворов в присутствии склонного к мицеллообразованию переносчика САФ-М-99.

2. В условиях m vitro доказано, что матричные трансдермальные терапевтические системы (TTC) обеспечивают постоянную скорость переноса инсулина через кожу в течение 24 ч.

3. В условиях in vitro показано, что разработанные конструкции коллагеновой, коллагеновой армированной и синтетической матричной TTC позволяют получить значения удельных скоростей диффузии инсулина через кожу равные (41±12)-10'3 Ед/см2час, (105,2±8,9)10'3 Ед/см2час, (81,9±14,8>10"3 Ед/см2час, соответственно. Среднее время достижения постоянной скорости чрескожной диффузии гормона не более 10 ч.

4. Установлено, что резервуарная TTC инсулина в условиях in vitro поддерживает в течение 48 ч. постоянную среднюю удельную скорость диффузии гормона через кожу, равную (86,4±24,7)-10"э Ед/см2час. При площади TTC -12 см2 скорость диффузии инсулина через кожу становится соразмерной с базальной скоростью его секреции поджелудочной железой.

5. В экспериментах in vivo, проведенных в соответствии с национальными стандартами ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» доказано отсутствие раздражающего действия разработанных трансдермальных систем на кожу кроликов.

6. Сохранение биологической активности гормона при трансдермальной доставке было доказано достоверным снижением уровня гликемии на 37,9±13,8 % (n=5) у крыс с экспериментальным сахарным диабетом, вызванным стрептозотоцином.

7. В исследованиях на двух пациентах-добровольцах с сахарным диабетом была подтверждена возможность трансдермальной доставки биологически активного инсулина. Эффект компенсации сниженной дозы пролонгированного инъекционного инсулина сохранялся в течение 48 ч. с момента аппликации TTC на кожу пациента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При исследовании in vitro чрескожной диффузии лекарственных веществ белковой природы из трансдермальных систем доставки спектрофотометрическим методом рекомендуется использовать метод мечения белковой молекулы флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) для отделения спектра поглощения лекарственных веществ от спектра поглощения собственных белков кожи. Максимум поглощения ФИТЦ - 495 нм, максимум испускания - 523 нм.

2. Независимо от конструкции трансдермальной формы для повышения скорости чрескожной диффузии, инсулин следует вводить в матрицу в эмульсионной форме.

3. Для поддержания постоянной скорости чрескожной доставки инсулина в течение 24 ч. рекомендуется использовать синтетическую TTC, а для поддержания постоянной скорости в течение не менее 48 ч. - резервуарную конструкцию TTC с эмульсионной формой инсулина.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации.

1. В.И.Севастьянов, ЛА.Саломатина, Е.Г.Кузнецова. Н.В.Яковлева, В.И.Шумаков. Трансдермальные системы введения инсулина. Медицинская техника, 2003, №2, с 2125.

2. E.G.Kuznetsova. L.A.Salomatina, N.N.Skaletskiy, V.I.Sevastianov. Transdermal insulin delivery systems with collagen matrix. Abstracts of Iй EUFEPS Conference on Optimising Drug Delivery and Formulation: New Challenges in drug Delivery, Versailles, France, 2003, p.177-178.

3. Е.Г.Кузнецова. Л.А.Саломатина, В.И.Севастъянов. Трансдермальные коллагенсодержащие системы доставки инсулина. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2003, №4, с.59-63.

4. В.И.Севастьянов, Л.А.Саломатина, Е.Г.Кузнецова. О.М Собко, В.И.Шумаков. Матричные и резервуарные трансдермальные терапевтические системы инсулина на основе нетканых и полимерных материалов. Перспективные материалы, 2004, №4, с 44-48.

5. О.М.Собко, Е.Г.Кузнецова. Л.А.Саломатина. Т.Н.Гончарова, В.И.Севастьянов, В.И.Шумаков. Первый опыт клинического применения трансдермальной терапевтической системы инсулина. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2004, №2, с. 45-46.

