Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Разработка хирургического подхода к лечению СПИД с помощью экстракорпоральной иммуносорбции (Экспериментальное исследование)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

2-ОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ Н.И.1МРОГОВА

РАЗРАБОТКА ХИРУРГИЧЕСКОГО ПОДХОДА К ЛЕЧЕНИЮ СПИЛ С ПОМОЩЬЮ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ИММУНОСОРБПИИ

(Экспериментальное исследование)

14.00.27 - Хирургия

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи УДК 615.38 - 005.2

ПАВЛЕНКО ВИКТОР ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

МОСКВА 1990

Работа выполнена во 2-ом Московском ордена Ленина государственном медицинском институте им. Н.И.Пирогова и Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РСФСР

Научный руководитель: Лауреат Государственных премий СССР и РСФСР заслуженный деятель науки РСФСР академик АМН СССР, профессор Ю.М.Лопухин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Б.К.Шуркалин доктор медицинских наук, профессор И.В.Петрова

Ведущее учреждение: Институт вирусологии им. Д.М.Ивановского АМН СССР

Защита диссертации состоится "_"_1990 года

на заседании специализированного Ученого совета К 084.14.01 при 2-ом Московском ордена Ленина государственном медицинском институте им. Н.И.Пирогова (117513, г. Масква, ул. Островитянова, Д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук, доцент

А.П.Чадаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность jjgoö^eмы. В настоящее время в мире насчитывается более 150 ООО больных СГЩ, а количество инфицированных (по оценкам экспертов ВОЗ) достигает 5 ООО ООО - 10 ООО ООО. Каждые 8-12 месяцев число больных удваивается. В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в патогенезе СПИД. И хотя ВИЧ достаточно хорошо изучен (по сравнению с вирусами, вызывающими другие заболевания), это не дает оснований для оптимизма. Патогенез многочислённых иммунологических нарушений, развивающихся при инфицировании ВИЧ неясен. Имеются данные о прямом иммуносупрессивном■ действии Еирусного белка gp4i и др. вирусных белков (Sandstrom et al., 1986; Mann et al., 19S7; Amadori et al., 1988). Многочисленными исследованиям показана аутоиммунная природа нарушений при СГЩ. Аутоагрессия провоцируется свободно циркулирующими вирусными белками. ВИЧ способен к потере поверхностного белка gpl20 по мере своего созревания (Gelderblom et al., 1987), наличие высокого сродства данного белка к CD4-peuenTopy приводит к атаке сенсибилизированными лимфоцитами и/или антителами к gpi20 в организме больных комплекса gpi20-CD4 на поверхности здоровых С04-положительных клеток (Klatzman, Montagner, 1986; Lyerly et al., 1987; Sodorsky et al., 1987). Инфицированные ВИЧ субъекты продуцируют сильный иммунный ответ на оболочечные и ядерные антигены вируса, однако, нейтрализующая вирус активность чрезвычайно слаба и не предотвращает развитие болезни (Weiss et al., 1985; Klatzmarm et al., 1986; Sullivan, 1989). Возможна передача ВИЧ непосредственно из клетки в клетку при наличии специфических антител в организме больного (Bloom, 1937).

Э

Несмотря на значительные успехи медицинской науки, проблема лечения синдрома приобретенного иммунодефицита является одной из наиболее трудноразрешимых проблем современности. Традиционные подхода - попытки создания вакцины и лекарственная терапия не приносят ожидаемого успеха. Наиболее эффективный химиотерапевтический препарат - азидотимидин (АЗТ) - вызывает ряд побочных действий, кровь больных, которые лечатся АЗТ, сохраняет инфекционность (Baumgarten, 1989; Collins, Unadkat, 1989). Растет число сообщений о формировании резистентности вируса иммунодефицита человека к лекарственным препаратам (Маги, 1989). Применение плазмафереза и биоспецифической плазмосорбции с использованием иммобилизованного протеина А приводит, наряду с удалением вирусных белков в составе циркулирующих иммунных комплексов (Balint, Hargreaves, 1987; Bercnan et al., 1988), К значительному уменьшению содержания всех иммуноглобулинов в крови больных и углублению иммунодефицита.

