Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Разработка фармакологических средств на основе низкомолекулярных пектинов и альгинатов для антитоксической терапии

Хотимченко Родион Юрьевич

Разработка фармакологических средств на основе низкомолекулярных пектинов и альгинатов для антитоксической терапии

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 ОКТ 2015

Владивосток 2015

005563229

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель: д.м.н., профессор Кириллов Олег Иванович Официальные оппоненты:

Кушнерова Наталья Федоровна, д.б.н., профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения Российской академии наук, заведующая лабораторией биохимии

Кузнецова Татьяна Алексеевна, д.м.н., старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», заведующая лабораторией иммунологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга»

Защита состоится «25» ноября 2015 г. в 12:00 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при Тихоокеанском государственном медицинском университете по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тихоокеанского государственного медицинского университета и на сайте http://tgmu.ru/

Автореферат разослан «.30» сентября

Ученый секретарь диссертационного совета

)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Некрахмальные полисахариды (НПС) составляют группу растительных углеводных биополимеров, которые содержат от нескольких сот до нескольких тысяч моносахаридных остатков, соединенных преимущественно /?-гликозидной связью (Englyst K.N. et al., 2007; Lovegrove A. et al., 2015). Основные НПС, такие как пектины, /З-глюканы, пентозаны, гетероксиланы и ксилоглюканы наземных растений, альгинаты, каррагинаны и фукоиданы морских водорослей и хитин ракообразных, различающиеся последовательностью и составом моносахаридов, типами связей, размерами молекул и присутствием линейных или разветвленных боковых ветвей, отходящих от осевой полимерной цепи (Хотимченко Ю.С. и др., 2005; Cummings J.H., Stephen A.M., 2007; Kumar V. et al. 2012), проявляют широкий спектр физиологических и фармакологических эффектов, благодаря которым они рассматриваются в качестве источника новых фармацевтических субстанций. Заслуживают внимания такие эффекты НПС, как гипохолестеринемический и гипотриглицериде-мический (Brouns F. et al., 2012; Кузнецова T.A. и др., 2014; Adam C.L. et al., 2015), гепатопротекторный, гастропротекторный и нефропротекторный (Крылова С.Г. и др., 2009; Wang J. et al., 2012; Беседнова H.H. и др., 2014; Woodward М.С. et al., 2014), им-муномодулирующий (Yoshikawa Y. et al., 2008; Hou Y. et al., 2013; Galvào Cándido F. et al., 2014), антикоагулянтный и антиагрегантный эффекты (Jiao G. et al., 2011; Mourâo P.A., 2015), a также способность связывать и выводить из организма тяжелые металлы, радионуклиды и токсичные метаболиты (Zhao Z.Y. et al., 2008; Nesterenko V.B., Nesterenko A.V., 2009; Dalia M., El-Nahal A., 2010; Savchenko O.V. et al., 2014).

НПС отличаются от многих лекарственными препаратами тем, что, будучи природными соединениями, они обладают низкой токсичностью, возможностью длительного применения без нарушения водно-электролитного баланса, наличием благоприятных физиологических эффектов в отношении органов желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой и выделительной систем (Satoh, 2010; Hong et al., 2012; Torres et al., 2015). НПС уже находят применение в медицинской практике в форме биоактивных соединений и функциональных продуктов (Dhingra D. et al., 2012; Abuajah С. et al., 2015), но в меньшей степени в качестве лекарственных препаратов (Fitton J.H., 2011; Ahmed А.В. et al., 2014; Palíela R., 2014). Последний факт объясня-

ется чрезвычайной сложностью и огромным разнообразием структуры полисахаридов, что делает задачу стандартизации этих крупных органических молекул трудной для практического решения, что значительно усложняет проведение адекватной оценки их фармакологической активности. Кроме того, размер молекул НПС делает маловероятным существование в организме человека и животных специфических фармакологических рецепторов для крупных углеводных биополимеров. Именно размер полисахаридов не позволяет им абсорбироваться в тонкой кишке и оказывать резорбтивные эффекты. Сравнительно новое направление в экспериментальной фармакологии может быть связано с получением низкомолекулярных полисахаридов (Pedrolli D.B. et al., 2012; Kothari D. et al., 2014; Wefers D. et al., 2014) и изучением их фармакологической активности как основы для разработки новых фармацевтических субстанций (Babbar N. et al., 2015). На сегодняшний день основной областью применения пектиновых олигосахаридов является производство пребиотиков (Westphal Y. et al., 2010; Combo A.M.M. et al., 2012; Munoz A.L. et al., 2012). Ряд интересных эффектов описан для низкомолекулярных хитозанов (Lodhi G. et al., 2014; Azuma К. et al., 2015; Huang L. et al., 2015), фукоиданов (Cui W. et al., 2014; Jo B.W., Choi S.K., 2014; Stonik V.A., Fedorov S.N., 2014; Shu Z. et al., 2015 ), пектинов (Vos A.P. et al., 2007; Рыбалкина О.Ю. и др., 2012) и альгинатов (Tondervik A. et al., 2014; Zhou R. et al., 2015). Однако многие стороны фармакологии олигоуронидов и других олигосахаридов, связанные с изучением их фармакокинетики и фармакодинамики, а также стандартизации остаются недостаточно исследованными, что определило цели и задачи работы.

Цель работы: изучить антитоксические свойства низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов для разработки новых фармацевтических субстанций на основе олигоуронидов.

Задачи работы:

1. Изучить молекулярно-массовое распределение низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов, полученных методом кислотного гидролиза высокомолекулярных полисахаридов, выделенных из морских водорослей и трав, и описать физико-химические свойства экспериментальных олигоуронидов для стандартизации.

2. На модели инвертированного сегмента тонкой кишки крыс изучить абсорбцию высокомолекулярных и низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов.

3. Изучить металл-связывающую активность низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов и определить с помощью математических моделей сорбции основные константы связывания.