6. Е.Г.Кузнецова. О.М.Собко, Н.В.Яковлева, Л.А.Саломатина. Исследование трансдермальной терапевтической системы доставки инсулина. Материалы IX научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника». Под редакцией Д.В.Быкова (Украина, Судак, 19 -24 сентября 2004), М., Московский государственный институт электроники и математики, 2004, с. 260-263.

Заказ №834. Объем I пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». Г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.pMtator.rn

РНБ Русский фонд

2005-4 47996

f î

1421

Актуальность и практическая значимость.

Сахарный диабет (СД) является одной из основных проблем современной медицины. Он стоит на третьем месте среди причин смертности на земле после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Дедов И.И., Шестакова М.В., 2003). Во всем мире на сегодняшний день насчитывается около 130 млн. больных сахарным диабетом. С каждым годом их число неуклонно растет и, по мнению экспертов, к 2025 году может достигнуть 300 млн. человек. В Российской Федерации сахарным диабетом страдает около 8 млн. человек. На долю диабета 1 типа (инсулинзависимого СД) приходится 10% - 15% от всех заболевших диабетом. Оставшуюся часть (85% - 90%) составляют больные диабетом 2 типа (инсулиннезависимого сд).

Лечебный процесс при сахарном диабете в первую очередь должен быть направлен на максимально возможную компенсацию тех метаболических нарушений, которые возникают в организме вследствие абсолютной или относительной недостаточности выработки организмом гормона инсулина.

В норме у здорового человека различают базальную (фоновую) и болюсную (пищевую) секрецию инсулина. Базальная секреция гормона происходит непрерывно в течение суток. Во время еды отмечается дополнительная секреция инсулина, названная болюсной. Традиционные инъекционные формы инсулина не могут полностью компенсировать недостаток гормона в организме больного сахарным диабетом.

Для улучшения качества жизни больных сахарным диабетом разрабатываются неинъкционные способы доставки инсулина: оральные (Платэ Н.А., Валуев И.Л., 2001), интраназальные (Kupila А., 2003), ингаляционные (Patton S.J., 1999) и трансбуккальные (Al-Achi А., 1993). Все эти системы могут заменить только инъекции инсулина короткого действия.

Особый интерес представляют трансдермальные терапевтические системы (ТТС) доставки инсулина (Севастьянов В.И., 2001). Трансдермальные системы, являясь аналогом внутривенного капельного введения JIB, обеспечивают постоянную скорость диффузии лекарства через неповреждённую кожу от нескольких часов до нескольких дней (Шумаков В.И., Севастьянов В.И., 1995).

Было предположено, что чрескожное введение инсулина будет играть роль препаратов инсулина пролонгированного действия, связанную с поддержанием базального (фонового) уровня инсулина в крови. Кроме того, трансдермальное введение инсулина, по сравнению с подкожными инъекциями, является безболезненным и более удобным в применении.

Основной трудностью в создании ТТС инсулина является то, что большая молекулярная масса инсулина (5700 Да) препятствует его проникновению через кожу без какого-либо специфического переносчика. Несмотря на то, что многими фармацевтическими компаниями ведется интенсивный поиск химических, физических и биологических активаторов, которые позволили бы доставлять инсулин через неповреждённые участки кожи, в настоящее время не существует допущенных к клиническому применению ТТС инсулина.

Цель работы состояла в создании и экспериментальном исследовании различных систем трансдермальной доставки инсулина.

Основные задачи работы:

1. Доказать возможность трансдермального переноса инсулина.

2. Разработать экспериментальные методики для оценки эффективности чрескожного переноса инсулина в условиях in vitro.

3. Найти биологически безопасные разрыхлители кожи и переносчики инсулина через кожу, позволяющие поддерживать постоянную концентрацию инсулина в крови в течение не менее 24 ч.

4. Исследовать функциональные свойства трансдермальных терапевтических систем инсулина различной конструкции в условиях in vitro и in vivo.

Научная новизна

Найдены составы инсулинсодержащих водно-спиртовых и эмульсионных растворов, обеспечивающие в модельных условиях трансдермальный перенос гормона.