Альтернативой традиционным подходам к лечению СПИД может яеиться патогенетически обоснованное селективное удаление из организма носителя БИЧ вирусных белков и/или некоторых популяций антител, а также инфицированных ВИЧ клеток с помощью методов эфферентной медицины. Имеются в виду хирургические методы экстракорпоральной дегоксикации такие как, например, экстракорпоральная иммуносорбция, основанная на специфическом взаимодействии антиген-антитело. Преимущество данного подхода в том, что взаимодействие комплиментарных молекул осуществляется вне организма и характеризуется высокой избирательностью по отношению к извлекаемым компонентам. Существенное понижение уровня заданного протеина в кидкостях тела, а так же'

инфицированных ВИЧ клеток может бить полезно как в уточнении

патогенеза СПИЛ, так и в Енрабогке его комплексной терапии.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования - разработка экстракорпорального метода связывания индивидуальных вирусных ОелкоЕ и антител к ним, вирионов ВИ и инфицированных ВИЧ клеток с помощью специфических сорбентов.

В соответствии с целью были сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1. Создать высокосяецифичные иммуносорбенты с использованием доступных методик и материалов.

2. Оценить гемосовместимость иммуносорбентов и выяснить возможность проведения экстракорпоральной иммуносорбции без предварительной сепарации плазмы.

3. Подобрать оптимальную модель на животных, позволяющую точно оценивать результаты экстракорпоральной иммуносорбции.

Научная_новизна. Впервые разработан принципиально ноенй подход к детоксикэции организма при С1ВД - селективная элиминация из крови индивидуальных вирусных белков (епу) с помощью иммуносорбции. Настоящий подход полностью лишен недостатков традиционных методов лечения, связанных с введением в организм больного ксенобиотиков, и направлен на охрану внутренней среды организма.

Впервые были созданы (синтезированы) и испытаны соответствующие вида иммуносорбентов, проведена апробация метода на животных. Результаты испытаний сорбентов свидетельствуют - о высокой избирательности и высокой емкости сорбентов по отношению к извлекаемым индивидуальным белкам вируса иммунодефицита

человека.

Практичегаая_цещость. Разработанный метод может быть адаптирован для применения в клинике с целью удаления индивидуальных белков ВИЧ из крови больного. Анализ полученных данных позволил обосновать .возможность применения синтезированных иммуносорбентов, специфически связывающих индивидуальные белки вируса иммунодефицита человека (§р120) в комплексном лечении больных синдромом приобретенного иммуннодефицита для снижения ангигенемии и вирусемии ( у больных с развернутой клинической картиной СПИД ).

Проведение экстракорпоральной иммуносорбции возможно как на плазме, так и на цельной крови, без предварительной сепарации плазмы.

В экспериментах на кивотных продемонстрирована безопасность метода, показана гемосовместимость иммуносорбентов.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии 2-го МОЛГММ им. Н.И.Пирогова (Москва,1986-1990); на научных семинарах лабораторий аффинной сорбции, прикладной иммунохимии, иммунопатологии НИИ ФХМ МЗ РСФСР (Москва, 1987-1990). Апробация работы состоялась на совместной научно-практической конференции кафедры оперативной хирургии и топграфической анатомии 2-го МОЛГШ им. Н.И.Пирогова и НИИ ФХМ МЗ РСФСР (Москва, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы, получено положительное решение по заявке на изобретение.

0б5ём_и_стр^щгв§_диссе2гации. Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения,

оозора литературы, описания материалов и методов, собственных

результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка

использованной литературы, Еключающего 226 источников ( 56

отечественных и (70 зарубежных ). Диссертация содержит 7 таблиц,

1 схему и рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили клетки крови человека,

инфицированные вирусом иммунодефицита человека, вирионы ВИЧ,

индивидуальные белки БИЧ и антитела к ним, а также

экспериментальные животные. Распределение материала по сериям

экспериментальных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1.

'РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МАТЕРИАЛА ПО СЕРИЯМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Серии экспериментов кол-во

пп * экспериментов

1.СТ9НД0ЕЫе опыты Испытания сорбентов в статическом режиме.

