Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия генов раннего ответа и генов каспаз как возможный диагностический маркер при развитии рака шейки матки

На правах рукописи

О.Ях^

Курмышкина Ольга Вадимовна

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА И ГЕНОВ КАСПАЗ КАК ВОЗМОЖНЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР ПРИ РАЗВИТИИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ

14.01.12 - Онкология 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

МАЙ 2013

005059344

005059344

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии эколого-биологического факультета, в Лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» и в ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер» Республики Карелия

Научные руководители: доктор биологических наук, доцент

Волкова Татьяна Олеговна доктор медицинских наук, доцент Бахлаев Иван Егорович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Имянитов Евгений Наумович

ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России, лаборатория молекулярной онкологии, руководитель лаборатории

доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна

ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, лаборатория гистогенеза, главный научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБУН «Институт химической биоло-

гии и фундаментальной медицины» СО РАН

Защита состоится Н ULjQhijdU 2013 года в асов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России по адресу: 197758 г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68. Тел.: (812) 456-78-98, Факс: (812) 596-89-47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России (197758 г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68).

Автореферат разослан__2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.В. Бахидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Несмотря на значительные успехи современной медицины в разработке методов профилактики, ранней диагностики и терапии злокачественных новообразований, рак шейки матки (РШМ) по-прежнему остается одной из главных причин смертности женщин от онкологических заболеваний. В течение двух последних десятилетий в России отмечается существенный прирост показателей инфицированное™ населения вирусом папилломы человека (ВПЧ) и числа заболевших РШМ, особенно среди женщин моложе 45 лет (Мерабишви-ли В.М. и соавт., 2012). Развитие скрининговых программ способствует снижению смертности от РШМ, в первую очередь, за счет увеличения частоты выявления ранних, доклинических форм рака и дисплазий. Однако используемые подходы к терапии РШМ недостаточно эффективны, и причины сложившейся ситуации связаны, в том числе, с несовершенством методов диагностики. Применяемые сегодня в клинической практике критерии диагностики РШМ имеют ряд ограничений в отношении точности постановки диагноза, возможности прогнозирования течения заболевания и не позволяют учитывать индивидуальный статус пациентки. Для преодоления этих недостатков необходимы разработка и внедрение новых методов молекулярно-генетической и биохимической диагностики, основанной на анализе изменений экспрессии тканевых биомаркеров (Имянитов E.H., 2010).

Несмотря на то, что ВПЧ-инфекция является главным этиологическим фактором РШМ, именно иммунной системе организма-хозяина принадлежит роль ключевого пермиссивного фактора, определяющего окончательный результат инфицирования (Ibeanu O.A. и соавт., 2011). В подавляющем большинстве случаев иммунная система формирует эффективный противовирусный/противоопухолевый ответ. Неспособность иммунитета элиминировать инфекцию на ранних этапах и, следовательно, повышенная вероятность развития патологии шейки матки определяются иммунным статусом организма. Поэтому анализ текущего иммунного статуса женщин с выявленными дисплазиями или ранней формой РШМ может помочь в прогнозировании индивидуального риска прогрессии заболевания и в выборе тактики лечения. Процесс восстановления иммунного статуса может также характеризовать результат и эффективность терапии. В связи с этим, изучение маркеров, всесторонне характеризующих иммунный статус пациенток с ВПЧ-инфекцией, дисплазиями или РШМ, является важнейшим этапом терапевтических мероприятий.

Таким образом, актуальность темы диссертационного исследования обусловлена необходимостью разработки комплексного подхода к ранней диагностике РШМ, основанного на прецизионных методах анализа биомаркеров, отражающих индивидуальные особенности развития опухоли и состояния иммунной системы.

Степень разработанности темы. Данные о жизненном цикле ВПЧ и молекулярных механизмах, ведущих к злокачественной трансформации клеток цервикального эпителия, интенсивно накапливаются (Moody С.А. и соавт., 2010). Также становятся известны механизмы ВПЧ-индуцируе-мой иммуносупрессии в очаге неоплазии (Jayshree R.S. и соавт., 2009). Эти сведения создают основу для поиска и изучения биомаркеров РШМ. Кроме того, проводится полногеномное профилирование РШМ по спектру хромосомных аберраций, эпигенетических изменений, изменений транс-криптома и протеома, результаты которого предлагают широкий спектр потенциальных маркерных генов и белков. Для большинства из них возможность использования в качестве диагностических маркеров еще не исследована.

Гены раннего пролиферативного ответа (с-тус, c-fos, c-juri) — это клеточные протоонкогены, экспрессия которых резко увеличивается в ответ на пролиферативные сигналы на самых ранних этапах трансформации клетки (Eferl R., Wagner E.F, 2003, Eilers M., Eisenman R.N., 2008). Установлено, что жизненный цикл ВПЧ зависит от транскрипционных факторов, кодируемых данными генами, однако систематического изучения активности генов раннего ответа при развитии РШМ не проводилось. Каспазы - центральные медиаторы и эффекторы апоптоза, отвечающие за внутриклеточное распространение апоптотического сигнала и за конечную реализацию апоптотической программы (Olsson M., Zhivotovsky В., 2011). По проблеме нарушения функций каспаз в раковых клетках накоплен большой экспериментальный материал для опухолей различных локализаций. Каспазы могут рассматриваться в качестве перспективных биомаркеров, и кроме того, они привлекательны как терапевтические мишени. Однако, ввиду полифункциональности этих ферментов, их диагностическое и терапевтическое применение требует детальных сведений об изменении их протеолитической активности в ходе развития неоплазии. При дисплазиях и раке шейки матки данный вопрос практически не разработан.

Активно исследуются иммунные отклонения, ассоциированные с развитием РШМ. Полученные данные указывают на ведущую роль Т-хелпе-ров и регуляторных Т-клеток в прогрессии заболевания. Предполагается

также, что одним из механизмов супрессорного воздействия опухоли на иммунитет является индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток (Jager R., Zwacka R.M., 2010). Данные, подтверждающие это предположение, получены для разных типов рака, однако, в случае РШМ экспресс-сия маркеров апоптоза и возможность их использования в качестве показателей иммунного статуса не исследована.

Цель работы. Исследовать изменение уровней экспрессии генов раннего ответа и генов каспаз в эпителии шейки матки и лейкоцитах крови при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки, проанализировать возможность их использования в качестве биомаркеров для диагностики данных заболеваний и оценки иммунного статуса.

Задачи исследования:

1) Изучить экспрессию генов раннего пролиферативного ответа {с-тус, c-fos, c-jun) на уровне мРНК и количества белка в клетках эпителия шейки матки больных с цервикальными интраэпителиальными не-оплазиями 3-ей степени (ЦИН 3) и РШМ I-IV стадий;

2) Изучить экспрессию генов каспаз -3,-6,-8,-9 на уровне мРНК и протеазной активности в клетках цервикального эпителия и лейкоцитах крови у больных с ЦИН 3 и РШМ;

3) Провести количественный анализ субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови (Т-хелперов, цитотоксических и регуляторных Т-кле-ток, B-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток) и оценить их предрасположенность к апоптозу при развитии и прогрессии РШМ;

4) Исследовать влияние комплексной терапии на показатели клеточного иммунитета и апоптоза пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ (стадия IA1).

Научная новизна. Проведено систематическое исследование профиля экспрессии генов раннего пролиферативного ответа с-тус, c-fos, c-jun в патологически измененных клетках шейки матки при ЦИН 3 и инва-зивном раке, в сравнении со здоровой эпителиальной тканью. Установлено соответствие транскрипционного и трансляционного уровней экспрессии данных генов. Показана гетерогенность ЦИН 3 и микрокарциномы шейки матки по содержанию мРНК генов раннего ответа, которая может отражать нелинейный характер зависимости их экспрессии от стадии заболевания и являться характеристикой молекулярно-генетического профиля («портрета») опухоли, на основании которой возможна дальнейшая разработка дополнительных критериев молекулярной диагностики дисплазий и ранних форм РШМ. Выявлена специфическая активация генов c-fos и с-тус, сопровождающаяся подавлением гена c-jun, при раз-

витии и прогрессии РШМ. Впервые изучена активность апоптотических процессов и степень их подавления в опухолевых клетках цервикального эпителия на основании уровня экспрессии ключевых медиаторов апопто-за - инициаторных каспаз (-8, -9) и эффекторных каспаз (-3, -6). Установлено, что начальные этапы развития РШМ могут сопровождаться активизацией апоптоза.

Впервые для ЦИН 3 и рака шейки матки получены доказательства индукции апоптоза иммунокомпетентных клеток крови, продемонстрировано дифференциальное распределение активности каспаз по мере прогрессии заболевания, выявлена ведущая роль «внешнего» пути передачи апоптотического сигнала. Проведен комплексный анализ иммунного статуса пациенток изучаемых групп с использованием показателей клеточного иммунитета и уровня апоптоза иммунных клеток крови.

Впервые исследовано влияние иммуномодулирующей терапии (препаратом Аллокин-альфа) на показатели иммунного статуса пациенток с ЦИН 3 и РШМ 1А стадии, выявлено специфическое действие препарата, направленное на нормализацию численности регуляторных Т-клеток, натуральных киллеров и В-лимфоцитов, получены данные об изменении экспрессии каспаз в лейкоцитах крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования расширяют представления о роли протоонкогенных транскрипционных факторов с-Мус, с-Роэ и с-Лт в ВПЧ-индуцированном канцерогенезе на разных этапах естественного развития РШМ. Полученные данные также вносят вклад в понимание механизмов формирования резистентности клеток РШМ к проапоптотическим сигналам и, как следствие, их высокой злокачественности. Результаты работы подкрепляют гипотезу о существовании опухолевой «контратаки» (т.е. индукции клетками опухоли апоптоза иммунных клеток при одновременном формировании собственной устойчивости к цитотоксическим сигналам) и дополняют сведения о роли иммунной системы в патогенезе РШМ. По результатам исследования выявлены вероятные клеточные мишени действия аллоферонов и, таким образом, созданы предпосылки для более глубокого изучения молекулярного механизма действия этой группы биологически активных пептидов. Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, могут являться основой для последующей разработки диагностических тест-систем, направленных на повышение специфичности, объективности и точности критериев диагностики интраэпителиальных неоплазий и ранних стадий рака шейки матки. Гены раннего ответа (с-тус, с^оэ, с-рт) и каспаз могут быть использова-

ны в качестве биомаркеров, характеризующих степень смещения баланса между процессами пролиферации и апоптоза, в составе данных тест-систем наравне с маркерами ангиогенеза, инвазии и другими. Изученные параметры иммунного статуса могут быть использованы для долгосрочного наблюдения пациенток после курса лечения в комплексе со стандартным клиническим обследованием, тестом на ВПЧ и цитологическим исследованием.

Положения, выносимые на защиту:

1. Различные этапы развития РШМ (ЦИН 3, микроинвазивный и инва-зивный рак) характеризуются специфичным паттерном экспрессии генов раннего пролиферативного ответа (с-тус, c-fos, c-jurí).

2. При прогрессии РШМ увеличивается степень подавления активности каспаз; опухолевые клетки приобретают апоптоз-резистентный фенотип.

3. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия 3-ей степени и микроинвазивный РШМ ассоциированы с множественными нарушениями иммунного статуса, которые усиливаются при прогрессии опухоли.

4. Развитие и дальнейшая прогрессия РШМ сопровождаются активацией СБ95-зависимого пути апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови.

Степень достоверности и апробация результатов. Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном научном семинаре Лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета Петрозаводского государственного университета (ПетрГУ) и кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ 26 ноября 2012 года.

Основные положения диссертации были представлены и обсуждены на международных и всероссийских конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2012» (результаты отмечены дипломом I степени в секции «Фундаментальная медицина/Клинические исследования» в 2012 году) (Москва, 2010, 2012); III и IV Всероссийская научно-практическая конференция «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010, 2011); Мая и 15ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 го века» (Москва, 2010, 2011); VII Международная конференция по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010) (Новосибирск, 2010); XVI Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (Санкг-Пе-тербург, 2010); XII и XIII Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2011, 2012); V Всероссийский Симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); II Международная научная интернет-конференция «Актуальные проблемы

биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011); II Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск,

2011); III Съезд физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Ялта, 2011); I Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цито-скелет» (Санкт-Петербург, 2011); XI Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011); I Международная научная интернет-конференция «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012); Всероссийский конгресс с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья» (Москва, 2012, 2013); II Всероссийская научная конференция молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург,

2012); Международный конгресс «The 14th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society» (Vancouver, Canada, 2012); Международный конгресс «The 28th Congress of the new European Society for Comparative Physiology and Biochemistry ESCPB» (Bilbao, Spain, 2012); II Международный научно-образовательный форум «Хирургия и онкология - 2012» (Санкт-Петербург, 2012).

По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ. На основании результатов исследования подана заявка в Роспатент на изобретение «Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки» (№ 2012157453 от 26.12.2012 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источника, из них 196 зарубежных и 7 отечественных, приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 18 рисунками.

Конкурсная поддержка и благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям д.б.н. Волковой Т.О. и д.м.н. Бахлаеву И.Е. за всестороннюю помощь в подготовке диссертационной работы, а также к.м.н., доц. кафедры лучевой диагностики и лучевой терапии, онкологии, урологии и фтизиатрии ПетрГУ Ковчуру П.И., к.б.н., с.н.с. лаборатории генетики Института биологии КарНЦ РАН Топчиевой JI.B. и к.б.н., с.н.с. Коломейчуку С.Н., к.б.н., с.н.с. лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН Лысенко Л.А., директору Института биологии КарНЦ РАН, заведующей кафедрой молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, д.б.н., проф., чл.-корр. РАН Немовой H.H.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы ткани и периферической крови были получены от 156 пациенток, оперированных в ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер» Республики Карелия в 2010-2012 гг. Обследовано 75 женшин с ЦИН 3 и 81 - с плоскоклеточным РШМ, в том числе 45 - со стадией IA, 21 - стадией II, 15 - стадиями III-IV. Стадирование РШМ проводилось в соответствии с классификациями TNM и FIGO. Всем вошедшим в исследование больным перед операцией проводилась расширенная кольпоскопия. От каждой пациентки в ходе проведения операции диатермоконизации или тотальной гистерэктомии были получены фрагменты ткани патологической зоны и морфологически здорового эпителия («контроль»), У всех больных первоначальный диагноз был верифицирован путем гистологического исследования. Непосредственно перед операцией производился забор венозной крови для выделения фракции мононуклеарных клеток (МНПК). Также кровь была взята у 45 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту, данным анамнеза и не имеющих патологии шейки матки и ВПЧ-инфекции (контрольная группа №1).

У пациенток с ЦИН 3 и РШМ IA стадии осуществлялся повторный забор крови и исследование иммунологических показателей через 1 и 3 мес. после операции диатермоконизации и лечения препаратом Аллокин-альфа. Препарат вводился подкожно в дозе 1 мг 6 раз в течение двух недель. Контрольную группу №2 составили пациентки с ЦИН 3 (п=15) и РШМ (п=15) стадии IA, получившие только хирургическое лечение. По анамнезу, данным вирусологического и гистологического исследований рассматриваемые группы не различались.

Уровень экспрессии мРНК генов раннего ответа и генов каспаз в ткани шейки матки или МНПК определяли методом ПЦР в «режиме реального времени». Нативность препаратов РНК определяли методом капиллярного электрофореза на микрочипах RNA StdSens с помощью автоматической станции Experion {«Bio-Rad», США). Эффективность амплификации при текущих условиях эксперимента определяли по графику зависимости порогового цикла от концентрации матрицы. Порядок изменения уровня экспрессии изучаемого гена в образце опухолевой ткани относительно уровня его экспрессии в образце здоровой ткани, полученных от одной и той же пациентки, оценивали с помощью величины A=lg2ct<':ol"ro')"c'("lmor). Результаты ПЦР нормализовали по массе суммарной фракции РНК. Анализ относительного уровня экспрессии мРНК генов каспаз в МНПК проводили с использованием gapdh в качестве референсного гена по методу AACt.

Уровень экспрессии белков с-Мус, c-Fos и c-Jun анализировали методом Western-блоттинга с хемилюминесцентной детекцией. В работе были использованы препараты моноклональных антител: c-Jun (G-4):sc-74543, c-Fos (D-l):sc-8047, c-Myc (9E10):sc-40 («SantaCniz», США).

Определение активности каспаз проводили спектрофлуориметрическим методом с использованием специфических субстратов, меченных 7-амино-4-трифторме-

тилкумарином («BioRad'», США). Субстрат для каспазы-3 - DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), для каспазы-6 - VEID (Val-Glu-Ile-Asp), для каспазы-8 - LETD (Leu-Glu-Thr-Asp), для каспазы-9 - LEHD (Leu-Glii-His-Asp). Относительную активность каспаз вычисляли как AS/At, где AS - изменение интенсивности флуоресценции (оптической плотности) (отн. ед.) за промежуток времени At (мин). Полученную величину умножали на 104.

Иммунофенотипирование МНПК осуществляли с помощью моноклональ-ных антител, специфичных к дифференцировочным антигенам (CD3, CD4, CD8, CD 16, CD20, CD25, CD95) {«Sigma», США). Полученные препараты анализировали методом флуоресцентной микроскопии (Nikon ECLIPSE TS100, Япония).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы StatGraphics Plus 2.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Экспрессия генов раннего ответа в ткани при ЦИН 3 и РШМ

Увеличение уровня экспрессии мРНК гена c-fos наблюдалось в 50% образцов ткани ЦИН 3 и 100% образцов микроинвазивного РШМ относительно образцов нормального эпителия, полученных от тех же пациенток (Рис.1). При РШМ II-IV стадий изменение относительного содержания с-^сю-транскриптов было наиболее значительным, по сравнению с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ. В отличие от c-fos, индукция экспрессии мРНК гена с-тус наблюдалась только в 50% случаев РШМ IA-IV стадий; для 45% образцов РШМ IA стадии отмечается тенденция к незначительному подавлению экспрессии с-тус. В большинстве образцов ЦИН 3 отсутствовали изменения уровня с-тус-мРНК в сравнении с соответствующими участками нормального эпителия. Для гена c-jun, также как и для с-тус и c-fos, может наблюдаться активация экспрессии мРНК при ЦИН 3 и РШМ I-IV стадий, но в значительно меньшей степени. Для образцов пре-инвазивного рака и более 60% случаев микроинвазивного РШМ показана более выраженная тенденция к ингибированию экспрессии c-jun относительно нормального эпителия.

H

s \

c-FOS

c-MYC

1

ЦИН 3

РШМ1А РШММ-IV

c-JUN

30% *

* 55» __

ЦИНЗ

РШМ1А стадии

РШМИ-IV стадий

■

ЦИНЗ

РШМ IA стадии

РШМ II-IV стадий

Рисунок 1. Изменение относительного уровня экспрессии мРНК (Д) генов c-fos, с-тус и с-jun при ЦИН 3 (п=29) и РШМ стадий IA (n=15), II-IV (п=12). На гистограммах приведены средние значения и значения стандартных ошибок [М(Д)±т(Л)]. Символом "*" обозначены достоверные различия между значениями пороговых циклов, полученными для образцов патологического и соответствующего нормального эпителия. Результаты считали достоверными при р<0,05 (тест Уилкоксона-Манна-Уитни). В процентах указана доля пациенток в группе с наблюдаемыми изменениями.

Результаты блот-анализа относительного содержания c-Fos, с-Мус и c-Jun при тяжелой дисплазии, преинвазивном и микроинвазивном РШМ (Рис.2) в целом подтверждают результаты оценки экспрессии соответствующих мРНК. Наиболее заметное увеличение количества c-Fos относительно «контроля» наблюдалось при РШМ IA стадии, что подтверждает важную роль данного фактора в регуляции процесса инвазии (Eferl R., Wagner E.F, 2003). Аналогичная закономерность выявлена для с-Мус. Для образцов ЦИН 3 получены различные варианты изменения экспрессии: слабое или умеренное, в сравнении с РШМ IA стадии, увеличение -для c-Fos, отсутствие изменений или заметное увеличение - для с-Мус, что согласуется с данными ПЦР-анализа. Активация экспрессии данных факторов при ЦИН 3 может отражать их участие в процессах ВПЧ-инду-цированной злокачественной трансформации. В отношении уровня экспрессии c-Jun различий между нормой, ЦИН 3 и РШМ IA стадии не наблюдалось.

~1ГТ~1

c-Fos

с-Мус

c-Jun

Рисунок 2. \\'е51еп1-блот-анализ экспрессии с-Боз, с-Мус и с-1ип при ЦИН 3 / РШМ («б») и в нормальном эпителии шейки матки («н»).

цинз ^ В случае РШМ II-III стадий продук-

ты экспрессии генов c-fos и с-тус с ожидаемой молекулярной массой не были выявлены, что может быть связано с интенсивной деградацией данных факторов, ассоциированной с повышением их экспрессии (Jurado J., 2007). В образцах РШМ II стадии при окрашивании антителами anti-c-Myc были визуализированы белковые полосы с меньшей молекулярной массой, мигрирующие на уровне 40-45 кДа. Возможно, они соответствуют низкомолекулярной изоформе c-MycS, лишенной около 100 аминокислотных остатков с N-конца (Spotts G.D., 1997). Установлено, что «переключение» на экспрессию данной изоформы может быть сопряжено с фазой активного роста опухоли.

Таким образом, в работе были выявлены следующие общие закономерности: а) гены, принадлежащие разным семействам транскрипционных факторов (MYC, FOS, JUN), характеризуются индивидуальным профилем экспрессии на протяжении прогрессии РШМ, б) среди нарушений, морфологически объединяемых в группу ЦИН 3, возможна дифференциация по уровню экспрессии генов раннего ответа. Понимание биологического и клинического смысла выявленных закономерностей требует более глубоких исследований, тем не менее, полученные данные дают основания рассматривать гены раннего пролиферативного ответа как потенциальные биомаркеры для диагностики ранних форм РШМ.

2. Экспрессия генов касиаз -3, -6 и -9 в ткани при ЦИН 3 и РШМ

Прогрессия опухоли есть результат нарушения естественного баланса между процессами пролиферации и клеточной гибели (апоптоза). Разнообразные механизмы формирования устойчивости опухолевых клеток к апоптотическим факторам направлены, в конечном счете, на подавление активности каспаз. В связи с этим, в рамках диссертационной работы была сделана попытка оценить степень нарушения апоптотической программы (и формирование апоптоз-резистентного фенотипа) при развитии РШМ через определение экспрессии каспаз -3, -6 и -9 на уровне протеолитической активности и содержания соответствующих мРНК.

В группе ЦИН 3 в значительном количестве случаев наблюдалось увеличение активности эффекторных каспаз -3 и -6 по сравнению с уровнем контроля (Рис.3). При РШМ 1А стадии наблюдается снижение активности всех исследуемых каспаз; данная тенденция сохраняется при дальнейшей прогрессии РШМ (стадии И-1У). В 6 (из 26) образцах РШМ 1А стадии активность каспазы-6 оставалась значительно повышенной. Степень подавления активности каспаз-3 и -9 достоверно коррелировала со стадией заболевания в ряду ЦИН 3 —» РШМ 1А-1У стадий.

каспаза-3

р-101

Ло

I-1 8 8

о г о ----------- , |

¡5 0О 8 р=0,0003 §

т тт 1-1

р»0,0010

р=0,0005

____£

¡и Т 4 А | ж.....:

контроль ЦИНЗ РШМ1А РШМ II РШМ 111-1У стадии стадии стадий

контроль ЦИНЗ РШМ1А РШМ II РШМ 111-1V стадии стадии стадий

*Р*0,001г тч т.

. | | Рисунок 3. Изменение относительной актив-

сх&ео р=0,0009 ^

' 1 ности каспаз -3, -б и -9 в клетках цервикальио-

го эпителия при развитии РШМ. Пунктирны-003 ми линиями (здесь и далее) обозначены стан-

р.0.0003

| | дартные отклонения для группы контроля, жир__________„____________________ными линиями - медианное значение активно- -- - ------------------сти в группе; п = 30 (морфологически нормаль-

"цр" * ный эпителий, «контроль»), п=44 (ЦИН 3), п=24

"Т" (РШМ 1А стадии), п=20 (РШМ II ст.), п=6

контроль цинз ршм|д ршм ii ршм (РШМ ПЫУ ст.). Символом «*» маркированы

стадии стадии стадий шпшх

группы (РШМ), в которых активность каспаз достоверно отличается от контроля (р<0,05). На диаграммах приведены значения р, полученные при сравнении последовательных стадий развития РШМ.

Сравнение результатов ПЦР-анализа и определения энзиматической активности каспаз позволяет предположить относительную автономию между механизмами транскрипционной и посттрансляционной регуляции экспрессии этих ферментов при развитии РШМ, т.к. в большинстве образцов ЦИН 3 и РШМ регистрировался контрольный уровень мРНК каспаз или его увеличение (на фоне общего снижения протеазной активности). Полученные данные указывают на то, что прогрессия РШМ со-

провождается многосторонними нарушениями апоптотических процессов, которые реализуются в глобальном подавлении функционирования кас-паз и множественной резистентности опухолевых клеток к апоптотиче-ским стимулам.

3. Иммунофенотипирование МНПК больных ЦИН 3 и РШМ

Согласно полученным результатам, прогрессия РШМ сопровождается снижением численности СБЗ(+) Т-лимфоцитов (г= -0,69; Я2=0,48; р<0,01), С04(+) Т- хелперов (г= -0,85; Я2=0,73; р<0,01) и СЭ8(+) цитоток-сических Т-лимфоцитов (г= -0,59; Я2=0,35; р<0,01) и увеличением количества СВ4(+)СБ25(+) регуляторных Т-клеток (г= 0,71; Я2=0,50; р<0,01) (Рис.4).

Изменение численности С016(+) натуральных киллеров (НК) и СБ20(+) В-клеток при прогрессии ЦИН 3—>РШМ 1-1У не может быть описано линейной зависимостью. Содержание циркулирующих НК- и В-клеток достоверно увеличивалось в ряду ЦИН 3—>РШМ 1А стадии относительно контрольных значений; стадии П-ГУ были отмечены снижением численности данных клеток.

CDS CD8

Рисунок 4. Иммунограммы изменений параметров иммунного статуса больных ЦИН 3 и РШМ. Изменение относительного содержания CD-позитивных клеток выражены в процентах от нормы. Ly - изменение общей численности лимфоцитов в % от нормы.

Также было проанализировано изменение мембранной экспрессии фенотипического маркера CD95, представляющего собой FasL-регулируе-мый рецептор смерти, с целью оценить развитие предрасположенности периферических лимфоцитов к апоптозу при прогрессии РШМ (Рис.4).

Как видно из иммунограмм, численность популяции С095(+)-лимфо-цитов существенно увеличивалась по мере увеличения стадии заболевания (г= 0,91; R2=0,82; р<0,01).

4. Экспрессия каспаз в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ

Согласно результатам иммунофенотипирования, по мере прогрессии РШМ происходит повышение мембранной экспрессии Fas-рецептора в МНПК-фракции. В связи с этим было решено проверить, сопровождается ли наблюдаемое изменение фенотипа циркулирующих лимфоцитов внутриклеточной активацией процессов, ассоциированных с апоптозом. В качестве показателя интенсивности апоптоз-ассоциированных процессов мы исследовали уровень протеолитической активности рецептор-регулируемой каспазы -8, эффекторных каспаз -3 и -6, и каспазы-9, инициирующей «внутренний» путь апоптоза, в МНПК больных ЦИН 3, РШМ и группы контроля (Рис.5).

По мере увеличения стадии РШМ наблюдалось достоверное увеличение активности каспазы-8 в МНПК (r=0,92; R2=0,86; р<0,01), в то время как при ЦИН 3 в 50% случаев уровень активности не отличался от контроля. Схожая закономерность наблюдалась для каспазы-6 (i=0,77; R =0,59; р<0,01). Взаимосвязь между активностью каспазы-3 и стадией заболевания не является линейной: в ряду ЦИН 3 —> РШМ IA стадии активность повышалась, а при РШМ II—»IV стадий постепенно снижалась до контрольных значений. При всех исследуемых стадиях развития РШМ в определенном проценте случаев активность каспазы-3 не отличалась от контроля. В отличие от каспаз -8, -3 и -6, активность каспазы-9 при прогрессии РШМ снижается относительно группы контроля (г= -0,60; R2=0,36; р<0,01). Далее мы проверили, распространяются ли наблюдаемые изменения протеолитической активности каспаз -3, -6 и -9 на транскрипционный уровень их экспрессии. Изменение относительного содержания мРНК каспа-зы-3 при увеличении стадии заболевания имеет тот же характер, что и изменение ее активности: увеличение - в ряду ЦИН 3 —» РШМ IA-II стадий и снижение до контрольных значений - при РШМ III-IV стадий. Для каспазы-6 наблюдается тенденция к повышению уровня экспрессии мРНК при развитии инвазивного РШМ, однако, регистрируемые изменения значительно менее выражены по сравнению с увеличением активности. Для относительного уровня мРНК каспазы-9 корреляция со стадией заболевания не была выявлена.

контроль ЦИНЗ РШМ1А РШМII РШМ Н1-1У контроль ЦИНЗ РШМ 1А РШМ II РШМ1П-1У

стадии стадии стадии стадии стадии стадии

Рисунок 5. Изменение относительной активности каспаз -8, -3, -6 и -9 в МНПК при развитии РШМ; п = 30 (группа контроля), п=53 (ЦИН 3), п=30 (РШМ стЛА), п =21 (РШМ ст. II), п=14 (РШМ ст.ПЫУ). Символом «*» маркированы группы, в которых активность каспаз достоверно отличается от контроля. На диаграммах приведены значения р, полученные при сравнении последовательных стадий РШМ (тест Уилкокосона-Манна-Уитни).

Суммируя полученные данные, можно заключить, что развитие РШМ ассоциировано с разнонаправленными изменениями профиля экспрессии инициаторных и эффекторных каспаз в лимфоцитах периферической крови больных - усилением экспрессии каспаз -3,-6,-8, вовлеченных в данном случае во «внешний» путь апоптоза, и снижением уровня экспрессии каспазы-9 «внутреннего» пути. Наиболее выраженные и закономерные изменения экспрессии выявлены на уровне протеолитической активности каспаз, в сравнении с содержанием соответствующих мРНК. В совокупности, усиление экспрессии СБ95 и активности каспаз-8, -3, -6 в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ указывает на повышение их чувствительности к РаБ-индуцированному апоптозу, что может являться одним их способов противодействия опухоли реакциям иммунитета.

5. Влияние иммуномодулирующей терапии на показатели клеточного иммунитета больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ

Выбранные нами молекулярные маркеры (CD-антигены, каспазы) позволили выявить изменения как состава, так и функционального состояния лимфоцитов периферической крови при развитии РШМ. Далее, используя данный спектр иммуномаркеров, была сделана попытка оценить процесс восстановления иммунного статуса больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ в постоперационный период при использовании препарата иммуномодулирующего действия Аллокина-альфа.

В течение 3-х месяцев после лечения в крови пациенток с ЦИН 3 (Рис.6) и РШМ IA стадии отмечается увеличение численности CD4(+)-клеток и уменьшение числа С04(+)СЮ25(+)-лимфоцитов; при этом в группе пациенток, получавших препарат, в отличие от пациенток контрольной группы №2, через 3 месяца происходит восстановление данных показателей до значений, определяемых в группе здоровых (контроль №1). В отношении CD8(+) ЦТЛ также выявлена тенденция к нормализации численности после лечения, однако, закономерные различия между группами пациенток, получавших и не получавших препарат, на данном этапе работы не обнаружены. Достовер-Lv нос изменение количества CDI6(+) и

aso:-

CD95 С020(+)-лимфоцитов в периферической

................. ^ крови больных с ЦИН 3 и РШМ 1А

стадии наблюдалось именно на фоне иммуномодулирующей терапии, по сравнению с контрольной группой больных. В МНПК-фракции пациенток с ЦИН 3 и РШМ IA стадии, не получавших препарат, в течение 3-х месяцев экспрессия С095-маркера практически не изменяет-со8 ся, в то время как прохождение курса

, т, „ иммуномодулирующей терапии сопря-

Риеунок 6. Иммунограмма изменении параметров иммунного статуса больных жен0 со значимым уменьшением коли-ЦИН 3 до лечения (точечная линия) и че- ЧеСТВа СО95-П03ИТИВНЫХ ЛИМфоЦИТОВ. рез 3 месяца после хирургического (пунктирная линия) или комплексного лечения (сплошная линия). Изменение относительного содержания CD-позитивных клеток выражены в процентах от нормы (принятой за 100%).

1 к> (И/ и *Д\- _L ......: г пд

V. \ VA Ч у ■ -А

CD16 CD4CD2S

6. Экспрессия каспаз в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ 1А стадии после курса терапии Аллокином-альфа

Опираясь на полученные данные о постепенной нормализации количества циркулирующих С095-позитивных лимфоцитов в постоперационный период на фоне приема Аллокина-альфа, было принято решение проверить, может ли данное изменение сопровождаться нормализацией уровня экспрессии каспаз.

Процесс нормализации активности каспаз после этапа лечения был наиболее выраженным в случае каспазы-8 (Рис.7): в группах ЦИН 3 и РШМ 1А стадии активность снижалась до уровня контроля через 1 и 3 месяца, соответственно. В группе РШМ 1А стадии после лечения в большинстве про-

Я г

Л

* «*85%

анализированных случаев активность каспазы-6 также не отличается от контроля, однако, в отличие от каспазы-8, в группе ЦИН 3 наблюдалось повышение активности. Профиль активности каспа-зы-3 в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ 1А стадии после курса лечения в целом сохраняется таким же, как и в соответствующих группах до лечения. После терапии в МНПК обследованных групп больных регистрируется контрольный уровень активности каспазы-9 или его повышение. Закономерных изменений содержания мРНК каспаз -3, -6 и -9, в отличие от уровня протеолитической активности, в МНПК пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ после курса иммуномодулирующей терапии выявлено не было. Полученные результаты указывают на то, что по прохождении курса лечения действительно может наблюдаться восстановление нормального уровня активности каспаз в циркулирующих лимфоцитах больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ, причем наибольший вклад терапии прослеживается в отношении инициаторных каспаз -8 и -9. В совокупности с наблюдаемым восстановлением уровня экспрессии СБ95, эти данные подтверждают вклад апоп-тотических процесов в нарушение иммунного статуса при развитии РШМ.

Рисунок 7. Изменение относительной активности каспазы-8 в МНПК пациенток с ЦИН 3 и РШМ 1А стадии до и после лечения. * -достоверное отличие от контроля, ** - достоверное отличие от соответствующей группы до лечения (р<0,01).

ВЫВОДЫ

1. Цервикальная интраэпителиальная неоплазия 3-ей степени, микроинвазив-ный и инвазивный РШМ характеризуются специфичным паттерном активности генов раннего пролиферативного ответа с-тус, с-/о$, с-]ип. При ЦИН 3 выявлена активация экспрессии мРНК с^/ог (в 50% случаев) и с-тус/с-]ип (в 30% случаев). Прогрессия инвазивного РШМ (стадии 1А—»IV) ассоциирована с усилением экспрессии мРНК с-/о5 (100%) и с-тус (50% случаев), но не с-]ип. Наиболее существенное увеличение содержания белков с-Роя и с-Мус наблюдается при микроинвазивном РШМ, в то время для с-.Тип характерен относительно постоянный уровень экспрессии на протяжении развития РШМ, сравнимый с таковым в нормальной эпителиальной ткани.

2. Прогрессия РШМ сопряжена с постепенным подавлением протеолитической активности инициаторной каспазы-9 и эффекторных каспаз -3 и -6 в опухолевых клетках, в то время как при ЦИН 3 может наблюдаться значительное повышение активности каспаз-3 и -6 относительно нормального эпителия. Уровень экспрессии мРНК каспаз -3, -6 и -9 в клетках ЦИН 3 и РШМ соответствует таковому в клетках нормального цервикального эпителия или увеличивается.

3. Развитие РШМ сопровождается снижением общей численности циркулирующих Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток и увеличением количества регуляторных Т-лимфоцитов. Содержание натуральных киллеров и В-лимфоцитов увеличивается относительно контрольных значений в ряду ЦИН 3 —> РШМ 1А стадии и уменьшается (до уровня контроля или ниже) в ряду РШМ II —> IV стадий. Достоверные отклонения изученных показателей иммунного статуса пациенток от контрольных значений фиксируются на ранних этапах индукции и развития РШМ - при ЦИН 3 и преинва-зивном РШМ.

4. Развитие РШМ ассоциировано с увеличением экспрессии различных компонентов «внешнего» сигнального пути апоптоза в МНПК периферической крови больных, а именно с повышением мембранной экспресии Рая-рецептора, усилением активности Раэ-регулируемой инициаторной каспазы-8 и эффекторных каспаз -3 и -6.

5. После прохождения курса лечения (стандартного/комплексного) у пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ наблюдается нормализация численности анализируемых субпопуляций МНПК и уровня активности каспаз. Применение иммуномодулирующей терапии способствует более быстрому восстановлению количества регуляторных Т-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток и В-лимфоцитов в периферической крови больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ.

6. Результаты анализа экспрессии генов раннего ответа (в частности, с-уЬз) и активности каспаз -3,-6,-9 в опухолевой ткани и каспаз -3,-6,-8 в МНПК позволяют рассматривать данные гены как перспективные биомаркеры при комплексной диагностике ЦИН 3 и ранних форм РШМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Курмышкина, О.В. Нанокомпозит на основе кристаллов кремния и фуллереновой фазы - новый фотосенсибилизатор с выраженным цитостатическим эффектом на опухолевые клетки / О.В. Курмышкина II Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». — Москва. -2010.-С.62.

2. Курмышкина, О.В. Апоптоз-индуцирующее действие производных N-оксида хино-лина на опухолевые клетки / О.В. Курмышкина, У.С. Багина // Материалы 14ой Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». Секция «Физиология животных и биомедицина». — Пущино. — 2010. - Т. 1. - С. 150-151.

3. Volkova, Т.О. Cellular caspases: new targets for the action of pharmacological agents / Т.О. Volkova, О. V. Kurmyshkina, N.N. Nemova // Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Systems of Biology (BGRS/SB-2010). -Novosibirsk. - 2010.

4. Волкова, Т.О. Цитостатический и апоптоз-индуцирующий эффекты нанокомпозитов на основе кристаллов кремния и фуллереновой фазы на опухолевые клетки HT-1080 / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, H.H. Немова // Цитология. — 2010. — Т.52. — №8. — С.650.

5. Волкова, Т.О. Функциональное перераспределение активностей каспаз в опухолевых клетках при обработке индукторами дифференцировки / Т.О. Волкова, И.Е. Малышева, О.В. Курмышкина, H.H. Немова // Цитология. — 2010. — Т.52. — №8. — С.651.

6. Волкова, Т.О. Оценка антипролиферативного и апоптоз-индуцирующего эффектов производных N-оксида хинолина на опухолевые клетки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, У.С. Багина, H.H. Немова // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». — Москва. — 2010. — С.27.

7. Курмышкина, О.В. Стирильные производные N-оксида хинолина - новая группа перспективных антиопухолевых агентов / О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова // Медицинский академический журнал. — 2010. — Т.10. — №5. — С.211-212.

8. Курмышкина, О.В. Гены раннего ответа в патогенезе рака шейки матки: обзор I О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Опухоли женской репродуктивной системы (маммология/онкогинекология). — 2011.- №1, —С.96-105.

9. Курмышкина, О.В. Иммунный ответ организма при индукции и прогрессии рака шейки матки - возможные механизмы / О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Опухоли женской репродуктивной системы (маммология/онкогинекология). — 2011. — №3. — С.65-70.

10. Багина, У.С. Апоптоз-индуцирующее действие комбинаций системных кортикосте-роидов с цитозинарабинозидом на опухолевые клетки / У.С. Багина, О.В. Курмышкина II Материалы 15ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». Секция «Физиология животных и биомедицина». — Пущино. — 2011. — С.190-191.

11. Волкова, Т.О. Экспрессия каспаз в опухолевых клетках человека при обработке комбинациями цитостатиков с системными кортикостероидами / Т.О. Волкова, У.С. Багина, О.В. Курмышкина, H.H. Немова // Материалы V Всероссийского Симпозиума «Белки и пептиды». — Петрозаводск. — 2011. — С.239.

12. Волкова, Т.О. Оценка фенотипических изменений и активности апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с дисплазиями и раком шейки матки / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Мате-

риалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». — Москва. — 2011. —С.24-25.

13. Волкова, Т.О. Показатели клеточного иммунитета и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с тяжелыми дисплазиями и раком шейки матки / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Аллергология и иммунология . — 2011. — Т.12. — №3. — С.283-284.

14. Волкова, Т.О. Экспрессия каспаз в лимфоцитах периферической крови и опухолевой ткани при индукции и прогрессии рака шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Материалы III Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». — Ялта. — 2011. — С.205-206.

15. Волкова, Т.О. Индукция апоптоза лимфоцитов периферической крови при развитии рака шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, У.С. Багина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Цитология. - 2011. - Т.53. - №9. - С.696-697.

16. Волкова, Т.О. Экспрессия генов раннего пролиферативного ответа в опухолевой ткани больных раком шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Цитология. - 2011. - Т.53. - №9. - С.697.

17. Волкова, Т.О. Экспрессия CD95 и каспаз в лимфоцитах периферической крови и опухолях женской репродуктивной системы (на примере рака шейки матки) / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, У.С. Багина, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Российский аллергологический журнал. — 2011. — №4(Вып.1). — С.71-72.

18. Волкова, Т.О. Экспрессия генов раннего ответа в опухолевой ткани — важный диагностический маркер при развитии рака шейки матки / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика». — Новосибирск. - 2011,-С.41.

19. Ковчур, П.И. Влияние иммуномодулирующей терапии на показатели клеточного иммунитета и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с интраэпителиальными неоплазиями и микроинвазивным раком шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва. — 2011. — С.322-323.

20. Ковчур, П.И. Показатели клеточного иммунитета и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с интраэпителиальными неоплазиями и микроинвазивным раком шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, H.H. Немова // Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва. — 2011. — С.323-324.

21. Курмышкина, О.В. Экспрессия каспаз в лейкоцитах периферической крови и опухолевой ткани у больных раком шейки матки / О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, H.H. Немова // Материалы II Международной научной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». — Казань. -2011. - С.169-171.

22. Бахлаев, И.Е. Рак шейки матки в Карелии / И.Е. Бахлаев, П.И. Ковчур, A.A. Михстько, О.В. Курмышкина, С.Е. Нильва // Вестник РОНЦ им. H.H. Бло-хина РАМН. - 2011. - JV«1. - С.22-28.

23. Волкова, Т.О. Клеточный иммунитет и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови при интраэпителиальнон иеоплазии и микроинвазивном

раке шейки матки. Иммуномодулирующая терапия / Т.О. Волкова, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, А.Н. Полторак // Российский аллерголо-гический журнал. — 2012. — №1(Вып.1). — С.77-78.

24. Ковчур, П.И. Экспрессия генов раннего ответа при развитии цервикальных интра-эпителиальных неоплазий и рака шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья». — Москва. — 2012. — С.242-243.

25. Ковчур, П.И. Экспрессия каспаз в лейкоцитах периферической крови и опухолевой ткани у больных с интраэпителиальными неоплазиями и раком шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика — в эпицентре женского здоровья». — Москва. — 2012. — С.243-245.

26. Ковчур, П.И. Использование экспрессии генов раннего ответа в опухолевой ткани как маркера развития рака шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Онкохирургия. — 2012. — Т.4. — №2, Приложение. — С. 16.

27. Ковчур, П.И. Экспрессия каспаз в лейкоцитах периферической крови и опухолевой ткани у больных с интраэпителиальными неоплазиями и раком шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Онкохирургия. — 2012. — Т.4. —№2, Приложение. — С.16.

28. Ковчур, П.И. Влияние иммунотерапии на клеточный иммунитет и активность апоп-тоза лимфоцитов периферической крови у больных с пре- и микроинвазивным раком шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Онкохирургия. — 2012. — Т.4. — №2, Приложение. — С.18.

29. Волкова, Т.О. Системные колебания численности CD16+ клеток при интраэпи-телиальных неоплазиях и микроинвазивном раке шейки матки до и после лечения аллокином / Т.О. Волкова, П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, И.Е. Бахлаев, А.Н. Полторак // Российский аллергологический журнал. — 2012. — №5(Вып.1). — С.51-52.

30. Kurmyshkina, О. V. The level of caspase expression as indicator of systemic immune stress resulted from HPV-induced cervical cancer development / O.V. Kurmyshkina, P.I. Kovchur, I.E. Bahlaev, Т.О. Volkova, A.N. Poltorak // Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular and Integrative Physiology (CBA). — 2012. — Vol.l63A. — №1 (suppl.). — P.40-41.

31. Kurmyshkina, О. V. Caspases as putative predictive biomarkers of cervical cancer development and progression / O.V. Kurmyshkina, P.I. Kovchur, I.E. Bakhlaev, A.N. Poltorak, Т.О. Volkova // International Journal of Gynecological Cancer. — 2012. — Vol.22. — №8(suppl.3). - P.E647.

32. Багина, У.С. Экспрессия CD95 и активность каспаз в лимфоцитах периферической крови при развитии рака молочной железы / У.С. Багина, К.С. Игнатьев, О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, А.Н. Полторак, Т.О. Волкова // Медицинский академический журнал (приложение). — 2012. — С.189-191.

33. Ковчур, П.И. Маркеры оценки эффективности методов терапии цервикальных интра-эпителиальных неоплазий (CIN) и микрокарциномы шейки матки / П.И. Ковчур, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, И.Е. Бахлаев, Н.Н. Немова // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва. — 2012. — С.275—276.

34. Курмышкина, О.В. Перспективные маркеры для оценки эффективности методов терапии рака шейки матки / О.В. Курмышкина, П.И. Ковчур // Материалы I Международной научной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы». — Казань. — 2012. — С. 135-137.

35. Курмышкина, О.В. Экспрессия каспаз - возможный предикторный маркер при раке шейки матки / О.В. Курмышкина // Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». — Москва. — 2012.

36. Ковчур, П.И. Биомаркеры в тераностике предрака и микроинвазивного рака шейки матки / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, А.Н. Полторак // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья». — Москва. — 2013. — С.194-197.

37. Ковчур, П.И. Колебания клеточного иммунитета и активности апоптоза лимфоцитов периферической крови при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и микрокарциноме шейки матки. Возможности иммуномодулирующей терапии / П.И. Ковчур, И.Е. Бахлаев, О.В. Курмышкина, Т.О. Волкова, А.Н. Полторак // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлини-ческая помощь - в эпицентре женского здоровья». — Москва. — 2013. — С.197-200.

38. Заявка на патент РФ «Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисилазий и рака шейки матки» / Волкова Т.О., Курмышкина О.В., Бахлаев И.Е., Ковчур П.И., Полторак А.Н. - № 2012157453; Заяв. 26.12.2012.

Подписано в печать 23.04.2013. Формат 60x84 У . Бумага офсетная. Печать офсетная. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Изд. № 124.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Отпечатано в типографии Издательства ПетрГУ 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33