Разработаны и исследованы три вида матричных ТТС инсулина с использованием коллагеновой, коллагеновой армированной и синтетической матрицы, а также резервуарная ТТС инсулина.

Найдены оптимальные составы и размеры ТТС инсулина, которые позволяют достичь скорости переноса гормона, соизмеримые со средней скоростью секреции инсулина поджелудочной железой.

В условиях in vitro показано, что матричные и резервуарные ТТС могут поддерживать постоянную концентрацию гормона в крови в течение 24 и 48 ч, соответственно.

В экспериментах на животных доказано сохранение биологической активности инсулина при его чрескожном переносе. На двух пациентах-добровольцах с сахарным диабетом подтверждена возможность трансдермальной доставки биологически активного гормона.

Практическая значимость

Разработан и внедрен в программу доклинических испытаний трансдермальных терапевтических систем инсулина спектрофотометрический метод определения гормона, меченного флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ).

Матричные и резервуарные ТТС инсулина могут быть использованы в качестве пролонгированной лекарственной формы гормона для больных сахарным диабетом.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межинститутских семинарах Центра по исследованию биоматериалов ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов (2002, 2003, 2004, 2005 гг.), на IX научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника» 19-24 сентября 2004, Судак, Украина.

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 6 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и объем диссертации

ВЫВОДЫ

1. В модельных условиях спектрофотометрическим методом доказан трансдермальный перенос инсулина из водно-спиртовых и эмульсионных растворов в присутствии склонного к мицеллообразованию переносчика САФ-М-99.

2. В условиях in vitro доказано, что матричные трансдермальные терапевтические системы (ТТС) обеспечивают постоянную скорость переноса инсулина через кожу в течение 24 ч.

3. В условиях in vitro показано, что разработанные конструкции коллагеновой, коллагеновой армированной и синтетической матричной ТТС позволяют получить значения удельных скоростей диффузии инсулина через кожу равные (41±12)-10"3 Ед/см2час, (105,2±8,9)* 10"3

2 3 2

Ед/см час, (81,9±14,8)-10 Ед/см час, соответственно. Среднее время достижения постоянной скорости чрескожной диффузии гормона не более 10 ч.

4. Установлено, что резервуарная ТТС инсулина в условиях in vitro поддерживает в течение 48 ч. постоянную среднюю удельную скорость

3 л диффузии гормона через кожу, равную (86,4±24,7)Т0 Ед/см час. При у площади ТТС ~ 12 см скорость диффузии инсулина через кожу становится соразмерной с базальной скоростью его секреции поджелудочной железой.

5. В экспериментах in vivo, проведенных в соответствии с национальными стандартами ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» доказано отсутствие раздражающего действия при аппликации разработанных трансдермальных систем на кожу кроликов.

6. Сохранение биологической активности гормона при трансдермальной доставке было доказано достоверным снижением уровня гликемии на

37,9±13,8 % (п=5) у крыс с экспериментальным сахарным диабетом, вызванным стрептозотоцином. 7. В исследованиях на двух пациентах-добровольцах с сахарным диабетом была подтверждена возможность трансдермальной доставки биологически активного инсулина. Эффект компенсации сниженной дозы пролонгированного инъекционного инсулина сохранялся в течение 48 ч. с момента аппликации ТТС на кожу пациента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При исследовании in vitro чрескожной диффузии лекарственных веществ белковой природы из трансдермальных систем доставки спектрофотометрическим методом рекомендуется использовать метод мечения белковой молекулы флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) для отделения спектра поглощения лекарственных веществ от спектра поглощения собственных белков кожи. Максимум поглощения ФИТЦ -495 нм, максимум испускания - 523 нм.

2. Независимо от конструкции трансдермальной формы для повышения скорости чрескожной диффузии, инсулин следует вводить в матрицу в эмульсионной форме.

3. Для поддержания постоянной скорости чрескожной доставки инсулина в течение 24 ч. рекомендуется использовать синтетическую ТТС, а для поддержания постоянной скорости в течение не менее 48 ч. -резервуарную конструкцию ТТС с эмульсионной формой инсулина.