1. Иммуносорбция рекоибинантного белка епу 24

2. Иммуносорбция нативного белка епт 12

3. Иммуносорбция специфических антител к белку ВИЧ

(епу) из сыворотки больного СПИД 7 Испытания сорбентов в динамическом режиме.

4. Иммуносорбция инфицированных ВИЧ клеток 34

5. Иммуносорбция вирионов ВИЧ 12

II.Эксперименты на животных.

6. Изучение естественного клиренса рекоибинантного бежа вот, введенного в кровь животного 5

Животные, подвергшиеся гемоперфузии с использованием:

7. Контрольного сорбента 6

8. Специфического иммуносорбента 7

9. Изучение гемосовместимости иммуносорбентов 16

Всего : 123 При синтезе иммуносорбентов были использованы в качестве

матриц силикагели и макропористые стекла производства Горьковского опытного завода ВНИИНП, сефароза 4в фирмы Pharmacia Pine Chemicals (Швеция).

. В качестве лигандов использовались следующие препараты;

а) сыворотки больных СГЩ, содержащие специфические антитела в высоких титрах;

б) антитела, выделенные на. аффинном сорбенте из сыворотки • крови кроликов, иммунизированных белками ВИЧ;

в) моноклонэльные антитела к некоторым эпитопам вирусного белка gp120 (получены в НИИ Иммунологии МЗ СССР);

г) высокоочищенные рекомбинантные белки env и gag ВИЧ, содержащие последовательности генов env и gag (соответственно), • кодирующих синтез гликопротеинов gp4i, gpi20 и р55, р24 (получены

в НИИ ОЧБ г.Ленинград).

Для синтеза сорбентов контрольных груш использовали 7-фракцию сыворотки крови здоровых доноров.

Для получения из сыворотки крови (больных СПИД и здоровых доноров) препаратов с повышенным содержанием igG использовали метод осавдения сульфатом аммония (Brock, 1984). Сыворотки крови больных СПИД предварительно инактивировали прогреванием на водяной бане при температуре -t-56cC в течении 45 минут.

Концентрацию белка определяли по методу связывания красителей (Bradford, 1976; Spector, -1978). Концентрацию иммуноглобулинов определяли методом простой радиальной иммунодиффузш! (Mancini, 1963) с использованием моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека и стандартных сывороток крови человека предприятия по производству бакпрепаратов НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи. Лиганд присоединялся к матрице путем

простой физической адсорбции либо ковалентной иммобилизации.

Стендовые испытания сорбентов проводили в статическом (инкубация сорбентов с модельной средой при встряхивании) и динамическом (перфузия модельной среды через колонку с сорбентом) режиме.

Для проведения экстракорпоральной иммуносорбции на животных под в/в наркозом калипсолом 10 мг/кг и местной анестезией 0,5% раствором новокаина, каптировали сонные (у крыс) или бедренные (у кроликов) сосуда. Циркуляцию крови осуществляли по артерио-венозному контуру со скоростью 0,5 мл/мин (у крыс) или 5-10 мл/мин (у кроликов).

Емкость сорбентов при испытании оценивали по разнице активности антигенного материала и концентрации клеток в образце до и после сорбции; по убыли белка или снижению титра индивидуальных вирусных белков (env). При расчетах емкости учитывали разведение образца раствором добавляемым при промывании сорбента после сорбции. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева по стандартной методике. Содержание инфицированных клеток в культуре определяли в реакции иммунофлуоресценции (Bluraberg et. al., 1986; Fauvel, Ozanne, 1989) Активность антигенного материала определяли иммуноферментным методом (Elisa) с помощью тест-системы для выявления антител к вирусу СПИД и вирусного антигена производства НПО "Вектор" Минмедбиопрома СССР в соответствии с инструкцией по применению указанной системы, утвержденной МЗ СССР (25.12.86). Результаты учитывали на автоматическом спектрофотометре "Mulfciscan". Титры вирусного белка (env) определяли с помощью Dot Blot-анализа (Kimball et al., 1988).

Качественный анализ образцов до и после сорбции, а также элюатов проводили в ряде случаев методом Western Blot (Mortimer, Clewley, 1987).

