Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Ранняя диагностика и лечение ретинобластомы

На правах рукописи

сд

8л 32

СААКЯН СВЕТЛАНА ВАГОВНА

РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ РЕТИНОБЛАСТОМЫ

14.00.08 - Глазные болезни 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца

г. -

Научные консультанты: 1

Член - корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор А.Ф.БРОВКИНА

Доктор биологических наук Д.В. ЗАЛЕТАЕВ

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор М.Р .ГУСЕВА

Доктор медицинских наук, главный

научный сотрудник Л.А.КАТАРГИНА Доктор медицинских наук,

профессор А.Н.ПЕТРИН

Ведущая организация:

Российская медицинская академия постдипломного образования

Защита состоится «11 « июня 2002 г. в / / часов на заседани] диссертационного совета Д.208.042.02 при Московском научно исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца п адресу: 103064, Москва, ул.Садовая-Черногрязская, дом 14/19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно исследовательского института глазных болезней им.Гельмгольца

Автореферат разослан « ¥» ^ 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор М.Б.КОДЗО!

Актуальность проблемы

Рост заболеваемости злокачественными опухолями, а также своеобразие и особенности опухолевого процесса у детей привели к развитию новой науки детской онкологии. В офтальмологии выделилась офтальмоонкология, в том числе и детская. Организация офтальмоонкологической службы и специальных центров связана со специфичностью течения опухолевых процессов у детей, первичным обращением больных к офтальмологам, применением специальных диагностических методик для выявления этой сложной патологии органа зрения.

Важность изучения проблемы ретинобластомы подтверждена и созданием в 1989-1991 г.г. специальной международной группы по изучению ретинобластомы RISC с центром в Филадельфии (США), куда вошли два специалиста из нашей страны (проф.А.Ф.Бровкина и к.м.н. С.В.Саакян).

Ретинобластома (РБ) - единственная злокачественная опухоль сетчатки, встречающаяся в детском возрасте. В последние десятилетия частота РБ увеличилась 1:34 ООО до 1:15 000-1:20 ООО новорожденных (Пантелеева О.Г, 1997; Телеуова Т.С.,1997; Malkani.I.,1993; Mateu Е.,1997; Shields С.,2001). В последние 10 лет наблюдается не только рост заболеваемости, но и увеличение частоты билатеральных форм с мультицентричным ростом опухоли (Bechrakis N., 1998; Goddard А., 1999; Mohney В., 1998). Отмечена тенденция к "повзрослению" РБ: увеличивается число детей старше 5 лет, страдающих РБ (Бровкина А.Ф.,2002; Shields J., 1993)

Несмотря на множество публикаций, посвященных РБ, многие вопросы остаются дискутабельными и неразрешенными (Abramson D.,1998; Desjardins L.,2001; Kingston J.,1996, 2001). Нет единого мнения о факторах, влияющих на развитие, клиническое течение и эффективность лечения РБ. Данные о росте заболеваемости в регионах с повышенной радиоактивностью и индустриально развитых зонах разноречивы. По данным разных авторов, РБ

одинаково часто поражает как мальчиков, так и девочек (Ковалевский Е.И., 1985; Пантелеева О.Г., 1997; Malkani I., 1993) с небольшим преобладанием мальчиков при спорадических формах опухоли. Зарубежные авторы не отмечают особых различий в расовой принадлежности больных, эндемичности по различным регионам и населенным пунктам (Brinkert A.et al,1998; Tan N.,1997).

Ретинобластома поражает в основном детей в возрасте от 0 до 5 лет жизни. Несмотря на то, что в последние годы появились сообщения о развитии РБ у детей старше 5 лет, особенности течения опухоли у них описаны недостаточно четко. Оказалось, что увеличивается как число заболевших в старшем возрасте, так и частота врожденных и далекозашедших форм болезни (Abramson D., 1998 Koraszevska В, 1993). А между тем, все еще отсутствуют методы ранней диагностики опухоли.

К сожалению, в последние годы утрачены те навыки и организационные достижения, которые использовались ранее при обследовании новорожденных в роддомах и поликлиниках. Офтальмопедиатры не осматривают новорожденных в роддомах, а в поликлиниках часто пренебрегают жалобами родителей на косоглазие и даже свечение зрачка у ребенка. В результате потери времени дети попадают в специализированные клиники на далеко зашедших стадиях заболевания, что ограничивает выбор методов лечения и делает невозможными органосохранные операции. Отсутствуют программа обследования детей и критерии, позволяющие выявить группы риска по РБ, методы ее профилактики и ранней диагностики.

В последние годы появились новые цитостатики, позволяющие разрушить первичный очаг внутри глаза, но сведения о применяемых дозах и протоколах разноречивы, не выработана схема органосохраняющего лечения при больших и мультицентричных опухолях (Doz F., 1995; Shields С.,1996; Duffull S.,1997; Namouni F., 1997; Di Felice V., 1998;). Нет должного внимания к социальной реабилитации детей, выживших после лечения. Столь

противоречивые и неполные данные объясняются отсутствием достаточного клинического материала и комплексных

многоцентровых исследований, необходимых для выработки обоснованной тактики обследования, лечения и реабилитации больных РБ.

Все вышеперечисленное подчеркивает актуальность и целесообразность исследований по данной проблеме.

Цель исследования: разработать программу

дифференцированного обследования и рациональной тактики лечения детей с различными формами РБ с применением высокоэффективных методик и новых технологий для повышения эффективности лечения.

Задачи

1. Изучить частоту и некоторые закономерности распространения РБ в разных регионах России.

2. На основании многофакторного молекулярно-генетического обследования больных с РБ и их родственников, изучения операционного материала определить спектр и характеристику генетических и эпигенетических нарушений и их роль в патогенезе РБ. Определить роль кооперативного взаимодействия генов 1Ш-1 и р 1 б/СБКША в возникновении РБ.

3. Разработать ДНК-протокол с целью выявления групп высокого риска по ретинобластоме, прогнозирования течения заболевания и рождения здорового потомства.

4. Изучить особенности клинической картины в зависимости от возраста ребенка, формы и стадии ретинобластомы и факторов, осложняющих течение опухоли.

5. На основании клинико-лабораторного анализа провести сравнительную оценку информативности методов ранней и дифференцированной диагностики РБ, определить роль и последовательность их использования. Разработать протокол

обследования больных РБ с применением современных методов визуализации.

6. Оптимизировать тактику комбинированной и сочетанной терапии, включающей методы местного и общего воздействия на опухоль с учетом формы и характера роста опухоли, стадии ее распространения и определить критерии отбора больных для органосохраняющего лечения. Разработать новую схему неадъювантной химиотерапии с использованием карбоплатина, обеспечивающую выполнение органосохраняющих операций.

Работа была начата в 1994 г., итог подведен в 2001 г. Средние сроки наблюдения составили 61,8+1,8 мес.

Научная новизна

Доказана высокая частота ретинобластомы у детей среди внутриглазных опухолей органа зрения, их поздняя диагностика по территории нашей страны.

Выявлены новые механизмы образования опухоли.

Установлено, что развитие ретинобластомы происходит не только в результате структурных, но и функциональных повреждений гена RB1. Это приводит к образованию функционально неполноценного белка, что, в свою очередь вызывает нарушение регуляции клеточного цикла и злокачественную трансформацию клетки.

Выявлено 47 мутаций в различных экзонах и интронных областях гена RB1, при этом 24 мутации описаны впервые в мире.

Впервые показана роль аномального метилирования регуляторных областей генов-супрессоров в опухолевой трансформации клетки.

Впервые показано метилирование гена RB1 не только в опухоли, но и в геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови.

Впервые выявлено значение других генов, а именно pl6/CDKN2A в возникновении РБ.

Показано, что исследование структурных изменений в случае семейной и/или двусторонней ретинобластомы можно проводить на ДНК из лимфоцитов периферической крови пациентов с РБ и их близких родственников. Разработана мультиплексная метилчувствительная ПЦР для совместной оценки статуса метилирования промоторных районов генов RB1 и pl6/CDKN2A.

Разработанный ДНК-протокол позволил не только подтвердить диагноз РБ в 95% случаев, но и выявить терминальную мутацию у 23,6% больных со спорадической формой заболевания. На основании предложенного протокола определены группы высокого риска по наследственной патологии, которым необходимо углубленное молекулярно-генетическое обследование с целью профилактики рождения больного ребенка.

Уточнены особенности 3 клинических форм РБ и их частота. Установлено, что экзофитный рост наблюдается в 22% случаев и проявляется повышением внутриглазного давления, отслойкой сетчатки, ранним прорастанием хориоидеи.

Наиболее характерными признаками эндофитной формы, которая встречается в 57,1% случаев являются отсевы опухолевых клеток в стекловидное тело и передний отрезок глаза.

Достоверно определено, что наиболее тяжелым в плане клинического течения и витального прогноза является смешанная форма, выявляемая у 20% больных. Для нее характерны все описанные выше признаки, встречающиеся значительно чаще, но документируемые намного позже.

Установлено, что за последние 5 лет в 2 раза увеличилась частота ретинобластомы среди детей старшей возрастной группы (возраст появления первых признаков более 60 месяцев) и составила 9,5%. Выявлены особенности клинического течения заболевания в этой группе (вялотекущий увеитоподобный процесс с вовлечением переднего отрезка глаза - псевдопреципитаты и псевдогипопион, раннее развитие вторичной глаукомы; отслойка сетчатки).

Для повышения точности диагностики разработан протокол

обследования больных РБ, включающий современные методы скрининга и визуального контроля и инструментальные методы исследования (УЗИ, КТ, определение уровней онкомаркеров, цитодиагностика).

Разработана новая рациональная схема неадъювантной полихимиотерапии с использованием карбоплатина, позволяющая в 2 раза уменьшить объем опухоли и снизить ее рецидивирование, сузить показания к ликвидационным операциям, наружному облучению глаза и расширить показания к органосохраняющему лечению при уменьшении токсичности химиотерапии. Благодаря разработанной тактике дифференцированного лечения удалось сохранить глаза и повысить качество жизни в 86% случаев.

Практическая значимость

Даны четкие клинические критерии диагноза РБ, описаны возможные осложнения, способные маскировать основной диагноз, особенно в старшей возрастной группе. На основании собственных наблюдений представлен дифференциально-диагностический ряд заболеваний, манифестирующих ретинобластому и требующих пристального внимания.

Показано, что семейные и врожденные формы ретинобластомы имеют более тяжелое клиническое течение и худший прогноз, а первичные очаги РБ возникают на периферии сетчатки, что делает целесообразными профилактические осмотры детей на местах только в условиях максимального мидриаза.

На основании данных, полученных на большом однородном клиническом материале, разработана, научно обоснована и внедрена в клиническую практику система обследования и тактика лечения больных с РБ.

Установлено значение структурно-функциональных нарушений в гене КВ-1 в возникновении и развитии РБ. Разработанный ДНК-протокол позволяет не только установить диагноз у 95% обследованных больных, но и выявить врожденные формы

заболевания. Это подтверждает необходимость профилактических осмотров новорожденных и детального обследования групп высокого риска, их семей, что необходимо для планирования рождения здорового потомства.

Разработанная тактика лечения больных с РБ, основанная на обязательном применении полихимиотерапии, нового цитостатика (карбоплатина) и локальных методов разрушения опухоли, внедрена в практику и способствует повышению эффективности терапии. Уменьшение объема опухоли на фоне неадъювантной химиотерапии позволило проводить органосохраняющее лечение у детей с Ш стадией заболевания и сузить показания к энуклеации. Применение новой схемы лечения не увеличивает тяжесть и число побочных эффектов полихимиотерапии.

Анализ результатов комбинированного лечения РБ с учетом характера и стадии опухоли, а также факторов риска доказывает необходимость использования в практике здравоохранения разработанной нами схемы лечения как наиболее целесообразной, эффективной, минимально травматичной и органосохраняющей.

Положения, выносимые на защиту

1. РБ следует считать наиболее частой злокачественной внутриглазной опухолью, со структурно-функциональными нарушениями гена RB1, сложным комплексом молекулярно-биологических расстройств, которые наряду с другими отягощающими факторами приводят к возникновению, развитию и рецидивированию опухоли.

2. Диагностика РБ должна быть комплексной, включать современные методы визуализации элементов глазного дна, орбиты, определения уровня онкомаркеров, цитодиагностики и медико-генетического исследования. В выявлении ранних форм РБ большое место занимают профилактические осмотры новорожденных офтальмологом, обследование детей и их семей из группы высокого риска по разработанному ДНК-протоколу, который позволяет в 95%

случаев установить диагноз и выявить наследственные формы у 23,6% больных

3. Клинические проявления РБ весьма полиморфны и зависят от формы опухоли (эндофитной, экзофитной и смешанной) и возраста ребенка. Наиболее неблагоприятна смешанная форма РБ с сочетанием всех симптомов опухоли и их поздним проявлением, что определяет клиническое течение и плохой прогноз.

4. Лечение РБ должно быть комбинированным и по возможности органосохраняющим. Разработанная схема лечения детей РБ с использованием нового цитостатика карбоплатина позволяет, уменьшить размер опухоли вдвое, что расширяет показания к органосохранному лечению, улучшить ближайшие и отдаленные результаты лечения, повысить качество жизни в целом.

Апробация диссертации.

Основные положения работы доложены и обсуждены на Российских научных съездах и конференциях (1990, 1998 и 2001 годы) и международных офтальмоонкологических конгрессах (1998 г. в Филадельфии, США; в 2001 г Нидерландах), на VI съезде офтальмологов России (Москва, 1999), Европейских конференциях по генетике человека (Амстердам, 2000, Вена 2001), на международной конференции "Геном человека" (Ванкувер 2000, Эдинбург 2001г.), на конференциях ГНТП "Геном человека" в 1998,1999 и 2000 г.г.научно-практических конференциях МНИИ ГБ им. Гельмгольцав 1999.

Внедрение результатов работы.

Результаты работы отражены в 43 публикациях, в том числе в главах руководства "Офтальмоонкология" и "Наследственные и врожденные заболевания сетчатки и зрительного нерва", методических пособиях. Внедрены в практиктическую деятельность отдела офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца. По теме диссертации получен патент № 2169371 от

20.06.2001г. и решение о выдаче патента № 2001113691/14 от 28.03.02г.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных наблюдений и результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 30

таблиц и 41 рисунок. Список литературы включает 340 источника, в том числе 79 отечественных и 2^1 зарубежных авторов.

Содержание работы

Материал и методы исследования.

В основу работы положены результаты клинических наблюдений и исследований (1994 - 2001 год) 264 больных (528 глаз). Обследование больных и лабораторно-инструментальные исследования проводили до операции и каждые 3 месяца после операции в течение 1-го года, каждые 6 месяцев в течение 2-го года, затем ежегодно. Средний срок наблюдений составил 61, 8+1,8 месяцев.

Наши наблюдения подтвердили мнение о практически равном поражении правого и левого глаза при монокулярной форме (48,1 и 51,9% соответственно). При бинокулярных формах РБ отмечено более раннее поражение правого глаза (59,3 и 39,5% соответственно). Различий и по половому признаку не выявлено: к нам обратились 129 мальчика (48,9%) и 135 девочек (51,1%).

Возраст детей колебался от 1 до 168 мес. Менее четверти больных (23,9%) были в возрасте до 1 года, а на возраст старше 37 месяцев приходилось 27,6%. Распределение больных по возрасту представлено на рис. 1.

140-1 120100 806040 20 0

ит.| и» «т.|

менее 7-12 13-36 37-59 60-108 109-168 более 6 168 возраст, месяцы

□ Всего

В Монокулярная РБ

□ Бинокулярная РБ

Рис. 1. Распределение больных по возрасту с учетом формы заболевания на момент обращения.

Чаще заболевали дети в возрасте от 13 до 36 мес. (128 пациента), что составляет 48,5% от всех больных. Детей от 0 до 12 месяцев оказалось 63. Число детей с монокулярным и бинокулярным поражением достоверно различалось (р<0,05). Пациентов с монокулярной РБ в возрасте до 1 года было достоверно меньше, чем с бинокулярной формой (18,2 и 36,1%, р<0,05), а среди больных старше 3 лет было больше пациентов с монокулярной формой РБ (18,8 и 8,4%; р<0,05). Число детей до 6 мес. с бинокулярным поражением более чем в 3 раза больше, чем с односторонним поражением.

Полисимптоматичность и нередкая манифестация ретинобластомы под масками других заболеваний становились причиной ошибочной диагностики (по нашим данным, до 32,2%), а раннее выявление при профилактических осмотрах составило всего 8,3%. Поздно установленный и зачастую неправильный диагноз был причиной позднего лечения (10 мес. и более с момента начала

заболевания). В таб.1 приведены заболевания наиболее часто имитирующие ретинобластому.

Таблица 1.

Частота ошибочных диагнозов при РБ (п=83)

Диагноз маскирующего заболевания Абсолютное число %

Увеит 24 28,9

Ретинит Коатса 22 26,5

Катаракта 10 12,5

Фиброплазия 9 10,8

Отслойка сетчатки 9 10,8

Глиома зрительного нерва 4 4,8

Глаукома 3 3,6

Киста стекловидного тела 1 1,2

Миелиновые волокна 1 1,2

У 21,7% больных с ошибочным диагнозом при первичном обращении по месту жительства патологических изменений со стороны глазного дна не выявлено и дети признаны здоровыми. Спустя 2-3 мес. (при повторном обращении) «установлены» вышеперечисленные заболевания и только через 10 мес., когда ретинобластома начинала манифестировать, было заподозрено основное заболевание и больные направлены в специализированную клинику.

Наследственность была отягощена только у 41 человека (15,5%). Из них у 18 больных была выявлена семейная форма РБ

Большинство детей поступили к нам на далеко зашедшей стадии. На рис.2 приведена частота наиболее часто встречающихся клинических признаков РБ

% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Б

ЯЛ,

I

н

о а.

в о

о в

£

м о

о из

о.

« г

и ■в-

§ г

К 8 В « 3

й в 1= О ш о

о & й- 5 н с

ё о

Е

н

0

1

□всего В монокулярная □бинокулярная

3 £ в

I

Рис. 2. Частота клинических симптомов при РБ (п=264).

Как следует из рис. 2, у трети больных выявлена вторичная гипертензия, у 42% обнаружен рубеоз радужки. В 71% случаев имели место опухолевые сателлиты в стекловидном теле и передней камере. Кальцификаты обнаружены у 75% больных. Приведенные цифры свидетельствуют о позднем направлении больных ретинобластомой на лечение.

Осмотр глазного дна оказался возможным в 104 случаях (39,4%). Мультифокальность опухолевого роста более характерна для бинокулярных форм (79%), при монокулярной форме множественные очаги встречались в 18% случаев. Юкстапапиллярная локализация диагностирована у 26,5% больных, при этом достоверно чаще встречалась при бинокулярной форме.

Чаще поражается нижняя половина сетчатки, особенно нижненаружный квадрант (48,2%), в нижневнутреннем квадранте располагалось 41,5% очагов. Таким образом, поражение нижней

половины глазного дна встречается достоверно чаще, чем поражение верхней (р< 0,01).

Проминенция опухолевого узла при монокулярной форме, а также в худших глазах при бинокулярной форме, по нашим данным, составила в среднем 10,5 ±2,3 мм.

Табл.2 иллюстрирует преобладание эндофитного характера роста опухоли (57,2%).

Таблица 2.

Характер роста Всего (п=264) больных Сторона поражена

Монокуля рная РБ (п=181) Бинокулярная РБ (п=83)

Абс.чис ло % Абс.число % Абс.числ о. %

Экзофитный 58 21,9 43 23,7 15 18,1

Эндофитный 151 57,2 102 56,4 49 59,0

Смешанный 55 20,8 36 19,8 19 22,8

Больные получили лечение в отделе офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца, у 93,6% из них проведено комбинированное лечение (полихимиотерапия + один из способов локального разрушения опухоли). Преобладали больные с монокулярными формами ретинобластомы (70,5%). Следует особо подчеркнуть, что по классификации ВОЗ по стадиям роста (Т1-Т4) 94,3% леченых детей имели ТЗ-Т4 стадию распространения опухоли в глазу, как при монокулярной, так и при бинокулярной форме. Таким образом, под нашим наблюдением находились дети с наиболее тяжелой стадией роста опухоли. Тем не менее, органосохраняющее лечение (локальное облучение, лазердеструкция, криодеструкция) оказалось возможным у 1/3 из них.

Методы обследования больных.

Полное комплексное общеклиническое и предварительное офтальмологическое обследование все дети, поступавшие в стационар, проходили в амбулаторных условиях

В программу обязательного обследования детей с ретинобластомой включены помимо стандартных для всех больных методов офтальмологического исследования (офтальмоскопия с максимальным мидриазом, биомикроскопия, тонометрия, диафаноскопия) и ряд инструментальных методов (ультразвуковое сканирование и компьютерная томография). Если для УЗИ отсутствуют ограничения, но необходимо присутствие офтальмолога в момент исследования, то КТ можно проводить детям старше 1 года, а до 1 года только по показаниям (подозрение на экстрабульбарный рост, метастазы в головной мозг). Из иммунологических методов исследования мы остановили свой выбор на РО-тесте и определении уровня эритропоэтина в сыворотке крови. РО-тест представляет собой реакцию СОЭ-иммуноСОЭ и позволяет с помощью универсального антигенного маркера обнаружить опухолевые клетки, адсорбированные на эритроцитах. Коэффициент показателя РО-теста определяется по формуле, учитывающей разницу между средним арифметическим СОЭ контрольной пробы и СОЭ рабочей пробы в миллиметрах, умноженную на большую из двух величин и разделенную на 50. Положительной считается реакция с коэффициентом показателя более 1,5. Исследование проводили в отделе офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ.

Изучение уровня эритропоэтина (ЭПО) в сыворотке крови, который осуществляет контроль и регуляцию гемопоэза, позволило нам показать возможности этого метода как дифференциально-диагностического теста в сомнительных случаях ретинобластомы. Исследование проводилось на базе лаборатории иммунологии МНИИ Г (руководитель - проф.О.С.Слепова), способ запатентован, №2169371 от 20.06.2001.

Тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) показана в особо сложных случаях, когда клинические и неинвазивные инструментальные методики неэффективны, и является по сути экспресс - методом, подтверждающим, но не исключающим РБ.ТИАБ проводили в отделе офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ (анализ цитограмм проводила н.с. М.Г.Жильцова).

При обследовании в стационаре применялся медикаментозный

сон.

Медико - генетическое обследование больных детей проводили на базе Московского генетического - научного центра РАМН (д.м.н.Залетаев Д.В.).

Для исключения цитогенетической патологии у всех пациентов с РБ был проведен высокоразрешающий хромосомный анализ.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и молекулярного веса геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови и операционного (опухолевая ткань) материала стандартным способом (БатЬгоок е1 а1.,1989). Молекулярный анализ гена КБ 1 проводили на ДНК, полученного из материала опухолей, а также на ДНК из лимфоцитов периферической крови.

Биоптат опухоли брали сразу после удаления глаза до заливки его в формалин в отделе патогистологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца (проф. Маслова-Хорошилова И.П.) и направляли в лабораторию МГНЦ для ее дальнейшей обработки с целью выделения ДНК. Для получения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали венозную кровь пациентов и членов их семей (10 мл). Кровь брали у ребенка, его родителей и родственников в стационаре. В качестве консерванта был использовали 0,5 М раствор ЭДТА. К 1 мл консерванта добавляли 10 мл крови и тщательно перемешивали, после чего кровь замораживали.

Полное молекулярное-генетическое исследование проведено у 60 больных и членов их семей (всего 187 человек).

Для каждого из 27 экзонов гена RB1 были использованы соответствующие праймеры и подобраны оптимальные условия полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволила многократно увеличить уникальную последовательность ДНК, выделить кодирующий участок ДНК и изучить его на предмет мутации. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме при помощи программируемого термоциклера MC- 2 фирмы "DNA-Technology LTD" (Россия) с использованием термофильной ДНК- полимеразы Tag фирмы "МВР' и праймеров, синтезированных на приборе ASM 102U фирмы «Биоссет» (Новосибирск).

Поиск мутаций в гене проводили методами анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) и анализа гетеродуплексов (НА). Электрофорез, регистрацию и обработку результатов сиквенса делали на приборе ALFTM DNA Sequencer фирмы "Pharmacia Biotech". Вероятность идентификации точечных мутаций этим методом достигает 80-90% при длине фрагментов ДНК не более 300 пар нуклеотидов.

Для выявления механизма потери (делеции) неповрежденного аллеля (ПГ) использовали микросателлитные маркеры Rbint2, Rbint20 и маркеры фланкирующие ген RBI: D13S262, D13S284, располагающиеся внутри самого гена или в непосредственной близости от него. Доказательством инактивации служила ПГ (потеря гетерозиготности) даже по одному из микросателлитных маркеров.

Анализ метилирования промоторных областей генов RB1 и pl6/CDKN2A проводили с использованием метилчувствительной ПЦР, геномную ДНК предварительно обрабатывали рестриктазами Нра II и Hhal.

Компьютерный анализ последовательностей ДНК осуществляли с помощью программ Genbank Pustell, Genepro, WIN-SUN, Autogene 1.1, Oligo 4.0; анализ хроматограмм секвенированных последовательностей - с помощью программ Executor и Chromas.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Монокулярная форма заболевания выявлена у 181 ребенка (68,5%), бинокулярная — у 83 (31,4%). Средний возраст детей с монокулярной форме при обращении в институт составил 34,5±2,3 месяца, при бинокулярной форме - 22,9 ±2,5 месяца. Среди детей, поступивших в стационар с диагнозом ретинобластома, РБ была подтверждена в 91,7% случаев. В остальных случаях имели место увеиты, пороки развития, ретиниты.

Анализ распределения больных по регионам показал, что наибольшее количество детей обратилось из Центральной и Центрально-Черноземной части России (21,3%). 19% обратившихся были из Северо-Кавказского региона, 18% - из Среднего Поволжья и Урала , 11,8% обратившихся в Институт больных, были дети из Северного региона с эндемичной зоной в республике Коми. Из Западной Сибири обратилось 5,1% больных. Из Дальневосточного региона направлено 14 детей (5,6%), из них 7 проживала в Якутии. По частоте выявления бинокулярных форм лидируют Западная Сибирь, Среднее Поволжье и Центрально-Черноземный район, откуда поступило более половины детей с бинокулярной формой ретинобластомы (48 детей). Большинство больных представляли городское население.

Отдаленные результаты изучены у 264 больных.

Дифференцированное лечение получили 247 больных. В комплекс хирургических методов входили ликвидационные (энуклеация, экзентерация) и органосохранные методы (брахитерапия, лазеркоагуляция, криодеструкция). Все больные находились под динамическим наблюдением. Средний срок наблюдения составил 61,8±1,8 месяцев.

Наши исследования подтверждают возросшую частоту бинокулярных форм (32%), как правило относящихся к наследственной РБ.

Полное молекулярно-генетическое обследование 60 больных с разными формами РБ и членов их семей (187 человек) позволило изучить спектр структурных и функциональных нарушений, приводящих к развитию РБ и выявить три основных механизма возникновения и развития ретинобластомы.

Первый механизм развития РБ обусловлен структурными нарушениями гена RB1, представленными точковыми мутациями, внутригенными делециями и потерей гетерозиготности. Поиск точковых мутаций проводили в промоторной области гена и во всех 27 экзонах гена, выявлено 47 точковых мутаций, 24 из них описаны впервые. Полиморфизмы (нуклеотидные замены) не приводят к изменению аминокислотной последовательности и не изменяют структуру и функцию белка, но могут влиять на кодирующую область гена. Мы выявили 6 полиморфизмов в интронах и экзонах гена, 3 из них описаны впервые.

Важнейшим механизмом инактивации гена-супрессора злокачественной трансформации РВ1, приводящим к развитию РБ, согласно теории Кнудсена является наличие двух последовательных мутационных событий. Одним из них является потеря одного из аллелей гена в опухолевых образцах. Потеря гетерозиготности гена выявлена в 71% случаев. На рис.3 четко прослеживается отсутствие второго аллеля в образцах опухоли Т9, TI 1, Т12 и Т15

I* "-i

КР- РДЧ I кр- . on.'.j кр. ОП. I кр. оп. I кр. on. Т5 I Т9 I Т11 I Т12 I TÍ 5 Рис.3 Анализ состояния зиготиости гена RB1 по внутригенному

маркеру Rbiní20.

Как оказалось, к развитию заболевания приводят не только структурные изменения гена РВ1, но и функциональные нарушения. К таким повреждениям относят аномальное метилирование регуляторных элементов генов супрессоров. Метилирование, является вторым механизмом, имеющим большое значение в патогенезе РБ. Аномальное метилирование выявлено в 14 образцах опухоли (27%), что значительно превышает зарубежные данные, причем почти в трети случаев спорадических РБ метилирование сочеталось с ПГ. Впервые в нашем исследовании удалось показать метилирование не только в опухоли, но и в лимфоцитах периферической крови.

Нами получены данные, позволяющие высказаться в пользу определенного влияния инактивации гена pl6/CDKN2A на развитие опухолевого процесса в клетках сетчатки (в 17% выявлено метилирование промоторной области гена р16), которое опосредованно влияет на снижение активности RB1 и дальнейшее нарушение процессов пролиферации, дифференцировки клетки и апоптоза, что приводит к развитию РБ. Следует подчеркнуть, что закономерностей в последовательности возникновения этих нарушений не обнаружены.

Молекулярно-генетический анализ позволил нам выявить скрытую форму наследственной патологии у 24% больных со спорадической формой заболевания и уточнить особенности клинического течения ретинобластомы у этих пациентов (ранний возраст появления первых признаков заболевания, мультифокальное поражение при монокулярной форме, экзофитный и смешанный характер роста опухоли, что обуславливает более тяжелое течение).

Разработанный нами ДНК-диагностический протокол позволил в 95% случаев выявить молекулярную патологию, сформировать группы риска, к которым относятся дети со спорадической монокулярной РБ с мультифокальным поражением, дети с бинокулярной РБ и дети с моно- и бинокулярной РБ в сочетании с другими пороками развития.

Отработаны оптимальные диагностические подходы, с помощью которых следует проводить обследование семей с различными формами РБ, позволяющие выявить носителей терминальных мутаций, оценить риск возникновения заболевания у близких родственников больного и оптимизировать пренатальную диагностику ретинобластомы в целях ее профилактики. При молекулярно-диагностическом обследовании больных с РБ и членов их семей рекомендована следующая тактика (см.рис.4)

1). Высокоразрешающий кариотипический анализ больного для исключения возможной хромосомной патологии, представленной микроделециями, транслокациями и инверсиями хромосомы 13(ql4.1). Хромосомный анализ особенно рекомендован больным с дополнительными аномалиями развития и задержкой умственного и физического развития. При выявлении хромосомной патологии у пациентов с ретинобластомой необходимо обследование родителей и близких родственников с целью исключения сбалансированных хромосомных перестроек.

2). Проведение оценки состояния зиготности гена RB1 в материале опухоли, с использованием внутригенных {Rbint2, Rbint20) и фланкирующих ген маркеров (D13S262, D13S284), что позволяет определить одно из структурных изменений гена - потерю одного из аллелей, вследствие рекомбинации или делеции участка хромосомы 13, включающего RB1. В случае неинформативности вышеуказанных маркеров необходимо проведение сравнительного микросателлитного анализа ДНК из лимфоцитов периферической крови больного ребенка и родителей, с целью исключения субмикроскопических делеций в одном из аллелей гена RB1.

3). Проведение анализа метилирования промоторной области гена RB1 в опухолевом материале РБ и/или в лимфоцитах периферической крови для исключения функциональной патологии, равноценной потере гетерозиготности и микроделеции. Следует отметить, что возможное повреждения других генов - регуляторов RB1, на долю которых приходится около 5-10% причин

возникновения опухоли, остается практически неизученным. Так, например, нами впервые показано аномальное метилирование промоторной области гена pl6/CDKN2A в операционном материале РБ.

4). Скрининг структурных мутаций в гене RB1 методами анализа SSCP и НА в ДНК из опухолевого материала. При отсутствии опухолевого материала скрининг проводится на ДНК из лимфоцитов периферической крови. При наследственных формах заболевания исследование сразу следует проводить на ДНК из лимфоцитов периферической крови.

5). Исследование ДНК из лимфоцитов крови при выявлении мутации в операционном материале РБ в конкретном участке гена RB1 с целью исключения или подтверждения терминального характера мутации. В случае установления терминального характера мутации у пациента, необходимо проведение анализа ДНК в этой области гена у сибсов и близких родственников больного с РБ для исключения носительства.

При отсутствии достаточных лабораторных возможностей и недоступности опухолевого материала рекомендуется следующий минимальный диагностический протокол:

• Микросателлитный анализ ДНК из лимфоцитов периферической крови, с использованием внутригенных и фланкирующих ген маркеров, для исключения субмикроскопических делеций гена RB1;

• Анализ метилирования промоторной области генов RB1 и р16 в лимфоцитах периферической крови для исключения функциональной патологии гена, равноценной микроделеции;

• Проведение скрининга точковых мутаций в гене RB1 методами анализа SSCP и НА в ДНК из лимфоцитов периферической крови;

Рис.4 Алгоритм проведения молекулярно-цитогенетического обследования при ретинобластоме.

• При установлении терминального характера мутации у больного с РБ, требуется исключение носительства обнаруженной мутации. В семьях высокого риска повторного возникновения РБ, возможно проведение пренатальной диагностики анализ определенной мутации у сибсов и близких родственников пациента с целью профилактики ретинобласты.

Таким образом, нами доказано, что в основе развития РБ лежит сложный комплекс молекулярно-биологических расстройств, которые наряду с отягощенными эпидемиологическими, экологическими, наследственными и другими факторами приводят к возникновению, развитию и рецидивированию заболевания.

Проведен сравнительный анализ различных инструментальных методов исследования и показана диагностическая ценность каждого из них.

Алгоритм инструментальных методов обследования на 1 этапе должен включать после углубленного офтальмологического осмотра обоих глаз (с максимально широким зрачком в условиях медикаментозного сна) УЗИ сканирование, которое оказалось наиболее распространенным благодаря своей безопасности и информативным при правильном использовании методики в 84% случаев, даже при начальных опухолях (проминенция 1мм). Следует обратить внимание на сложность интерпретации сканнограмм при плотных или при распадающихся опухолях, когда плотность опухоли значительно уменьшается. В таких случаях необходимо прибегать к КТ исследованию. КТ позволяет в начальных стадиях визуализировать топографию опухоли, выход за пределы склеральной капсулы, исключить или подтвердить наличие метастазов в головном мозге. Чувствительность метода составляет 87%.

Используемые нами иммунологические тесты, такие как РО-тест и определение ЭПО в СК, целесообразно применять в качестве дополнительных методов при трудных дифференциально

диагностических ситуациях (увеиты, ретинит Коатса). Чувствительность тестов примерно одинаковая и составляет 72-75%.

ТИАБ использовали только при невозможности установить диагноз другим неинвазивным методом. Его информативность при ретинобластоме составила 75%. Применение тонкоигольной аспирационной биопсии позволяет своевременно удалить опухолевый глаз и сохранить глаза с неопухолевым заболеванием.

Анализ наших исследований свидетельствует о том, что опухолевые очаги в большинстве случаев возникают в периферических, трудно доступных для осмотра отделах сетчатки (70%). Особенно показательны в этом .отношении вновь появляющиеся очажки при мультицентричных формах опухоли. В 40 случаях (60%) новые очаги выявлены во время контрольных осмотров в состоянии медикаментозного сна и 57,5% из них локализовались на крайней и средней периферии сетчатки. Такие начальные очажки невозможно выявить без осмотра глазного дна с максимально-широким зрачком, что доказывается большим количеством диагностических ошибок, при которых в 21,7% случаев патология не выявляется и ребенка относят к категории здоровых, а это значит, что ребенок не подвергается диспансерному наблюдению и выпадает из поля зрения офтальмопедиатра.

Клиническая картина как спорадической, так и семейной формы ретинобластомы у детей первых трех лет жизни описаны достаточно полно.

Мы систематизировали и уточнили симптомокомплекс, типичный для больных старшего возраста (5 лет и старше), число которых увеличилось за последние 5 лет практически вдвое и составило 9,5%. Он представлен, как правило, вялотекущим увеитом с характерными жировыми псевдопреципитатами, за счет оседания опухолевых сателлитов в углу передней камеры формируется симптом псевдогипопиона. При этом глаз долго остается относительно интактным. Подобная картина более типична для РБ преэкваториального расположения.

Второй симптомокомплекс у детей старшей возрастной группы характеризовался вяло и длительно-текущей воронкообразной отслойкой сетчатки, которая была утолщена на всем протяжении. Как показывают наши наблюдения, такая клиническая картина часто бывает причиной ошибочных диагнозов. Если общий процент ошибок у всех больных составил 31,2, то в старшей возрастной группе он достигал 56. Установление неправильного диагноза (у 14 из 25 детей старшего возраста) сопровождалось необоснованным противовоспалительным, а в некоторых случаях и хирургическим лечением. Все это затягивало начало лечения (при правильном диагнозе от момента появления первых признаков до начала лечения проходило 5,6 мес., а при ошибочном - 10,5 месяца), что уменьшало шансы на сохранение глаза. Наиболее частый ошибочный диагноз -увеит, ретинит Коатса, катаракта.

Нами оценен прогноз заболевания при разных клинических формах роста опухоли (экзофитной, эндофитной, смешанной). Статистически достоверно доказан худший прогноз при смешанной форме ретинобластомы, которая может имитировать неопухолевые заболевания воспалительного и дистрофического характера. Статистически доказана корректность корреляции мультицентрического роста, более типичного для бинокулярной ретинобластомы, с плохим витальным прогнозом. Как оказалось, при смешанной форме, встречающейся в 20% случаев, смертность от метастазирования в 3 раза превышает таковую при эндофитной форме и в 2 раза при экзофитной и составляет (9,6%). Объясняется это максимальным сочетанием всех симптомов заболевания и поздним их выявлением, что определяет тяжелое клиническое течение и плохой прогноз.

Отдаленные результаты лечения 247 больных с РБ (174 ребенка с монокулярной формой РБ и 73 ребенка с бинокулярной формой) однозначно доказали необходимость обязательного включения в схему комбинированного лечения ретинобластомы полихимиотерапии. Адьювантная химиотерапия, как обязательный

компонент лечения больных РБ была назначена всем детям, находящимся под нашим наблюдением. Отказ от полихимиотерапии приводит к метастазированию в ближайшие 6-12 месяцев, однако адъювантная ПХТ, позволяя снизить частоту метастазирования, не влияет на первичный очаг.

Принципиально новые возможности открылись при использовании неадъювантной высокодозной химиотерапии. Оказалось, что эта терапия снижает биологическую активность опухоли и уменьшает ее размеры, что значительно повышает возможности ее удаления в пределах здоровых тканей. Это объясняется разрушением генного аппарата опухолевой клетки в первичном очаге, в результате чего тормозится рост опухоли. Первые препараты (цисплатин), обладающие такими свойствами, были очень токсичны, и применение их в детской клинике было проблематичным. С момента появления нового препарата карбоплатина, адаптированного для детского организма, стали использовать этот вид терапии для лечения злокачественных опухолей у детей. Несмотря на очевидные преимущества карбоплатина (сравнительно низкая токсичность, возможность пролонгации лечения), до настоящего времени не были разработаны дозовые режимы, оптимальные сочетания с другими цитостатиками, не определена частота побочных явлений и осложнений при применении у детей при РБ. Учитывая направленное действие карбоплатина на первичный очаг, мы включили его в схему лечения РБ. Был разработан протокол с учетом особенностей детского организма, возраста ребенка, распространенности опухолевого процесса. Критериями отбора больных были: 1) больные с бинокулярной формой РБ с моно- и мультицентричным ростом; 2) больные с единственным видящим глазом с 3 стадией роста опухоли; 3) больные с монокулярной формой, с единичным узлом больших размеров (более 6 мм и основанием более 15 мм), родители которых категорически отказались от энуклеации. Таким образом, это были больные с III стадией развития опухоли, которым по

существующим принципам лечения была показана энуклеация. Учитывая характер побочных действий препарата, из протокола лечения были исключены дети с заболеваниями почек, печени, сердечно-сосудистой системы, ЦНС, желудочно-кишечного тракта, общим тяжелым состоянием, с острым инфекционным заболеванием, генерализацией опухолевого процесса. Критериями исключения со стороны органов зрения были повышение внутриглазного давления, экстраокулярный рост опухоли, диссеминация опухолевых клеток в переднюю камеру глаза.

Лечение получили 36 больных. Средний возраст при обращении в институт составил 24,5±3,6 мес. (от 1,5 до 103 мес.). Сроки наблюдения после лечения были равны 17-57 месяцев (34,6±3,2 мес.). Бинокулярная форма РБ выявлена у 28 детей, монокулярная форма-у 8.

Способ введения и используемые дозы карбоплатина: препарат вводили внутривенно в дозе 18,7мг/кг для ребенка старше 1 года, дети моложе 6 мес. получали 50% этой дозы и в возрасте от 6-12 мес. - 75% от дозы. Винкристин вводили в дозе 0,05 мг на кг. Препараты вводили медленно последовательно со строгим соблюдением инструкций, 1 раз в 3 недели. Количество курсов колеблется от 2 до 6 в зависимости от эффекта лечения.

У детей с монокулярной формой заболевания средний возраст колебался от 12 до 80 мес. (37,1±4 месяца), среди них был годовалый ребенок с наследственной формой РБ и мультицентричным характером роста опухоли. В клинической картине преобладали опухоли с эндофитным характером роста. В остальных 5 случаях обнаружены одиночные узлы. Размеры опухоли колебались от 1,5 до 12,9 мм (в среднем 6,7±1,5 мм), диаметр очага составил 15,7±3,2 мм. По стадиям заболевания больным распределялись следующим образом: опухоль соответствовала Т2 у 2 больных, ТЗ у 6 больных. Во всех случаях через 3 нед. после начала лечения размеры опухоли уменьшились в 2 раза (см. рис.5, 6). Это позволило в 5 случаях провести 2-м этапом локальное разрушение опухоли с помощью

брахитерапии, лазеркоа1уляции, криодеструкции или применять сочетание этих видов в зависимости от локализации, размеров опухоли.

ММ 10 т—:---:-----:—7Г,-

до 3 6 9 12

лечения недели

Рис. 5. Проминенция опухоли до начала и в процессе лечения (усредненные показатели)

щ о л«ч«ния ** чем»3 шдЛ*

** Ч|р»} 9 Н«Д1ЛЬ * * Ч«р«11 мд«пь

Рис. 6. Фрагментация опухоли под воздействием химиотерапии. Ультразвуковое исследование в динамике.

Из 8 детей с монокулярной РБ (8 глаз) удалось сохранить не только глаза, но и зрение даже при центрально расположенных очагах в 5 случаях.

Основной группой больных, подвергнутых лечению разработанной схемой, были пациенты с бинокулярной формой ретинобластомы.

Средний возраст больных с бинокулярной формой РБ (28 человек - 56 глаз) при поступлении составлял 20,9±4,0 месяца. По характеру роста преобладали эндофитные опухоли. Худшие глаза (28 глаз) были удалены.

В лучших глазах выявлен мультицентрический роста в 82,1%. Средняя проминенция самых крупных узлов составила 4,2±0,75 мм (от 1,6 до 11,2 мм), диаметр основания 12,7 мм.

На фоне монотерапии (карбоплатин+винкристин) полная резорбция опухоли получена в 2 глазах, в 8 глазах мелкие очаги резорбировались, а оставшиеся крупные очаги подверглись локальному разрушению. В целом, полной резорбции удалось достичь у 92,8% больных.

Характерным для больных, леченных при помощи карбоплатина, было появление кальцификатов в строме опухоли на фоне полихимиотерапии, которые появлялись после 3-ей инъекции (9 нед.) и сочетались с уменьшением объема опухоли.

Необходимо подчеркнуть, что уменьшение параметров очага позволило не только применить тот или иной метод органосохранного лечения, но и уменьшить побочный эффект от проводимого лечения. Так, при брахитерапии становилось возможным уменьшении лучевой нагрузки или использование более щадящих стронциевых аппликаторов, что в дальнейшем препятствовало развитию постлучевой ретинопатии.

Все опухолевые очаги, в которых наблюдалась кальцификация, впоследствии зарубцевались. Следовательно, проявление этого симптома может служить хорошим прогностическим признаком.

Как показали наши исследования, при лечении по схеме СУ появлялись разной степени выраженности побочные реакции (которые оценивались согласно рекомендациям ВОЗ и Международного противоракового союза для учета токсичности).

Расстройства I степени наблюдались у 83,5 % детей; II степени — в 18,2 %. Изменения III степени, когда возникала необходимость отсрочки лечения, развились у 6,1 % больных. Наиболее распространенным осложнением была рвота, которая наблюдалась у 90 % детей. Она возникала через 2—6 ч. после введения препарата, т.е. классифицировалась как срочная [Гершанович М.,1999г.]. Вторым по частоте осложнением была миелосупрессия. В отличие от других исследователей, которые на фоне лечения карбоплатином наблюдали тромбоцитопению, мы отметили лейкопению. Она выявлена у 36,4 % больных, носила в основном транзиторный характер и не требовала лекарственной коррекции. Из других осложнений необходимо отметить алопецию (у 4 детей; 11,1 %) и периферическую нейропатию, проявляющуюся транзиторной парестезией конечностей (3 случая; 8,3 %). Полихимиотерапия была прервана 1 раз в связи с выраженной аллергической реакцией в виде везикулярного дерматита. После антигистаминной терапии аллергия была купирована и в дальнейшем полихимиотерапия продолжена под прикрытием антигистаминных препаратов.

Резюмируя вышесказанное, можно сделать следующее заключение: применение нового протокола лечения с включением карбоплатина не только позволяет расширить рамки органосохранного лечения без применения наружного облучения, но и при грамотном использовании не повышает риск осложнений после применения высокодозных цитостатиков.

Таким образом, комплексное обследование больных с РБ (оценка жалоб, особенностей клинических проявлений, различных методов клинического, инструментального, лабораторного исследования), а также изучения отдаленных результатов комбинированного лечения, показали, что РБ по праву считается наиболее частым внутриглазным опухолевым заболеванием детского возраста и развивается в результате структурно-функциональных изменений в гене RB1 у детей с отягощенной наследственностью, живущих в неблагоприятных экологических и социальных условиях.

Разработанный нами алгоритм обследования больных с РБ, включающий последовательное применение скрининговых методов и специального медико-генетического анализа согласно ДНК-протоколу, позволяет повысить точность диагностики до 95% и определить группы риска по наследственным и семейным формам РБ, что имеет важное научное и практическое значение.

Комплексная оценка результатов лечения у 247 больных с РБ по разработанной нами программе комбинированного органосохранного лечения с учетом формы, стадии РБ и факторов риска по развитию и рецидивированию заболевания, включающего хирургическое разрушение опухоли, полихимиотерапию и локальные лучевые методы, свидетельствует о высокой эффективности неадъювантной полихимиотерапии с использованием карбоплатина. Продолжительность лечения, дозовые режимы, предложенные нами, с учетом особенностей детского организма и переносимости, позволили уменьшить опухолевый очаг в 2 раза, расширить показания для органосохранного лечения при снижении токсичности, побочных явлений и осложнений.

Снижение числа осложнений после полихимиотерапии, сохранение глаза и зрения (86,9%), бесспорно, повышают качество жизни детей, как в процессе лечения, так и в отдаленные сроки, а по мере взросления ребенка улучшает его социальную реабилитацию.

ВЫВОДЫ

1. Ретинобластома является наиболее частой внутриглазной злокачественной опухолью детского возраста (91,7%). Согласно обращаемости регионами риска являются Центральный (21,3% больных), Северо-Кавказский (19%), Поволжье и Урал (18%), Дальний Восток (5,6%).

2. Основную роль в этиопатогенезе ретинобластомы играют структурно-функциональные нарушения гена RB1, а также инактивация гена pl6/CDKN2A которые наряду с другими

отягощающими факторами приводят к возникновению и развитии РБ.

3. Разработанный ДНК-протокол с использованием методо] молекулярной генетики позволяет диагностировать молекулярнук патологию в опухоли в 95% случаев, выявить терминальны« мутации при спорадических формах в 23,6% случаев и определит! группы высокого риска по возникновению и развитии ретинобластомы. Детальное обследование детей и и> родственников позволяет проводить пренатальную диагностик] РБ и начать обследование и лечение больного ребенка с момент, рождения.

4. Клинические проявления РБ характеризуются значительны.ч полиморфизмом и зависят от формы опухоли и возраста ребенка Более неблагоприятна смешанная форма опухоли, встречающая^ в 20% случаев, характеризующаяся сочетанием всех симптомо! опухоли, их поздним проявлением, что определяет клиническо< течение и плохой прогноз.

5. Отмечено увеличение частоты РБ у детей в старшей возрастной группе вдвое (9,5%). Особенностью клинической картинь является вялое течение, вовлечение в процесс переднего отрезка р отслойка сетчатки, что маскирует основное заболевание I приводит к диагностическим ошибкам.

6. Предложен алгоритм обследования больных ретинобластомой основанный на применении современных методов визуализацш глазного дна и орбиты, определения уровня онкомаркеров цитодиагностики. При адекватном использовании современны? методов точность диагностики составляет в среднем 75-85%.

7. Разработанная рациональная схема неадъювантной ПХТ с использованием карбоплатина позволяет уменьшить объек опухоли вдвое и расширить показания к органосохранном} лечению при уменьшении токсичности терапии и частоть осложнений. Использование карбоплатина позволило разрушит! опухоль у 88,9% больных.

з:

8. Схема комплексной терапии с использованием нового цитостатика (карбоплатина), позволяет сохранить «лучшие» глаза при бинокулярной РБ не только как косметический, но и как функционирующий орган у 86,1% больных, что приводит к улучшению качества жизни и дальнейшей социальной адаптации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Первостепенное значение в возникновении РБ имеет комплекс молекулярно-генетической патологии, включающий наличие структурных и функциональных расстройств как в гене RB1, так и в гене pl6/CDK2A, которые, наряду с отягощенными экологическими, наследственными факторами, приводят к развитию РБ. Согласно обращаемости больных в МНИИ ГБ регионами риска являются Центральный с центром в Брянске, Северо-Кавказский и Поволжский, а также Дальний Восток с центром в Якутске и жители городского сектора.

Имеются три основные формы РБ, отличающиеся по клинической картине. Экзофитный рост сопровождается отслойкой сетчатки, вторичной глаукомой и инфильтративным ростом в хориоидею. Эндофитный рост характеризуется наличием опухолевых отсевов в стекловидное тело и передний отрезок глаза. Наиболее неблагоприятной по прогнозу заболевания считается смешанная форма, сочетающая в себе все указанные симптомы.

Частота РБ у детей старшей возрастной группы увеличивается. В связи с завуалированностью клинической картины заболевания (вялое течение, вовлечение в процесс переднего отрезка глаза (псевдопреципитаты и псевдогипопион), отслойка сетчатки и раннее развитие вторичной глаукомы) увеличилось число ошибочных диагнозов в этой группе (56%). Наиболее частыми ошибочными диагнозами остаются увеит, ретинит Коатса, катаракта.

Группами высокого риска в плане обнаружения терминальной мутации у детей с РБ следует считать больных со спорадической монолатеральной РБ и мультицентричным ростом; спорадической

бинокулярной РБ; moho- и бинокулярными формами РБ в сочетании с различными пороками развития.

Таких пациентов необходимо направлять на углубленное молекулярно-генетическое обследование с применением разработанного ДНК-диагностического протокола, позволяющего выявить молекулярную патологию у 95% больных. Это позволит или предупредить рождение больного ребенка (пренатальная диагностика и прерывание беременности) или после его рождения -выявить опухоль на ранних стадиях развития, что позволит провести органосохранное лечение.

Своевременная диагностика РБ требует осмотра детей с широким зрачком офтальмопедиатрами сразу после рождения, в 1 мес., 6 мес., в 12 мес. При подозрении на РБ необходимо проводить дополнительные методы исследования, такие как офтальмоскопия, УЗИ и КТ.

УЗИ обеспечивает визуализацию как при прозрачных, так и при непрозрачных средах глаза, мониторинг за течением процесса как до, так и во время и после лечения. Метод безопасен, и его следует обязательно применять при подозрении РБ. КТ обеспечивает контроль состояния орбиты, костных стенок и канала зрительного нерва, своевременное выявление метастазов в головной мозг. КТ следует проводить всем детям старше 1 года и при показаниях детям до 1 года жизни, но не чаще 1 раза в год.

При нетипичной клинической картине, на далеко зашедших стадиях или неэффективности противовоспалительной терапии в диагностический комплекс целесообразно включать иммунологические методы (РО-тест; определение уровня эритропоэтина в СК) диагностическая ценность которых достигает 75%. При невозможности уточнения диагноза неинвазивными методами применяют ТИАБ.

Лечение РБ должно быть комбинированным с обязательным включением полихимиотерапии. Дифференцированное лечение проводится в зависимости от стадии заболевания и локализации

процесса. При 1-П стадии проводится локальное разрушение опухоли (брахитерапия, лазердеструкция, криодеструкция или их сочетание). При невозможности сохранения глаза прибегают к энуклеации.

Методом выбора является разработанная схема неадъювантной полихимиотерапии, позволившая расширить рамки органосохранного лечения благодаря разрушению первичного очага или уменьшению его объема вдвое у детей с III стадией ретинобластомы, сохранить глаз не только как косметический, но и как функционирующий орган.

Побочные эффекты неадъювантной полихимиотерапии являются традиционными; необходимо обратить внимание на возможность нефропатии, нейротоксичности, кардиопатии. Однако соблюдение дозного режима (дифференцированного в зависимости от возраста), дробно-протяженного протокола и динамического контроля клинических и биохимических показателей крови (еженедельные исследования) способствует хорошей переносимости и минимизации осложнений, что повышает качество жизни.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме докторской диссертации:

1. Место КТ в диагностике и лечении ретинобластомы. // Сб. тр молод, ученых. — 1988, с.48 (соавт. Вальский В.В)

2. Трудности в КТ-диагностике ретинобластомы // Сб. трудо] Всесоюзн. конф. «Опухоли и опухолеподобные заболевания орган; зрения» — М., 1990, с. 64 - 65. (соавт. Вальский В.В.)

3. Ультразвук в дифференциальной диагностик ретинобластомы и других форм глазной патологии у детей раннег» возраста // Матер. Всесоюзн. конф. по ультразвуку в онкологии. — М., 1990., с.54-56 (соав. Малюта Г.Д., Бердыев Б.Д)

4. О кооперированных международных исследованиях п< ретинобластоме // Тезисы 7 съезда офтальмологов Украины. — 1990 с.72 (соат. Бровкина А.Ф)

5. Ультразвуковой контроль эффективности брахитерапш ретинобластом // Матер, симпоз. с междун. участ. — Суздаль, 1991 с. (соавт.Тимакова В.И., Зарубей Т.Д., Малюта Г.Д).

6. Ультразвуковая диагностика в лечении ретинобластом // Сб статей по офтальмологии. — Якутск, 1995, с.67-69 (соавт Зарубей Т.Д., Малюта Г.Д.)

7. Ро-тест как метод индикации внутриглазных опухолей // Акт вопр. офтальмол.—М., 1996 , с.169-170 (соавт. Бровкина А.Ф. Ерхов B.C.)

8. Лечение ретинобластомы // Пособие для врачей. — М., 1996 10 с. (соав. Бровкина А.Ф., Пантелеева О.Г.)

9. К дифференциальной диагностике ретинобластом i ретинитов Коатса // Акт. пробл.офтальмологии, 1997, с.172-17г (соавт. Пантелеева О.Г.)

10. Фактор некроза опухоли-альфа в сыворотке крови npi ретинобластоме // Акт. вопр. детской офтальм. — М., 1997.с. 132-131 (соавт. Лихванцева В.Г.)

11. Значение РО-теста в процессе динамического наблюдения при ретинобластоме // Акт. пробл. офтальмологии. — Благовещенск, 1997, с.174-175 (соавт. Бровкина А.Ф)

12.. Химиотерапия ретинобластомы // Пособие для врачей. — М., 1997, 12 с. (соавт. Бровкина А.Ф)

13.. Юношеская ретинобластома // Тр. Оренбургск. ООЦ.— Оренбург, 1998, с.8-9 (соавт. Пантелеева О.Г.)

14.. Точковые мутации в гене RB-1 у больных с ретинобластомой // Тезисы симп. "Опухоли и опухолеподобные заболевания органа зрения" — М., 1998, с. 12-14 (соавт. Залетаев Д.В., Бровкина А.Ф., Бабенко О.В)

15. Первый опыт лечения ретинобластомы новой схемой ПХТ // Тез.симп. с межд. участ. «Опухоли и опухолепод. заболевай, органа зрения» М.,1998, с. 84-85 (соавт. Бровкина А.Ф.)

16. Применение низкочастотного УЗ при хирургических заболеваниях глаза и орбиты // Пособие для врачей., 1998г. (соавт. Бровкина А.Ф., Кодзов М.Б)

17. Поиск мутаций в гене RB-1 при различных формах ретинобластомы // 8 итог. конф. "Геном человека". — Черноголовка, 1998., с.69-70 (соавт. Бровкина А.Ф., Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бабенко О.И др.)

18. Характеристика мутаций в гене RB-1 при различных формах ретинобластомы// 9 итог. конф. "Геном человека". —1999., с.109-110 (соавт. Бабенко О.В., Залетаев Д.В., Козлова В.М. и др.)

19. Detection of mutation in RB-1 Gene in different form RBL // Abstracts of the 30 Annual Meeting of ESHG. — Portugal. — Vol. 6, Suppl. 1. — p. 162.(Zaletayev D., Nemtsova M., Babenko O.et al.)

20. Different mutation in gene RB-1 // IX ICOO, Philadelphia, USA, 1998. (Zaletaev D.V)

21. Molecular analysis of RB-1 gene Mutations in different forms of Retinoblastoma // Abst. of the 11 Ann. Meeting of the German Society of human Genetics. Germany—1999. — P. 184.( Babenko O., Nemtsova M., Zaletaev D)

22. Molecular analysis of RB-1 gene mutations, loss of heterozygosity and methylation pattern on retinoblastoma patients // Abstr. of HGM. — 2000. — Canada. — P. 13. (соавт. Babenko O., Nemtsova M., Kozlova V., Brovkina A.)

23. Molecular analysis of RB-1 anomalies of retinoblastoma patients // Abstr. of the 12 Conference HGS. — Germany—Lubeck, 2000. — P 129—130.(соавт. Babenko O.Y., Nemtsova M., Kozlova V., Zaletaev D)

24. Molecular analysis of RB-1 gene mutations, loss of heterozygosity and methylation pattern on retinoblastoma patients // Abstr. of ESHG. —Amsterdam, Netherlands, 2000. — P. 159.(соавт. Babenko O., Nemtsova M., Kozlova V., Brovkina A)

25. Карбоплатин в комплексной терапии ретинобластом // Пособие для врачей. —М, 200I.e. 14 (соавт. Бровкина А.Ф).

26.. Неоадьювантная химиотерапия ретинобластом // 7 съезд офтальмол. России — М., 2000. —с. 105. (соавт. Бровкина А.Ф)

27.. Клинико-генетическая характеристика ретинобластомы // Глава в руков. "Наследств и врожд. заболевания сетчатки и зрит.нерва". — 2001. — с. 371-384.(соавт Залетаев Д.В)

28. Молекулярная диагностика ретинобластомы. Первый опыт в России // Вестник офтальмологии. 2002, №1, с.28-32 (соавт.Бабенко О.В., Бровкина А.Ф., Козлова В.М., Немцова М.В., Залетаев Д.В.)

29. The spectrum of RB-1 gene anomalies in different form retinoblastoma // Abstr. of ESHG, Vienna, Austria, 2001. —p. 124. (Babenko O., Nemtsova M. Brovkina A. et al.)

30. Molecular pathology on retinoblastoma patients // Abstr. of HGM, 2001, Edinburgh, Scotland.—2001.— P. 19.(Babenko O.,Nemtsova M. BrovkinaA. Zaletayev D)

31. Molecular analysis of structural and functional RB-1 anomalies in different forms of RB // Abstr. of 10 Congress of Ocular Oncology, Amsterdam, 2001.p262 (Babenko O.,Nemtsova M., Kozlova V., Zaletayev D.)

32. The neoadjuvant chemotherapy of retinoblastoma // X ICOO, 2001, p.211 (Brovkina A)

33. Организация медицинской помощи больным с РБ //Сб. науч. тр. "Офтальмоонкология на рубеже веков". — СПб., 2001.— С. 323. (соавт. Бровкина А.Ф., Пантелеева О.Г.)

34. Ошибки в лечении и диагностике ретинобластом // Сб. научн. тр. «Офтальмоонкология на рубеже веков»- СП, 2001, с.356

35. Ошибки в диагностике ретинобластомы // Сб. трудов научно-практ. конф., М., 2001. — с. 80-82.

36. Отдаленные результаты лечения детей с РБ при помощи неоадьювантной химиотерапии // Сб. трудов научно-практ. конф., 2001. —с. 140-143.

37. Сравнительный анализ осложнений, возникающих при лечении разными схемами полихимиотерапии // Сб. трудов научно-практ. конф., 2001. —с. 143-147.

38. Характеристика спектра молекулярной патологии гена РВ-1 и разработка диагностического протокола при РБ // Сб. трудов научно-практ. конф., 2001. — с.6-10. (соавт.Бабенко О., Бровкина А.Ф., Козлова В., Немцова М., Залетаев Д.)

39. Дифференциальная диагностика РБ и ретинита Коатса // Методические рекомендации.(соавт.Бровкина А.Ф., Лихванцева В.Г.)

40. Химиотерапия // Глава в "Руководстве по офтальмоонкологии". М., 2002, с. 15 8-167 (соавт. Пантелеева О.Г.)

41. Спектр и частота структурной патологии гена RB-1 при ретинобластоме // Молекулярная биология, №4. (соавт. Бабенко О., Залетаев Д., Бровкина А.)

42. Функциональная инактивация генов RB-1 и р16 CDKN2A при РБ // Молек. биология, № 4.(соавт. Бабенко О., Залетаев Д., Бровкина А.Ф.)

43. Роль ТИАБ в комплексной диагностике РБ // Тезисы конгресса "Человек и лекарство". 2002, с.388 (соавт. Жильцова М.Г.)

СПИСОК ПАТЕНТОВ по теме докторской диссертации

1. Дифференциальная диагностика ретинобластомы и ретинита Коатса

№ 2169371 от 23.05. 2001

2. Разрешение на получение патента «Способ лечения больших и мультицентричных ретинобластом» № 2001113691/14 от