4. Фотометрическими методами FRAP и окисления твина-80 до малонового диальдегида оценить антиоксидантные свойства низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов.

5. Исследовать антитоксические свойства низкомолекулярных и высокомолекулярных пектинов и альгинатов на модели лейкопенического действия циклофосфа-мида.

6. Изучить действие низкомолекулярных и высокомолекулярных пектинов и альгинатов на эффективность циклофосфамида у мышей с карциномой легких Лыоис.

Научная новизна и теоретическое значение работы. Изучены изменения физико-химических показателей пектинов и альгинатов, обусловленные проведением кислотного гидролиза с целью получения низкомолекулярных фракций полисахаридов. Проведена количественная оценка молекулярно-массового распределения высокомолекулярных и низкомолекулярных образцов пектинов и альгинатов. Проведена сравнительная оценка in vitro и in vivo металл-связывающей, антиоксидантной и антитоксической активности высокомолекулярных и низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов. С помощью математической модели сорбции Лэнгмюра показано, что уменьшение молекулярной массы сопровождается достоверным повышением максимальной кадмий-связывающей емкости пектинов. С уменьшением молекулярной массы пектинов и альгинатов повышается их железо-восстанавливающая способность и ингибиторная активность железо/аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида.

На модели инвертированной тонкой кишки крысы изучена абсорбция высокомолекулярного пектина и низкомолекулярных образцов с различными молекулярными массами, определена скорость прохождения разноразмерных полисахаридов через стенку кишки и проведена оценка этого процесса в сравнении с показателями галак-туроновой кислоты.

Теоретическое значение работы состоит в получении новых данных о зависимости фармакологических эффектов пектинов и альгинатов от их структуры и молекулярной массы.

Практическая значимость работы и реализация результатов исследования.

Качественный и количественный анализ физико-химических свойств низкомолекулярных производных пектинов и альгинатов позволяет проводить адекватную стандартизацию образцов олигоуронидов с целью получения воспроизводимых результатов экспериментов по оценке их фармакологической активности. Получены образцы окгагалакту-ронида и гептагалактуронида, характеризующиеся низкими значениями полидисперсности, что свидетельствует об их высокой степени однородности. Исследованный вид морских растений РИуИозрасОх Ы?а1епз1$ предложен в качестве нового сырьевого источника олигогалактуронидов с фармакологической активностью. Способность низкомолекулярных альгинатов натрия, полученных из альгиновой кислоты и натрий/кальциевого аль-гината морских бурых водорослей, ослаблять токсические эффекты цитостатиков без изменения основного действия, позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения в качестве вспомогательных средств антиметастатической терапии. Препараты пектиновых и альгинатных олигосахаридов рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве природных антиоксидантов и разработки средств, предназначенных для профилактики и коррекции хронических отравлений тяжелыми металлами.

По материалам исследований получен патент РФ № 2540946 «Способ получения быстрорастворимого альгината натрия».

Технология изготовления быстрорастворимого альгината натрия и разработанные методы выделения индивидуальных олигогалактуронидов внедрены в производство функциональных продуктов ООО НПФ «Востокфарм».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Низкомолекулярные фракции пектинов и альгинатов, размер молекул которых менее 1,424 кДа способны абсорбироваться в тонком кишечнике и оказывать ре-зорбтивные эффекты.

2. Низкомолекулярный альгинат натрия со средневесовой молекулярной массой 3,64 кДа способен ослаблять лейкопенический эффект циклофосфамида у мышей путем стимуляции лейкопоэза.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Отчетных научных конференциях Института биологии моря им. А.В.Жирмунского ДВО РАН (2013, 2014, 2015), на отчетных конференциях Целевой комплексной про-

граммы фундаментальных научных исследований ДВО РАН «Получение, исследование и моделирование биогенных и биомиметических наноструктурированных материалов» (Владивосток, 20U, 2012, 2013), Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2013), на Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), на 9-ой Международной конференции «Anticancer Research» (Porto Carras, Greece, 2014).

Материалы диссертации были доложены на заседании объединенного семинара лабораторий фармакологии, сравнительной биохимии, сравнительной цитологии, биофизики клетки, клеточных технологий, генетики и эмбриологии Института биологии моря им. А.В.Жирмунского ДВО РАН. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 5 статей в российских журналах, входящих в рекомендованный ВАК «Перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций», 2 статьи в журналах, входящих в базы данных Scopus и Web of Science, патент Российской Федерации.

Финансовая поддержка. Работа выполнялась при финансовой поддержке Целевой комплексной программы фундаментальных научных исследований ДВО РАН «Получение, исследование и моделирование биогенных и биомиметических наноструктурированных материалов», Государственного контракта № 02.512.12.2043 «Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в терапии злокачественных новообразований», грантов ДВО РАН № 12-1-П24-11 «Разработка современных систем направленной доставки лекарственных веществ на основе наноструктурированных полисахаридных носителей» и № 12-1-П7-06 «Токсикокинетика стабильных изотопов стронция и цезия и способы ее лекарственной регуляции».

Личный вклад автора. Лично автором выполнен основной объем работ по обобщению литературных данных по теме диссертации и составлению общего плана работ, разработан способ выделения индивидуальных олигогалактуронидов из продуктов гидролиза пектина морских трав, проведены эксперименты по установлению параметров металл-связывающей и антиоксидантной активности низко-

молекулярных производных пектинов и альгинатов in vitro и оценке их эффектов на токсическое действие циклофосфамида in vivo, систематизированы, статистически обработаны и проанализированы экспериментальные данные. Автором изготовлена оригинальная конструкция для оценки скорости кишечной абсорбции оли-гоуронидов и проведены опыты с низкомолекулярными препаратами пектинов и альгинатов. В разработке методики кислотного гидролиза высокомолекулярных пектинов и альгинатов и получения быстрорастворимого альгината натрия участвовали сотрудники лаборатории фармакологии Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН к.б.н. В.В.Ковалев, к.б.н. Е.В.Хожаенко, д.м.н. М.Ю.Хотимченко. В экспериментах с культурами опухолевых клеток участвовал заведующий лабораторией молекулярной и клеточной нейробиологии Дальневосточного федерального университета к.м.н. И.С. Брюховецкий. Содержание экспериментальных животных осуществлялось под руководством заведующего виварием ИБМ ДВО РАН к.м.н. Т.В.Полещук.

Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 15 таблицами. Библиография состоит из 244 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использовали: альгинат натрия марки Grindsted® Alginate PH (Danisco, Чехия) и альгинат натрия (Fluka, Великобритания), пектин SC501 (Herbstraight and Fox, Германия), свинца (II) хлорид безводный (Sigma-Aldrich, Япония), кадмия (II) хлорид (Sigma-Aldrich, Индия), реагенты класса чистоты для хроматографии: натрия нитрат (Sigma-Aldrich, Япония), натрия хлорид (Sigma-Aldrich, Япония), натрий фосфорнокислый 2-замещенный (Fluka, Великобритания), натрий фосфорнокислый 1-замещенный (Sigma-Aldrich, Китай), сульфат меди 5-водный (Sigma-Aldrich, Индия), L-серин (Sigma, Бельгия), натрия бицинхонинат (Sigma-Aldrich, Швейцария).

Для получения пектина из морского сырья морскую траву Phyllospadix iwatensis собирали в бух. Западная (зал. Петра Великого, Японское море). Свежую траву очищали, промывали, измельчали и заливали 0,1 М НС1 (1:15, рН 2,5) и перемешивали в течение 3 ч на водяной бане при температуре 60°С и промывали водой. Пектин экстрагировали 0,5% раствором оксалата аммония при рН 6,0 и температуре 75°С в течение 3 ч. Готовый экстракт пектина охлаждали и очищали центрифугированием, и пектин осаждали 95% этанолом. Для получения низкомолекулярных образцов пектин подвергали дальнейшему кислотному гидролизу.

Молекулярно-массовое распределение пектинов, альгинатов, их гидролизатов и олигоуронидов анализировали методом эксклюзионной хроматографии. Хроматогра-фическая система состояла из модулей: DGU-20A5 дегазатор, LC-20AD системный контролер, СВМ-20А насос, СТО-20А термостат для колонок and RID-20A рефрактометрический детектор (Shimadzu, Japan). Сбор и обсчет данных производили с помощью стандартного сертифицированного программного обеспечения, предусматривающего статистическую обработку данных LC Solution Version 1.25 с функцией расчета молекулярно-массовых характеристик. Анализ поли- и олигоуронидов проводили на гель-фильтрационных колонках Shodex Asahipak GS-320 7Е (7,5 мм х 250 мм, лимит эксклюзии 40х103 г/Моль, размер частиц бцм); OHpak SB-804HQ (8 мм х 300 мм, лимит эксклюзии 1 х 106 г/Моль, размер частиц Юцм). В качестве стандартов для калибровок колонок использовали пуллуланы с различными молекулярными массами: Р-1 (MW = 1,32 кДа), Р-5 (MW = 5,9 кДа), Р-10 (MW = 11,8 кДа), Р-20 (MW = 22,8 кДа), Р-50 (MW = 47,3 кДа), Р-100 (MW = 112,0 кДа), Р-200 (MW = 212,0 кДа), Р-400 (MW = 404,0 кДа), Р-800 (MW = 788,0 кДа).

С помощью метода концевых групп рассчитывали средничесленную молекулярную массу (Мп) биополимеров по формуле:

Mn = nxg/ е,

где п — число концевых групп в молекуле полимера; g - масса навески полимера, г; е - общее число эквивалентов концевых групп.

Для определения среднечисленной молекулярной массы полисахаридов использовали бицинхонинатный метод (Waffenschmidt, Jaenicke, 1987; Moretti, Thorson, 2008).

Для количественного определения концевых групп в пектинах, альгинатах и олигоуронидах готовили серию разведений раствора И-галактуроновой кислоты с концентрациями от 0,285 до 9,15 мкг/мл, строили калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации О-галактуропопой кислоты. В данной работе полученное уравнение по калибровочной кривой имело вид у = 0,0568х + 0,0051 с коэффициентом аппроксимации Я2 = 0,9995.

Среднечисловую молекулярную массу (Мп) образцов пектинов и альгинатов в Да вычисляли по формуле:

.. тх(юо-ИОхо,8В4х1оооо

МП = -,

СХО,907x100

где т — масса навески поли- и олигоуронидов, мг; XV - массовая доля воды в образцах поли- и олигоуронидов; С — концентрация /)-галактуроновой кислоты, найденная по калибровочному графику, мкмоль/л; 0,907 - коэффициент пересчета .О-галактуроновой кислоты в ангидро-£)-галактуроновую кислоту, 0,884 — коэффициент пересчета натриевой соли олигоуронидов в полигалактуроновую кислоту.

Определение молекулярной массы олигогалактоуронидов проводили на жидкостном хроматомасс-спектрометре ЬСМ8-2020 (ЭЫтаёги, Япония). Определение уро-новых кислот в растворах пектинов и альгинатов проводили фотометрическим методом с мета-гидроксибифенилом (В1итепкгап1г, АзЬое-Нашеп, 1973).

Для определения металл-связывающей активности пектинов, альгинатов и их производных в емкость объемом 20,0 мл вносили 0,08-2,7 мл 0,1 М раствора кадмия или свинца, 1,0 мл 1 М ацетатного буфера с необходимым значением рН и 10,0 мл раствора уронидов с концентрацией 5 мг/мл. Фактическая концентрация металлов в смеси составляла 0,93-7,46 г/мл. Объем смеси доводили до 20,0 мл дистиллированной водой. Смесь инкубировали при перемешивании в течение 100 мин. Жидкую фазу отделяли от образовавшегося плотного гелеобразного осадка фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 5 мкм. Концентрацию свинца и кадмия в фильтрате определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре 8Ытас1ги АА-6800 (вЫтаё-га, Япония).