Подсчет форменных элементов осуществляли в аппарате "Picoskale" (ВНР).

В качестве модельных систем использовались:

а), в экспериментах по сорбции клеток - моноцитарная клеточная культура ЭВК/ША/3, хронически инфицированная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1), полученная группой иммунохимии Института вирусологии им. Ивановского на основе неинфицированной перевиваемой клеточной линии и-937. Концентрация клеток в образцах составляла 1-2 млн/мл. Содержание инфицированных клеток в культуре колебалось от 25% до 45%.

б), в экспериментах по сорбции вирионов ВИЧ - супернатант инфицированной культуры клеток (ЭВК/ША/3 и СЕМ/LAV), содержащий зрелые вирионы.

в), в экспериментах по сорбции специфических антител - сыворотку больного ОВД.

г), в экспериментах по сорбции рекомбинантного белка env ВИЧ -раствор этого высокоочицеиного бежа с концентрацией 0,12 мг/мл; чистота 9556.

Концентрации веществ, титры антител и вирусных белков являются

средними значениями не менее, чем трех параллельных измерений.

Полученные результаты обрабатывали с использованием

стандартных статистических методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Сорбция инфицированных клеток.

Известно, что на поверхности клеток, инфицированных вирусом

иммунодефицита человека (ВИЧ) экспрессировэн вирусный белок

gpiso. Нами (Зила предпринята попытка создания аффинного (иммуно) сорбента для извлечения зараженных ВИЧ клеток из смешанной культуры с использованием в качестве лигандов специфических антител к вирусному белку gpi20 (moho- и поликлональных), которые образуют прочный комплекс "антиген-антитело".

На поверхность гранул сорбента была иммобилизована 7-фракция сыворотки крови больного СПИД (сорбенты 1А и 1К), моноклональные антитела к вирусному белку gpi20 (сорбенты группы 2А и 2К); при синтезе сорбентов контрольной группы (ЗА и ЗК) использовалась у-фракция сыворотки крови здоровых доноров. Способ иммобилизации лиганда - адсорбция (груша А) и ковалентная иммобилизация (К).

Емкость сорбентов при испытаниях на модельной системе оценивали по снижению концентрации клеток и снижению активности антигенного материала после перфузии образца через колонку. Для оценки избирательности действия сорбентов нами был введен "коэффициент селективности" который расчитывали

следующей формуле:

, где

Bt - В2

At - активность антигенного материала в исходном образце, Az - активность антигенного материала на выходе колонки, Bi - концентрация клеток в исходном материале, В2 - концентрация клеток на выходе колонки.

Величины At и В, принимали за 100%, а А2 и В2 вычисляли по отношению к исходным (А, и В» соответственно) в процентах.

Результаты испытаний сорбентов с адсорбированными 7-фракцией сыворотки крови больных СПИД (1А) и моноклональными антителами (ЗА) представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

ЕМКОСТЬ СОРБЕНТОВ (А) ПО КЛЕТКАМ И ВМЧ-АНТИГЕКУ

М серии экс- емкость сорбентов X + т (Я!) кол-во пп периментов по клеткам по антигену опытов .

1 Контроль (ЗА) 52,4 ± 1,3 22,4 +2,1 7 •

* к А

2 Опытная (1А) 41,6 ±4,3 51,9+2,5 7

3 Опытная (2А) 52,8 ± 5,8 31,3 + 4,5 5

* р < и.01, ** р < о.иь (по сравнению с аналогичным показателем

контрольной группы).

Сорбенты группы 1А по емкости антигенного материала

значительно превосходят сорбенты контрольной группы (ЗА) (более

чем в два раза) (р<0,01) при меньшей емкости (на 10%) по клеткам

(рС0,05). Следовательно, наличие на поверхности гранул сорбента '

даже небольшого количества специфического лиганда увеличивает

сродство поверхности к инфицированным клеткам, и в какой-то мере

•препятствует задержке клеток на колонке. В случае кв применения

моноклональных антител в качестве лиганда, емкость сорбента

практически не отличалась от емкости контрольного сорбента, что,

вероятно, связано со снижением функциональной активности молекул

иммуноглобулинов в процессе иммобилизации и другими причинами.

