Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Исследование процессов формирования памяти в обонятельных луковицах крысят

Г - С

1 о '1

\ 3 I > ' * МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 612.86 : 599.323.4

КАЙЗЕР Олег Васильевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ФОРМИРОВАНИЯ ПАМЯТИ В ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ЛУКОВИЦАХ КРЫСЯТ

14.00.17 — Нормальная физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН, объединенного с кафедрой нормальной физиологии Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук, профессор Ю. А. Фадеев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор В. В. Андрианов доктор биологических наук, профессор Н. А. Тушмалова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ — Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 30 мая 1996 г. в « » часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.08.01. при Научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. П, К. Анохина РАМН (103009, Москва, ул. Большая Никитская, д. 6, строение 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН.

Автореферат разослан « » апреля 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат медицинских наук

0. А. Гумемюк

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования. Со времен Декарта мало кто из выдающихся людей в области медицины и естественных наук не пытался бы объяснить способность индивидов к формированию жизненного опыта ( Брока П., 1866; Крепелин Э., 1910; Корсаков С.С., 1901; Павлов И.П., 1949; Сеченов И.М., 1961). Однако несмотря на многочисленный фактический материал, накопленный в этой области знаний клиницистами, психологами, нейрофизиологами и нейробиологами, а также многократные попытки объединить разрозненные Факты с помощью различных гипотез и теорий и в настоящее время механизмы обучения и памяти остаются загадкой.

Согласно представлениям П.К.Анохина только на основе тесной связи памяти, мотивации, обстановочных и пусковых раздражителей складывается аппарат афферентного синтеза, обеспечивающий формирование "цели к получению любого результата" (Анохин Г1.К., 1968).

Важную роль память играет и в аппарате предвидения результатов деятельности. Согласно представлениям К.В. Судакова акцептор результатов действия уже содержит и 'цель и программу для удовлетворения потребностей организма. "Каждый фактор внешней среды, особенно несущий жизненно важную информацию для организма в плане удовлетворения его ведущей потребности" (Судаков К.В., 1987) запечатляется и обогащает аппарат акцептора результата действия. Всякий раз когда вновь возникает эта потребность формирующийся на основе памяти акцептор результата действия способствует реагированию организма по опережающему типу, что ведет к более быстрому и успешному удовлетворению потребностей организма. Таким образом, изменения, происходящие в мозгу на уровне нервных клеток, обеспечивающие формирование памяти, служат для более успешного выживанию индивидов в окружающем мире.

К середине двадцатого века у большинства исследователей проблем памяти сложилось представление о том, что процессы запе-чатления, хранения и воспроизведения информации протекают только в нервных клетках, проявляющих активность при обучении. С начала 60-х годов до настоящего времени появились и работы, результаты которых не согласовались с этой точкой зрения. Это исследования, связанные с "переносом" результатов обучения из одного полушария в другое ( Schrier A.M., Sperry R.W, 1959; Бианки В.Л., Забоева Н.В.. 1960, Gazzaniga M. S.. 1963; Bures J., Buresova 0., 1966; Klelnman K.M., Little R.W., 1973).

Необходимо отметить, что под термином "перенос" памяти в настоящей работе мы понимаем процесс, который ведет к формированию энграммы в полушарии интактном относительно обучения. При формировании этой энграммы используется информация, латерализо-ванная во время обучения в другом полушарии за счет анатомических особенностей анализатора(ов).

Исследование феномена "переноса" памяти на наш взгляд является перспективным, так как позволяет изучать не только механизмы фиксации следов памяти, но и механизмы хранения и воспроизведения приобретенного навыка. Несмотря на то, что данный феномен в последнее время изучался многими авторами (Bell G.A., Glbbs М.Е.. 1977; 1979; 1981; Kucharskl D.. Hall W.G.. 1987), механизм его неясен. Более того, для некоторых видов обучения (дискриминации зрительных образов у обезьян) получены данные относительно билатерального формирования навыка уже на момент обучения (Butler C.R.. 1968; Noble J.. 1968). Для обонятельного обучения нет убедительных экспериментальных доказательств "переноса" энграммы в обонятельной системе. В исследованиях Hall и Kucharskl было показано. что по мере созревания комиссуральных связей между обонятельными луковицами информация об унилатеральном обучении становится доступной для другой обонятельной луковицы. Остается нерешенным вопрос где хранится информация о запахе после унилатераль-ного обучения, в одной или обеих луковицах. И если имеется "перенос" навыка из представительства одной обонятельной луковицы в другую, то каков возможный механизм этого процесса.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью нашего исследования явилось изучение процессов формирования памяти после унилатерального обонятельного обучения у крысят со зрелой передней комиссурой.

В связи с этим были определены экспериментальные задачи исследования:

1. Определить имеется ли "перенос" следов памяти в обонятельных луковицах крысят после унилатерального обонятельного обучения.

2. Изучить временные характеристики процесса формирования энграммы в контралатеральной обонятельной луковице.

3. Исследовать возможный механизм "переноса" навыка из одной обонятельной луковицы в другую.

Научная новизна работы. Впервые была показана возможность переноса энграммы обонятельного обучения ( дупликации энграммы) у крысят со зрелой передней комиссурой. Подтверждена гипотеза о формировании памяти о запахе в обонятельных луковицах. Выявлены основные закономерности формирования следов памяти в обонятельных луковицах после унилатерального и билатерального обучения.