Количество связавшегося кадмия или свинца вычисляли по формуле:

Ч=У(С0-Се)/М,

где q - количество связавшегося сорбентом металла, мг/г; V - объем раствора в инкубационной емкости, л; С0 - начальная концентрация металла в растворе, мг/л; Се— равновесная концентрация металла в растворе, мг/л; М — масса уронида, г.

По результатам экспериментов строили изотермы сорбционного равновесия согласно сорбционной модели Лэнгмгора. Коэффициент сродства уронидов к ионам кадмия и свинца и их максимальную сорбционную емкость определяли по формуле:

_ _ Я т,, х с « 4 к + С е

где q — связывание ионов кадмия или свинца, мг/г сухой массы уронида; Се - равновесная концентрация кадмия или свинца в растворе, мг/л; к - коэффициент сродства экспериментального образца к ионам кадмия или свинца, л/мг; цтах - максимальное связывание ионов кадмия или свинца в данных условиях, мг/г уронидов.

Для изучения абсорбции поли- и олигоуронидов у крыс-самцов весом 150-160 г под эфирным наркозом после срединной лапарттомии извлекали фрагменты проксимального отдела тонкой кишки длиной 4 см, промывали буфером Кребса, удаляли серозную оболочку и мышцы, эвертировали и фиксировали в инкубационной камере, заполненной буферным раствором Кребса, на авторской установке (Рисунок 1). Внутреннюю полость эвертированной кишки заполняли раствором Кребса (рН 6,0). Во внешний раствор, насыщаемый кислородом, вносили образец в конечной концентрации 5-10 мг/мл. Инкубацию продолжали в течение 15, 30, 45, 60, 75, 90 мин при 37°С. Для оценки жизнеспособности фрагментов кишки определяли электрические показатели, такие как потенциал покоя и силу тока при переменном сопротивлении (2000 и 4000 Ом).

Объем раствора внутри полости эвертированного мешка длиной 4 см составлял 3,0 мл. Коэффициент сравнительной кишечной проницаемости определяли по формуле:

р _ Дт _1_

"арр ~ лг Х ч ХГ '

раствора

где Рарр - расчетный (кажущийся) коэффициент проницаемости, см/с; Дш - количество исследуемого вещества, прошедшее через кишечник за время, равное Д^ мг; Д1 - продолжительность эксперимента, с; 5КИШ - площадь изолированного фрагмента кишечника, см2; С исх раСтвора - концентрация исследуемого вещества в исходном растворе, мг/см3.

Отбор проб

Насос-дозатор Подача рабочего р-ра

Схема установки

Фильтр

Рисунок 1 - Схема экспериментальной установки с эвертированной тонкой кишкой крысы.

Количество исследуемого вещества, прошедшее через стенку кишки, определяли по формуле:

Am = Сх V,

где С — концентрация вещества в растворе, прошедшего через стенку кишки кишечник за время, равное At; V - объем раствора, прошедшего через стенку кишки за время, равное At, см3.

Определение антиоксидантной активности. Об антиоксидантной активности пектинов и альгинатов судили по их способности восстанавливать трехвалентное железо в условиях in vitro фотометрическим методом FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power) (Benzie, Strain, 1996) и по ингибированию Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида (Коленченко, 2004).

Экспериментальные модели. Эксперименты на лабораторных животных проводили на самцах и самках беспородных белых мышей (массой 20-30 г) в виварии Института биологии моря им. А.В.Жирмунского Дальневосточного отделения РАН и на мышах-самцах линии C57BL/6 (массой 19-26 г), полученных из Отдела экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д.Гольдберга Сибирского отделения РАН (сертификат качества № 188-05). Содер-

жание животных осуществляли по правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Эксперименты проводили в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005). Дизайн экспериментов одобрен Этическим комитетом ИБМ ДВО РАН. По окончании экспериментов животных умерщвляли дислокацией шейного отдела позвоночника, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Эксперимент с циклофосфамидом. Опыты продолжались в течение 14 суток. С 1-го дня контрольным животным внугрижелудочно с помощью зонда вводили 0,3 мл дистиллированной воды. На 4-е сутки опыта второй группе животных внутримышечно однократно вводили циклофосфамид в дозе 150 мг/кг массы в 0,1 мл воды для инъекций. Третьей группе животных вводили тестируемые поли- и олигосахари-ды с 1-го дня внугрижелудочно в 0,3 мл дистиллированной воды ежедневно, и на 4-е сутки им же вводили однократно циклофосфамид в той же дозе. Еще через 10 суток опыт прекращали, животных умерщвляли, и показатели периферической крови определяли стандартными гематологическими методами (Гольдберг и др., 1992).

Эксперимент с карциномой легких Льюис. После вскрытия животных-доноров опухолевую массу измельчали, помещали в стерильный стеклянный флакон, разводили физиологическим раствором и пропускали через капроновый фильтр. Взвесь, содержащую 5,0 х 106 опухолевых клеток в 0,1 мл, вводили животным-реципиентам в мышцу задней левой лапы. Исследуемые вещества вводили внугрижелудочно с помощью зонда через 7 суток после перевивки опухоли и далее ежедневно в течение 11 суток. Циклофосфамид в дозе 125 мг/кг массы вводили внутрибрюшинно однократно в 0,1 мл воды для инъекций на 10 сутки после перевивки опухоли. После вскрытия животных первичный опухолевый узел выделяли и взвешивали. Количество метастатических очагов в плевре подсчитывали визуально и вычисляли среднее количество метастазов в пересчете на одно животное в группе. Диаметр метастазов измеряли, определяли площадь метастазов и вычисляли среднюю площадь метастатического поражения в пересчете на одно животное.