Коэффициенты селективности представлены в таблице 3.

Таблица 3.;

КОЭФФИЦИЕНТ СЕЛЕКТИВНОСТИ (Кс) ДЛЯ СОРБЕНТОВ РАЗНЫХ ТИПОВ.

ш серии экспериментов число наблюдений "п" Кс

1 Контрольная (ЗА) 7 0,42

2 Опытная (1А) 7 1,25

3 Опытная (2А) 7 0,59

При синтезе сорбентов с использованием методики ковалентной иммобилизации в качестве лигандов применялись те же препараты, что и в предыдущей серии. Емкость и избирательность сорбентов

оценивали по тем же параметрам, что и сорбента первой серии (данные представлены в таблицах 4 и 5). При анализе результатов были виявлены те же тенденции, что и при испытаниях сорбентов групп 1А - ЗА. Сорбенты опытный группы (ЗК) более чем в два раза (различия статистически достоверны, р<0,01) превосходили в емкости то клеткам сорбенты контрольной группы (ЗА), при превосходстве по. снижению активности антигенного материала более чем в 6 раз (р<0,01).

Таблица 4,

ЕМКОСТЬ СОРБЕНТОВ (К) ПО КЛЕТКАМ И ВИЧ-АНТИГЕНУ

т пп серии экспериментов емкость сорбентов X + т (%) по клеткам по антигену кол-во опытов

1 о /О 3 Контроль (ЗК) Опытная (1К) Опытная (2К) 29.8 ± 4,1 60.9 ± 1,7* 47,9 ± 4,2** 8,7 ± 0,7 У 56,3 ± 6,8 18,1 ± 1,2 5 5 5

* р < 0.01, ** р < 0.05 (по сравнению с аналогичным показателем

контрольной группы).

Коэффициент селективности был в 3 раза выше в группе сорбентов

опытной группы, чем в группе контроля (таблица 5).

Таблица 5.

КОЭФФИЦИЕНТ СЕЛЕКТИВНОСТИ (К.) ДЛЯ СОРБЕНТОВ РАЗНЫХ ТИПОВ.

и

дай серии экспериментов число наблюдений "п" Кс

1 Контрольная (ЗК) 5 0,29

2 Опытная (1К) 5 0,92

3 Опытная (2К) 5 0,37 Способ иммобилизации лиганда - ковалентный(К.)

Иные результаты были получены при испытании; сорбентов с

иммобилизованными моноклоналъшми антителами. Емкость сорбентов данной группы (2К) по клеткам была выше в 1,5 раза, (различия статистически достоверны р<0,05), однако, несмотря на большую

емкость сорбентов по вирусному антигену статистически достоверных различий не было получено. При этом, сорбенты группы 1К превосходили в среднем на \0% в емкости по клеткам сорбенты группы 2К (р<0,05) и более чем в 3 раза - в емкости по вирусному антигену (р<0,01).

Эти данные, а так же результаты, полученные при испытании сорбентов синтезированных с применением простой физической, адсорбции, позволяют заключить, что использование данной популяции моноклональных антител в качестве лигандов не приводит, к получению селективных аффинных сорбентов для связывания: инфицированных ВОТ клеток.

В работе было использовано сочетание двух подходов к получению сорбентов: иммобилизация на жесткой матрице лигандов к поверхностному вирусному белку ^120, экспрессированному на поверхности пораженных клеток и использование неспецифических взаимодействий клеток модельной системы с гранулами сорбентов.

Плотность экспрессированных белков ВИЧ на поверхности инфицированных клеток нам не была известна, не было данных и о прочности фиксации белков ВИЧ на поверхности клеток, а так же прочности фиксации почкующегося вируса. Поэтому, приступая к проведению экспериментов, мы не стремились к максимальному уменьшению неспецифических взаимодействий в системе "клетка -сорбент". При выборе клеточной линии для стендовых испытаний (ЭВК/ша/З) мы учитывали повышенную склонность, моноцитов к адгезии, на твердых поверхностях, что, по нашему мнению, .должно было привести к возникновению кооперативного эффекта, когда адгезия значительно повышает возможность задержки на сорбенте инфицированных клеток в результате специфических взаимодействий

"антиген - антитело".

