Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:"Ранние гены" в механизмах обучения и памяти

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П. К. Анохина

Константин Владимирович

«РАННИЕ ГЕНЫ» В МЕХАНИЗМАХ ОБУЧЕНИЯ И ПАМЯТИ

(14.00.17 — нормальная физиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

На правах рукописи

УДК 612.82.571.1.599.323

АНОХИН

Москва, 1992

/О'

\

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН.

Научный консультант — академик РАМН

К. В. СУДАКОВ.

Официальные оппоненты: — академик РАМН

И. П. АШМАРИН, •— члсн-корр. РАН

Л. И. КОРОЧКИН, — докт. мед. наук, профессор В. В. ШЕРСТНЁВ.

Ведущая организация — Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Защита диссертации состоится » (¿И>Нр . .1992 г. в . . . часов на заседании Специализированного ученого совета Д 001.08.01 при Научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН (103009, Москва, ул. Герцена, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН.

Автореферат разослан « »....... 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук

В. А. Гуменюк

дат^' }

¡.'■: - I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ol . _ I

^"'Актуальность исследования

Одним из фундаментальных свойств нервной системы является способность к длительному хранению следов памяти.

Принято считать, что ключевую роль в этих процессах играет генетический аппарат нервных клеток (Крылов и соавт. 1965; Корочкин, 1972; Тушмалова, 1973; Дергачев, 1977; Кругликов, 1981; Ашмарин, 1987; Шерстнев И соавт, 1987; Kandel, 1988; Dudai, 1989; Matthies, 1989). Данная гипотеза, выдвинутая более 40 лет назад (Katz, iaistead, 1950), получила подтверждение в многочисленных экспериментах, демонстрирующих активацию синтеза РНК и белка в <летках мозга при обучении (Hyden, 1962; Glassman, 1969; Barondes, 1975; Dunn, 1980; КруГЛИКОВ, 1981; Shashoua, 1982) И нарушение долговременной памяти при блокаде синтеза РНК и белка в мозге (Flexner 1966; MeepCOH, 1967; Agranoff, 1970; Davis, Squire, 1984).

Однако, каковы механизмы активации генетического аппарата ¡ервных клеток при обучении и какие именно гены при этом репрессируются остается неизвестным. Исследование этих вопросов шилось предметом настоящей работы.

Цели и задачи исследования

Для экспериментального поиска генов, активирующихся при бучении, требовалась исходная рабочая гипотеза. При ее формулировке ы исходили из двух теоретических предпосылок:

1. Гипотезы "конвергентного замыкания условного рефлекса на олекулярной основе" (Р.к. Anokhin, 1965, 1966; П.К. Анохин, 1968), редполагающей, что консолидация памяти использует эволюционно ревний механизм отражения внешних воздействий в химических реакциях ротоплазмы клетки и их ассоциации на общем молекулярном субстрате.

2. Идеи, что сигналы, конвергирующие к нервной клетке при Зучении, могут запускать ту же цепь внутриклеточных процессов, что

воздействия, индуцирующие клеточную дифференцировку (Крылов, 1976;

ЭКОЛОВ, 1981; Berridge, 1986; Goelet et al., 1986).

В связи с этим, мы поставили перед данной работой це экспериментально исследовать вопрос, не используются ли при обучен и форхированш шивши леханизлы активации генетического аппарат действующие при клеточном росте и дифференцировке?

В последние годы ключевые этапы процессов клеточного роста дифференцировки были подвергнуты детальному изучению (Greenbei

Ziff, 1984; Lau, Nathans, 1985; Varmus, 1987; Herrlich, Ponta, 19E Mitchei, Tjian, 1989). Известно, что активация генома при дейсть индуцирующих агентов протекает как минимум в две стадии. На перн происходит быстрая активация семейства "ранних" генов, кодируют специфические транскрипционные факторы. Затем эти факто{ транспортируясь в ядро клетки, запускают транскрипцию набс генов-мишеней ("поздних" генов). Экспрессия поздних reí перестраивает долговременные программы деятельности клетки.

Некоторые из ранних генов были идентифицированы. Hau6oj изученными ИЗ НИХ ЯВЛЯЮТСЯ c-fos И c-jun (Verma, 1986; Curr; Franza, 1988; Vogt, Tjian, 1988). ЭТИ гены У ЖИВОТНЫХ ПроклонироВ! и известны пути регуляции их транскрипции при делении

ДИффереНЦИроВКе (Curran et al., 1984, Sassone-Corsi et al., 19; vogt, Bos, 1989). Таким образом, исследование экспрессии рай генов c-fos и с-jun при обучении могло стать удобным cnocoi проверки интересующего нас вопроса о сходстве механизмов актива: генома при обучении и дифференцировке.

Поэтому перед настоящей работой были поставлены следую экспериментальные задачи:

1. Выяснить, функционирует ли в нервных клетках двухфазный механ регуляции транскрипции с участием ранних генов c-fos и c-jun.

2. Определить, участвуют ли ранние гены c-fos и c-jun в актива генетического аппарата клеток мозга при обучении и формирова памяти.

3. В случае выявления экспрессии ранних генов при обучении:

а), выяснить роль отдельных компонентов системной архитектор поведенческих актов в мозговых механизмах активации ранних ген

б), исследовать мозговую локализацию экспрессии ранних ге при отдельных формах обучения.

Основные результаты исследования и их новизна

В работе экспериментально установлено, что активация знетического аппарата нервных клеток при обучении происходит с эмощыо регуляторного механизма, аналогичного тому, который пользуется при делении и дифференцировке клеток.

Исследованы некоторые свойства работы данного механизма в 1етках нервной системы. Показано, что активация транскрипции эоисходат в две фазы. Установлено, что в составе первой фазы шуцируются регуляторные гены c-fos, c-jun и zif/286, кодирующие занскрипционные факторы из семейств белков с "лейциновыми ¡стежками" и "цинковыми пальцами". Выяснено, что базальная сспрессия генов c-fos и c-jun в нервной системе находится на низком ювне, а после соответствующей стимуляции (обучение, судорожная ;тивность) экспрессия резко возрастает, причем активация >анскрипции данных генов может происходить на фоне блокады синтеза !лка в мозге. Обнаружено, что индукция генов c-fos и c-jun в ¡рвных клетках является кратковременной и подавляется белковыми юдуктами, синтезирующимися в результате первой волны транскрипции. :тановлено, что через 4-6 часов после индукции ранних генов в мозге оникает вторая волна экспрессии генов.

Впервые исследованы характеристики экспрессии ранних генов в рвной системе при обучении. Обнаружено, гены c-fos и c-jun :тивируется в мозге при разных видах обучения и у разных видов вотных. Установлено, что по мере потери новизны воздействия данный ханизм активации генетического аппарата нейронов перестает йствовать и экспрессия c-fos и c-jun угасает.

Показано, что паттерны экспрессии гена c-fos в мозге при учении зависят от характера поведенческой задачи и имеют разную намику угасания в разных структурах мозга в ходе выработки навыка, помощью метода гибридизации in situ'охарактеризована локализация спрессии c-fos при некоторых видах обучения.

Установлено, что экспрессия ранних генов c-fos и c-jun в нервной стеме при поведении специфически связана с обучением и рмированием памяти и не вызывается такими составляющими системной хитектоники поведенческих актов, как обстановочная афферентация, тивация, выполнение программы действия или достижение результата.-

з

Проведенный экспериментальный и теоретический анализ поззо.1 сформулировать следующие концептуальные положения:

Активации генома нервных клеток при обучении происходи помощью особого регуляторного механизма. Он складывается из ; стадий. На первой стадии, протекающей в момент обучения, в нерг клетках происходит индукция специфического семейства "ранних" геи кодирующих транскрипционные факторы. В клетках мозга к таким ге относятся с-гов, с-]ип и г![/2вб. Активация данных генов поведении происходит на основе взаимодействия комплекса афферент возбуждений, специфических для ситуации обучения. Синтезируют» при этом транскрипционные факторы запускают вторую волну экспрес генов. В ее состав входят эффекторные гены, обеспечиваю модификации нервных клеток, связанные с долговременным хранен следов памяти. Данный двухфазный механизм вовлечения генетическ аппарата нервных клеток в формирование памяти родственен механиз перестройки программ экспрессии генов в клетках во время клеточн роста и дифференцировки.

Научно-практическое значение работы

В работе впервые идентифицированы регуляторные ге индуцирующиеся в мозге при обучении. Выявлен основанный на экспрессии двухфазный механизм активации генома нервных клеток, данные имеют существенное значение для понимания молекуляр механизмов памяти.

Обнаружение индукции с-гоя и с-jun при обучении позвол использовать эти гены как инструмент для выяснения механиз передачи сигналов от мембраны к геному, а также поиска "поздн генов, экспрессирующихся в нейронах при консолидации памяти. Кр того, экспрессия ранних генов может быть использована молекулярный маркер для выявления областей и зон моз вовлекающихся в пластические перестройки при обучении.

Результаты работы могут также послужить основой для но подходов к направленному поиску фармакологических средств, влияю на функции нервной системы через действие на генетический аппа нервных клеток.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на: 2-й Советско-Японской энференции "Физиология эмоций" (Осака, 1987); XIII Итоговой сессии i-та нормальной физиологии АМН СССР (Москва, 1988); Конференции i-та экспериментальной биологии им. Ненского (Варшава, 1988); !ждународной практической конференции "Гибридизация in situ" 1ондон, 1989); Научной конференции Отдела исследований мозга и шедения, Открытого Университета (Милтон Кейнес, 1989); ¡ждународной школе "Анализ изображения и новые методы исследований >зга" (Милтон Кейнес, 1989); Сателлитном симпозиуме XXXI Конгресса [зиологических наук "Молекулярные основы действия биологически ливных веществ на поведение" (Таллин, 1989); xxvin Совещании по юблемам высшей нервной деятельности (Ленинград, 1989); 2-й есоюзной Конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга ловека" (Ленинград, 1990); xv Итоговой сессии Ин-та нормальной :зиологии АМН СССР (Москва, 1990); 1-й Европейской конференции :ервные механизмы обучения и памяти" (Лондон, 1990); Заседании сковского физиологического общества (Москва, 1990); Международной оле "Нейробиология развития" (Падуя, 1990); Симпозиуме овременные аспекты системогенеза" (Москва, 1991); ветско-Американском симпозиуме "Молекулярная нейробиология" (Киев, 91 ) ; Международном симпозиуме "Обучение и пластичность у птиц" илтон Кейнес, 1991); 14-м Съезде Европейской ассоциации нейронаук эмбридж, 1991); vin Международном семинаре по развитию теории нкциональных систем "Системные механизмы обучения и памяти" осква, 1991); 1-м Совещании по картированию мозга (Москва, 1991); й Международной конференции "Мир через науки о разуме и мозге" амаматсу, 1992).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания гериала и методов, шести глав результатов исследований, обсуждения выводов. Она изложена на 316 страницах машинописного текста и 1ержит 76 рисунков. Библиографический указатель состоит из 612 сочников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Работа проведена на самцах мышей линии cbwa весом 23-; г , самцах крыс линии Вистар весом 250-300 г , самцах капшонн крыс в возрасте 3-х недель, котятах обоего пола в возрасте 4-недель и цыплятах обоего пола в возрасте 1-4 дней.

Поведенческие методики. В работе исЪользованы следующие стандартн поведенческие методики: определение индивидуальной поведенческ активности мышей в тесте "открытого поля" (Вальдман и соавт., 1976 Обучение мышей пассивному избеганию в модели "step-down" (Kameya et ai., 1986); обучение мышей условной реакции активного избегания навыку активного избавления от тока в камере с полкой_(гетр et ai 1966); Обучение ЦЫПЛЯТ пассивному избеганию (Cherkin, 1972 обучение цыплят зрительной дискриминации пищи на "гравийном пол (Andrew, Rogers, 1972); зрительная стимуляция новорожденных ЦЫПЛЯТ новой среде (Rose, 1977); монокулярная зрительная стимуляция котят НОВОЙ среде (Singer, 1979).

Вещества. Для индукции судорожной активности животные (крысы, мьш цыплята) получали внутрибрюшинные инъекции коразола (Pentyier tetrazoie, "sigma") в дозе 50 мг/кг. Для блокады синтеза белка мозге мышам ВВОДИЛИ циклогексемид (Actidione,"Serva")-120 МГ/КГ,П/

Анализ экспрессии генов. Общую транскрипционную активность клег мозга измеряли по степени включения ^-уридина в новообразующу! РНК. ^-уридин вводили животным в дозе 2 мкКю/г, в/бр за 60 мин декапитации. Тотальную РНК из ткани мозга выдел; гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом (chomczynski, sacc; 1987). Суммарную транскрипционную активность оценивали на жидкост: сцинцилляционнном счетчике (Rack-Beta, "LKB") по соотношению рад активности препаратов РНК к невключившейся метке в ткани мозга.

Количественную оценку уровней мРНК отдельных генов в ткани мо проводили методом блот-гибридизации. Тотальную РНК выделяли структур головного мозга гуанидин-тиоцианат-фенол-хлорофоры методом (chomczynski, sacchi, 1987). Формальдегид-агарозный re электрофорез РНК, перенос РНК на нейлоновые фильтры (Hybond

mersham"), НИК-траНСЛЯЦИЮ С ИСПОЛЬЗОВЭНИеМ [d-32P]-dNTP ("ИЯФ", Ташкент), гибридизацию и авторадиографию проводили по стандартным годикам (Маниатис и соавт., 1984). Количественное измерение гналов осуществляли на сканирующем денситометре chromoscan-з

эусе-ЬоеЫе) И ДеНСИТОМвТре DU-70 (Beckman).

Паттерны экспрессии мРНК отдельных генов в структурах мозга 7чэли методом гибридизации in situ. Криостатные срезы мозга шциной 12 мкм фиксировали в 4% параформальдегиде. Прегибридизацию, 5ридизацию, отмывку и авторадиографию срезов проводили по зндартным методикам (Young, 1986). В качестве гибридизационных адов использовали синтетические олигонуклеотиды длиной 45-50 и.о., 1еные ПО 3'-концу [CX-^SJdATP (1200 КЮ/ММОЛЬ, "NEN") с помощью эминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы ("Pharmacia"). Экспозицию ;зов проводили вместе с радиоактивными стандартами (14с, nershain") С пленкой Hyperfilm-ßmax ("Amersham") . Анализ ^орадиограмм осуществляли с помощью компьютерной системы анализа Сражения (Magiscan-2a, "Joyce-Loeble").

Для иммуногистохимических экспериментов использовали вибратомные ;зы мозга толщиной 50 мкм. Фиксацию мозга производили перфузией ютных 4% р-ром параформальдегида. c-fos - подобную иммуно-жтивность в клетках мозга определяли авидин-биотин-пероксидазным юдом (Hsu et ai., 1981) с помощью поликлональных антител к белку ros ("Medac", Hamburg) В разведениях 1:1000 - 1:2000 И Набора :tastain Élite (Vector Labs).

»ридизационные зонды. Для блот-гибридизации использовали кДНК :ледовательность гена v-fos (предоставленную др-ом В.Бухманом), 1гмент экзона 4 гена c-fos цыпленка (предоставленный др-ом ;awai), кДНК гена с-jan человека (предоставленную др-ом ireathnach), КДНК Гена v-Jun (предоставленную др-ом Т.Bos) и кДНК [а ß-актина.

Для in situ гибридизации использованы смысловые и тивосмысловые синтетические олигонуклеотиды комплиментарные ованиям 2341-2383 Гена c-fos цыпленка (Fujiwara et al., 1987), стку, кодирующему аминокислоты I-I5 в гене c-fos крысы (curran et , 1987), и участку, кодирующему аминокислоты 2-16 в гене zif/гвб

lbrandt, 19В7).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. МЕХАНИЗМ ДВУХФАЗНОЙ АКТИВАЦИИ ГЕНОМА НЕРВНЫХ КЛЕТОК

Если активация генома в нервных клетках при обуче! осуществляется с помощью тех же механизмов, что и при клеточ! росте и дифференцировке, то при определенных воздействиях на клеп нервной системы в них должен запускаться двухфазный механк регуляции транскрипции с характерной индукцией ранних генов с-гоб c-jип на первом этапе. Проверке этого предсказания и были посвяще эксперименты настоящей главы. В качестве модельной стимуляи нервных клеток было использовано введение животным судорожных д коразола.

1.1. Характеристики и особенности экспрессии генов с-гоя и С-./Ш1 в нервной системе

В мозге контрольных мышей содержание мРНК генов с-{об и с-} находилось на низком уровне, граничащем с порогом детекции метод блот-гибридизации. Уровни мРНК обоих генов были несколько выше передней мозге (кора головного мозга и гиппокамп), чем в подкоркой структурах и уровень мРНК с-]ип был незначительно выше, чем мР

С-/05.

Введение судорожной дозы коразола (50 мг/кг) вызывало индукц экспрессии обоих генов. Ее выраженность и динамика была различ» для с-тоя и с-^ип и по разному проявлялась в переднем мозге подкорковых структурах. В переднем мозге через 30 минут пос. инъекции коразола уровень мРНК с-£ов повышался в 14 раз по сравнен] с контрольный, оставался на том же уровне через 60 минут, рез: снижался до уровня, незначительно превышавшего контрольный через часа и не определялся через 8 часов. Индукция мРНК с-^ап в эт> структурах была менее выраженной, однако более продолжительной ] времени. Через 30 мин после введения коразола экспрессия с-я увеличивалась в 3,5 раза, через I час-в 4 раза, через 2 и 8 часс содержание мРНК c-juп все еще превышало контрольный уровень 3,5-2,5 раза.

в

В подкорковых структурах индукция мРНК c-fos была менее сраженной и происходила в более поздние сроки после введения ;оразола. Максимум активации c-fos - в 3 раза, набюдался через I час юсле инъекции, а через 2 и 8 часов уровни мРНК c-fos практически не >пределялись. Сходную динамику, однако с еще менее выраженной [ндукцией претерпевали уровни мРНК c-jun.

Введение коразола на фона действия циклогексемида (120 мг/кг) шивало выраженную "супериндукцию" обоих генов. Она проявлялась в юлее высоких уровнях мРНК на пике индукции и более продолжительном охранении повышенной экспрессии. В переднем мозге индукция c-fos [роисходала в 25 раз через I час, продолжала оставаться повышенной в I раз через 2 часа и превышала контрольный уровень в 3 раза через 8 асов. Сходную динамику имела индукция гена c-jun. В подкорковых труктурах его "супериндукция" проявлялась повышением уровней мРНК боих генов в 20-25 раз через I час после введения коразола, охранением повышенных в 5-6 раз уровней мРНК через 2 часа и нижением к недектируемому уровню через 8 часов.

При ГИбрИДИЗаЦИИ in situ В МОЗГе КОНТРОЛЬНЫХ КРЫС МРНК c-fos рактически не определялась. У животных через 60 мин после инъекции удорожных доз коразола наблюдалась интенсивная экспрессия c-fos, реимущественно в коре больших полушарий и гигаюкампе.

В иммуногистохимических опытах в мозге контрольных крыс бнаруживались лишь отдельные нервные клетки с c-fos ммунореактивностью. Слабая окраска, свидетельствующая о наличии -fos, наблюдалась в нейронах энторинальной и пириформной коры, ирамидных клетках полей са^ саз гиппокампа и гранулярных клетках убчатой извилины. Окраска была локализована в ядрах клеток. В одкорковых структурах у контрольных животных c-fos иммунопозитивные летки практически не обнаруживались. Через 3 часа после введения оразола большое число нейронов коры и гиппокампа имели выраженную -fos иммунореактивность. В коре распределение иммунопозитивных леток было относительно равномерным по всем слоям и не наблюдалось белом веществе. В гиппокампе наибольшая плотность c-fos кспрессирующих нейронов наблюдалась в зубчатой извилине. В эдкорковых структурах также обнаруживалось большое число c-fos лмунопозитивных клеток, с высоким сосредоточением в миндалине, эрегородке и хвостатом ядре.

Таким образом, два представителя семейства ранних генов-с-гоя с-л'ип-экспрессируются в клетках мозга при судорожной стимуляци Активация обоих генов происходит одновременно, что допуска возможность кооперативного взаимодействия их продуктов, необходимо для запуска транскрипции поздних генов. Белковые продукты гена с-£ обнаруживаются в нейронах и имеют ядерную локализацию, что так указывает на возможность их участия в механизмах нейрональн пластичности. Характеристики экспрессии генов с-гоэ и с-}ип нервной системе отвечают всем критериям раннего геномного ответа моделях роста и дифференцировки - низкая экспрессия в покое, быстр и сильная индукция, ее независимость от синтеза белка, коротк активация транскрипции, быстрое торможение транскрипц образующимися белковыми продуктами.

1.2. Динамика транскрипционной активности клеток мозга при индукции ранних генов

Цель данных экспериментов заключалась в том, чтобы провери происходят ли изменения экспресии поздних генов в условиях, ког наблюдается индукция ранних генов. В качестве индуцирующе воздействия мы вновь использовали судорожную активность, вызываем коразолом. Опыты предыдущей серии показали, что белковые продук ранних генов накапливаются, в ядрах нейронов через 3 часа пос введения коразола. Если они способны активировать транскрипц других генов, то вторую волну изменений транскрипции следует ожида начиная с этого времени.

Динамика синтеза РНК в переднем мозге мышей после введен коразола представлена на рис. 2. Через 30 мин после инъеки наблюдалось повышение включения ^-уридина на 63% от контрольно уровня, через I час синтез возвращался к базальному уровню, через часа падал на 30% ниже уровня контрольных животных, через 4 ча вновь возвращался к норме, а через 6-8 часов наблюдался второй л синтеза РНК, достигавший 260% от контрольного уровня. Через 24 ча синтез РНК все еще оставался повышенным, составляя 138% от уроЕ контрольных животных (рис.2).

А

• -р«0.05 • • -р<0.01

0 1 2 3 4 б 8 24 Часы

В

с-£О8

□ а,в 1 в э а в а м

Часы

Рис Л. Динамика синтеза РНК (А) и содержания мРНК гена с-Соб (В) в переднем мозге мышей после введения судорожной дозы коразола (50 мг/кг). По оси абсцисс - время после введения коразола. По оси ординат - удельная радиоактивность РНК из переднего мозга мышей,получивших коразол (в % по отношению к контролю)

Исследование динамики экспрессии гена с-{об в переднем мозге показало, что увеличение уровней мРНК этого гена наблюдалось через 30 мин после введения коразола, достигало максимума через I час, снижалось до контрольного уровня через 3 часа и оставалось на этом уровне на всем остальном протяжении эксперимента (рис. 2).

Итак, полученные результаты показывают, что при судорожной активности вслед за экспрессией в нервной системе ранних генов наблюдается вторая волна транскрипции, свидетельствующая об индукции поздних генов. Таким образом, транскрипционный ответ нервных клеток на судорожную стимуляцию протекает в две стадии, так же как и активация генома других соматических клеток при воздействиях, ведущих к делению и дифференцировке.

2. ЭКСПРЕССИЯ РАННИХ ГЕНОВ В МОЗГЕ ПРИ ОБУЧЕНИИ ПАССИВНОМУ ИЗБЕГАНИЮ

В настоящей серии опытов исследовался вопрос, может экспрессия ранних генов, обнаруженная на модели судорож] активности, осуществляться в клетках мозга в нормальных услови! при естественном обучении.

2.1. Экспрессия генов с-гоз и с-]ип в мозге мышей при обучении пассивному избеганию

Обучение мышей пассивному избзганию проводили по метода Катеуата е! а1., (1986) В Камере С ЭЛвКТрОДНЫМ ПОЛОМ, В Цент

которого был установлен деревянный кубик размерами 4x4x4 см. Мы помещали из "домашней" клетки на кубик и регистрировали латентн период спуска животного на электродный пол (ЛС). Сразу после тог как мышь касалась пола четырьмя лапами, на него подавался ток частотой 50 Гц и напряжением 35-40 В. Запрыгивая на кубик, мы обучалась избавляться от электрического воздействия (ЛИ).

При обучении мыши спускались с кубика с латентным периодом 9,0 1,8 сек, а при нанесении ударов тока находили избавление с латентн периодом 23,9 ± 6,7 сек.

При тестировании животных через 24 часа после обучения повышался до 250,3 ±34,3 сек, а ЛИ сокращался до 2,7 ± 0,8 сек, ч достоверно отличалось (р < 0,001) от данных показателей в сеан обучения. Через 7 дней после обучения ЛС составляла 283,8 ± 16 сек, а ЛИ-2,9 ± 1,1 сек. Эти показатели достоверно отличались таковых в день обучения и достоверно не отличались от данн тестирования через 24 часа после обучения.

Анализ динамики синтеза РНК в переднем мозге обученных мышей 1 включению ^-уридина показал, что через 30 мин интенсивное транскрипции возрастала на 37%, через час после обучения эт< показатель возвращался к базальному уровню, через 2 часа синтез Р1 падал на 48% и через 4 часа вновь возвращался к контрольному уровю Затем, через 6 часов, наблюдалось незначительное повторное повышен! синтеза РНК на 13% и незначительное снижение (на 13%) через 8 час<

еле обучения. Через 24 часа интенсивность синтеза РНК у обученных шей не отличалась от показателей контрольных животных.

Уровни мРНК с-гоб в переднем мозге мышей повышались через 15 мин еле обучения, достигали максимального уровня, превосходящего нтрольные значения в 3,3 раза, через 30 мин и сохранялись вышенными в течение двух часов. Уровень мРНК с-_/ип увеличивался рез 15 мин после обучения в 1,8 раза.

Таким образом, на ранних сроках после обучения мышей в тесте ссивного избегания в переднем мозге животных увеличивается синтез К. В составе данной волны транскрипции индуцируются ранние гены

Соз И с-_;ип.

2.2. Экспрессия генов c-fos и c-jun в мозге цыплят при обучении пассивному избеганию

Обучение двухдневных цыплят пассивному избеганию проводилось по годике cherkin (1972) и состояло в однократном предъявлении на 10 < светлой металлической бусинки диаметром 4 мм, покрытой либо цой (В), либо горьким веществом - метилантранилатом (МА). Еще одна ¡шла животных являлась пассивным контролем (ПК). Через 30 мин :ле обучения цыплят тестировали, предъявляя им на 10 сек сухую галлическую бусинку и регистрируя их реакцию (клевание или 5егание). Более 85% цыплят группы В клевали бусинку и более 80% 1лят группы МА избегали ее. Только животные, отвечающие этим сериям, были использованы для выделения РНК после тестирования.

РНК выделяли из двух структур мозга цыплят - промежуточного ■ггрального гиперстриатума (ПМВГ) и параольфакторной доли (ПОД), горые в экспериментах других авторов были идентифицированы как таические для формирования данного поведенческого навыка (Rose,

34; Stewart, 1990).

Как показали проведенные нами опыты, через 30 мин после обучения :сивному избеганию уровни мРНК c-fos в ПМВГ и ПОД обоих полушарий гченных цыплят увеличивались в 2-3 раза по сравнению с группой, 1учавшей бусинку, покрытую водой. В "водной" группе также 5людалось незначительное увеличение экспрессии c-fos по сравнению штактными животными.

Итак, эксперименты настоящей серии подтверждают наблюд< предыдущего раздела об активации генов c-fos и c-jun в мозге обучении пассивному избеганию. В мозге цыплят экспрессия происх( в ПМВГ и ПОД - структурах, где на более поздних сроках п< обучения пассивному избеганию увеличивается синтез гликопротеинс наблюдаются долговременные перестройки синаптических св. (Stewart, i99ú; Rose, 1991). Таким образом, результаты данных OIH укладываются в схему: обучение =» индукция ранних генов => инду] поздних генов =» изменение эффективности синаптических связей mi нейронами => долговременное хранение энграммы.

3. ЭКСПРЕССИЯ РАННИХ ГЕНОВ В МОЗГЕ МЫШЕИ ПРИ ОБУЧЕНИИ АКТИВНОМУ ИЗБЕГАНИЮ

Данная модель обучения была использована для исследов вопроса о специфичности связи экспрессии ранних генов в мозг формированием памяти. Обучение мышей проводили по методике гелц а1., 1966. Сеанс обучения продолжался около 20 мин., в теч1 которых животным предъявлялось 30 сочетаний условного сигнала (I и звук) с ударом электрического тока через электродный пол кам1 Животные обучались избегать тока, запрыгивая на полочку в каш Мыши, помещавшиеся одновременно с обучаемыми животными в сосе, отсек камеры без полочки, не имели возможности избе: электрического тока, но получали такое же количество уело] сигналов и ударов током и в той же последовательности, ка обученные мыши. Их использовали в качестве "активного контро. "Пассивным контролем" служили мыши, взятые для выделения РНК домашней клетки.

3.1. Экспрессия генов с-гоя и с-]ип в мозге мышей после однократного сеанса обучения активному избеганию

В группе животных, использованных для изучения дина: формирования навыка и долговременности его сохранения, про] ошибочных реакций в ходе выработки навыка сокращался с 78±9% в о1 на первые 10 предъявлений условного сигнала до 23±П% в ответ

[оследние 10 предъявлений. Среднее время выполнения реакции гсеньшалось с 9,9±0,4 сек в первые 10 предъявлений до 3,1±0,6 сек в :оследние 10 предъявлений. В сумме за сеанс обучения мыши совершили 5±3% ошибок от числа предъявлений и избегали подачи тока со средним ременем реакции 5,0±0,5 сек. При тестировании этих животных через 4 часа наблюдалось достоверное уменьшение числа допущенных ошибок р<0,03) и среднего времени выполнения реакции (р<0,01).

Уровни мРНК с-гоэ в переднем мозге (коре и гиппокампе) мышей разу после окончания 20 минутного сеанса обучения активному [збеганию увеличивались, по сравнению с "пассивным" контролем, в 7 >аз в опытной группе (6 животных) и в 3,4 раза в группе активного :онтроля (6 животных). В переднем мозге мышей через 30 мин после >бучения пассивному избеганию (6 животных) экспрессия с-гоя величивалась в 6,4 раза. Относительный уровень мРНК с-./ип повышался :осле обоих видов обучения в 3-3,5 раза, а у группы "активного" юнтроля увеличивался в 1,7 раза (рис. 2).

Ис.2. Экспрессия генов с-гоэ и c-jun в переднем мозге мышей после обучения активному избеганию. По оси ординат - уровни мРНК в процентах по отношению к "пассивному" контролю. А - "пассивный контроль; Б - обучение пассивному избеганию; В - обучение активному избеганию; Г - "активный" контроль при обучении активному избеганию; Д - хроническое обучение активному избавлению.

В следующей серии исследовали экспрессию генов с-гоэ и с-^п в различных структурах головного мозга. Уровни мРНК с-гоз и c-jun измеряли в коре головного мозга, гиппокампе, мозжечке и подкорковых структурах мозга, выделенных у мышей сразу после обучения.

Максимальное повышение содержания мРНК с-гоя наблюдалось в коре головного мозга и мозжечке как у обученных животных, так и у активного контроля. При этом уровни экспрессии с-гоэ в коре головного мозга были выше у обученных животных, чем у "активного" контроля, а в мозжечке практически не отличались друг от друга. Наибольшее превышение экспрессии с-гогг у обученных мышей по отношению к активному контролю наблюдалось в гиппокампе (в 2,0 раза) и подкорковых структурах (в I,9 раза).

Относительный уровень мРНК с-}ип в исследованных структурах мозга был ниже, чем уровень мРНК с-{об и почти не отличался у обученных животных от "активного" контроля. Наибольшее различие в уровнях мРНК с-]ип у этих двух групп наблюдалось в гиппокампе, где уровень экспрессии был в 1.4 раза выше у обученных животных, чем у "активного" контроля.

3.2. Индивидуальный анализ экспрессии гена с-гоб в переднем мозге мышей после обучения активному избеганию

В данной серии было использовано 50 животных. В группах обучения и "активного" контроля было по II мышей, а группе "пассивного" контроля - 12 мышей. Кроме того, 8 животных обучали избавлению (условный сигнал предъявлялся одновременно с подачей электрического тока) и еще 8 мышей помещали в экспериментальную камеру, где им предъявляли условные сигналы без подкрепления электрическим током. РНК, выделенная из переднего мозга (кора головного мозга и гиппокамп) каждого животного, составляла отдельную пробу и анализировалась отдельно.

Через 30 мин после окончания сеанса уровни мРНК с-{об были достоверно повышены в переднем мозге обученных животных (в 1,9 раз), группы "активного" контроля (в 1,8 раз), животных, обученных избавлению, (в 2,1 раза) и получавших условные сигналы без подкрепления (в 1,8 раза) по сравнению с "пассивным" контролем.

Затем мы проанаш; лровали зависимость содержания мРНК с-го.г в переднем мозге мышей от показателей их обучения активному избеганию. Группа обученных животных была условно разделена на две подгруппы по пять мышей - с малой (30% и менее) или большой (40% и более) долей ошибок, допускаемых в ответ на последние 10 предъявлений условного сигнала. Такой операцией мы достигали разбиения популяции экспериментальных животных на две группы, каждая из которых получала по 30 сочетаний! условного сигнала и тока, но животные с малой долей ошибок (МДО) обучились избегать тока раньше и затем лишь выполняли уже выработанный навык, в то время как мыши из группы с большой долей ошибок (БДО) продолжали совершать ошибки и обучаться до самого конца сеанса. При сравнении уровней мРНК с-го* в мозге животных этих групп он оказался в 1,8 раз выше для мышей из группы БДО, у которых обучение занимало более длительное время (рис. 3). У животных из группы "активного" контроля, разделенной на подгруппы по принципу парности к обученным животным и, следовательно, получавших удары тока в том же количестве и последовательности, что и парные им животные соответствующих обученных подгрупп, различий в уровнях мРНК с-гоэ обнаружено не было (рис. 3).

3.3. Экспрессия гена с-^оэ в переднем мозге мышей после хронического обучения активному избавлению

При ежедневном обучении мышей реакции избавления существенное сокращение среднего времени реакции происходило в первые пять сеансов обучения, в дальнейшем этот показатель стабилизировался на одном уровне.

После первого сеанса обучения избавлению в переднем мозге мышей наблюдалось значительное увеличение экспресии генов с-гоя и c-jun. Содержание мРНК этих генов возрастало по сравнению с "пассивным" контролем на 570% для с-гоэ и 310%-для c-jun.

На девятый день опыта после очередного сеанса обучения избавлению уровни мРНК с-Гоб и с-^ип в переднем мозге экспериментальной группы мышей претерпевали совсем незначительное увеличение, лишь на 30% превышающее показатели "пассивного" контроля (рис. 2).

ШМДО БДО

0.50

р<0.03

0.40

0.10

0.3 0

0.20

0.00

Об

лк

Рис. 3. Уровни мРНК гена с-гоя в переднем мозге мышей с различи! скоростью обучения. По оси абсцисс - уровень мРНк с-гоя относительных оптических единицах. Обозначения: Об - груга обученных животных; АК - "активный" контроль; МДО - животш с малой долей ошибок в последние 10 сочетаний; БДО животные с большой долей ошибок в последние 10 сочетаний.

Таким образом, эксперименты, изложенные в настоящей глав« выявили существенное увеличение уровней мРНК генов с-гоэ и с-]ип мозге мышей при обучении условной реакции активного избегания. 01 значительно выше у обучающихся животных, чем у парного I "активного" контроля, получавшего точно такое же по числз длительности и последовательности воздействие условных сигналов ударов тока. Индивидуальный анализ уровней мРНК с-{ов у обучавшихс мышей показывает, что экспрессия этого гена коррелирует показателями обучения животных. При этом она не имес

непосредственной зависимости от числа отрицательных подкреплений щ получении ударов тока или числа положительных подкреплений щ избегании ударов тока. Выполнение уже приобретенного навы! активного избегания не вызывает заметной активации экспрессии гене

с-{ов И с-^ип.

4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ АКТИВАЦИИ РАННИХ ГЕНОВ В МОЗГЕ ПРИ ПОВЕДЕНИИ

Эксперименты предыдущих разделов показали, что экспрессия с-тоб и c-juг, наблюдается в клетках мозга при различных формах естественного обучения. Однако поскольку поведенческие акты при обучении включают в свою операциональную архитектонику целый ряд компонетов, таких как мотивационное возбуждение, обстановочная афферентация, пусковая афферентадая, реализация программы действия, получение и оценка результата поведения, следовало проверить, не может ли экспрессия ранних генов в нервных клетках быть вызвана не обучением, а каким-то из этих факторов.

Эксперименты, описанные в настоящей главе, были направлены на проверку данного вопроса.

4.1. Экспрессия гена с-£оэ в мозге мышей при неизбегаемой электроболевой стимуляции и ее отмене

Данная серия опытов была посвящена выяснению вопроса, не может ли 5олевое раздражение, получавшееся животными в ходе предыдущих зкспериментов, являться причиной индукции ранних генов в нервной :истеме. Если это так, то повторные неизбегаемые раздражения )лектирческим током, несмотря на потерю ими компонента новизны, (олжны вызывать экспрессию этих генов. Именно это допущение гроверялось нами в экспериментах настоящего раздела.

Мышей подвергали ежедневным 15-минутным сеансам неизбегаемой лектроболевой стимуляции в камере с электродным полом и определяли ровни мРНК с-{об в коре головного мозга, гиппокампе и мозжечке ерез 30 мин. после окончания очередного сеанса. Группа "пассивного" онтроля состояла из мышей, взятых из домашней клетки, а группа обстановочной стимуляции"-из животных, помещавшихся в камеру на 15 инут, но не получавших ударов тока.

Во всех трех исследованных структурах мозга животных группы пассивного" контроля мРНК с-гоя находилась на низком уровне, эизбегаемая стимуляция мышей электрическим током в первый день лзвала существенное повышение уровней мРНК с-гоб во всех трех :следованных структурах. Наибольшая индукция с-еоя наблюдалась в

мозжечке (в 5,8 раз), менее выраженная-в гиппокампе (в 2,8 раза) коре (в 2 раза). На второй и четвертый дни стимуляции экспрессия мозжечке и коре головного мозга существенно падала, а в гиппокамг продолжала оставаться на уровне первого дня стимуляции. На шестс день неизбегаемого воздействия содержание мРНК c-fos стимулированных животных во всех трех структурах практически i отличалось от уровня "пассивного" контроля.

Помещение мышей в первый день опыта в камеру без раздражен: током ("обстановочная стимуляция") также вызывало значительна активацию гена c-fos. Наиболее выраженной она была в гиппокампе, г; в 5,2 раза превышала уровни у "интактных" животных и в 1,9 р; уровни мРНК после первой неизбегаемой стимуляции. В мозжеч! индукция по сравнению с "интактными" животными происходила в 2 раза, а в коре в 1,8 раза.

На шестой день опыта часть животных, ранее получавпп неизбегаемое электрическое раздражение, помещали на 15 минут камеру без включения тока. Эта ситуация "отмены" неизбегаемо: болевого раздражения вызвала мощную индукцию экспрессии c-fos гиппокампе и коре головного мозга и не изменила уровней мРНК данно: гена в мозжечке. В гиппокампе экспрессия c-fos у группы, i получившей стимуляции, была в 6,8 раз выше, чем у животны: подвергнутых действию электрического тока. В коре эта разни составила 1,6 раза.

Таким образом, индукция мРНК c-fos, наблюдавшаяся в нервн системе мьшей при первой неизбегаемой электроболевой стимуляци угасала до контрольного уровня во всех трех исследованных структур к шестому дню воздействия, а отмена болевой стимуляции на шест день приводила к реактивации экспрессии c-fos в коре головного моз и гиппокампе. Это свидетельствует о том, что индукция c-fos в моз животных в ситуациях, сопровождающихся болевыми воздействиями, вр ли объясняется непосредственным действием ноцицептивной стимуляции

4.2. Экспрессия генов c-fos и c-jun в мозге цыплят при сенсорной стимуляции

Не исключено, что экспрессия ранних генов в нервных клетках г

обучении обусловлена любой формой переработки информации на стадии афферентного синтеза. Чтобы проверить эту возможность, мы провели специальную серию экспериментов по анализу экспрессии c-tos и c-jun при зрительной стимуляции цыплят.

Было использовано четыре группы цыплят. Цыплята первой группы вылуплялись в темноте, и их содержали в темном инкубаторе до момента декапитации на второй день после вылупления. Цыплята второй группы вылуплялись в обычном инкубаторе, и их содержали в нем при 12-часовоы световом цикле с освещением лампой 60 Вт. Их также декапитировали на второй день после вылупления, в конце светлой фазы цикла. Цыплят третьей группы после вылупления переносили из инкубатора в камеру с обогащенной зрительной средой (окрашенные предметы и игрушки, распределенные по полу камеры). Их содержали в обогащенной среде при 12-часовом световом цикле до момента декапитации, производившегося в конце светлой фазы цикла на второй день после вылупления. Таким образом, эти цыплята имели возможность адаптироваться к условиям в камере. Цыплята четвертой группы вылуплялись и содержались в обычном инкубаторе при 12-часовом световом цикле. На второй день жизни, в конце светлой фазы цикла их переносили на 60 мин в камеру с обогащенной зрительной средой и затем сразу декапитировали.

Результаты блот-гибридизации с РНК из переднего мозга четырех групп цыплят показали, что уровни мРНК c-fos и c-jun у первых трех групп были на одинаково низком уровне, не достигавшем порога для денситометрического измерения. В четвертой группе наблюдалась выраженная экспрессия c-fos и c-jun.

Таким образом, помещение цыплят в условия обогащенной зрительной среды вызывает у них мощную активацию экспрессии c-fos и c-jun в мозге. Однако у цыплят, привыкших к условиям этой зрительной среды, экспрессия c-fos и c-jun находится на таком же низком уровне, как и у животных, содержавшихся в полной темноте. Это свидетельствует о том, что процессы афферентного синтеза как таковые, без определенных дополнительных условий, не сопровождаются экспрессией генов c-fos и c-jun в нервной системе.

4.3. Экспрессия генов c-fos и c-jun в мозге цыплят

при обучении зрительной дискриминации

В настоящей серии экспериментов была предпринята попытка одновременно проверить роль нескольких факторов.

Во-первых, поскольку все предыдущие модели обучения были построены на отрицательном подкреплении, в настоящих экспериментах проверялся вопрос, не специфична ли активация c-fos и c-jun только для обучения с такой формой подкрепления. Поэтому в данной серии проводилось обучение в задаче с пищевым подкреплением.

Во-вторых, выяснялся вопрос, не обусловлена ли повышенная экспрессия ранних генов эффектами мотивационного возбуждения. Поэтому в настоящий эксперимент была включена специальная группа животных для контроля эффектов собственно пищевой депривации на экспрессию генов c-fos и c-jun.

В-третьих, поскольку во всех предыдущих опытах обучение всегда было связано с помещением животных в новую для них экспериментальную камеру и экспрессия c-fos и c-jun могла иметь какую-то связь именно с этим фактором, настоящие эксперименты были построены таким образом, что обучение происходило в знакомой для животных обстановке.

В-четвертых, эксперименты были спланированы так, чтобы исключить роль моторной и общей активации в ходе обучения за счет того, что две группы животных должны были выполнять одинаковые по моторике действия, но одна группа обучалась больше, чем вторая.

Эксперименты были построены на обучении цыплят задаче пищевой зрительной дискриминации (Andrews, Rogers, 1972). ЦыПЛЯТа ДОЛЖНЫ были обучиться отличать кусочки пищи, рассыпанные по полу камеры, от приклееных к полу гранул гравия, которые были похожи по цвету и размерам на корм.

Для того, чтобы учесть возможное увеличение экспрессии генов вследствие влияния мотивации, двигательной активности и сенсорной стимуляции, в эксперимент была введена стадия предварительного обучения. Оно состояло из трех сеансов по 8 минут, разделенных трехчасовыми интервалами, на время которых цыплят возвращали в их "домашние" камеры. Для двух груш (-/- и -/+) предварительное

бучение состояло из помещения цыплят на гравийный пол без пищи, ретью группу (+/+) помещали на гравийный пол с, пищей. Четвертой руппе (0/0) гравийный пол не предъявлялся. На следующий день роводили окончательный 8-минутный сеанс обучения. Группе -/-редъявляли гравийный пол без пищи, группам -/+ и +/+ гравийный пол пищей, а группа 0/0 оставалась в "домашних" камерах. Через 30 инут после этого сеанса обучения цыплят декапитировали, выделяли ередний мозг и индивидуально измеряли уровни мРНК с-£оз и c-jun.

Такое построение эксперимента позволяло проводить сравнение ежду экспрессией генов у цыплят, имеющих одинаковую мотивацию, омещенных в одинаковую среду, выполняющих одинаковое поведение и гличающихся только по прошлому опыту данного поведения, так что цна группа цыплят (-/+) в финальном эксперименте обучалась больше, эм вторая (+/+). Если экспрессия генов с-гоэ и c-jun при обучении-ритически связана с запоминанием нового навыка, то она должна быть лше в группе -/+, обучающейся различать пищу и гравий впервые, по эавнению с группой +/+, имевшей три сеанса предобучения в эедыдущий день.

Цыплята группы -/- при первом предъявлении им гравийного пола гз пищи клевали гранулы гравия достаточно активно (75±17 раз за 8 га), однако постепенно это поведение угасало, и на следующий день ш клевали гранулы гравия достоверно меньше (34±9, р<0,01). Цыплята эуппы -/+, впервые помещенные на второй день обучения на гравийный зл с пищей, достаточно эффективно обучились отличать пищу от завия, делая в среднем одну ошибку на три правильных клевания за ¡анс. Общее число их правильных клеваний (134+20) было сравнимо с [слом правильных клеваний цыплят группы +/+ в первый сеанс ¡учения (95±44). На второй день обучения цыплята группы +/+ гтенсивно и точно клевали пищу (388±76 правильных клеваний, 5±2 шбок).

Уровни мРНК генов с-го? и с-)ип у всех четырех групп цыплят юдставлены на рис. 4. В группе -/-, помещавшейся на гравийный пол з пищи,уровни мРНК с-Гоб были увеличены в 1,9 раз (р<0,04), а с-./ип-1,4 раза (р=0,54) по сравнению с группой 0/0. Уровни мРНК с-{ов в |уппе -/+ были в 4,8 раз выше, чем в группе 0/0 (р<0,001) и в 2,5 з выше, чем в группе -/- (р<0,001). Уровни мРНК с-]ип в группе -/+

были увеличены в 3,7 раз по сравнению с группой 0/0 (р<0,002) и 2,7 раз по сравнению с группой -/- (р<0,005).

Критическим являлось сравнение экспрессии в группах -/+ и +/ Группа -/+ имела достоверно более высокие уровни мРНК с-_/ип (164 р<0,03) и недостоверно более высокие уровни мРНК с-Гог (124 р=0,26). Однако группа +/+- являлась гораздо более активной выполнении дискриминационной задачи, чем группа -/+, так'как чис клеваний в ней было в 2,5 раза больше, чем в группе -/+. Перерасч относительных уровней мРНК на среднее число поведенческих актов каждой из групп дает показатель экспрессии с-гоэ 27,8 усл.ед. группе -/+ и 11,5 усл.ед. в группе +/+. Для с-^п эти значеи составляют 64,2 в группе -/+ и 20,2 в группе +/+.

с^ип

с-Яов

2000

1000-

0/0 -/- -/♦ + / +

0/0 -/- -/+ +/+

Рис. 4. Экспрессия генов с-Гоэ и с-_;ип в переднем мозге цыплят поел обучения в тесте зрительной дискримирнации. По оси абсцисс уровни мРНК с-еоя и с-)ип в относительных оптически единицах. Внизу - обозначения груш животных (см. текст).

Таким образом, уровни экспрессии с-гоэ в группе -/+ более, чем два раза выше, а с-}ип-более, чем в три раза выше, чем это следует и гипотезы, объясняющей их индукцию просто активацией програм действия, мотивационным возбуждением, сенсорной афферентацией ия эффектами положительного подкрепления.

5. ЭКСПРЕССИЯ РАННИХ ГЕНОВ В МОЗГЕ ЖИВОТНЫХ ПРИ МОНОКУЛЯРНОМ ОБУЧЕНИИ

Опыты, описанные в настоящей главе, были построены таким образом, чтобы сопоставить в мозге обучающегося животного экспрессию ранних генов в областях или клетках, где происходят пластические процессы, с областями и клетками, где эти процессы не протекают. Для этих целей мы воспользовались моделями унилатерального обучения, где. возможность индукции пластических перестроек в одних, но не других группах клеток обеспечивалась исходными анатомическими особенностями строения мозга животных. При этом одна модель проверяла поставленный вопрос на цыплятах, вторая-на крысах, а третья-на кошках.

5.1. Экспрессия гена c-fos в мозге цыплят при монокулярном обучении пассивному избеганию

Особенностью организации зрительной системы птиц является полный перекрест зрительных нервов на уровне chiasma opticum (Ariens-Kappera et al., 1936, Polyak, 1957, Cuenod et al., 1972). Работами Gibbs И соавторов (Bell, Gibbs, 1977, 1979; Gibbs et al., 1979) было показано, что при монокулярном обучении цыплят пассивному избеганию образование следа долговременной памяти происходит только в контралатеральном к открытому глазу полушарии и зависит от активации синтеза белка в данной половине мозга. Следовательно, если экспрессия ранних генов связана с формированием энграммы, то при монокулярном обучении цыплят она должна наблюдаться в зрительных структурах только "обучающегося" полушария, а если она связана с результатами общего возбуждения и стрессорной реакции цыпленка после клевания аверсивной бусинки, то ее, по-видимому, следует ожидать симметрично в обоих полушариях мозга. Проверке этого вопроса и были посвящены настоящие эксперименты. Помимо уже исследовавшихся ранее ПМВГ и ПОД, в этих опытах мы изучали также экспрессию c-fos в эктостриатуме (ЭС), являющемся в мозге птиц областью окончания тектофугального зрительного пути (Karten, Hodos, 1970).

Однодневным цыплятам закрывали левый или правый глаз черным непрозрачным колпачком, фиксируемым к орбите глаза биологическим

клеем. На следующее утро цыплят обучали пассивному избегаю) согласно методике, описанной в разделе 2.2.

Опыты показали, что у цыплят, обучавшихся с закрытым правь глазом, содержание мРНК с-Гоб в ПМВГ, ПОД и ЭС левого полушари находилось на низком уровне, а в структурах правого полушарк наблюдалась значительная индукция экспрессии данного гена (рис. 5).

У цыплят, обучавшихся с закрытым левым глазом, для ПМВГ и с наблюдалась обратная картина - уровни мРНК с-^об в структуре правого полушария находились на границе чувствительности метода, а левом полушарии были существенно увеличены. В ПОД экспрессия с-гоя правом полушарии была выше,чем в левом (рис. 5).

А

В

800 (00 400 200 О

ЭС ПОД ПМВГ

ЭС ПОД ПМВГ

Рис. 5. Экспрессия гена с-гоб в структурах мозга цыплят пос; монокулярного обучения пассивному избеганию. По оси абсцис

- уровни мРНК с-гоб в относительных оптических единицах. А закрыт правый глаз, Б -закрыт левый глаз. Светлая штрихов»

- правое полушарие, темная штриховка - левое полушарие.

Такш образом, в двух структурах мозга, связанных с анализе зрительной информации, - ПМВГ и ЭС -экспрессия с-гоэ наблюдалас каждый раз только в контралатеральном к открытому глазу полушарии, то же время в ПОД, которая не имеет установленных зрительных входе и является областью проекции афферентных волокон из обонятельнс луковицы, такой зависимости не прослеживалось. Эти даннь существенно снижают вероятность того, что экспрессия с-гоя п] данном обучении определяется неспецифическими эффектами обще1 возбуждения и стресса.

5.2. Экспрессия генов c-fos и zif/286 в мозге крысят при монокулярной стимуляции в новой среде

После инъекции крысам в один глаз ^-пролина в контралатеральной затылочной коре происходит сильное накопление метки. в монокулярной части первичной коры (ocim) и слабое-в бинокулярной части (ocib) (ziiies et ai., 1984), На ипсилатеральной стороне обнаруживается крайне мало метки в зоне ocim и наблюдается некоторое накопление в ocib. Все это указывает на то, что зона ocim первичной зрительной коры крыс получает проекции почти исключительно от контралатераль-ного глаза.

Следовательно, у крыс, подвергнутых монокулярному зрительному обучению, пластические перестройки должны наблюдаться преимущественно в контралатеральной, но не ипсилатеральной ocim. Если экспрессия ранних генов специфически вовлечена в данные перестройки, то она также должна происходить в контралатеральной ocim. Если же данная экспрессия обусловлена общим возбуждением и неспецифическими эффектами стрессорных гормонов и медиаторов, то она должна быть симметричной с обеих сторон. Эксперименты настоящего раздела были направлены на проверку этого вопроса.

В экспериментах были использованы капюшонные крысы обоего пола в возрасте 17-20 дней. На 17-й день после рождения у части крысят под гексеналовым наркозом зашивали веки одного (правого или левого) или обоих глаз. Утром 20-го дня часть крысят брали для иммуногистохимии и in situ гибридизации непосредственно из темной комнаты ("темновой" контроль), а часть - после одного часа экспозиции в обогащенной зрительной среде. Для гибридизации in situ мозг крысят брали сразу после окончания сеанса экспозиции, а для иммуногистохимических опытов - через 2 часа.

Как показали проведенные опыты, в зрительной коре контрольных животных, находившихся в темноте с незакрытыми глазами, экспрессия мРНК c-fos находилась на низком уровне, граничащем с чувствительностью метода in situ гибридизации. Такой же низкой была экспрессия у крысят, находившихся в темноте с одним или с обоими , закрытыми глазами.

У крысят, подвергнутых световой стимуляции с обоими открытии глазами, в обоих полушариях мозга наблюдались высокие уровни мРИ с-[оз в областях ос1м и существенно меньшие-в ос1в (рис. 6) Экспрессия была неравномерной по слоям коры, с более высокм уровнями мРНК с-/о5 в супрагранулярных (и-1У) и инфрагранулярны (VI) слоях.

Рис. 6. Паттерны экспрессии мРНК гена с-Гоэ в зрительной коре мозгг крысят после бинокулярной (А) и монокулярной (В) стимуляции в новой зрительной среде.

У крысят, подвергнутых зрительной стимуляции с одним закрытым глазом, значительно более высокие уровни мРНК т-гоэ наблюдались в зоне ос1м полушария, контралатерального к открытому глазу (рис. 6). Если стимуляция производилась с открытым правым глазом, то индукция наблюдалась в левом полушарии и наоборот. В ипсилатеральной зоне ос1м тоже отмечалась некоторая индукция экспрессии с-гоя, однако в значительно меньшей степени, чем контралатерально. Повышение уровней мРНК с-1об происходило и в зоне осгв первичной зрительной коры, где она была также выше в контралатеральном полушарии (рис. 6). В слуховой и энторинальной коре повышение экспрессии происходило симметрично с обеих сторон. Тэ^ке, как и при бинокулярной стимуляции.

аивысшие уровни мРНК c-fos наблюдались в слоях ii-iv, более низкие-слое vi и низкие-в слое v. Помимо зрительной коры, асимметрия в <спрессии наблюдалась в верхнем двухолмии и таламусе, будучи выше в энтралатеральном, чем в ипсилатеральном полушарии.

Анализ паттернов мРНК zif/габ у описанных групп животных жазал, что экспрессия этого гена происходит по теи же 1кономерностям и в тех же отделах мозга, что и гена c-fos.

Иммуногистохимические эксперименты с антисывороткой к c-fos дали зультаты, совпадающие с данными гибридизации in situ. У контрольных вотных, содержавшихся в темноте, число нейронов с c-Fos-подобной мунореактивностью было низким. Отдельные клетки встречались в ппокампе и различных слоях коры, без преимущественной локализации каком-либо из ее отделов. При бинокулярной зрительной стимуляции ачительное число иммунопозитивных нейронов появлялось симметрично обоих полушариях в областях ocim, ocib и осгм зрительной коры, в уховой и энторинальной коре. c-Fos-иммунореактивные нейроны были :редоточены преимущественно в слоях ii-iv и слое vi.

При монокулярной стимуляции происходило значительное увеличение :ла c-fos содержащих нейронов в контралатеральных, но не :илатеральных отделах ocim и осгм и в меньшей степени-в ocib. В гховой и энторинальной коре индукция была билатеральной.

Таким образом, эксперименты данной серии свидетельствуют о том, > экспрессия ранних генов происходит именно в тех структурах и тках мозга, которые осуществляют переработку и хранение новой юрмации. Опыты настоящего и предыдущего раздела позволяют лючить возможность непосредственной активации ранних генов ствием гормональных факторов, высвобождающихся в общую циркуляцию стрессе или действием медиаторных веществ, выделяемых ивационными системами мозга при обучении.

5.3. Экспрессия гена c-fos в зрительной коре котят при монокулярной зрительной стимуляции в новой среде

В первичной зрительной коре кошек существует анатомическая легация входов от разных глаз, образующая так называемые

"глазодоыинантные колонки" (Rodieck, 1979; Sherman, Spear, 198 При монокулярном обучении молодых котят возникает ситуация, когд одном и том же участке зрительной коры (поле 17) находятся регулярно чередующиеся популяции нейронов (глазодоминант колонки), на одних из которых конвергируют все сигналы, необходи для запуска пластических перестроек, а на других не хват афферентации от сетчатки. Таким образом, если активация ранних ге связана с пластическими перестройками, то при монокулярном обуче котят она должна наблюдаться только в глазодоминатных колон одного глаза. Этот вопрос исследовался в экспериментах настоящ раздела.

У котят в возрасте 30-35 дней зашивали веки правого или лев глаза и возвращали их к матери. Через день их помещали вместе матерью в темную комнату. На следующие сутки часть котят оставлял темной комнате ("темновой" контроль), а часть подверг 60-минутному сеансу экспозиции в новой среде. Сеанс состоял помещения котенка в новую для него комнату и предоставлением возможности ее обследовать. Иммуногистохимическое определение с-иммунореактивности проводили на срезах зрительной коры, взятых че; 2 часа после окончания сеанса стимуляции.

Эксперименты показали, что в зрительной коре контрольных ко1 с-гоs-иммунопозитивных нейронов практически не обнаруживалось. По монокулярной стимуляции в зрительной коре выявлялось большое чи нервных клеток с c-fos-подобной иммунореактивностью. Распределе; клеток по слоям коры было неравномерным. Высокая плотно! иммунореактивных клеток наблюдалась в слоях ii-iv и в слое vi. слоях iv-v число c-Fos-позитивных клеток было существенно ниже.

В поле 17 зрительной коры иммунореактивные клетки 6i сгруппированы в колонки. Колончатость выявлялась на коронар: срезах, однако наиболее отчетливо она была видна на горизонталь: срезах. На одиночных срезах проследить прохождение колонки нейро] через все слои коры не удавалось, однако при реконструкции учас ткани наложением проекций от нескольких соседних 50-микронных сре: колонки выявлялись более отчетливо (рис. 7). При этом была та: заметна более низкая плотность c-Fos-экспрессирующих нейронов слоях iv-v.

В поле 18 распределение нейронов, содержащих с-гоэ-иммукорегк -тивность, было равномерным, без признаков колончатого паттерна.

I

II

III

IV

V

VI

Рис. 7. Реконструкция распределения с-роб иммунореактивных нейронов в участке зрительной коры (область 17) котенка,подвергнутого 60-минутной стимуляции в новой зрительной среде. |Рекострук-ция получена путем наложения четырех соседних срезов толщиной 50 мкм.

Таким образом, эксперименты данной серии свидетельствуют о тон, что активация экспрессии с-Гоя происходит избирательно в тех нейронах зрительной коры, которые получают специфическую сенсорную афферентацию и демонстрируют пластические перестройки. Они также показывают, что при устранении одной необходимой для пластических перестроек афферентации весь остальной комплекс конвергирующих к нейронам возбуждений не способен запустить экспрессию с-гоэ.

6. КАРТИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА с-Гоэ В МОЗГЕ ЦЫПЛЯТ ПРИ ЗРИТЕЛЬНОЙ СТИМУЛЯЦИИ

Целью экспериментов настоящего раздела было исследоват зависимость между экспрессией c-fos и повышением метаболическо активности нейронов. В качестве модели была использована зрительна стимуляция новорожденных цыплят, вызывающая мощную разрядную : метаболическую активацию нейронов в зрительных структурах мозг

(L.Rogers, G.Bell, 1989).

Однодневных цыплят, вылупившихся и содержавшихся в темно) инкубаторе, помещали на 60 мин в ярко освещенную экспериментальну: камеру, содержащую несколько окрашенных предметов (игрушки) Контролем служили цыплята того же возраста, содержавшиеся все врем от момента вылупления в темном инкубаторе. Сразу после сеанс цыплят декапитировали и извлекали мозг для гибридизации in situ.

В мозге контрольных цыплят, находившихся в темноте, уровни мРН c-fos на всех исследованных уровнях нервной системы были крайн низкими. В мозге цыплят сразу после окончания одночасового сеанс зрительной стимуляции наблюдалась выраженная экспрессия c-fos Наиболее значительное повышение происходило в мозжечке, а также i области, не совпадающей с известными анатомическими структурам мозга цыпленка. Эта область и включала в себя медиальные отдел! неостриатуиа, а также часть вентрального и дорсальног гиперстриатума. Зона увеличенной экспрессии c-fos продолжалас: достаточно далеко в ростральном направлении, заканчиваясь н переднем полюсе мозга. В каудальном направлении высокие уровни мРН c-fos наблюдались в промежуточном медиальном вентрально: гиперстриатуме (ПМВГ). Некоторая индукция c-fos отмечалась зрительном тектуме, однако в других структурах зрительной системы, частности в эктостриатуме и wuist, где наблюдается максимально увеличение утилизации 2-дезоксиглюкозы при подобной стимуляци (L.Rogers, G.Beii, 1989), экспрессии c-fos не наблюдалось.

Таким образом, эксперименты этой серии указывают на то, чт индукция экспрессии c-fos в мозге цыплят при зрительной стимуляции новой среде не приурочена к зрительным путям и областям первичны зрительных проекции, демонстрирующим максимальное увеличени метаболической активности нейронов в данной модели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе удалось идентифицировать три конкретных гена (c-fos, c-jun. zif/286), экспрессирующихся в мозге животных при обучении. Все три гена кодируют различные транскрипционные факторы

(Lau, Nathans, 1987, Milbrandt, 1987, Rauscher et al, 1988).

Индукция данных транскрипционных факторов свидетельствует о том, что активация экспрессии генов в нервной системе при обучении происходит з помощью специфического транскрипционного механизма. Принципиальной особенностью этого механизма является поэтапная активация генетического аппарата, когда транскрипционные факторы, кодируемые 'ранними" генами, функционируют как связущее звено между Фатковременными сигналами, действующими на клетку и долговременными вменениями клеточного фенотипа, происходящих за счет индукции •поздшрс" генов (curran, Morgan, 1987). Подобный каскадный механизм зегуляции транскрипции первоначально был описан при размножении эирусов, а потом был обнаружен при клеточном делении и

Щфференцировке (Greenberg et al, 1985; Kruijer et al, 1985; Ryder

it al, 1988). Настоящее исследование демонстрирует, что этот же :пособ запуска перестроек деятельности генетического аппарата [спользуется в нервных клетках при обучении.

Важно подчеркнуть, что данный транскрипционный механизм «лючается в нейронах лишь во вполне специфических ситуациях. Нам не далось выявить экспрессии "ранних" генов в тех поведенческих адачах, которые не несли бы в себе элементов новизны и обучения для ивотного. Иными словами, что активация каскадного механизма егуляции транскрипции требует определенных условий, по-видимому, есно связанных с процессами обучения и пластических перестроек ервных клеток.

Естественно возникает вопрос о том, каковы эти условия? Имеются снования предполагать, что одним из критических требований для ктивации гена c-fos в нейронах является одновременная встреча злого комплекса возбуждений различной сенсорной и биологической

модальности. Устранение даже одного из них, как показывают опыты монокулярной депривацией, делает невозможной индукцию c-j оставшимися сигналами.

Если "ранние" гены индуцируются вследствие интеграции компле! возбуждений, то должен существовать субстрат на котором происхо; встреча и ассоциация этих сигналов. Известно, что в npoMoropi областях c-fos и других "ранних" генов, кодирующих транскрипциош факторы, сосредоточены разнообразные регуляторные цис-элемент чувствительные к экстраклеточным сигналам различной химичеа

ПРИРОДЫ (Cohen, Curran, 1988; Treisman, 1990; Hagner et al, 199<

Было также установлено, что сигналы, приходящие к промотору c-¡ через разные пути, могут потенциировать друг друга и многокра: усиливать транскрипцию гена (Seng, Greenberg, 1990; Curran, 199: Это делает промоторы c-fos и других "ранних" генов, кодирун транскрипционные факторы. потенциальными областями ядер! интеграции возбуждений, конвергирующих к клетке. Таким образе данные гены сочетают в себе способности , с одной стор< синтезировать разнообразные экстраклеточные сигналы, а с дру: стороны запускать интегративные реакции клётки за счет актива] наборов "поздних" генов. В настоящее время еще недостато' фактических данных для того, чтобы понять, как осуществляю1 подобные интеграторные функции "ранних" генов при обучении. Ода; обнаружение экспрессии c-fos и c-jun в мозге животных в х< приобретения нового опыта открывает пути экспериментального изуче: этих вопросов.

выводы

. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что ктивация генома нервных клеток внешними воздействиями существляется с помощью двухфазного механизма. Первая фаза связана экспрессией "ранних" генов, в число которых входят гены -{оБ.с-^ип и г1е/28б, кодирующие ядерные транскрипционные факторы, ранскрипция ранних генов запускается в клетках мозга в первые пнуты после нанесения воздействия и продолжается около I часа, ктивация данных генов обеспечивается белками, существовавшими в ервных клетках до момента стимуляции, а быстрое подавлении кспрессии ранних генов происходит за счет негативной регуляции от х собственных белковых продуктов, синтезированных в результате эрвой волны транскрипции. Накопление белков, кодируемых ранними энами, происходит в нервных клетках через 1-3 часа после гимуляции. Затем, через 4-6 часов после воздействия, в мозге эзникает вторая волна транскрипции, связанная с экспрессией пока эидентифицированных "поздних" генов.

. Данный двухфазный механизм экспрессии генов активируется в мозге явотных при обучении и формировании памяти. Экспрессия ранних генов клетках мозга в этих ситуациях характеризуется высокой гвствительностыо. Однократное предъявление нового объекта на 10 экунд (обучение цыплят пассивному избеганию) или новой ситуации на минуты (обучение мышей пассивному избеганию) вызывает значительную ю 600%) индукцию генов с-соя и с-л'ил в мозге животных, гщественное повышение мРНК обоих генов в ткани мозга наблюдается ш через 15 минут после начала обучения и достигает максимума к )-60 минутам.

, Экспрессия ранних генов затухает в нервных клетках по мере потери шизны воздействия или в ходе выработки нового навыка. Обыденная шеденческая активность животных, выполнение ими автоматизированных шыков, нанесение им привычных воздействий или помещение животных в гакомую среду не приводит к индукции генов с-гоя и c-jun в нервной ютеме.

4. Обнаруженный механизм не обладает специфичностью по отношених какой-либо одной форме приобретения нового опыта, а обеспечив! вовлечение генетического аппарата в разнообразные в] обучения.Активация генов с-{оэ и с-_;ип происходит в мозге живот! при обучении разным задачам и навыкам, с разными вид; отрицательного и положительного подкрепления. Данный механизм им( также и достаточно широкое филогенетическое распространен поскольку экспрессия генов с-гоэ и с-./ип в мозге при обуче] наблюдается у разных классов и видов животных (цыплята, мыши, крьи кошки).

5. Механизм активации ранних генов в нервных клетках достато1 жестко связан с процессами формирования памяти и нейроналы пластичности. Отдельные компоненты поведенческого акта, такие 1 мотивационное возбуждение, эмоциональное возбуждение, положителы подкрепление, сенсорная афферентация, реализация программы действ] сами по себе, вне обучения, не вызывают индукции генов и св клетках мозга.

6. Экспрессия ранних генов с-гоз, с-зип и ги/габ при обуче] захватывает обширные области мозга. При этом:

а). В разных структурах мозга степень индукции генов с-гоэ с-}ип при обучении различается. Различные отделы мозга имеют раз] динамику угасания данного геномного ответа в ходе приобрете] навыка.

б). Различные модели обучения характеризуются различным паттер] распределения экспрессии с-{оэ по областям мозга.

в). В моделях обучения, где локусы нейрональной пластично! известны, прослеживается связь локализации экспрессии ранних гено] данными структурами мозга (пассивное избегание у цыплят), участк; коры головного мозга (приобретение зрительного опыта у крысят) ] группами нервных клеток (монокулярное зрительное обучение у котят

7. На основании изложенных фактов можно сделать заключение, ' ' активация генетического аппарата нервных клеток при обуче!

происходит с помощью специфического механизма, аналогичного то]

зторый используется клетками для вовлечения генома в процессы зления и дифференцировки. Данный механизм имеет двухфазный характер включается через экспрессию регуляторных генов, кодирующих ядерные ¡лки - транкрипционные факторы. Запуск этого геномного ответа ¡условлен процессами протекающего при обучении афферентного синтеза требует сочетания доминирующей мотивации, эмоционального >збу*дения, обстановочной и пусковой афферентации. Есть основания >лагать, что конвергенция этих возбуждений происходит на уровне сер отдельных нервных клеток. По-видимому, молекулярным субстратом [я встречи этих сигналов могут служить промоторные области ранних нов, способные суммировать транскрипционные эффекты от различных 13буждений,приходящих к нервной клетке в ходе обучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Anokhin K.V. In situ hybridization approach for mapping of arning-related changes in brain activity. // Abstracts of ternational Conference "Current Advances in Laboratory Techniques: Situ Hybridization". - London, 1989 - p.76.

Малеева H.E., Иволгина Г.Л., Анохин К.В., Лимборская С.А. Анализ :прессии протоонкогена c-tos в коре головного мозга крыс при /чении // Генетика. - 1989.- т.25, - C.III9-II2I.

Anokhin K.V., Ryabinin А.Е., Zeiner В., Abramova A.B. Induction "immediate early genes" expression on the brain by behavioural i chemical stimuli. // Abstracts of International Simposium Jlecular Basis of Action of Bioactive Substances on Behaviour". -Llin, 1989.- p.4.

Ryabinin A.E., Anokhin K.V. Expression of "immediate early genes" the mouse brain. // Konferenzen der Klinishen und Experiment, irowissenschaften. Konferenzmaterialen.- Magdeburg, 1989.-p.100.

5. Анохин К.В. "Ранние" гены в обучении: факторы компетентности и сигналы консолидации? // Материалы xxviii Совещания по проблем высшей нервной деятельности.- Л., Наука.- 1989 - С.3-4.

6. Лимборская С.А., Малеева Н.Е., Иволгина Г.Л., Бикбулатова Л.С Анохин К.В., Кругликов Р.И. Экспрессия протоонкогена c-fos различных структурах головного мозга при обучении // Тезисы 2 Всесоюзной Конференции. "Принципы и механизмы деятельности моз человека".- Л., Наука, 1989.- С.220-221.

7. Анохин К.В. Генные зонды для картирования нервных сетей п обучении // Тезисы 2-й Всесоюзной Конференции. "Принципы и механиз деятельности мозга человека".- Л., Наука, 1939.- С. I9I-I92.

е. Малеева Н.Е..Бикбулатова Л.С., Иволгина Г.Л., Анохин К.В Лимборская С.А., Кругликов Р.И. Активация протоонкогена c-fos различных структурах головного мозга крыс при обучении псевдообусловливании. // Доклады АН СССР, 1990.- т.314.- С. 762-76

9. Anokhin К.V.,Rose S.P.R. Learning-induced expression of immedia early genes in the chick forebrain. // Open Network Conferen "Neural Mechanisms of Learning and Memory".- London, 1990.- p.5-10

10. Anokhin K.V., Mileusnic R., Shamakina I.Y., Rose S.P.R. Effec of early experience on c-fos gene expression in the chi forebrain. // Brain Research.- 1991.-v.544.- p.101-107.

11. Anokhin K.V., Rose S.P.R. Learning-induced increase of imraedia early gene messenger RNA in the chick forebrain. // European Journ of Neuroscience.- 1991. - v.3.-p.162-167.

12. Shamakina I.V., Krylova O.Y., Anokhin K.V. Extinction of c-f expression in the brain after repeatable noxious stimulation a morphine administration.// Abstracts of 3 IBRO World Congress Neuroscience.-Montreal, 1991.-p.302.

13. Anokhin К.V. Early response genes and novelty detection in the nervous system.//Abstracts of 3 IBRO World Congress of Neuroscience.- Montreal, 1991.- p.302.

14. Anokhin K.V. Early genomic response of nerve cells to learning. // Abstracts of USSR-USA Symposium on Molecular Neurobiology.- Kiev, 1991.-p. 87-89.

15. Anokhin K.V., Ryabinin A.E. C-fos gene expression in the mouse brain after active avoidance learning.//Abstracts of the 14th Annual Meeting of the European Neuroscience Association.- Cambridge, 1991.-p. 62 .

16. Abramova А.В., Anokhin K.V. Dynamics of transcriptional activity in the mouse cerebral cortex after seizures reveals two waves of RNA synthesis. // Abstracts of the 14th Annual Meeting of the European Neuroscience Association.- Cambridge, 1991.- p.276.

17. Анохин К.В. РГ-картирование: выявление пластических перестроек в обучающемся мозге по экспрессии "ранних" генов // Материалы 1-го Совещания по картированию мозга.- М., 1991.- С.21-22.

18. Maleeva N.E., Bikbulatova L.S., Ivolgina G.L., Anokhin K.V., Limborskaya S.A., Kruglikov R.I. Participation of protooncogene c-fos cells of different brain structures in the learning and memory processes// Biologicheskie Membrany.-1991.- v.8.- p.1179-1180.

19. Anokhin K.V. C-fos mapping as an approach for studying plasticity in the chick brain // A Satellite Meeting of the European Neuroscience Association Avian Learning and Plasticity.- Milton Keynes, 1991.- p.21.

20. Anokhin K.V. Genomic response of neurons to learning // Neuroscience Facts. 1991 -v.2.-N.20.-p.3-4.

21. Рябинин А.Э., Анохин К.В.,Бухман В.JI. Повышение экспрессии генов c-fos и c-jun в головном мозге и надпочечниках после стрессорного

воздействия// Журнал ВНД им.И.П.Павлова.-1992.-В печати.

22. РяОинин А.Э.,Анохин К.В. Экспрессия гена с-^оя в новой : мышей после выработки реакции активного избегания // Сборник тру, "Экспериментальная и прикладная физиология"- М., 1992.

_________Закрой________ХЩ Л50

Типография пгП; Хозя'стсонном Упраилсшш Минздрава России.