Статистическая обработка результатов. Количественные данные подвергали статистической обработке методами вариационной статистики с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 for Windows и программного обеспечения SPSS for Windows, версия 11.0. Для статистического анализа рассчитывали средние арифметические величины и ошибки средних арифметических. Оценку достоверности различия результатов экспериментальных наблюдений проводили в сравнении с контролем с использованием t-критерия Стыодента для малых величин (п < 30). Для оценки результатов исследований с несколькими выборками использовали метод однофактор-ного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим проведением post hoc теста Tkuey's. Уровень значимости считали достоверным при р < 0,05 (Гублер Е.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Технология получения и характеристика низкомолекулярных пектинов и альгинатов. Содержание пектина в Phyllospadix iwatensis составило 9,72% на сухое вещество. Содержание D-галактуроновой кислоты в полученном пектине — 57,2%. Для повышения содержания уроновой кислоты пектин подвергали кислотному гидролизу в течение 2 ч в 0,5 М HCl при 90°С. В ходе гидролиза произошло отщепление части нейтральных Сахаров, и содержание уроновой кислоты повысилось до 76,9%. Степень метоксилирования пектина уменьшилась в 2,7 раза, до 2,54%, и относительное содержание свободных (деметоксилированных) остатков £)-галактуроновой кислоты увеличилось с 53,3% до 75,0%. Выход гидролизованного пектина составил 67,2% от нативного пектина.

Анализ состава жидкого гидролизата пектина, проведенный с помощью экс-клюзионной хроматографии, показал присутствие в нем всех низших олигогалакту-ронидов, от моногалактуроновой кислоты до октагалактуронида. Для разделения полученной смеси олигогалактуронидов на более узкие молекулярные фракции использовали метод дробного осаждения этанолом. Было получено 5 фракций олигогалактуронидов. На хроматограммах осажденных фракций олигогалактуронидов (Рисунок 2) видно, что первый образовавшийся осадок, формирование которого произошло при концентрации этанола 15% , представляет собой сравнительно однородную и узкую фракцию, представленную преимущественно октагалактуронидом со степенью полимеризации 8. Следующий осадок, образовавшийся при концентрации этанола 26%,

также представлял собой однородную и узкую фракцию, представленную преимущественно гептагапактуронидом (степень полимеризации 7). Оба осадка подвергали дополнительной очистке. Для подтверждения состава полученных фракций проводили дополнительное исследование методом квадрупольной масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем. На масс-спектре, полученном для фракции 1, установлено присутствие иона со значением m/z = 1425, что соответствует молекулярному иону окта-галактуронида. На масс-спектре фракции 2 установлено присутствие иона со значением m/z = 1249, что соответствует молекулярному иону гептагалактуронида. Суммарный выход окгагалактуронида составил 2,64%, гептагалактуронида - 1,86% в пересчете на сухую массу нативного пектина.

цУ

min

Рисунок 2 - Хроматограммы осаждаемых фракций олигогалактуронидов (GPC): 8 — октагалактуронид (Mw 1424 Да), 7 - гептагалактуронид (Mw 1249 Да), 6 - смесь галакту-ронидов ( Mw 1071-1249 Да), 5 - смесь галактуронидов (Mw 724-987 Да), 4 - смесь гапакту-

ронидов (Mw 176-724 Да).

Альгинатные олигоурониды получали путем структурной деградации исходного высокомолекулярного альгината натрия (содержание уроновых кислот 77,3±0,78%) с предварительным переводом в альгиновую кислоту. Сначала были получены образцы гидролизованного альгината (полиурониды F и G). Выделение олигоуронида Н из жидкой фазы гидролизата осуществляли путем его осаждения этанолом при pH 4,0-

5,0 и концентрации этанола 60%. Выход полиуронида Б (содержание уроновых кислот 83,7±1,97%) составил 57,4%, полиуронида в (содержание уроновых кислот 86,4±3,79%) - 43,3%, олигоуронида Н (содержание уроновых кислот 88,5±4,47%) -11,2%.

Методом эксюиозионной хроматографии была получена кривая молекулярно-массового распределения для нативного пектина (полигалактуронид А), выделенного из РЛм!а(епз13, которая имела бимодальный характер, пик 1 соответствовал М\у = 940,4 кДа (ю = 20,87%), а пик 2 - Мад = 163,3 кДа (ш= 79,13 %). Кислотный гидролиз пектина приводил к существенному снижению его молекулярной массы. Полученные олигогалактурониды характеризовались гомогенным составом, низкой молекулярной массой и полидисперсностью, близкой к 1. Дополнительно с помощью эксклюзионной хроматографии и метода концевых групп для них были рассчитаны молекулярно-массовые характеристики (Таблица 1).

Таблица 1 - Молекулярно-массовые характеристики пектина из РИуИозрасЧх ¡\vatensis, его гидролизатов и олигоуронидов

Наименование Эксклюзионная хроматография Метод концевых Масс-спектромет-

групп рия

Муу Мл Mw/Mn Мп (кДа) М/г (кДа)

(кДа) (кДа)

Полигалактуронид А 325,45 101,81 3,1969 96,73 -

Полигалактуронид В 112,21 52,1 2,1539 48,58 -

Октагалактуронид С 3,94 3,42 1,1506 3,12 1,424

Гептагалактуронид В 3,63 3,57 1,0170 3,37 1,249

Методом эксклюзионной хроматографии были получены кривые молекулярно-массового распределения для альгината и его производных. В процессе гидролиза происходило резкое снижение молекулярной массы полиуронидов, при этом кривая ММР сужалась, приближаясь к Гауссовому распределению. Полидисперсность низкомолекулярных производных также значительно снизилась (Таблица 2).