Несмотря на возможность неспецифических взаимодействий в процессе сорбции можно отметить селективность связывания инфицированных клеток сорбентами 1А и 1К групп по сравнению с сорбентами контрольных групп (ЗА и ЗК соответственно).

Сорбция вирионов ВИЧ.

В ачествв матрицы при синтезе сорбентов были использовали макропористые стекла МБС-8000 со средним диаметром пор 6300 А Такие характеристики, го нашему предположению, должны были обеспечить проникновение вирионов ВИЧ в поры гранул сорбента. В качестве лиганда для привязки применили специфические антитела, выделенные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных рекомбинантным белком env ВИЧ, содержащим эпитопы гомологичные таковым нативных вирусных гликопротеинов gp4i и gp120. При этом мы расчитывали на возможность создания сорбента большой емкости за счет специфических взаимодействий, поскольку известно, что на поверхности зрелого вириона фиксирован гликопротеин gpl20. По мере утраты вирионом (в процессе' созревания) gpl20 (Gelderblom et al., 1985) обнажается и становится доступным для взаимодействия с комплиментарными антителами ;трансмембранный гликопротеин gp4i (Starchich et al., 1986; Modrow et al., 1987).

После перфузии через иммуносорбент титр вирусных■антигенов (в elisa) снижался в 8 раз (при использовании в качестве продуцента вируса хронически инфицированной клеточной культуры gem/lav) - в исходном образце вирусный антиген определялся в разведении 1:128, после перфузии через контрольный (неспецифический) сорбент -1:64, а после перфузии через иммуносорбейт с иммобилизованной 7-фракцией сыворотки крови иммунизированного кролика - 1:16.

Испытание иммуносорбента (продуцент вируса - хронически инфицированная клеточная линия 3BK/URA/3) с иммобилизованными специфическими антителами (выделенными на аффинном сорбенте из •антисыворотки) показало, что если в исходном образце вирусный антиген определялся в разведении 1:128, а после перфузии через контрольный (неспецифический) сорбент - 1:64, то содержание вирусного антигена после перфузии через иммуносорбент было ниже порога чувствительности метода даже в пробе без разведения образца.

Сорбция рекомбинантных вирусных белков.

В качестве эталонных мы испытывали в данной серии экспериментов сорбенты, синтезированные на основе коммерческой сефарозы 4В поскольку сефароза практически не способна к неспецифической сорбции (Нешге! et al., 1976). Сефарозу активировали бромцианом и присоединяли антитела, выделенные, из сыворотки крови кроликов, иммунизированных рекомбинантным вирусным белком env или gag. Инкубация синтезированного таким образом сорбента с раствором рекомбинантного белка env (концентрация 0.12 мг/мл) в соотношении 1:$ приводила к снижению концентрации последнего до 0.05 мг/мл. Емкость антительного иммуносорбента сефароза-env 0.07 мг/мл. Регенерация не приводила к снижению емкости сорбентов.

Для подтверждения селективности полученных иммуносорбентюбыли проведены опыты по сорбции индивидуальных белков ВИЧ из осажденных центрифугированием и разрушенных ультразвуком инфицированных ВИЧ клеток (3BK/URA/3). Такой препарат содержит, как правило, полный спектр ядерных и поверхностных белков ВИЧ, что подтверждается нашими данными (Western Blot). Инкубация

сорбента с препаратом (в соотношении 1:2), содержащим нативнне

вирусные белки не приводила к визуальноопределяемым изменениям.

Однако, в полученных элюатах определялись только специфичные для

соответствующей популяции антител вирусные белки ( gpi60, gpi20,

gp41 и р55, р24 соответственно). Это доказывает высокую

специфичность синтезированных сорбентов.

Сорбция специфических антител.

По аналогичной методике были синтезированы иммуносорбенты с

использованием в качестве лиганда рекомбинантных белков env и gag

ВИЧ для сорбции специфических антител. Испытания проводили при

соотношении сорбент:сыворотка (разведенная в Ю раз) - 1:2.

Анализ результатов испытания антигенных сорбентов проводили

используя стрипы полученные нами методом Western Blot. Визуальных

изменений в спектре специфических антител сыворотки больного не

было обнаружено. В элюатах, полученных с иммуносорбентов с

иммобилизованными рекомбинантными белками env и gag определялись

антитела к белкам gpi60, gpi20 и р24 соответственно. Таким

образом, показана высокая специфичность полученных

иммуносорбентов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИИ СОРБЕНТОВ IN VIVO.

Для изучения возможности удаления вирусных белков (env) в

процессе экстракорпоральной иммуносорбции, а также для оценки

гемосовместимости иммуносорбентов были проведены испытания на

животных (крысы линии vistar, кролики породы шиншшга).

Сорбция рекомбинантных вирусных белков.

Животные (крысы линии Vistar) были разделены на три группы:

тавотным первой группы вводили рекомбинантный белок env ВИЧ и в

течение 60 минут (с интервалом в 15 минут) определяли его титр в

кровотоке. Через 15 минут после внутривенного введения белкэ его

титр снижался на 25<С, к 30-й минуте - уменьшался до 60% от исходного, а далее стабилизировался на этом уровне, но крайней мере, е течение получаса.

Ео втсгой группе подопытных тавотных через 2 минуты после введения сежа ет начинали перфузию через иммуносорбент па артерио-венсзнсму контуру со скоростью 0,5 мл/мин. Через 15 минут после начала перфузии титр введенного белка снижался более чем на 60й в общем кровотоке. Снизившись к концу 30-й минуты почти в 10 раз, титр белка оставался на этом уроЕна до конца процедуры. На выходе из колонки белок не определялся. При перфузии через контрольный сорбент отмечалось небольшое снижение титра белка епу в крови г-геотных, что связано, по-видимому, с неспецкфической сорбцией белка кремнеземной матрицей (рис.1).

100

ей к

§ 50 чэ

а, в к н

О

время

РисЛ. Сорбция рекомбинантного белка епу .

1-естественный клиренс,

2-перфузия через контрольный сорбент,

3-перфузия через иммуносорбент

Изучение гемосовместимости сорбентов.

Испытание синтезированных иммуносорбентов (матрица силикагель МСА-2500; лиганд - аффинноочищеиные антитела к белку епу ВИЧ; способ фиксации лиганда - ковалентная иммобилизация) на кроликах породы шинигала массой 3-4 кг показало, что перфузия сорбента осуществляется без затруднений, сопротивление колонки в процессе перфузии не меняется. Гемодинамика и основные гематологические показатели остаются стабильными. Отмечается значительное снижение содержания тромбоцитов в периферической крови животных в процессе перфузии крови через иммуносорбент - до 50-7056 от исходного уровня (таблица 6).

Таблица 6.

Содержание форменных элементов крови во время гемоперфузии через непокрытый иммуносорбент.

Время исследования тромбоциты, х 1041/л эритроциты, х 1012/л лейкоциты, х 10"/л

До перфузии 2,72+0,5 4,5+0,4 9,0+1,1

После введения гепарина 1-я колонка : через 10 мин.вход выход 1,02+0,3 1,38+0,2 0,54+0,5 4,5+0,4 4,0+0,3 4,3+0,5 8,4+0,8 7,6+1,1 7,6+0,8

через 30 мин.вход выход 1,49+0,5 0,86+0,2 4,4+0,5 4,4+0,5 8,4+0,7 8,3±0,8

2-я колонка :

через 10 мин.вход выход 1,46+0,6 0,75+0,7 4,5+0,7 4,5+0,7 8,4+1,1 8,4+0,9

через 30 мин.вход выход 1,40+0,4 0,86+0,1 4,5+0,5 4,3+0,4 8,9+0,7 8,8+1,1

Предварительная обработка иммуносорбента сывороткой крови неиммунизированного кролика значительно снижала адгезию тромбоцитов, их содержание к концу перфузии составляло 70-90$ от исходного (таблица 7).

Таблица 7.

Содержание форменных элементов крови во время гемоперфузии через иммуносорбент, обработанный гомологичной сывороткой.