Научно-практическая ценность работы. Работа посвящена изучению механизмов обучения и памяти. Несмотря на многочисленные данные и теории объясняющие процессы запечатления, хранения и воспроизведения информации у индивидов, социальный заказ на исследования памяти до сих пор актуален. Результаты работы могут быть использованы в дальнейшем в научно-исследовательских целях, при применении биохимических и иммунологических методик для изучения механизмов памяти. Кроме того, данные нашего исследования могут служить основой для формирования новых взглядов на механизмы памяти в норме у человека, ее нарушений в рамках различных дегенеративных заболеваний ЦНС, психотических расстройств и интеллектуальной недостаточности, а следовательно и новых подходов к лечению патологии мозга.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на конференции студенческого научного общества имени Н. И.Пирогова Московской медицинской академии в 1992 г.. международной конференции молодых ученых и студентов НИИ нормальной физиологии в 1993 г.. итоговых сессиях НИИ нормальной физиологии в 1993 и 1994 гг. По теме диссертации опубликованы тезисы докладов на конференциях, сданы в печать статьи в " Журнал высшей нервной деятельности имени И.П. Павлова" (1996) и в журнал "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины"(1996). Ранние исследования проблемы были включены в дипломную работу на факультете по подготовке научных и научно-педагогических кадров ММА им. И.М.Сеченова (1993). Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры нормальной физиологии ММА им. И.М.Сеченова и лабораторий НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина (1996).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка. 2 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов исследований, обсуждения и выводов. Библиографический указатель содержит 107 источников ( 27 на русском и 80 на иностранных языках).

- 6 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследования проведены на 532 самцах и самках беспородных белых крыс в возрасте 15-18 постнатальных дней, выращенных в лабораторном виварии. Беременных самок содержали в отдельных пластиковых клетках. На второй день после родов пометы выравнивались до 8 крысят в каждом помете. Распределение крысят по сериям и группам экспериментов приведено в таблицах 1 и 2.

Обучение. За два часа до обучения крысят отсаживали от матери и содержали в термостате при температуре 25 градусов. В это время крысята были лишены воды и пищи. Обучение производилось в установке, состоящей из клетки с матерью и четырех " Y "- образных лабиринтов. Каждый из лабиринтов имел 3 одинаковых рукава (стартовый отсек, ход, ведущий к материнской клетке и тупиковый ход), длинной 8. шириной 5,5, с высотой стенок 3,5 сантиметра. Клетка с матерью была цилиндрической формы, высотой 15, диаметром 20 сантиметров, и имела 4 одинаковых входа (2.3 * 4,0 сантиметра) , стыкующихся с ходами 4 лабиринтов таким образом , что крысенок выползая из лабиринта попадал к матери. При обучении в качестве условного сигнала использовали запах подсолнечного масла. Брюхо самки также как и пол, ведущего к ней хода, были увлажнены подсолнечным маслом. Два лабиринта были правосторонними по отношению к ходу, увлажненному подсолнечным маслом, а два -левосторонними (рис.1). Фактором положительного подкрепления являлся контакт крысят с матерью.

Крысенок помещался в стартовый отсек лабиринта и мог выбрать один из выходов. Если он выбирал выход, ведущий к матери, то на 6 минут его оставляли с матерью для кормления. В случае выбора тупикового хода - помещали в стартовый отсек другого лабиринта, но не более 10 раз за один сеанс обучения. Все время обучения складывалось из 8 сеансов и составляло около 70 минут. К этому времени все животные, прошедшие 7 сеансов обучения, после помещения в стартовый отсек с первого раза выбирали ход, который вел к матери. Сразу после окончания обучения крысят всех групп возвращали без матерей в термостат, где они находились до начала тестирования.

Тестирование. Для определения эффективности обучения использовали тест предпочтения места, аналогичный применяемым ранее другими авторами (Vehoe Pr., Blass М.Е. 1986; Kucharski D., Hall W.G. 1987), который проводили через 24 часа после обучения. Каме-

Рис. 1 Установка для обонятельного обучения крысят.

Обозначения: 1 - клетка с матерью; 2 - "У" - образные лабиринты; 3 - стартовый отсек лабиринта; 4 - тупиковый ход; 5 -ход, ведущий к матери (пол хода увлажнен подсолнечным маслом): 6 - лампы освещения (подключены к источнику питания).

pa предпочтения места представляла собой пластиковую платформу размером 29*20*12 сантиметра. Дно камеры было покрыто решеткой, на 0.4 сантиметра приподнятой над полом. Под решеткой находились два одинаковых по размеру листа бумаги, один из них был смазан подсолнечным маслом, а второй оставался чистым. Листы были расположены таким образом, что делили камеру на две стороны : одна сторона камеры была мечена запахом подсолнечного масла, другая -без запаха. По центру камеры, между листами бумаги под решеткой, проходила разделительная полоса. Ширина полосы составляла 1 см. Процедура тестирования заключалась в следующем. Крысенок помещался на разделительную полосу и имел возможность выбрать _ какую-то из сторон камеры (с запахом подсолнечного масла или без него). Регистрировали время нахождения крысенка на меченной и немеченной стороне. Общее время теста составляло 5 минут.

Методика унилатерального обучения. Методика унилатерального обучения заключалась в том. что за 30 минут до обучения крысятам в одну ноздрю вставляли блокирующий тампон и они имели возможность ориентироваться на запах в лабиринте, используя только одну обонятельную луковицу. После обучения закрытая прежде ноздря открывалась, а противоположная ("обученная") перекрывалась.

В исследованиях были использованы фармакологические препараты: 1) Новокаин для временной блокады обонятельных луковиц на момент консолидации и извлечения памяти. 2) Анизомицин для блокады протеинзависимой стадии консолидации памяти в обонятельных луковицах. Введение растворов в обонятельные луковицы осуществлялось с помощью микрошприца Hamilton в специальном устройстве для инъекций в центр луковицы на глубину 3 мм. Для инъекций были использованы растворы 0,5%. 1% новокаина и 1%, 2%, 3% анизомицина и 0.9% NaCl, которые вводились в равных объемах, по 1 мкл в обонятельную луковицу.

Для статистической обработки данных был использован метод факторного анализа (ANOVA, STATGRAF, Ver. 2.6, 1987). В качестве показателя предпочтения использовался процент предпочтения: процент предпочтения - 100хТ1/ (Т1+Т2), где Т1 - время нахождения крысенка на сторон меченной запахом подсолнечного масла; Т2 -время нахождения крысенка на стороне камеры без запаха.

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ДИНАМИКА УНИЛАТЕРАЛЬНОГО ОБОНЯТЕЛЬНОГО ОБУЧЕНИЯ КРЫСЯТ.

При исследовании формирования энграммы в одной из обонятельных луковиц у крысят со зрелой передней комиссурой нельзя исключить участия в процессе воспроизведения, запечатления информации обонятельной луковицы другой стороны. Поэтому в экспериментах с унилатеральным обучением использовали новокаин, который осуществлял временное выключение одной из обонятельных луковиц на момент обучения или тестирования.

Перед тем, как использовать новокаин в экспериментах с унилатеральным обучением были определены оптимальные дозы и эффективность действия этого анестетика. Для этого непосредственно перед тестом или за 15 минут до теста новокаин вводили предварительно обученным животным в обе обонятельные луковицы в дозе по 5 или 10 мкг в каждую луковицу.

Во время теста крысята, которым вводили новокаин за 15 минут до теста в дозе, равной 10 мкг., вели себя также как необученные. Они достоверно, А1ША Е(1,16)=8,21, р<0. 01, меньше предпочитали часть камеры с запахом подсолнечного масла, чем крысята с аналогичным введением физиологического раствора и обученные животные без инъекций. Количество крысят в группах в этой и других сериях экспериментов см. таблицы 1 и 2.

При аналогичном инъецировании новокаина в дозе 5 мкг., а также при введении новокаина непосредственно перед тестом достоверных различий в поведении экспериментальных и контрольных групп крысят (с введением физиологического раствора и без произведения инъекций) выявлено не было.

С целью выяснения возможности воздействия новокаина при введении его в одну из обонятельных луковиц на процессы консолидации памяти в другой обонятельной луковице, крысятам за 30 минут до обучения в одну ноздрю вставляли блокирующий тампон а за 15 минут до обучения в соответствующую обонятельную луковицу вводили 10 мкг. новокаина. Различий в поведении таких крысят, крысят, которым вводили физиологический раствор и просто обученных животных не было. Следовательно, новокаин действовал только в пределах одной обонятельной луковицы.

Для того, чтобы решить вопрос о действии новокаина на процессы формирования памятного следа во время обонятельного обучения крысятам вводили новокаин в обонятельные луковицы билатераль-

но за 15 минут до обучения.

Нами было установлено, что действие новокаина при таком режиме введения приводит к нарушению процессов формирования обонятельного навыка, при тестировании такие крысята находятся столько же времени на части камеры, меченной запахом подсолнечного масла, сколько проводят там необученные животные Процент предпочтения руппы достоверно. ANOVA F(l.20)=5.97. р<0.03 ниже, чем у животных с аналогичным введение физиологического раствора.

Кроме того, мы показали, что введение крысятам новокаина за 75 минут до обучения в обе обонятельные луковицы в дозе по 10 мкг. в каждую не оказывает действия на формирование обонятельного навыка. Крысята, которым вводили новокаин подобным образом хорошо обучались и при тестировании так же демонстрировали достоверно большее предпочтение запаха подсолнечного масла, как и крысята, которым вводили физиологический раствор и обученные животные без инъекций в сравнении с необученными животными.

Таким образом. новокаин соответствовал гипотетическим критериям для временного выключения одной из обонятельных луковиц при унилатеральном обучении: эффективно блокировал процессы формирования и воспроизведения обонятельного навыка, действовал в пределах только той обонятельной луковицы, куда производилась инъекция, обладал ограниченным во времени действием (в пределах одного часа).

Билатеральное формирование энграммы в обонятельных луковицах при унилатеральном обучении ( феномен "переноса").

Для того, чтобы выяснить ограничивается ли формирование обонятельной энграммы после унилатерального обучения одной стороной мозга провели следующий эксперимент.

Обученным крысятам за 15 минут до теста в обонятельную луковицу, которая на момент обучения имела афферентный иход, вводили раствор новокаина в дозе 10 мкг. После этой процедуры извлечение информации из этой обонятельной луковицы было невозможным и, если процесс обучения и формирования долговременного памятного следа ограничивается только одной стороной мозга, то при тестировании такие животные не помнили бы запаха, связанного с процедурой обучения. Напротив, такие крысята достоверно. ANOVA F(l.16)=11.6. р<0.004 больше предпочитали часть камеры с запахом подсолнечного масла, нежели необученные животные. Использованные для контроля

животные с аналогичным введением физиологического раствора и просто обученные животные так же хорошо помнили ситуацию обучения и достоверно больше предпочитали часть камеры с запахом подсолнечного масла, чем необученные животные ANOVA F(1.14) = 11,7; р<0.004.

Следовательно, формирование обонятельной энграммы при унилатеральном обучении затрагивает обе стороны мозга.

Происходит ли процесс образования памятного следа во время обучения по обе стороны передней комиссуры у крысят в возрасте 15-18 постнатальных дней, когда комиссуральные проекции уже сформированы? Если так, то блокада новокаином обонятельной луковицы, не имеющей афферентного входа на момент обучения может предотвратить формирование билатерального представительства следов памяти.

Для проверки данного положения необученным крысятам за 15 до обучения обонятельную луковицу, соответствующую закрытой ноздре блокировали новокаином. Кроме того, чтобы исключить возможность извлечения информации из "обученной" обонятельной луковицы перед тестом в нее вводили новокаин также как и животным в предыдущем эксперименте. Оказалось, что такие крысята при тестировании достоверно больше предпочитают запах подсолнечного масла. AN0VA F(1,17)=5.2. р<0.04. чем интактные животные, крысята контрольных групп тоже хорошо помнят ситуацию обучения.

Такая ситуация могла иметь место если обонятельная энграмма сформировалась в обонятельной луковице, не имевшей на момент обучения афферентного входа, не во время обучения, а через какое-то время после него. То есть, во время обучения энграмма формируется только в обонятельной луковице, имеющей афферентный вход, а после обучения происходит дупликация или "перенос" энграммы на необученную сторону.

Временная характеристика унилатерального и билатерального формирования энграммы после унилатерального обонятельного обучения.

Для исследования динамики формирования энграммы в обонятельных луковицах после унилатерального обучения была применена методика отсроченного тестирования. Эта методика заключалась в том, что процедура тестирования осуществлялась через 30,60 и 120 минут после обучения.. На момент теста крысята экспериментальной группы пользовались только той ноздрей, которая была закрыта при обучении. В качестве контроля были использованы

2 группы животных: - с тестированием обонятельной луковицы, использованной крысенком при обучении ( соответствующей открытой во время обучения ноздре) и необученные крысята. В камере предпочтения места крысята, использующие "необученную" обонятельную луковицу через 30 и 60 минут после обучения случайно выбирали одну из сторон камеры. Вместе с тем, крысята, использующие во время теста "обученную" обонятельную луковицу находились на стороне камеры с запахом подсолнечного масла больше времени, чем необученные животные.

Таким образом, через 30 и 60 минут после обучения информация о приобретенном в "У"-образном лабиринте навыке фиксирована только в обонятельной луковице, имевшей во время обучения, афферентный вход. В это же время в другой обонятельной луковице энграмма обучения не сформирована.

При тестировании крысят с "необученной" луковицей через 120 минут после обучения результаты оказались иными : крысята хорошо помнили ситуацию обучения - достоверно больше А!ША Р(1,17)= 37, р<0.001, чем необученные животные предпочитали сторону камеры с запахом подсолнечного масла.

Такая ситуация могла иметь место в двух случаях : либо через 120 минут после обучения возможно формирование доступа к латерализованной во время обучения информации; либо в "необученной" обонятельной луковице имеется дубликат энграммы об обучении в "У"- образном лабиринте.

Для выяснения возможного в данном случае механизма провели следующий эксперимент. На время тестирования (через 120 минут после обучения) заблокировали "обученную" обонятельную луковицу новокаином. Таким образом, искусственно создали ситуацию, когда информация об обучении могла извлекаться только из обонятельной луковицы, которая была лишена на время обучения афферентного входа. Для контроля использовали животных с аналогичным введением физиологического раствора и необученных крысят. Крысята, которым инъецировали новокаин и физиологический раствор достоверно больше предпочитали сторону камеры с запахом подсолнечного масла, чем необученные крысята.

Следовательно, информация об унилатеральном обучении через 120 минут после обучения представлена в обеих обонятельных луковицах, а не только в той, которая имела во время обучения афферентный вход.

Таблица 1. Распределение животных по сериям экспериментов.

1 1 Серии 1 экспериментов 1 Количество 1 животных по группам I

1 1 ----------- 1 контроль I

1 ФР I ill 1 1 БИ | ДОП | НО I III 1

1 действие НК в дозе |5 мкг. перед тестом 1 1 10 1 10 1 III 1 III 1 III 1 ill I

1 действие НК при 1 введении за 15 мин. 1 до теста в дозах : 5 I и 10 мкг| 1 III 1 III 1 III 1

8 1 1 1 8 | 8 | | III 1 1 7 | | | iii i

1 1 11111 1 область действия НК I 8 1 8 1 I I 8 I I I 1>111

1 действие НК при 1 введении в дозе 10 |мкг. до обучения 75 1 и 15 мин| 1 ill i III 1 III 1

8 1 1 |8|8 I I III 1 III 1 III 1

1 билатеральный навык 1 при унил. обучении 1 8 I 9 1 III 1 III 1 1 7 | | 8 1 III 1

1 билатеральный навык I после унил.обучения 15 1 И 75 мин| 1 III 1 III 1 III 1

10 1 1 1 И 1 8 III 1 1 8 I | 6 1 III 1

1 время формирования 1 дубликата энграммы [(мин.после обучения) 30 1 1 1 I 6011201 1 1 ! III 1 III 1 III 1

8 1 1 1 1 7 | 7 | 1 1 1 III 1 1 1 7 | 7 | III I

1 формирование 1 дубликата энграммы 1 через 2 часа 1 1 7 | 6 1 р III 1 III 1 III 1 III 1 iii i

Обозначения к таб.1: НК-новокаин: ФР-введение физ. раствора; БИ-без инъекций; ДОП-тестирование с обонятельной луковицей, имевшей во время обучения афферентный вход; НО - необученные.

- 14 -

2.ФОРМИРОВАНИЕ ЭНГРАММЫ В ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ЛУКОВИЦАХ. Формирование обонятельной энграммы в условиях применения блокатора синтеза белка анизомицина.

Учитывая то обстоятельство, что анизомицин специфически ин-гибирует синтез белковых молекул, мы решили использовать его с целью блокировать протеинзависимую (долговременную) стадию консолидации памяти для выяснения возможных механизмов формирование обонятельной энграммы после унилатерального обучения в ипси- и контралатеральной обонятельной луковице .

До того как использовать в экспериментах анизомицин необходимо было исследовать какой минимальной дозы его достаточно, чтобы подавить формирование долговременной памяти в обонятельной луковице.

Для этого провели серию экспериментов, в которых растворы анизомицина различных концентраций, соответствующих дозам 10; 15; 20; 25 и 30 микрограмм вводили крысятам в обе обонятельные луковицы в равных объемах за 30 минут до обучения. Для контроля использовали 3 группы крысят: с введением в аналогичном режиме физиологического раствора, без инъекций какого бы то ни было вещества до обучения и необученных.

При тестировании через 24 часа после обучения крысята экспериментальных групп с введением анизомицина в дозах 10 и 15 мкг. в каждую обонятельную луковицу демонстрировали предпочтение запаха, использованного в процедуре обучения, достоверно большее, чем у необученных животных АНОУА Г(1,15)=29; р<0, 0001 (10 мкг. * необученные) и АЖЩ 1,13) =21; р<0, 001 (15 мкг. * необученные), поведение крысят этих экспериментальных групп во время теста по существу не отличалось от поведения животных контрольных групп с введением физиологического раствора и без применения инъекций. Следовательно применение блокатора синтеза белка анизомицина в таких дозах не достаточно чтобы нарушить запечатлеше ситуации обучения на 24 часа.

Напротив, крысята экспериментальных групп с введением анизомицина в дозах 20; 25 и 30 мкг. не показывали предпочтения запаху подсолнечного масла во время теста, их поведение было похоже на поведение необученных животных. Показатели предпочтения у крысят этих экспериментальных групп были достоверно ниже, чем у крысят с введением в аналогичном режиме физиологического раствора и без инъекций каких либо веществ АЫОУА Г(1,15)= 16;р<0. 001 (20 мкг. *

без инъекций); АЛОУА Р(1,12)=27;р<0,0003 (25 мкг. * физ.раствор); АИОУА Р(1. 14)=17.6;р<0,001.

Таким образом, введение анизомицина в дозах 20; 25 и 30 мкг. в каждую обонятельную луковицу до процедуры обучения предотвращает формирование протеинзависимой стадии консолидации памяти в нейронах этих мозговых структур. В последующих экспериментах для блокады синтеза белка в обонятельных луковицах применяли концентрацию раствора анизомицина. соответствующую дозе 20 мкг.

Для выяснения вопроса о том, в течении какого времени после обучения осуществляется синтез новых белков, необходимых для нейрональных перестроек, обеспечивающих долговременную память провели следующую серию экспериментов.

Крысятам вводили анизомицин в обонятельные луковицы через 30 и 60 минут после обучения в дозе 20 мкг. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор через 30 минут после обучения. Еще одну контрольную группу составили необученные крысята.

При тестировании крысят экспериментальной и контрольных групп через 24 часа установили, что крысята, которым анизомицин инъецировался через 30 минут после обучения, не помнили ситуации обучения, с одинаковой степенью вероятности они предпочитали и сторону камеры без запаха и сторону меченную подсолнечным маслом. Показатели предпочтения этих животных были достоверно ниже, чем у животных контрольной группы с аналогичным введением физ. раствора АИОУА Р(1.13)=24;р<0, 001. Введение анизомицина через 60 минут после обучения не предотвращало формирование обонятельного навыка у крысят. Во время теста они предпочитали сторону камеры меченную запахом подсолнечного масла достоверно больше, чем необученные животные А!ША Р(1.13) = 10,2; р<0,007.

Так как по литературным данным анизомицин кратковременно блокирует синтез белковых молекул, следовательно синтез новых белков, необходимых для формирования долговременной обонятельной памяти у крысят продолжается в течении одного часа после обучения. а в целом включая процедуру обучения занимает около 2 часов.

Так как с синтезом белка в нейронах активных при обучении связаны только перестройки, приводящие к формированию долговременной памяти, следовательно блокада синтеза белка анизомицином в обонятельных луковицах не должна затрагивать кратковременную стадию консолидации памяти и информация об обучении может храниться какое-то время без синтеза новых белков. Для проверки этого пред-

- 16 -

положения провели следующую серию экспериментов.

Крысятам экспериментальной группы за 30 минут до обучения вводили анизомицин. После этого дополнительно крысят разбивали на группы и тестировали их через 4; 8 и 12 часов после обучения. Для контроля использовали 2 группы животных: - без инъекций веществ в обонятельные луковицы и необученных животных. Крысят контрольных групп тестировали через 12 часов после обучения.

Мы установили, что при тестировании через 4 и 8 часов после обучения крысята с введением в обонятельные луковицы анизомицина хорошо помнили ситуацию обучения. При сравнении показателей предпочтения этих групп животных с аналогичными показателями необученных крысят выявлены достоверные различия АНОУА Г(1,13) = 9,9; р<0,008 (тест через 4 часа * необученные) и АИОУА Г(1.13) = 17, р<0,001 (тест через 8 часов * необученные). Показатели предпочтения групп крысят тестированных через 4 и 8 часов после обучения и показатели крысят, которым не производили никаких инъекций достоверно не отличались.При тестировании группы крысят с введением анизомицина через 12 часов после обучения результаты оказались иными. Крысята этой группы в камере предпочтения места делали случайный выбор между частями камеры с запахом подсолнечного масла и без него, то есть вели себя в тесте как необученные животные. Показатели предпочтения этой группы крысят были достоверно ниже показателей крысят, которым не производили инъекций анизомицина АШУА Г(1,11) = 9,5; р< 0,01 и достоверно не отличались от показателей необученных животных.

Таким образом, применение блокатора синтеза белка во время обучения не оказывает влияние на формирование энграммы через 4 и 8 часов после обучения и вызывает амнезию процесса обучения через 12 и 24 часа после обучения. Скорее всего наличие следов памяти об обучении в "У"- образном лабиринте через 4 и 8 часов после обучения не связано с синтезом новых белковых молекул и обеспечивается активацией вторичных посредников и модификацией уже синтезированных в цитоплазме нейронов белков, что соответствует кратковременной стадии консолидации памяти. Кроме того, выяснилось, что процессы отвечающие за формирование кратковременной и долговременной памяти начинаются в одном временном промежутке (во время обучения) и протекают в нейронах параллельно, обеспечивая хранение информации на разных сроках после обучения.

- 17 -

Механизмы формирования билатерального навыка после унилатерального обонятельного обучения.

С целью выяснения области действия анизомицина при введении его в одну обонятельную луковицу, провели следующий эксперимент. Экспериментальной группе крысят за 30 минут до обучения закрывали одну ноздрю и в обонятельную луковицу этой стороны вводили анизо-мицин в дозе 20 мкг. Контрольным животным инъецировали в соответствующую обонятельную луковицу за 30 минут до обучения физ. раствор.

При тестировании через 24 часа крысята пользовались той же обонятельной луковицей, что и при обучении. Показатели предпочтения экспериментальной и контрольной группы соответствовали хорошему запоминанию крысятами ситуации обучения в лабиринте и были достоверно выше показателей необученных крысят АГША Р (1.13)=14 ; р<0, 002 (анизомицин * необученные) и АГЮУА Р( 1.13) =24; р<0. 001 (физ.раствор * необученные). Такая ситуация была возможна только в том случае, если раствор анизомицина не проникал во время обучения в другую обонятельную луковицу, следовательно можно было применять анизомицин для воздействия на синтез белка в одной обонятельной луковице.

Учитывая данные Гиббс и соавт.. полученные в экспериментах с использованием модели аверсивного обучения цыплят (ИЬЬэ М.Е. а1 а1. 1981) о том. что дубликат энграммы в противоположном полушарии формируется подобно основной энграмме, а также наши первоначальные рабочие гипотезы о кратковременной и долговременной стадиях консолидации памяти решили исследовать в какое время синтезируются новые белки, необходимые для долговременной памяти в обонятельной луковице, не имевшей на момент обучения афферентного входа.

Для этого крысятам в обонятельную луковицу, лишенную во время обучения афферентного входа вводили анизомицин через 0.5; 1; 2; 3; 4; 5 часов после обучения. Тестировали крысят через 24 часа после обучения. Контрольные группы животных составили крысята, получившие в аналогичном режиме инъекцию физиологического раствора и необученные крысята. В качестве дополнительной контрольной группы в этой серии экспериментов использовали крысят, которым кроме инъекции анизомицина перед тестом вводили новокаин в "обученную" обонятельную луковицу для того. чтобы извлечение информации об обучении из этой

- 18 -

обонятельной луковицы было невозможным.

Крысята, которым анизомицин инъецировался через 1,2 и 3 часа после обучения во время теста не помнили ситуации обучения и вели себя подобно необученным животным, не выявляя существенного предпочтения какой-либо из сторон камеры. Показатели предпочтения этих животных были достоверно ниже, чем у крысят контрольной группы с введением физиологического раствора ANOVA F{1,15)=31; р<0,0005 (анизомицин через 1 час * физ.раствор), AN0VA F(1.13)=19; р<0,001 (анизомицин ч/з 2 часа * физ.раствор), AN0VA F(1,15)=21: р<0,001 (анизомицин ч/з 3 часа * физ.раствор).

Вместе с тем, при введении крысятам анизомицина через 0,5; 4 и 5 часов после обучения в тесте они демонстрировали отчетливое предпочтение стороне камеры меченной запахом подсолнечного масла ANOVA F(1,13)=12; р<0,004 (через 0.5 часа * необученные), AN0VA F(1.14)=5; р<0,05 (через 4 часа * необученные), ANOVA F(1.13)=7; р<0,02 (через 5 часов * необученные). Показатели предпочтения крысят контрольной группы с введением анизомицина в аналогичном режиме, получившие перед тестом инъекцию новокаина в "обученную" обонятельную луковицу были на уровне обученных животных, достоверно отличаясь от показателей необученных животных AN0VA F(1,14)=6; р<0,02 (анизомицин + новокаин * необученные),что могло быть только в том случае, если энграмма обучения была сформирована и в контралатеральной обонятельной луковице.

Таким образом, мы установили, что при введении блокатора синтеза белка через 1; 2; 3 часа после обучения в контралатераль-ную обонятельную луковицу формирование долговременной памяти об обучении в "Y"- образном лабиринте в этой обонятельной луковице нарушается. В то время как аналогичное инъецирование анизомицина через 0,5 и 4.5 часов после обучения не нарушает процессы формирования долговременной памяти в обонятельной луковице, лишенной во время обучения афферентного входа.

Следовательно процесс синтеза новых белков, необходимый для формирования долговременной памяти в контралатеральной обонятельной луковице ограничен временным промежутком от 1 до 3 часов включительно. В таком случае какими процессами обеспечивается существование следов памяти в контралатеральной луковице через 2 часа после обучения?

Через 1 час после унилатерального обучения крысятам в "необученную" обонятельную луковицу вводили анизомицин. Тест проводи-

ли через 2 часа после обучения. В тесте крысята пользовались "необученной" обонятельной луковицей, в которую раннее инъецировался анизомицин. Для того, чтобы исключить извлечение памяти из "обученной" обонятельной луковицы использовали контрольную группу крысят с введением анизомицина в аналогичном режиме, получивших дополнительно перед тестом инъекцию новокаина в "обученную" луковицу. Еще одну контрольную группу составили необученные крысята.

При сравнении показателей предпочтения запаха подсолнечного масла у животных этих групп выявили, что процент предпочтения у крысят экспериментальной группы с введением анизомицина и крысят контрольной группы с введением анизомицина и новокаина был достоверно выше, чем у необученных животных АШУА Р(1.13) = 13: р<0.003 (анизомицин * необученные) и АГША Г(1.14)=8; р<0, 01 (анизомицин + новокаин * необученные). Крысята экспериментальной группы помнили ситуацию обучения, несмотря на введение блокатора синтеза белка. Можно предположить, что наличие энграммы в это время в контралатеральной обонятельной луковице может определяться не зависимо от синтеза новых белков в нейронах этой луковицы. Следовательно, формирование дубликата энграммы в контралатеральной луковице проходит как кратковременную стадию консолидации, протеиннезависимую, так и долговременную, зависящую от синтеза белков з течении 1-3 часов после обучения.

Исходя из полученных в наших экспериментах данных, следы памяти об унилатеральном обучении появляются в контралатеральной обонятельной луковице с запозданием в 2 часа, в связи с этим наиболее возможным механизмом для "переноса" памяти в эту луковицу является аксональный транспорт веществ. Однако, какие же биологические вещества переносятся . в таком случае по аксонам нейронов. В наиих условиях при использовании блокатора синтеза белка можно лишь решить один вопрос: зависит ли такой "перенос" от синтеза ниьых белков в нейронах "обученной" обонятельной луковицы? С этой целью провели следующую серию экспериментов. Крысятам за 30 минут до или через 30 минут после унилатерального обучения в обонятельную луковицу, имевшую на момент обучения афферентный вход, вводили анизомицин. Для контроля использовали две группы: без инъекций и необученных животных.

При тестировании через 2 и 24 часа после обучения крысята использовали обонятельную луковицу, которая на момент обучения была лишена афферентного входа. Крысята экспериментальных групп

(с введением анизомицина до и после обучения) и через 2 и через 24 часа после обучения достоверно больше, чем необученные животные АЖ)УА Г(1.13) = 12,1: р<0.004 (до обучения*необученные). АИОУД Б(1,12)=6,5; рСО.ОЗ (после обучения*необученные) предпочитали сторону камеры меченную запахом подсолнечного масла, что могло иметь место в случае успешного "переноса" энграммы в контралатеральную обонятельную луковицу. Если "перенос" памяти определялся и на фоне действия блокатора синтеза белка, то, скорее всего, он не зависел от синтеза белков в обонятельной луковице, имевшей во время обучения афферентный вход.

Таблица 2. распределение животных по сериям экспериментов.

1 I

Количество животных по группам

Серии экспериментов

эксперимент

контроль

ФР

БИ

1-1-

ДОП I НО

действие анизомицина при билатер. введении в дозах : (микрограммы)

10

15 25

20 30

формирование навыка в зависимости от времени введения АМ после обучения (мин)

через 30 60

7 | 7 _|

действие АМ на формирование навыка в разные сроки после обучения (часы)

через 4 8 12

6 6 6

область действия АМ

7

7

п-1-1-1

7 I 6 | I 7 | 7

I формирование I дубликата Iэнграммы в зависимости от I введения АМ I(часы) I

0.5

|-.-

I формирование дубликата через 2 часа в I при действии АМ

I введение АМ до и по-|сле обучения в ипси-I латеральную обонятельную луковицу.

до I после

7 | 7

6

Обозначения к таблице 2 : АМ-анизомицин; ФР-введение физ. раствора; БИ-без инъекций; ДОП-группа с введением перед тестом новокаина перед тестом; НО-необученные.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты, полученные нами на модели обучения крысят в "Y''-образном лабиринте, при использовании в качестве подкрепления контактов крысят с матерью, согласуются с данными исследователей проблемы "переноса" навыка при других видах обучения: аверсивной зрительной дискриминации у цыплят (Glbbs М.Е.. 1979:1981). активное избегание плаванием у крыс (Bures J., Buresova 0., 1966), зрительной дискриминации у обезьян (Gazzaniga M.S., 1963). обонятельного и зрительного обучения у рыб ( Бианки В. Л., Забоева Н.В., 1960). Так же как и при других видах обучения в наших экспериментах след памяти после унилатерального обучения формируется лишь с одной стороны мозга и может индуцировать формирование подобного следа на контралатеральной стороне.

Данные, относительно того, что формирование и хранение энграммы обучения в контралатеральной обонятельной луковице обеспечивается процессами кратковременной ( не связанной с синтезом новых белков) и долговременной ( протеинзависимой) памяти подтверждают результаты экспериментов с монокулярным обучением цыплят (Glbbs М.Е., 1981).

Процессы, отвечающие за формирование кратковременной (протеиннезависимой) и долговременной (протеинзависимой) памяти и при билатеральном формировании навыка и при формировании дубликата энграммы в обонятельной луковице, лишенной во время обучения афферентного входа протекают параллельно. Это подтверждает гипотезу McGaugh J.L.(1969) о параллельном пути формирования кратковременной и долговременной памяти.

Несмотря на то. что в наших экспериментах получены данные о хранении следов памяти об обучении в обонятельных луковицах, не исключена возможность формирования энграммы обучения на более поздних сроках после обучения в центральных структурах обонятельной системы (грушевидной коре и гиппокампе). В этом случае обонятельные луковицы играют роль временного хранилища информации обо обонятельном обучении, а грушевидная кора и гиппокамп -роль постоянного хранилища.

ВЫВОДЫ.

1. Информация об обонятельном навыке, приобретаемом крысенком в "У"-образном лабиринте запечатляется и хранится в обонятельных луковицах в течении 24 часов после обучения.

2. Процесс формирования навыка в обонятельных луковицах включает протеиннезависимую и протеинзависимую стадии консолидации памяти. Протеиинезависимая стадия избирательно блокируется новокаином, а протеинзависимая анизомицином.

3. Применение блокатора синтеза белка анизомицина непосредственно перед и после обучения нарушает формирование долговременного следа обонятельной памяти. не оказывая существенного влияния на кратковременную память.

4. Обонятельная энграмма, фиксированная после унилатерального обучения в одной обонятельной луковице индуцирует образование подобной энграммы в противоположной обонятельной луковице.

5. Формирование энграммы в обонятельной луковице, не имевшей во время обучения афферентного входа завершается через 2 часа после унилатерального обучения, в это время энграмма обучения находится в кратковременной фазе консолидации. Формирование дубликата энграммы в контралатеральной обонятельной луковице включает процессы, обеспечивающие кратковременную и долговременную память. Формирование изменений, отвечающих за долговременное хранение информации в контралатеральной обонятельной луковице, зависит от синтеза новых белков в течении 1-3 часов после обучения.

6. Процессы. обеспечивающие формирование кратковременной и долговременной памяти как при билатеральном, так и при унилатеральном обучении протекают в обонятельных луковицах параллельно.

7. Процесс формирования дубликата энграммы не нарушается на фоне введения блокатора синтеза белка в обонятельную луковицу, имеющую во время обучения афферентный вход.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кайзер О.В. Исследование межбульбарного переноса обонятельной информации у крысят// Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Материалы XXXXXXXXIX конференции студенческого научного общества им.Н.И.Пироговя Московской медицинской академии. Владимир. 1992.

2. Кайзер О.В. Исследование процессов межбульбарного "переноса" сигналов при обонятельном обучении крысят// Тезисы докладов XVI Международной конференции молодых ученых и студентов "Современные вопросы экспериментальной и прикладной физиологии". Москва. 1993.

3. Кайзер О.В. Исследование процессов межбульбарного переноса сигналов при обонятельном обучении крысят// .Дипломная работа студента 6 курса факультета по подготовке научных и научно-педагогических кадров, 1993.

4. Кайзер О.В. Эффекты нейрохимической блокады процессов . переноса и фиксации сигналов в обонятельных луковицах крысят// Журнал высшей нервной деятельности им. И. П. Павлова, в печати.'

5. Кайзер О.В. Формирование энграммы в обонятельных луковицах крысят после унилатерального обучения// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, в печати.