Таблица 2 - Молекулярно-массовые характеристики альгината и его низкомолекулярных производных

Наименование Эксклюзионная хроматография Метод концевых групп

Mw (кДа) Мп (кДа) Mw/Mn Мп (кДа)

Альгинат натрия 335,94 133,35 2,5191 284,8

Полиуронид F 36,32 28,47 1,2756 25,1

Полиуронид G 24,70 13,74 1,7980 19,2

Олигоуронид Н 3,64 2,49 1,4631 1,8

Оценка кишечной проницаемости пектина из Р. iwatensis, альгината и их низкомолекулярных производных на модели изолированного кишечника. В качестве модельной субстанции была выбрана О-галактуроновая кислота, которая является основной структурной единицей пектинов и обладает наименьшей молекулярной массой из всех исследуемых образцов. В качестве репера целостности кишечника использовали фенолкрасный с нулевой абсорбцией. По результатам эксперимента были построены кинетические кривые абсорбции для D-галактуроновой кислоты, октага-лактуронида С, гептагалакутронида D и олигоуронида Н. Для остальных образцов (полигалакутронидов А и В, альгината натрия, полиуронидов F и G) была установлена нулевая абсорбция. Кажущиеся коэффициенты проницаемости для трех низкомолекулярных производных пектина и альгината натрия значительно ниже коэффициента проницаемости для D-галактуроновой кислоты в среднем в 210,9, 194,2 и 386,1 раза (таблица 3). Значения кажущихся коэффициентов проницаемости для олигога-лактоуронидов увеличивались при уменьшении молекулярных масс, а именно, Рарр гептагалактуронида D (Mw=3,63 кДа) был больше Рарр октагалактуронида С (Mw=3,94 кДа). Рарр олигоуронида Н (Mw=3,64 кДа) был наименьшим из исследованных олигоуронидов. Проницаемость октагалактуронида С составила 0,47% от проницаемости галактуроновой кислоты, гептагалактуронида D - 0,51% и олигоуронида Н — 0,26%.

Металл-связывающая активность низкомолекулярных и высокомолекулярных пектинов и альгинатов. Метал-связывшощая активность исследованных образцов пектинов и альгинатов зависит от pH среды взаимодействия.

Таблица 3 - Коэффициенты проницаемости кишечника, определенные методом ex vivo для экспериментальных образцов

Наименование Исходная концентрация вещества в растворе Кажущийся коэффициент проницаемости, Раррх10"6 Р

.D-галакгуроновая кислота 5 мг/мл 12,315±4,687 0,035

Октагалактуронид С 10 мг/мл 0,0584±0,036 0,028

Гептагалактуронид D 10 мг/мл 0,0634±0,014 0,006

Олигоуронид Н 10 мг/мл 0,0319±0,012 0,014

Максимальную кадмий-связывающую емкость проявлял полигалактуронид В. Активность высокомолекулярного полигалактуронида А была ниже в среднем в 1,5 раза. Октагалактуронид С и гептагалактуронид В незначительно отличались от поли-галакутронида В, в среднем на 12%, но превышали (при рН 6,0) активности нативнно-го пектин на 34,0% и 32,4%, соответственно (Таблица 4). Коэффициент сродства ок-тагалактуронида С к ионам кадмия при рН 6,0 не отличался от такового полигалактуронида А, а у гептагалактуронида Б был ниже на 42,9%. У обоих пектиновых олигосахаридов этот коэффициент был выше, чем у полигалактуронида В в 4,0 и 2,2 раза.

Альгинат натрия уступал по кадмий-связывающей емкости как нативному пектину из Р. ¡\valensis, так и всем низкомолекулярным производным пектина. Поли-и олигоурониды характеризовались относительно низкими значениями кадмий-связывающей емкости при всех условиях рН.

Наиболее эффективным сорбентом иона свинца при всех рН оказался полигалакутронид В, его максимальная свинец-связывающая емкость сохранялась на достаточно высоком уровне даже при рН 2,0. Максимальная свинец-связывающая емкость октагалактуронида С и гептагалактуронида В при рН 6,0 была ниже таковой полигалактуронида А на 5,7% и 3,4% и ниже активности полигалактуронида В на 11,6% и 9,81%, соответственно.

Таблица 4 - Константы Лэнгмюра для связывания ионов кадмия пектином, аль-гинатом натрия и их модифицированными производными (рН 6,0)

Наименование qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г К, коэффициент сродства, л/мг й/, коэффициент достоверности аппроксимации

Полигалактуронид А 181,2 0,0161 0,999

Полигалактуронид В 271,0 0,0040 0,999

Октагалактуронид С 242,8 0,0158 0,995

Гептагалактуронид Б 239,92 0,0092 0,997

Альгинат натрия 167,4 0,018 0,997

Полиуронид Р 105,6 0,0034 0,993

Полиуронид О 92,9 0,00875 0,997

Олигоуронид Н 66,8 0,00792 0,994

Таблица 5 - Константы Лэнгмюра для связывания ионов свинца пектином, аль-гинатом натрия и их модифицированными производными (рН 6,0)

Наименование Ятах, максимальная связывающая емкость, мг/г К, коэффициент сродства, л/мг Я2, коэффициент достоверности аппроксимации

Полигалакутронид А 625,0 0,0068 0,999

Полигалакутронид В 666,67 0,0020 0,999

Октагалактуронид С 589,2 0,0142 0,999

Гептагалактуронид Э 601,3 0,0152 0,999

Альгинат натрия 612,64 0,0099 0,997

Полиуронид Р 204,7 0,0054 0,973

Полиуронид в 216,1 0,0474 0,984

Олигоуронид Н 97,8 0,0047 0,997

Коэффициент сродства октагалактуронида С к ионам свинца был выше такового полигалактуронида А в 2,1 раз и полигалактуронида В — в 7,1 раза. Этот же показатель у гептагалактуронида D выше, чем у полигалактуронида А в 2,2 раза и полигалактуронида В - в 7,6 раза (Таблица 5).