Время исследования тромбоциты, х 10'1/л эритроциты, х 1012/л лейкоциты, х 10"/л

До перфузии 2,67+0,8 4,6+0,4 8,6+0,7

После введения гепарина 1-я колонка : через 10 мин.вход выход 0,92+0,3 1,36+0,6 0,94+0,6 4,5+0,7 4,4+0,5 4,4+0,5 8,2+0,7 7,5+0,9 7,5+0,9

через 30 мин.вход выход 1,80+0,2 1,37+0,2 4,3+0,3 4,1+0,5 8,3+1,1 8,3+0,7

2-я колонка :

через 10 мин.вход выход 2,12+0,3 1,65+0,2 4,4+0,3 4,4+0,4 8,5+0,9 8,4+0,6

через 30 мин.вход выход 2,31+0,2 2,09+0,1 4,6+0,4 4,6±0,5 8,5+0,6 8,5+0,6

В работе не ставилась задача создания суперселективных

сорбентов для извлечения клеток, зараженных ВИЧ; индивидуальных Еирусных белков и специфических антител к ним с характеристиками, предъявляемыми к сорбентам для тонких биохимических или иммунологических целей - для препаративного, лабораторного выделения и очистки каких-либо популяций клеток или белков. Поэтому под селективностью сорбентов подразумевается преимущественная сорбция инфицированных ВИЧ клеток по сравнению с непораженными клетками модельной системы или вирусных белков и специфических. антител по сравнению с другими компонентами модельной системы.

Таким образом, нами экспериментально показана принципиальная возможность использования данного подхода для удаления инфицированных ВИЧ клеток из смешанной культуры, индивидуальных вирусных белков в эксперименте in vitro и in vivo, что может

оказаться полезным при разработке комплексного лечения синдрома

приобретенного иммунодефицита.

выводи.

1. Созданы новые иммуносорбенты на основе отечественных материалов.

2. Иммуносорбенты обладают высокой емкостью и специфичностью по отношению к индивидуальным белкам ВИЧ и могут подвергаться регенерации для повторного использования.

3. Связывание индивидуальных вирусных белков на иммуносорбенте осуществляется за счет взаимодействия с иммобилизованными специфическими антителами. Перфузия через неселектиЕШй (контрольный) сорбент не приводит к выраженной элиминации индивидуальных вирусных белков.

4. Гемоперфузия через иммулосорбент приводит к эффективной элиминации введенных в организм животного вирусных белков.

5. Экстракорпоральная иммуносорбция сопровождается допустимыми гематологическими сдвигами. Это позволяет отказаться от сепарации плазмы, что значительно упрощает процедуру иммуносорбции.

6. Разработанный метод экстракорпоральной иммуносорбции является перспективным и может явиться основой для разработки комплексного лечения СПИД и СПИД- ассоциированного симптомокомплекса.

Практиче скш рекомендации.

1. Метод экстракорпоральной иммуносорбции может быть рекомендован для внедрения в медицинскую практику как способ детоксикащш (снижения антигенемш и вирусемии) в комплексном лечении больных СПИД.

2. Предварительная обработка иммуносорбента сыворотко; крови позволяет существенно снизить адгезию тромбоцитов н колонке, что позволяет проводить регенерацию и повторно! использование иммуносорбента.

3. При проведении экстракорпоральной иммуносорбцн использование плагмоееп^ращш не является обязательным.

5Ш?сок_работх_дщблщо^

1. Положительное решение государственной научно-техническо] , экспертизы изобретений по заявке № 4609214/30-13(161481) "Спосо<

одновременного извлечения белков вируса иммунодефицита человека ] лимфоцитов с экспрессированными на их поверхности белками ВИЧ и: биологических жидкостей." ( в соэет. Д.В.КулаеЕ, Ю.М.Лопухин В.С.Алексейчук, М.А.Руднева, Э.В.Карэмов, Д.Д.Петрушш М.В.Цибульская, Т.К.Люкова, В.А.Мурашов, О.Ю.Жданкина)

2. Экстракорпоральная селективная сорбция вирусных белко) ВИЧ-1 в эксперименте. В кн.: Материалы XII съезда хирурго] Дагестана. Махачкала, 1990. ( в соавт. Ю.М.Лопухин, Д.Б.Кулаев)