Антиоксидантная активность пектинов и альгинатов. В опытах in vitro с трехвалентным железом наибольшую восстанавливающую активность проявил окта-галактуронид С (Mw 3,94 кДа) и наименьшую — нативный пектин (Mw 325,45 кДа). Из альгинатов наибольшая активность была у олигоуронида Н (Mw 3,64 кДа), промежуточная - у полиуронида G (Mw 24,70 кДа) и наименьшая — у высокомолекулярного альгинат натрия (Mw 335,94 кДа). Исследованные фракции полисахаридов дозозави-симым образом подавляли образование МДА из твина-80. Ингибирующая активность полигалактуронида А при увеличении концентрации с 0,1 мг/мл до 2,0 мг/мл повышалась в среднем в 2,53 раза, у полигалактуронида В - в 4,35 раза, у олигогалактуро-нида С - в 3,73 раза. У высокомолекулярного альгината натрия увеличение концентрации с 0,1 мг/мл до 2,0 мг/мл приводило к повышению ингибирующей активности в среднем в 2,29 раза, у полиуронида G с молекулярной массой 24,7 кДа - в 3,4 раза, у олигоуронида Н с молекулярной массой 3,64 кДа —в 3,61 раза.

Влияние пектинов и альгинатов на токсичность циклофосфамида. Внутри-брюшинное введение мышам циклофосфамида вело к снижению содержания лейкоцитов на 3-й сутки в 1,88 раза, на 5-е сутки — в 4,31 раза и на 10-е сутки — в 2,72 раза (Р < 0,01). У мышей, которым на фоне циклофосфамида вводили полигалактуронид А в дозе 100 мг/кг массы, на 5-е сутки содержание лейкоцитов в крови было выше, чем в группе «циклофосфамид» на 128,6% (Р < 0,01). У мышей, которым на фоне циклофосфамида вводили этот же пектин в дозе 250 мг/кг массы, содержание лейкоцитов было большим на 152,3% на 5-е сутки (Р < 0,01) и на 38,8% на 10-е сутки (Р < 0,05). Альгинат натрия (335,94 кДа) в дозе 100 мг/кг массы не влиял на лейкопенический эффект циклофосфамида, но в дозе 250 мг/кг массы достоверные различия с группой мышей, которым вводили циклофосфамид, наблюдались на 3-й, 5-е и 10-е сутки. По-лиуронид G в дозе 100 мг/кг массы достоверно снижал лейкопенический эффект циклофосфамида на 10-е сутки, а в дозе 250 мг/кг — на 3-й и 10-е сутки. Также на 10-е сутки эффект циклофосфамида достоверно (Р < 0,05) снижал олигоуронид Н (3,64 кДа).

В опытах на мышах с карциномой легких Льюис при комбинированном введении олигоуронида Н и цитостатика общее количество лейкоцитов в крови мышей с карциномой на 7 сут после однократной инъекции циклофосфамида было достоверно выше, в среднем в 1,4 раз, этого показателя у животных, получавших только цитостатик, за счет большего числа сегментоядерных нейтрофилов (в 2,3 раза). При введении полиуронида в вместе с циклофосфамидом общее количество лейкоцитов у животных было большим на 3-й и 7-е сут в среднем в 2,6 и 1,3 раза (Р < 0,05), соответственно, преимущественно за счет увеличения числа сегментоядерных нейтрофилов.

Заключение. Результаты проведенной работы показали, что направление исследований, связанное с изучением фармакологии пектиновых и альгинатных олиго-сахаридов имеет перспективу в плане разработки новых лекарственных препаратов. Полученные олигогалактурониды характеризовались гомогенным составом, низкой молекулярной массой и полидисперсностью, близкой к 1. Эти данные говорят о существенной однородности данных образцов олигогалактуронидов, что значительно упрощает валидацию методов качественной оценки при создании лекарственных препаратов на их основе.

ВЫВОДЫ

1. Полидисперсность нативного высокомолекулярного пектина, выделенного из морской травы РИуНозрасОх ¡\vatensis, составляет 3,1969, диапазон молекулярно-массового распределения от 163,3 кДа до 940,4 кДа. Разработана технология получения октагалактуронида и гептагалактуронида из продуктов гидролиза пектина с низкими значениями полидисперсности, 1,1506 и 1,017, соответственно. Высокомолекулярный альгинат натрия характеризуется диапазоном молекулярно-массового распределения от 196,4 кДа до 784,2 кДа и полидисперсностью 2,5191. Кислотный гидролиз альгината натрия позволяет получить низкомолекулярные полиурониды и олигоуро-ниды со средневесовыми молекулярными массами 36,32 кДА, 24,70 кДа и 3,64 кДа и полидисперсностыо 1,2756, 1,7980 и 1,4631, соответственно.

2. Экспериментальные пектиновые олигогалактурониды со степенью полимеризации 7 и 8 и альгинатный олигоуронид со средневесовой молекулярной массой

3,64 кДа способны диффундировать через стенку тонкой кишки крыс; кажущийся коэффициент проницаемости составил 0,47%, 0,51% и 0,26% от проницаемости галак-туроновой кислоты.

3. Связывание ионов кадмия и свинца пектиновыми и альгинатными олигоса-харидами происходит в соответствии с математической моделью сорбции Лэнгмюра. Показатели максимальной кадмий-связывающей емкости октагапакгуронида и гепта-галактуронида, выделенных из морской травы Phyllospadix iwatensis, превышают таковые нативного пектина при рН 6,0 на 34,0% и 32,4%, соответственно. Максимальная свинец-связывающая емкость октагалактуронида и гептагалактуронида при рН 6,0 незначительно ниже таковой нативного полигалакгуронида, на 5,7% и 3,4%, соответственно. Коэффициент сродства октагалактуронида и гептагалактуронида к ионам свинца в 2,1 и 2,2 раза, соответственно, выше такового нативного полигалактуронида.

4. Восстанавливающая активность в условиях in vitro (метод FRAP) и ингиби-ругощая активность Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида у пектинов и альгинатов зависит от молекулярной массы, образуя следующие ряды активностей: октагалактуронид со средневесовой молекулярной массой 3,94 кДа > полигалактуроид со средневесовой молекулярной массой 112,21 кДа > по-лигалактуронид со средневесовой молекулярной массой 325,45 кДа; альгинатный олигоуронид со средневесовой молекулярной массой 3,64 кДа > альгинатный поли-уроид со средневесовой молекулярной массой 24,70 кДа > альгинат натрия с молекулярной массой 335,94 кДа.

5. Высокомолекулярные пектины и альгинаты и низкомолекулярные производные альгинатов со средневесовыми молекулярными массами 24,70 и 3,63 кДа дозоза-висимым образом ослабляют лейкопеническое действие циклофосфамида у мышей.

6. Высокомолекулярный альгинат натрия и альгинатный полиуронид со средневесовой молекулярной массой 24,70 кДа усиливают антиметастатический эффект циклофосфамида. Альгинатный полиуроид со средневесовой молекулярной массой 24,70 кДа и олигоуронид со средневесовой молекулярной массой 3,64 кДа ослабляют лейкопенический эффект циклофосфамида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах:

1. Макарова К.Е., Хожаенко Е.В., Хотимченко Р.Ю., Ковалев В.В. Сравнительная свинецсвязывающая активность пектинов с различной молекулярной массой in vitro И Тихоокеанский медицинский журнал. 2013. № 2. С. 85-88.

2. Макарова К.Е., Хожаенко Е.В., Ковалев В.В., Подкорытова Е.А., Хотимченко Р.Ю. Альгинаты с различными молекулярными массами как сорбенты ионов кадмия и свинца // Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3(6). С. 1841-1844.

3. Хожаенко Е.В., Хотимченко Р.Ю., Ковалев В.В., Подкорытова Е.А., Хотимченко М.Ю. Разработка метода стандартизации низкомолекулярных пектинов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. № 2. С. 83-87.

4. Ковалев В.В., Хотимченко Р.Ю., Подкорытова Е.А., Хожаенко Е.В. Разработка технологии быстрорастворимой формы альгината натрия // Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. № 2. С. 88-92.

5. Хотимченко Р.Ю. Фармаконутрициология некрахмальных полисахаридов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2015. № 2. С. 5—11.

6. Рыбалкина О.Ю., Ермакова H.H., Разина Т.Г., Зуева Е.П., Скурихин Е.Г., Хотимченко М.Ю., Хотимченко Р.Ю. Коррекция токсического влияния циклофосфана на гемопоэз животных с карциномой легких Льюис с помощью низкомолекулярных альгинатов натрия // Биология моря. 2015. Т. 41, № 5. С. 366-373.

7. Khotimchenko М., Kovalev V., Khozhaenko Е., Khotimchenko R. Removal of yttrium (III) ions from water solutions by alginate compounds // International Journal of Environmental Science and Technology. 2015. Vol. 12. P. 3107-3116. doi: 10.1007/sl3762-014-0737-2.

Статьи в сборниках:

8. Ковалев В.В., Хотимченко Р.Ю., Коленченко Е.А., Хотимченко Ю.С. Разработка наносистем адресной доставки лекарственных средств на основе углеводных биополимеров: оценка возможности использования микрогранул пектата кальция для системы пероральной доставки // Перспективные направления развития нанотехноло-гий в ДВО РАН, Т. 4 / Сб. статей. Владивосток: ИАПУ ДВО РАН. 2011. С. 123-132.

9. Ковалев В.В., Хотимченко Р.Ю., Коленченко Е.А., Хотимченко Ю.С. Разработка наносиетем адресной доставки лекарственных средств на основе углеводных биополимеров: разработка методов получения мембранного покрытия для перораль-ной системы адресной доставки инсулина // Перспективные направления развития на-нотехнологий в ДВО РАН, Т. 5 / Сб. статей. Владивосток: Дальнаука ДВО РАН. 2012. С. 163-171.

10. Ковалев В.В., Хотимченко Р.Ю., Хожаенко Е.В., Хотимченко Ю.С. Разработка современных систем направленной доставки лекарственных веществ на основе наноструктурированных полисахаридных носителей: оценка диффузионных свойств ионотропных гелей природных полисахаридов // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН, Т. 6 / Сб. статей. Владивосток: ИАПУ ДВО РАН, 2013.-С. 155-164.

Патент:

11. Хотимченко М.Ю., Ковалев В.В., Хотимченко Р.Ю. Способ получения быстрорастворимого альгината натрия. Патент РФ 2540946. Опубликовано: 10.02.2015 Бюл. № 4.

Материалы конференций:

12. Хожаенко Е.В., Макарова К.Е., Хотимченко Р.Ю. Пектины с разной молекулярной массой, как энтеросорбенты ионов кадмия в сравнении с лекарственными препаратами // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Республика Татарстан, г. Казань, 18-21 сентября 2012 г.). М.: Фолиум, 2012. С. 192-193.

13. Хотимченко Р.Ю., Говор В.В. Разработка технологии быстрорастворимой лекарственной формы энтеросорбента на основе альгината кальция // Тез. докл. XIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (19-20 апреля 2012 г.). Владивосток: Медицина ДВ, 2012. С. 315.

14. Шокур O.A., Макарова К.Е., Хожаенко Е.В., Хотимченко Р.Ю. Разработка метода получения низкомолекулярных пектинов // Человек и лекарство: материалы

X Дальневосточного регионального конгресса с международным участием (19-20 сентября 2013 г.) Владивосток: Изд-во «Медицина ДВ», 2013. Т. 4. С. 87-88.

15. Khotimchenko M.Y., Zueva Е.Р., Khotimchenko R.Y., Razina T.G., Kovalev V.V. Antitumor potential of the low-molecular fucoidan proven on several in vivo models // 9th International Conference of Anticancer Research. Greece, Porto Carras (06.1010.10.2014). 2014. P. 5996.

Хотимченко Родион Юрьевич

РАЗРАБОТКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕКТИНОВ И АЛЬГИНАТОВ ДЛЯ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 15.09.15 Формат 60x84/i6.

Бумага писчая. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru