Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Псориатическая болезнь: гетерогенность патогенеза, иммунологические особенности,комплексная терапия.

На правах рукописи УДК 616.5

Миннибаев Марат Талгатовнч

ПСОРИАТИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ: ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПАТОГЕНЕЗА, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, КОМПЛЕКСНАЯ

ТЕРАПИЯ

14.01.10 - кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

4 АПР 2013

Москва ■ 2013

005051533

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Потекаев Николай Николаевич

Доктор медицинских наук, профессор Корсунская Ирина Марковна

Официальные оппоненты:

Кочергин Николай Георгиевич - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Молочков Антон Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой дерматовенерологии ФПКМР РУДН

Шарова Наталья Михайловна - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры дерматовенерологии ПФ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава России

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов

Защита состоится «_»_2013 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.208.040.10 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Нахимовский проспект, 49, Москва, 117998).

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, д.м.н., профессор

Эрдес Светлана Ильинична

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы:

Псориаз - это эритематозно-сквамозный дерматоз мультифакторной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов. Характеризуется гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалительной реакцией в дерме, изменениями в различных органах и системах.

Псориаз - одна из самых распространенных патологий в дерматологической практике. Его частота в различных странах колеблется в очень широких пределах - от 0,1 до 4 %. По данным отечественных авторов, в Российской Федерации псориазом страдает до 1% населения. Значительная распространенность наряду с увеличением частоты развития тяжелых форм, а также системных проявлений заболевания, в последнее десятилетие являются причиной снижения качества жизни и утраты трудоспособности больных. Этот факт обуславливает дальнейшее изучения данной нозологии, необходимость более глубокого понимания особенностей этиологии и патогенеза используя возможности современных высокотехнологичных методов исследования, усовершенствования существующих подходов и разработки новых методов лечения псориаза ( Владимиров В.В. и др 2002; Мордовцев В.Н., 2002; Молочков В.А., 2007; Олисова О.Ю., 2004; Taylor С. et al. 2000).

Псориаз носит системный характер и сопровождается поражением висцеральных органов и систем, в связи с чем многие ученые склонны характеризовать этот дерматоз как «псориатическую болезнь» с доминирующими проявлениями на коже (Мордовцев В.Н. и др. 1992; Фитцпатрик Т. и др. 1999; Шилов В.Н., 2001; Кочергин Н.Г. и соавт., 2003; Altmeyer Р., 1996; Коо J. et al. 2004). Это подкрепляется данными о системных иммунных изменениях генетической природы и частом вовлечении в процесс опорно-двигателыюго аппарата (Burden A.D. et al., 1999).

з

В последнее время большое внимание уделяется иммунологической и генетической концепциям развития псориаза. Исследования последних лет позволили выявить нарушения иммунной регуляции кожи. Эти изменения обусловлены, в свою очередь, взаимодействием многих генов как друг с другом, так и с окружающей средой. Такое взаимодействие способствует активации кератиноцитов, лимфоцитов, макрофагов и резидентных клеток дермы, что приводит к выработке ими медиаторов иммунного ответа и воспаления, усиливающих пролиферацию неполноценных кератиноцитов и стимулирующих развитие характерных для псориаза воспалительных изменений в коже (Пинсон И.Я., 2006; Prinz J., 2000; Kormieli Т., 2004; Menter М. A. et al., 2003).

Одним из основных патогенетических звеньев при псориазе являются нарушения иммунной системы, а именно - девиация цитокинового профиля по пути Thl-типа. При этом наряду с повышением уровня интерлейкинов 1а, 2, 6, 7, 8, интерферона-у (INFy), важную роль играет изменение фактора некроза опухоли альфа (TNFa) в сторону увеличения его уровня (Соколова Е.И., 1998; Krurger J. et al., 1990; Ameglio F. et al., 1994; Austin L.M. et al., 1999).

Специальные исследования определи типичный комплексный характер заболевания. Таким образом, псориаз - мультигенное и многофакторное заболевание с гетерогенным генетическим наследованием (Myashita Т. et al., 1994; Nair R. etal., 1999).

Так как псориаз обусловлен нарушением регуляции работы генетического аппарата, то разработку и усовершенствование методов диагностики и лечения следует направить на поиск критических звеньев патологического процесса, а именно, генов-кандидатов и соответствующих белковых продуктов (Брускин С.А. и др., 2008; Campolmi P. et al. 2002).

Анализ транскриптомных данных показал, что при псориазе, который

обусловлен разрегулированной работой генетического аппарата, наблюдается

увеличение транскрипции множества генов транскрипционного комплекса АР-

4

1 (Пирузян Э.С. и др., 2007; Angel Р., Karin М., 1991). Транскрипционный фактор АР-1 представляет собой группу парных комплексов, образованных ДНК-связывающими белками, входящими в семейства Jun, Fos и ATF (Activatingtranscriptionfactor) (Chinenov Y., Kerppola Т.К., 2001)

Одну из ключевых позиций в данном комплексе занимает ген FOSL1, контролирующий много важных клеточных функций. Этот ген экспрессируется в клетках различных типов в разных количествах, в том числе влияет на регуляцию свободно-радикального окисления в клетках.

Известно, что свободно-радикальное окисление в коже при псориазе резко снижено, о чем говорит эффективность УФ облучения в терапии этих пациентов.

На настоящий момент единого подхода к лечению псориатической болезни не существует (Короткий Н.Г., 1998; Косухин А. Б. и др.1999; Владимиров В.В., 2002; Молочков В.А., 2007; Олисова О.Ю., 2004; Ferretti G., 2003; Gudjonsson J.E., et al., 2007). Используемые на сегодняшний день методы терапии направлены лишь на достижение ремиссии, удлинение ее сроков, сокращение частоты рецидивов и избежание осложнений псориаза. Медикаментозное лечение представлено системными и местными препаратами, обладающими противовоспалительным, антипролиферативным и дезинтоксикационным действием. Большинство используемых лекарственных средств обладает выраженными побочными эффектами, что при продолжительном курсе лечения большими дозами часто утяжеляет патологический процесс и может оказаться тяжелее самого заболевания. В связи с этим разработка новых способов лечения псориаза является актуальной задачей, стоящей перед дерматологами (Скрипкин Ю.К. и др. 1999, Молочков В.А., 1999; Томас П. 2006; Коо J. et al. 2004).

Доказанная эффективность лечения кожных проявлений псориаза,

исключительная безопасность, отсутствие аллергических реакций, низкой

частотой побочных эффектов, и возможность эффективного использования в

5

качестве монотерапии делает физиотерапию традиционным и широко распространенным методом лечения (Stem R. et al. 1997; Serup J. 2006).

В последние годы все большее применение в лечении псориаза находит лазерная терапия. В течение длительного времени в данной области ведутся активные исследования. Большинство способов связано с наружным воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения или в области проекции кровеносных сосудов, или в проекции пораженных областей. Однако единой методики, которая характеризовалась бы высокой эффективностью и безопасностью, с четко сформулированными показаниями исходя из особенностей и тяжести течения патологического процесса, и могла бы быть предложена для широкого внедрения в ЛПУ соответствующего профиля, на данный момент не существует.

Таким образом, детальное изучение этиологии, патогенеза, иммунологических особенностей псориаза с использованием новых высокотехнологических методов, разработка новых, совершенствование существующих методов лечения и разработка патогенетически обоснованных, эффективных и безопасных схем комплексной терапии псориаза является актуальной задачей.

Цель исследования

Изучить закономерности развития псориаза на основе высокотехнологичных методов оценки генетических и иммунологических характеристик, и с учетом выявленных нарушений разработать патогенетический подход к комплексной терапии псориатической болезни.

Задачи исследования:

1. Провести генетические исследования системы АР-1 в биоптатах кожи

для оценки состояния активности клеточных функций кератиноцитов при

псориазе.

2. Изучить значение возможных ассоциаций полиморфизма генов ДЖВ, ЛЖБ, сЛМ, сР08, РОБЬ2 и АТР4 при псориазе.

3. Установить связь активации цитокинового статуса с тяжестью процесса при псориатической болезни.

4. Изучить влияние различных методов комплексной терапии на цитокиновый статус у больных псориатической болезнью для выбора оптимальной тактики лечения.

5. На основании клинико-иммунологических различий псориатической болезни разработать алгоритм применения низкоинтенсивного лазерного излучения в комплексной терапии.

6. Оценить клиническую эффективность и переносимость разработанных высокотехнологичных вариантов комплексной терапии псориатической болезни.

Научная новизна

Впервые в клинических условиях у больных псориазом проведено генетическое исследование системы АР1 в биоптатах кожи. При псориазе имеются изменения всех оксидативных процессов в коже, которые можно оценивать при помощи исследования уровня экспрессии генов до и после лечения. Проводилось определение уровня экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора АР1 под влиянием проводимой терапии, что представляет большой интерес с практической точки зрения, как точный способ оценки эффективности того или иного лечебного воздействия при псориатическом поражении кожи.

Впервые изучено значение возможных ассоциаций полиморфизма генов ЛЖВ, ЛЛЧТО, с1Ш, сРОБ, Р08Ь2 и АТР4 при псориазе.

Впервые исследована связь активации цитокинов с тяжестью процесса при псориатической болезни путем исследования сывороточных уровней воспалительных и противовоспалительных цитокинов: интерлейкина-18 (1Ь-

7

18), интерлсйкина-15(1 Ь-15), интерлейкина-10 (1Ь-10), интерлейкина-13 (1Ь-13) и фактора некроза опухоли - альфа (ЮТ-а).

Впервые изучена степень дисбаланса цитокинов при различных методах терапии. Многочисленные исследования последних лет показали, что изменение уровня противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных псориазом позволяют судить об активности воспалительного процесса, тяжести течения заболевания и прогнозе развития осложнений. Идентификация специфических для псориаза иммунных механизмов открывает широкие возможности для разработки новой, эффективной и индивидуальной специфической терапии.

Впервые на основании клинико-иммунологических различий псориатической болезни разработан алгоритм применения лазерного излучения в комплексной терапии и оценена клиническая эффективность предлагаемых вариантов комплексной терапии.

Практическая значимость работы:

Впервые в России применён метод оценки результатов лечения с помощью измерения уровня экспрессии генов, что представляет большой интерес с практической точки зрения, как точный способ оценки эффективности того или иного лечебного воздействия при псориатическом поражении кожи. Разработка нового высокотехнологичного способа лечения псориаза - низкоинтенсивным лазерным излучением, позволяющая увеличить длительность ремиссии и снизить затраты на фармакотерапию.

Внедрение полученных результатов:

Результаты работы внедрены в практику работы отделений ГБУЗ «ГКБ №14 им.В.Г.Короленко» ДЗ г.Москвы, а также в работе Филиала "Вешняковский " МНПЦДиК ДЗ г.Москвы

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены на следующих научно-практических конференциях: «Мир людей с ограниченными возможностями» Москва, 2009, «Научная конференция по лазерной медицине Правительства Московской области» г.Дубна,2009, «Здоровье столицы», Москва 2010, «Мир людей с инвалидностью», Москва, 2011, «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии и косметологии", МОНИКИ, Москва, 2011г, Московское общество дерматологов и венерологов, Москва, 2011г.

Апробация работы проводилась на совместном заседании сотрудников лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России и Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии ДЗМ.

Личный вклад автора:

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализа, обобщения и научного обоснования полученных результатов. Автор лично участвовал в получении всех результатов клинической и лабораторно-инструментальной и лечебной части работы: анализировал данные литературы, занимался сбором материала исследования, наблюдал пациентов, составил карты анализа пациентов, проводил биоинформационный анализ и обработку результатов исследования. В экспериментальной части работы автор лично проводил облучение кератиноцитов низкоинтенсивным лазерным излучением. Заполнение разработанных для данного исследования анкет, выписки из протоколов обследования и из лабораторных журналов, ведение компьютерной базы данных обследованных пациентов с псориазом осуществлялись лично Миннибаевым Маратом Талгатовичем в соответствии с фактическими

данными, датой проведенного исследования, фамилией обследуемого. Автор провел статистический анализ полученных результатов, строил выводы и рекомендации на основе полученных результатов.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них в научных рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК - 15 статей.

Получен патент на изобретение РФ «Способ лазерного лечения различных форм псориаза» № 2393896 1Ш опубликовано 10.07.2010 г., Бюл. № 19

Положения выносимые на защиту: Предложен и комплексно изучен путь генных взаимодействий при передаче сигнала от лиганда 1Ь-17, через его рецепторы и ассоциированные с псориазом транскрипционные факторы, приводящий к активации экспрессии матриксных металлопротеаз, являющийся, возможно, одним из ключевых в развитии патологического процесса при псориазе.

Изучено действие лазерного излучения при лечении псориаза на экспрессию матриксных металлопротеаз и транскрипционний комплекс АР-1. Обнаружено значительное повышение экспрессии генов ММР-12, ММР-1 и ММР-9 и снижение экспрессии генов АР-1 комплекса (С-ЛМ, С-РОБ, ЛШ-В и ЛЖ-Б) при псориатическом процессе. Показана зависимость повышенной экспрессии генов матриксных металлопротеаз — ММР-1, -9 ,-12 в культуре кератиноцитов кожи человека от 1Ь-17.

На основе разработанной концепции патогенеза предлагается использование экспрессионных профилей генов 8100А8 и 8100А9 для мониторинга степени тяжести заболевания и эффективности лечения псориатической болезни.

На основании клинико-иммунологических различий псориатической болезни разработан алгоритм применения лазерного излучения в комплексной

терапии и оценена клиническая эффективность предлагаемых вариантов комплексной терапии

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 251 страницах, машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами, 40 графиками, состоит из введения и трех глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», а также заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 368 источников (111 на русском и 257 - на иностранных языках).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование выполнено в лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины ПМГМУ им.И.М.Сеченова на базе стационара ГКБ №14 им. В.Г.Короленко и КВД №15.

Всего было обследовано 866 пациента обоих полов в возрасте от 18 до 65 лет с диагнозами вульгарный, экссудативный, артропатический и ладонно-подошвенный псориаз. Для контроля над исследованием был разработан протокол наблюдения больных, одобренный этическим комитетом ММА им. И.М.Сеченова, в котором нашло отражение множество этиологических и патогенетических особенностей заболевания, а также проявление разнообразия форм его течения. В клиническое и лабораторно-инструментальное обследование входило изучение анамнеза жизни, заболевания, общего и локального статуса, определение индекса PASI, клинического и биохимического анализов крови, определение уровней цитокинов в сыворотке крови, определение уровня экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора API в пораженной псориазом коже и их ответ на воздействие BJIOK, ПУВА-терапии и базисной терапии. Каждый пациент

получал подробную информацию о проводимом исследовании и давал информированное согласие на участие в исследовании.

В соответствии с поставленной целью исследование было проведено в качестве открытого рандомизированного контролируемого.

Идентификация новых белков, участвующих в развитии очага поражения у больных псориазом.

Данное исследование осуществлялось на базе Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Забор биоптатов кожи для идентификации новых белков, участвующих в развитии очага поражения, у больных производили под местной анестезией 2% р-ром новокаина с помощью дерматологического пробойника диаметром 4 мм. Образцы пораженной кожи быстро замораживали в жидком азоте вплоть до определения биохимических параметров. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не должно превышать 15 секунд. Взятые пробы взвешивали и измельчали в ступке, не допуская размораживания образца. Однако, в связи с трудностью гомогенизации кожи, связанной, по всей видимости, с большим содержанием коллагена, первоначально мы проводили измельчение биопсии на предметном стекле скальпелем, а затем растирали в ступке.

Экстракция белков для изофокусировки и электрофореза. Биопсии из пораженной и не пораженной кожи от 3-х пациентов (~ 50 мг каждая) механически гомогенизировали на льду при помощи пестика и ступки в буфере для экстракции, содержащем 7М мочевину (FisherScientific), 2М тиомочевину (MERK), 4% (w/v) CHAPS (Fluka), 0.5% (w/v) Triton X-100 (ICN), 0.5%(w/v) амфолины 3/10 (Bio-Rad), 20 mMTrisbase (FisherScientific), 1 mM MgC12 (Fluka), and0.2 mM PMSF (Acros). Количество используемого буфера для экстракции в 7 раз больше массы образца (на 50 мг образца 350 ц1 буфера для экстракции). Образцы обрабатывались ультразвуком (3 раза по 10 сек, мощность 50%) на

coHHKaTopeBandelin. После гомогенизации и обработки ультразвуком к пробам добавляли DTT (Acros) до конечной концентрации 65мМ и инкубировали при +4°С в течение 30 минут. Затем добавляли Na2EDTA до конечной концентрации 2 мМ и смесь инкубировали 2 часа, после чего центрифугировали при 12,000xg в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса. Относительную концентрацию белков после 1D-SDS-PAGE определяли, используя GS-800 CalibratedDensitometer (Bio-Rad).

Двумерный электрофорез. В первом направлении разделение вели по заряду белка. Для этого стеклянные трубки 20x1.5 mm (Bio-Rad) заполняли гелем, содержащим 8.3 M мочевины (FisherScientific), 4% (w/v) акриламида (Acros), 2% CHAPS (Fluka), 1.6% (w/v) 5/8 and 0.4% (w/v) 3/10 амфолинов (Bio-Rad). В эксперименте использовали 120 ¡.ig белка на гель и разделение вели по следующей программе: 15 мин при 200V, 30 мин при 300V, 16 часов при 400V, и 1 ч при 800V. Изоэлектрофокусирование проводили в Protean II xicell (BioRad). Перед электрофорезом по второму направлению трубку эквилибровали в буфере, содержащем 60 mMTris-bufferpH 6.8, 2% (w/v) SDS, 10% (w/v) glycerol, and 1% (w/v) DTT в течение 30 мин. Для разделении белков во втором направлении использовали 9-16% градиентный ПААГ, который готовили по стандартному протоколу [Laemmli, 1970].

Затем производился анализ изображения. Пятна на геле были визуализированы при помощи окрашивания серебром и сканированы с разрешением 300 dpi. Рисунки были проанализированы с использованием программы MelanielII (GeneBio, Switzerland). Стандартный анализ включал (i) определение относительного объема (%Vol) пятен белков, который определялся как сумма точек в центральном пятне на количество точек во всех пятнах на геле; (п) выравнивание гелей; и (iii) выравнивание пятен. Далее, данные о %Vol каждого пятна обрабатывались тестом Стьюдента, и проверялось, есть ли достоверное различие количества белка в пораженной и непораженной псориазом коже.

Идентификацию белков проводили при помощи метода МА1_Ш-ТОК масс-спектрометрии и метода папоЬС-МЗ/МБ масс-спектрометрии в Протеомном центре Института биомедицинской химии РАМН.

После электрофореза и окрашивания гелей серебром мы идентифицировали 10 новых пятен, которые не встречались (или их интенсивность была существенно ниже) в непораженной коже и которые проявили себя в очаге поражения.

Пятна были вырезаны из геля (~ 3 мм2) и белки из них были идентифицированы. Белки из пятен № 1, 2, 3, 4 были идентифицированы методом МАЬБ1-ТОР масс-спектрометрии, а белки из пятен 5-10 были идентифицированы методом папоЬС-МБ/МБ масс-спектрометрии.

Анализ экспрессии генов кодирующих компоненты транскрипционного фактора АР1 в биоптатах кожи из псориатических очагов

В соответствии с задачами исследования, у пациентов проводилось и определение уровня экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора АР1, под влиянием проводимой терапии. Для этого, у пациентов из основной группы производили забор биоптатов кожи больного псориазом из пораженного участка кожи и из участка видимо неповрежденной кожи, который выступал в качестве контроля. Данное исследование также осуществлялось на базе Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Забор биоптатов кожи больного псориазом из пораженного участка кожи проводили под местной анестезией 2% р-ром новокаина с помощью дерматологического пробойника диаметром 4 мм. Образцы пораженной кожи быстро замораживали в жидком азоте. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не превышало 15 секунд.

РНК выделяли с использованием китов компании Qiagen. К фрагменту ткани добавляли 300ц1 RLT буфера (содержащего ß-ME) и немедленно гомогенизировали. Затем к гомогенату добавляли 590ц1 ddH20 и 10ц1 протеиназы К (10 мг/мл, AppliChem, USA) и перемешивали пипетированием. Инкубировали 10 мин при 55°С. Затем центрифугировали 3 мин при 10000g при комнатной температуре и супернатант (около 900ц1) переносили в новую пробирку.

К супернатанту добавляли половину объема (около 450ц1) этанола 96%. Переносили 700ц1 образца, включая преципитат, на RNeasymini колонку, вставленную в 2-х мл пробирку. Центрифугировали 15 сек при более 8000g (10000об/мин). Удаляли жидкость из пробирки и повторяли предыдущий этап.

Колонку промывали 350ц1 Buffer RW1, после чего обрабатывали ДНКазой. Для этого добавляли 10ц1 исходного раствора DNase I с 70|il Buffer RDD на поверхность силика-геля и оставляли при комнатной температуре на 15 мин. Колонку промывали 350ц1 Buffer RW1 и дважды 500 (ilBuffcr RPE.

РНК элюировали 60ц1 RNAase-free Н^О.

Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В пробирки для ПЦР объемом 200 мкл вносили: буфер , dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV (Promega), 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin (Promega), случайные гексануклеотидные праймеры (Promega) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 час при 37°С.

Для контроля отсутствия примеси ДНК в образце РНК ставили ПЦР на фрагмент гена J UND (forwardprimer 5'-AGCTCACAGTTCCTCTACCC-3', reverseprimer 5'-GCTGGTTCTGCTTGTGTAAATC-3') без обратной транскрипции.

Для контроля выделения РНК и обратной транскрипции, а также нормализации количества РНК в образцах проводили ПЦР с праймерами на «ген домашнего хозяйства» GAPDH (forwardprimer 5'-

TGCMTCCTGCACCACCAACT, reverseprimer 5'-YGCCTGCTTCAC CACCTTC).

ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) с использованием меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, в частности TaqMan® и Beacon®. Реакцию проводили с использованием 2,5-х реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез».

Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, iQ4), используя программу "twostep": (1) денатурация при 95°С в течение 4 мин, (2) денатурация при 94°С в течение 30 сек, (3) отжиг и элонгация при 60°С в течение 1 минуты, (4) этапы 2-3 повторяли 50 раз или "threestep" (1) денатурация при 95°С в течение 4 мин, (2) денатурация при 94°С в течение 15 сек, (3) отжиг при 55°С в течение 15 сек, (4) элонгация при 72°С в течение 15 сек, (5) этапы 2-4 повторяли 50 раз. В таблице 14 приведены гены и праймеры с пробами к ним.

Оценка экспрессии гена IL-17 в пораженной коже

Забор биоптатов кожи больных псориазом (бляшечного типа) Psoriasis vulgaris из пораженного и непораженного участков кожи проводили под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм). Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи. Исследование одобрено Локальным комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и соответствует принципам, изложенным в Декларации Хельсинкского соглашения.

На первом этапе работы пациенты не получали какой-либо системной или PUVA/UV терапии в течение одного месяца до взятия биопсии кожи. На втором этапе работы пациенты проходили курс гемолазеротерапии. Для определения эффективности терапии до и после лечения у пациентов брались биоптаты кожи.

Выделение РНК из биопсий проводили на колонках Qiagen по стандартному протоколу RNeasyMiniKit®. Для освобождения препаратов РНК от примесей ДНК проводили обработку ДПазойСНааеп '' .

Обратную транскрипцию проводили в пробирке для ПЦР объемом 200 мкл, вносили: буфер, 0,1М DTT, ЮмМ dNTP, 200 ед. обратной транскриптазы SuperScript™ (invitrogen), 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin (Promega), 500 Hroligo(dT)I2-i8npaiiмерой (ДНК-Синтез) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 час при 50°С.

ПЦР в реалыюм времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Реакцию проводили с использованием 2,5-х кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол). Праймеры и пробы были разработаны и синтезированы фирмой «ДНК-Синтез».

Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, iQ4), используя следующую программу: (1) денатурация при 95°С в течение 4 мин, (2) денатурация при 94°С в течение 15 сек, (3) отжиг при 55°С в течение 15 сек, (4) элонгация при 72°С в течение 15 сек, (5) этапы 2-4 повторяли 45 раз. Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH. Амплификация гена GAPDH и исследуемых генов проводилась в разных пробирках.

Для обсчета результатов использовались данные реакции ПЦР в реальном времени со следующими параметрами: эффективность праймеров в реакции ПЦР в реальном времени не менее 95%; коэффициент корреляции не менее 0,99; наклон кривой (slope) -3,4±0,2.

Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2"ААСТ, согласно (Livakand Schmittgen, 2001)

Методика внутривенной лазерной терапии

Курс гемолазеротерапии осуществляли с помощью аппарата для внутривенного облучения крови АЛТ "МУЛАТ" (ЗАО «НПО Космического приборостроения»)

Методика проведения процедуры внутривенной лазеротерапии следующая. Положение больного - лежа на спине (рис. 2.7). В кубитальную вену вводят медицинскую иглу в которую вмонтирован световод (комплект изделий для внутривенного облучения крови низкоинтенсивным лазерным излучением КИВЛ-01).

Сущность предлагаемого способа лечения больных различными формами псориаза характеризуется тем, что осуществляют ежедневное лазерное облучение крови с длиной волны 0,63 - 0,89 мкм, мощностью 1-2 мВт, в течение 10 - 30 минут, 1 раз в сутки, суммарной дозой 8- 39 Дж.

Методика ПУВА-терапии

Для общей ПУВА-терапии применяли терапевтическую установку «ПУФА-36» (Россия) с использованием ламп 80W-R фирмы «PHILIPS» (рис. 2.5). При этом дозы ультрафиолетового облучения соответствовали общепринятым. Перед процедурой пациенты принимали внутрь фотосенсибилизатор - аммифурин (ПЭЗ НПО «ВИЛАР») из расчета 0,8 мг на 1 кг массы тела. Препарат принимали только в день процедуры, один раз, после еды, за 2 часа до облучения. Курс лечения состоял из 14-15 процедур, проводимых с частотой 4 раза в неделю. Перед началом лечения с помощью биодозиметра «БД-2» определяли минимальную эритемную дозу области нижней половины живота, которая составила в среднем 5 мин (2 Дж/см2). При ПУВА-терапии с пероральным применением фотосенсибилизаторов за начальную дозу УФА брали 70% от минимальной эритемной дозы (в среднем 3 мин, что составляло 1,5 Дж/см2). Далее разовую дозу УФА увеличивали через процедуру на 1,5 Дж/см2 (3 мин), до максимального значения 18-20 Дж/см2.

Метод терапии контрольной группы пациентов

В соответствии с задачами исследования, пациентам, включенным в контрольную группу, помимо средств базисной системной терапии (дезинтоксикационная терапии (гемодез, раствор натрия хлорида 0,9%, раствор глюкозы 5%, глюконат кальция, тиосульфат натрия), витаминотерапии (витамины группы В, аскорбиновая кислота), гепатопротекторов (эссенциале, гептрал, карсил), антигистаминных препаратов (супрастин, тавегил, фенкарол, диазолин), успокоительных (экстракт валерианы, белласпон), снотворных (феназепам), слабительных (сенаде), проводилась наружная монотерапия очагов псориаза кортикостероидным комбинированным препаратом «Акридерм СК» .

Метод статистической обработки данных

Статистический анализ проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 for Windows. В ней для обработки полученных результатов используется альтернативный метод вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), средней ошибки (ш), среднеквадратичного отклонения (g), коэффициента достоверности (Р) по таблице Стыодента (t). Статистическую оценку результатов исследования проводили при минимальном допустимом уровне вероятности (95%), обычно используемом в медико-биологических исследованиях. Параметры нормальных распределений признаков в выборках описывали в формате M±sd (средние значения и средние квадратические отклонения). При сравнении показателей до и после лечения внутри групп использовали критерий Вилкоксона, при сравнении групп друг с другом — критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни. Сравнение трех и более связанных групп проводили непараметрическим методом Фридмена, корреляционный анализ — непараметрическим методом Кендала. Различия

считали статистически значимыми при р <0,05. Для анализа данных ПЦР в

ддст

реальном времени использовался 2 (Livakand Schmittgen, 2001)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ Клиническая эффективность физиотерапии псориаза

Клиническая оценка эффективности терапии у больных псориазом, включенных в исследование, проводилась при помощи индекса РАБ1 после завершения курса терапии. Проводилось и клиническое наблюдение за побочными эффектами и переносимостью проводимой терапии. Следует отметить, что переносимость всеми больными лечения с использованием различных методик фототерапии была хорошей. В 4случаях у пациентов возникли явления фото дерматита, для купирования которых потребовался перерыв 2-Здня и дополнительное назначение коротким курсом мазей, содержащих кортикостероиды. В дальнейшем лечение было продолжено.

Оценивая динамику клинических симптомов под влиянием проводимой терапии, следует подчеркнуть, что во всех изучаемых группах больных общая направленность изменений была одинаковой, отличия заключались в их характере и степени выраженности. Так проводимое лечение у подавляющего большинства обследованных пациентов способствовало исчезновению или уменьшению основных клинических проявлений (инфильтрация, отек, шелушение) заболевания. При клинической оценке результатов терапии было установлено, что у пациентов основной группы клиническая ремиссия и значительное улучшение после проведения терапии наступили в первой группе -в 94,9% случаев, во второй - в 67,2 %, а у пациентов контрольной группы — в 62,8%.

Вместе с тем, обнаружились и некоторые различия в клинических проявлениях действия ПУВА-терапии и процедур ВЛОК при распространенном вульгарном и экссудативном псориазе. Так, у пациентов изучаемых групп с данными формами псориаза выявлено благоприятное влияние примененных методов физиотерапии на регресс инфильтративных проявлений.

Однако, при вульгарном псориазе отмечалась меньшая положительная динамика в группе гемолазеротерапии (с 2,53±0,15 до1,75±0,11 баллов), тогда как более выраженный регресс инфильтративных проявлений наблюдался в группе, получивших ПУВА-терапию (с 2,79±0,19до 1,12±0,07 баллов; р<0,05). В случае экссудативного псориаза положительные сдвиги в динамике исследуемого показателя статистически не различались в 2-х первых группах, составляя к концу курса 1,73±0,19 балла (р<0,05) и 1,94±0,23 балла (р<0,05) и соответственно, при этом в группе сравнения регресс инфильтрации, безусловно, присутствовал, но в значительно меньшей степени.

У больных вульгарным псориазом II группы уже со 2-й недели лечения выявлено достоверное уменьшение данного показателя (р<0,05), тогда как статистически значимое снижение выраженности инфильтрации у пациентов I группы наблюдалось только к концу лечения. При этом, через 2 недели отмечалось преимущество изолированной ПУВА-терапии (1,92±0,15 баллов) по сравнению с больными получавшими процедуры ВЛОК (р<0,05). Что касается больных с экссудативным псориазом, динамика инфильтрации во всех группах носила однонаправленный характер. Однако, наблюдалось некоторое преобладание регресса инфильтрации в основных группах, по сравнению с больными группы сравнения.

В результате лечения, во всех изучаемых группах больных наблюдалась положительная динамика. Вместе с тем, полученные результаты свидетельствуют о том, что моногемолазеротерапия является эффективным методом воздействия на проявления псориатического процесса. При этом максимальный результат от применения моногемолазеротерапии (снижение индекса РА51 на 23,2 балла) наблюдался в отношении островоспалительных явлений, характерных преимущественно для клиники экссудативного псориаза (зуд, эритема, шелушение), которые регрессировали уже на первых процедурах. Вместе с тем, следует отметить ограниченное влияние ВЛОК на

такой симптом, как инфильтрация кожи.

Что касается зуда, то к концу лечения он исчез у всех больных, разница заключалась только в скорости регресса данного признака. Наиболее эффективной в данном случае оказалась гемолазеротерапия.

Результаты клинического исследования крови

Анализ полученных данных свидетельствует, что динамика гематологических показателей к завершению терапии была незначительной и существенно не различалась во всех группах. Следует отметить, что статистически значимых изменений показателей в пределах времени исследования зарегистрировано не было, все значения не выходили за границы референтных интервалов.

Результаты биохимического исследования крови

В большинстве случаев, среди пациентов, получивших ВЛОК, по сравнению с больными, которым была проведена ПУВА-терапия, изменение уровня исследуемых показателей липидного обмена произошло до величин, характерных или наиболее приближенных к диапазону здоровых лиц. Вместе с тем, не удалось выявить достоверных различий в динамики данных показателей, в зависимости от клинической формы псориатического процесса.

Анализ результатов других биохимических показателей позволил установить, что под влиянием проводимого лечения ни в одной из основных групп больных не отмечено ухудшения изначально нормальных биохимических показателей крови, таких как общий белок, билирубин, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, мочевая кислота.

Оценка содержания индикаторных ферментов к концу лечения у

обследованных групп пациентов в зависимости от клинической формы

псориаза, выявила снижение исходно повышенных показателей только среди

больных ВЛОК группы, при этом, независимо от формы псориаза, произошло

приближение содержания индикаторных ферментов к диапазону значений

здоровых лиц или их нормализация, тогда как у больных других групп

22

возникшие под влиянием лечения изменения не носили достоверного характера.

Оценка динамики цитокинового статуса сыворотки крови больных псориазом

До и после гемолазеротерапии определялись следующие иммунологические показатели сыворотки крови: интерлейкин-10(1Ь-10), интерлейкин-13 (1Ь-13), интерлейкин-15 (1Ь-15), фактор некроза опухоли-альфа (ТЫР-а).

В ходе исследования было выяснено, что уровень различных цитокинов изменялся в 1-3 группах следующим образом:

Таблица. Динамика основных показателей цитокинового статуса

сыворотки крови пациентов в ходе лечения

1 группа (п=334) 2 группа (п=260) 3 группа (п=272) Референт ные

Показатели исход после исход после исход после значения

ные терапии ные терапии ные терапии

10),пг/мл 0,56± 0.27 о,1± 0.12 1,08± 0.22 0,2± 0.18 5,76± 0.24* 0±0.12 * 0-20

13),пг/мл 0,031± 0.32 0 0,027± 0.16 0 0,021± 1.01* 0 0

(1Ь-15),пг/мл 0,061± 0.37 0 0,055± 0.29 0 0,085± 0.55* 0 0

(ТЫБа), пг/мл 0,6± 0.23 0 0,3± 0.25 0 0 0 0

* - различия между группами достоверны при р < 0.05 #- различие с референтными значениями достоверно при р < 0.05

Анализируя данные, полученные после завершения терапии, видно, что и в 1—2 группах, и в 3 (контрольной) группе пациентов наблюдалась нормализация уроня цитокинов IL-13 и IL-15 и уменьшение уроня IL-10 в пределах референтного интервала, a TNF-a снизился до нормальных значений в основной группе. При сопоставлении динамики данных показателей у больных в основной и контрольной группах не было выявлено статистически достоверных различий, за исключением TNF-a.

Под влиянием всех методов терапии происходило уменьшение воспалительной реакции в коже на фоне нормализации уровней IL-13 , IL-15 и TNF-a, а также уменьшение уроня IL-10 в пределах референтного интервала, на фоне улучшения или разрешения клинических симптомов заболевания. Все это позволяет заключить, что все указанные методы оказывают незначительное иммуномодулирующее действие.

Изучение отдаленных результатов лечения больных псориазом

Через 10—12 месяцев после окончания лечения проводилось наблюдение за больными. Было обследовано 149 человек из числа пациентов, получавших гемолазеротерапию, и 158 больных из группы сравнения.

В результате проведенных исследований было установлено, что 43,5% из больных I группы после лечения чувствовали себя хорошо, жалоб не предъявляли, а достигнутый под влиянием процедур гемолазеротерапии лечебный эффект сохранился у них на протяжении года. Это проявлялось отсутствием характерных клинических симптомов заболевания. Вместе с тем, у 21,7% больных период ремиссии составил менее 6 месяцев, тогда как у 34,8% пациентов свежие высыпания появились к концу первого года после окончания лечения.

Что касается группы ПУВА-терапии, то жалобы на появление свежих высыпаний в течение первых 6 месяцев с момента окончания лечения предъявили 22,2% пациентов, тогда как к концу первого года с аналогичными проблемами обратились еще 61,1% человек, что свидетельствовало о меньшей

24

по сравнению с больными I группы стабильности достигнутых положительных результатов и достоверно (р<0,05) уступало.

Наблюдения показали, что рецидивы возникали в связи с нервно-эмоциональными перегрузками, после перенесенных острых инфекционных заболеваний. При этом многие пациенты переставали соблюдать диетические рекомендации.

Необходимо отметить, что при рецидиве заболевания, у большинства больных I группы (76,9% человек) высыпания были единичными и появлялись в основном в типичных местах (локти, колени, голени). В то же время, у 5 пациентов, получивших БЛОК и у 56 больных группы ПУВА-терапии, псориаз носил распространенный характер, с наличием мелких папулезных элементов, типичных для прогрессирующей стадии заболевания. Следует также подчеркнуть, что возникшие после ВЛОК рецидивы, даже, несмотря на распространенный процесс (5 человек), в дальнейшем легче поддавались медикаментозной коррекции.

Таким образом, сравнив стойкость достигнутых результатов лечения у больных разных групп, можно сделать вывод, что через 12 месяцев после окончания терапии, положительные результаты у больных группы гемолазеротерапии (50,0%) значительно превосходили результаты среди пациентов группы ПУВА (16,7%). Протеомный анализ

Проведенный протеомный анализ образцов кожи больных псориазом позволил выявить маркерные белки, присутствующие только в пораженной коже, которые могут являться потенциальными мишенями для действия фармакологических препаратов при лечении данной нозологии (табл.).

Таблица. Идентифицированные белки, различающиеся в пораженной

и непораженной псориазом коже

Пятно, номер Название белка %Vol

Пораженная кожа Непораженная кожа

1 Кератин 17 1,97±0,92 0,18±0,06

Кератин 14

Кератин16

2 SCCA2/SCCA1 0,28±0,09 0,066±0,02

3 Антиген чешуйчатой клеточной карциномы; SCCantigen 0,35±0,18 0,03±0,01

4 Енолаза1 0,87±0,22 0,40±0,14

5 Супероксиддисмутаза [Мп] 0,22±0,03 0,11 ±0,02

6 Галлектин 7; Gal-7 1,14±0,41 0,19±0,01

7 Белок S100-A9 0,54±0,03 0

8 Белок S100-A9 0,15±0,07 0

9 Белок S100-A7 (Псориазин, Psoriasin) 0,51±0,16 0

10 Белок S100-A7 (Псориазин, Psoriasin) 1,36±0,37 0,02±0,03

Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора АР1 в биоптатах кожи из псориатических очагов до и после лечения.

Известно, что при псориазе имеются изменения всех оксидативных процессов в коже, и мы выявляли уровень этих изменений, исследую уровень экспрессии генов до и после лечения НИЛИ.

На рисунке показано изменение уровня экспрессии генов ЛЛЧВ, ЛЖО, сЛЖ, сБОБ, РОБЬ2 и АТР4 у двенадцати пациентов, из основной группы, в пораженной коже по сравнению с непораженной кожей, этих же больных, до и после лечения НИЛИ.

10 -I

П 1-1 п п И

г¥ ш \ю !го № [А] Р4 Ю >1.2

0,1 -1

[ п до лечений

Рис. Обобщённое изменение уровня экспрессии генов ЛЖВ, ЛЖБ, сЛЛЧ, сРОБ, Р08Ь2 и АТР4 у всех пациентов

Результаты исследования показали, что уровень экспрессии исследованных генов в пораженной псориазом коже стабильно отличается от уровня экспрессии в непораженной коже как до лечения НИЛИ, так и после. Так же было показано изменение уровня экспрессии, в сторону увеличения, в пораженной псориазом коже после лечения по отношению к уровню экспрессии в пораженной коже до лечения. Полученные результаты могут

свидетельствовать об эффективности применения НИЛИ при псориатическом поражении кожи.

Впервые в России был применён метод оценки результатов лечения с помощью измерения уровня экспрессии генов, что представляет большой интерес с практической точки зрения, как точный способ оценки эффективности того или иного лечебного воздействия при псориатическом поражении кожи.

Исследование экспрессии генов ММР-1,ММР-2,ММР-9, ММР-12

Используя метод ПЦР в реальном времени, мы изучали изменение уровня экспрессии генов ММР-1, -2, -9, -12, и С-ЛЖ, С-ЕЮЗ, ЛМ-В, ЛМ-Б в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной у 12 больных первой группы до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности (НИЛИ) с длиной волны 1,27 мкм (коротковолновая часть инфракрасного диапазона).

После лечения методом НИЛИ уровень экспрессии гена ММР-1 оказался ниже, чем до лечения - от 0.8 (пациент 5) до 13.3 раза (пациент 7) выше контроля. При сравнении экспрессии гена ММР-1 до и после лечения наблюдалось достоверное снижение у всех пациентов, кроме пациента 7 (уровень экспрессии гена после лечения оказался недостоверно выше). Достоверность отличий между выборками составила р<0.005. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 4.1 ±1.0 раза, в среднем уровень экспрессии гена снизился по данной выборке в 3.6-9.6 раз.

Увеличения экспрессии гена ММР-2 после лечения у пациентов не было обнаружено, а у 45% наблюдалось снижение. В среднем уровень экспрессии гена увеличился по данной выборке в 1.1-2.2 раза, однако отличие между выборками не является достоверным (р=0.10).

Воздействие лазерным излучением низкой интенсивности снижает уровень экспрессии гена ММР-9 в псориатической коже по сравнению с видимо непораженной кожей - от 0.13 (пациент 7) до 2.7 раза (пациент 2) выше контроля. При сравнении экспрессии гена ММР-9 до и после лечения наблюдалось достоверное снижение у всех пациентов, кроме 6 и 8-го пациентов (уровень экспрессии гена после лечения оказался недостоверно повышен). Значимость отличий между выборками составила р<0.05. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 1.2±0.2 раза, в среднем уровень экспрессии гена снизился по данной выборке в 1.7-4.5 раза.

Анализ экспрессии гена ММР-12 после лечения НИЛИ выявил снижение экспрессии гена практически у всех пациентов - При сравнении экспрессии гена ММР-12 до и после лечения НИЛИ наблюдалось достоверное снижение у всех пациентов, кроме пациента 6, и 8-го , - от 0.08 (пациент 5) до 44.5 раза (пациент 6) выше уровня экспрессии в видимо непораженной коже. Достоверность отличий между выборками (до лечения, после лечения) составила р<0.01. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 7.9±3.8 раза, в среднем уровень экспрессии гена снизился по данной выборке в 1.7-9.0 раз.

После лечебного воздействия лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм наблюдается достоверное увеличение экспрессии С-ДЖ (экспрессия повышена в интервале от 0.31 у 8-го пациента до 2.7 раза у 10-го), кроме 6 и 9-го пациентов (недостоверное снижение экспрессии данного гена). Достоверность отличий между выборками (до лечения, после лечения) составила р<0.001. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена С-ЛЖ после лечения оказалось пониженным в 1,4±0.2 раза, в среднем уровень экспрессии гена повысился по данной выборке в 1.5-3.0 раза.

После лечения НИЛИ уровень экспрессии гена С-ЯОЯ оказался выше, чем до лечения - от 0.12 (пациент 5) до 3.2 раза (пациент 6) выше контроля. При сравнении экспрессии гена С-РОБ до и после лечения наблюдалось достоверное повышение у всех пациентов. Значимость отличий между выборками (до лечения, после лечения) составила р<0.001. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения было повышено в 1.6±0.3 раза, т.е. уровень экспрессии гена в среднем повысился по данной выборке в 2.9-5.7 раз.

После лечения уровень экспрессии гена ЛЖ-В в целом оказался выше, чем до лечения - от 0.32 (пациент 11) до 2.5 раза (пациент 9) выше контроля. При сравнении экспрессии гена ЛМ-В до и после лечения наблюдалось достоверное повышение у всех пациентов, кроме пациента 5. Достоверность отличий между выборками составила р<0.005. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 1,5±0.2 раза, в среднем уровень экспрессии гена повысился по данной выборке в 1.7-3.1 раз.

После лечебного воздействия НИЛИ с длиной волны 1,27 мкм уровень экспрессии гена ЛМ-Б повысился - от 0.25 (пациент 8) до 5.9 раза (пациент 4) выше контроля. При сравнении экспрессии гена ЛЖ-О до и после лечения наблюдалось достоверное повышение у всех пациентов, кроме 1-го пациента (уровень экспрессии гена после лечения оказался недостоверно понижен). Значимость отличий между выборками составила р<0.01. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 1.4±0.4 раза, в среднем уровень экспрессии гена повысился по данной выборке в 1.8-5.6 раз.

Уровень экспрессии гена 1Ь-17 в пораженной псориатическим процессом коже после воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением значительно снижался у всех пациентов — от 0.67 (пациент 7) до 3470 раз (пациент 2) выше контроля. Значимость отличий между выборками (до лечения, после лечения)

составила р<0.01. В группе пациентов без противоспалительной терапии экспрессия гена 1Ь-17 в пораженной псориазом коже относительно видимо непораженной после лечения оказалась повышенной в 16±12 раз, т.е. в среднем уровень экспрессии гена снизился в первой группе в 1.2-22 раза. Во второй группе с длительной системной терапией после лечения уровень экспрессии 1Ь-17 в бляшках кожи пациентов значительно превышал контроль - в 1400±470 раз, а в среднем уровень экспрессии гена снизился во второй группе в 2.0-6.0 раз.

Достоверное снижение экспрессии сверхэкспрессированных генов ММР-1, ММР-9, ММР-12,1Ь-17 и повышение экспрессии генов С-Ш, С-Р08, ЛМ-В и ЛЖ-Б, подавляемых при активной стадии псориаза у исследуемой группы пациентов при воздействии низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1,27 мкм, позволяет говорить о высокой терапевтической эффективности этого метода.

Основной клинической симптоматикой псориаза является повышенная

репродукция клеток эпидермиса и нарушение процессов их дифференцировки,

что приводит к формированию дефектного рогового слоя на фоне

воспалительного характера изменений в дерме. Видимые тканевые изменения

при псориазе, как полагают, обусловлены повышенным содержанием

провоспалительных цитокинов, таких как ТЫР-а, ШЫ-у, 1Ь-1р, 1Ь-8, 1Ь-12 и 1Ь-

17 [Нетс1ап Ы.У. е1 а1., 2010]. Активированные Т-клетки высвобождают

хемокины и ростовые факторы, которые запускают пролиферацию

кератиноцитов, измененную дифференцировку и антигенные тканевые ответы.

При этом окончательно образуются хронические бляшки, характеризующиеся

внутриэпидермальными С08+ Т-клетками и нейтрофилами. Эта фаза

сопровождается утончением эпидермиса, образованием чешуек и ангиогенной

реакцией ткани, что полностью отражает картину поврежденных участков на

коже [ОисУопББОп е1 а1., 2010]. Таким образом, клиническая картина,

наблюдаемая при псориазе, является результатом взаимодействий между

31

иммунными клетками и кератиноцитами в коже. Именно изучению роли про воспалительных цитокинов (в том числе 1Ь-17) и посвящены многие исследования, проведенные в последнее время. Если ранее изучение псориаза заключалось в измерении параметров клеточных инфильтратов, то в настоящее время начинается новый уровень исследований, направленных на изучение молекулярных путей патогенеза при псориазе и идентификацию белковых мишеней для фармакологического эффекта. В этих исследованиях важнейшее значение имеет выявление механизмов регуляции экспрессии всех генов, задействованных в сложной сети, участвующей в развитии псориатического процесса.

На основании проведенного нами анализа баз данных мы идентифицировали ряд генов, которые в контексте с вышеизложенным представляются важными для исследования. В их числе гены, кодирующие транскрипционный фактор АР-1 (С-ЛЖ, ЛЖ-В, ЛЖ-Б, С-ГОБ и РЯА-1), интерлейкин 1Ь-17 и матриксные металлопротеазы (ММР-1, -2, -9 и -12). Центральная роль членов АР-1-семейства объясняется их ответом на целый ряд внеклеточных стимулов, а также тем, что ЛЖ, РОБ и АТИ белки становятся активными во многих биологических процессах, таких как эмбриональное развитие, ремоделирование тканей, опухолеобразование, воспаление и апоптоз, а также в ответ на действие радиации или химических канцерогенов. С помощью биоинформационного анализа был предложен путь действия 1Ь-17 на кератиноциты через транскрипционные факторы АР-1 и ЫР-кВ, ведущий к активации генов-мишеней матриксных металлопротеаз-1,-2, 9 и -12.

Для подтверждения присутствия построенного нами пути действия 1Ь-17

на клетки кожи в патогенезе псориаза мы исследовали уровень экспрессии гена

интерлейкина-17, генов транскрипционного комплекса АР-1 и генов-мишеней

металлопротеаз внеклеточного матрикса (ММР-1, ММР-2, ММР-9 и ММР-12).

С помощью метода ПЦР в реальном времени мы обнаружили снижение

экспрессии генов транскрипционного комплекса АР-1 (С-ЛЖ, ЛЖ-В, ЛЖ-Э и

32

C-FOS) в коже больных псориазом. Имеющиеся в литературе данные также свидетельствуют о сильном снижении экспрессии JUN белков в пораженной псориазом коже [ZenzR., 2005] и о том, что комплекс C-JUN/JUN-B является негативным регулятором псориатического процесса [Vandal К., 2003], что согласуется с полученными нами результатами. Ранее уже сообщалось о повышении экспрессии ММР-1 и ММР-9 при псориазе, однако оверэкспрессия ММР-12 показана нами впервые. Повышение экспрессии матриксных металлопротеаз, видимо, связано с ремоделированием эпителия, привлечением макрофагов и лейкоцитов при образовании бляшки.

Изменение экспрессии исследуемых генов (повышение - ММР-1, -9, -12, IL-17 и снижение - C-JUN, JUN-B, JUN-D и C-FOS) в псориатических бляшках, по сравнению с визуально непораженной кожей, нормализация экспрессии этих генов после терапевтического воздействия интерференционными токами или лазерным излучение низкой интенсивности говорят о значимости данных генов в патогенезе псориаза. Лечебный эффект биофизического воздействия лазерного излучения низкой интенсивности при терапии псориаза, по-видимому, связан с нормализацией ими разрегулированной работы генов через активацию трансмембранных рецепторов и протеинкиназ, участвующих при передаче сигнала IL-17 в ядро клеток. Ранее было показано, что уровень ММР-1 повышен в плазме крови и псориатических бляшках больных псориазом, коррелирует с коэффициентом PASI и даже может рассматриваться в качестве одного из маркеров псориатического процесса [Flisiak I., 2008]. Повышенная экспрессия гена ММР-12 на уровне мРНК в псориатических бляшках показана нами впервые и не противоречит данным о повышенном уровне ММР-12 в макрофагах пораженной псориазом кожи [Suomela S., 2001]. Повышение экспрессии генов ММР-1, -9, и -12 при псориатическом процессе позволяет предложить использование их в качестве критерия состояния патологического процесса и эффективности лечения.

Следует отметить, что полученные данные по изменению экспрессии генов в бляшках нормированы на уровень экспрессии в визуально непораженной коже пациентов. Ранее уже отмечалось отличие визуально непораженной кожи при псориазе и кожи здорового человека как на гистологическом (увеличение толщины дермы, количества резидентных лимфоцитов), так и на молекулярном уровнях. С использованием антител к ММР-12 мы показали накопление этой металлопротеазы в псориатических бляшках, снижение уровня ММР-12 в визуально непораженной коже и практически полное отсутствие синтеза ММР-12 в коже здоровых людей.

Нами было доказано, что действие провоспалительного цитокина (1Ь-17) на первичные и иммортализованные кератиноциты (основные клетки, задействованные в моделировании эпидермиса при псориазе) связано с активацией в них синтеза тех же металлопротеаз, что и при псориатическом процессе (ММР-1, -9 и -12). Это подтверждает созданную при биоинформационном анализе сеть передачи сигнала от рецептора 1Ь-17 через белки комплекса АР-1 к регулируемым ими генам-мишеням в кератиноцитах при патогенезе псориаза, в результате которых бессимптомная кожа превращается в пораженную псориатическими бляшками. Полученные результаты дополняют существующую цитокиновую модель патогенеза псориаза и могут способствовать идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения заболевания.

Одной из главных предпосылок к выполнению настоящего исследования явилась необходимость поиска эффективных патогенетически обоснованных методов лечения заболевания, обладающих широким спектром действия, малым количеством противопоказаний и легко воспроизводимых в любом медицинском учреждении.

Учитывая отсутствие сведений об использовании внутривенного

лазерного облучения крови, а также сравнительной эффективности

традиционных схем ПУВА-терапии и ВЛОК, целью настоящего исследования

34

явилось повышение эффективности комплексного лечения данной патологии с применением гемолазеротерапии.

Выбор гемолазеротерапии в качестве лечебного метода представлялся нам целесообразным по ряду причин. С одной стороны, она обладает системным действием на организм. Кроме того, включение ВЛОК в лечебный комплекс больных псориазом давало возможность ускорить рассасывание бляшек, снизить риск развития малигнизации и токсического воздействия на паренхиму печени и почек. Средством реализации в данном случае является влияние лазерного изучения на процессы образования свободно-радикальных соединений крови, обеспечивающих остановку гиперпластических процессов в бляшке с последующим апоптозом, сбалансированности окислительно-восстановительных процессов в коже путем нормализации антиоксидантной активности. Для гемолазеротерапии так же характерно (и это активно используется в широкой лечебной практике) позитивное регулирующее влияние на различные звенья иммунитета, способность при назначении в адекватных дозировках оказывать трофическое и противовоспалительное действие.

Представлялось важным изучить влияние процедур внутривенной лазеротерапии и ПУВА на клинические проявления псориаза (инфильтрация, эритема, шелушение), динамику лабораторных показателей, определяющих выраженность кожного процесса, нарушения иммунного статуса и процессы свободнорадикального окисления у наблюдаемых пациентов. Наряду с этим, на основании изучения изменений клинических и лабораторных показателей по данным непосредственных и отдаленных результатов лечения больных псориазом осуществить проведение анализа терапевтической эффективности используемых методик фототерапии и определить показания для их включения в комплекс лечебных мероприятий.

Основой настоящей работы стали результаты выполненных клинических,

биохимических и иммунологических исследований, позволившие оценить

35

разные аспекты действия гемолазеротерапии и ПУВА у 594 больных псориазом, поступивших в стационар для лечения. В качестве группы сравнения выступали 272 пациента с псориазом, получавшие стандартную базисную терапию.

У всех пациентов, включенных в исследование, заболевание находилось в прогрессирующей или стационарных стадиях. Преимущественное большинство пациентов, включенных в исследование, находились в активном трудоспособном возрасте.

В соответствии с методикой терапии больные были разделены на три группы: Первую группу составили 334 пациента, получавших на фоне базисной терапии ВЛОК, во вторую группу вошло 260 пациентов, получавших базисную и ПУВА-терапию, третью (контрольную) группу составили 272 пациента, получавших только базисную терапию. Во всех группах лечение проводилось с использованием базисных методов лечения псориаза (дезинтоксикационная терапия, витамины, гепатопротекторы, антигистаминные, успокоительные препараты). Наружно в контрольной группе - комбинированный препарат салициловой кислоты и глюкокортикостероида, в 1-2 группах не проводилось никакой наружной терапии, кроме физиотерапии и смягчающих средств.

Оценка анамнестических данных показала, что у большинства пациентов (51,62%) псориазом страдали ближайшие родственники. Из факторов, провоцирующих возникновение псориаза и его рецидивов, наиболее часто отмечался психотравмирующий фактор - 53,92%.

Анализ частоты сопутствующей патологии показал, что у обследуемых больных псориазом преобладала патология сердечнососудистой (31,99%) и пищеварительной (31,87%) систем.

Объективная оценка тяжести заболевания проводилась с помощью интегрального индекса распространенности и тяжести псориаза (РАБ1), который учитывал основные клинические симптомы псориаза (инфильтрация,

эритема, шелушение) и площадь поражения кожных покровов.

36

Анализ результатов лабораторных исследований показал, что в наблюдаемой нами группе больных псориазом стандартные гематологические показатели в целом не выходят за пределы нормальных значений. В то же время, при биохимическом исследовании крови больных, наиболее значимые изменения касались преимущественно липидного обмена и уровня активности индикаторных ферментов, что свидетельствует об определенных метаболических нарушениях.

Анализ результатов проведенного лечения в каждой из изучаемых групп показал хорошую переносимость примененных методов физической терапии, положительную динамику клинических симптомов заболевания и нарушенных лабораторных показателей. При этом выявились как общие закономерности, так и определенные различия в характере и степени влияния применяемых методов фототерапии на имеющиеся нарушения.

Под влиянием используемых методов терапии клиническая ремиссия и значительное улучшение после проведения терапии наступили в первой группе -в 94,9% случаев, во второй - в 67,2 %, а у пациентов контрольной группы - в 62,8%.

При этом обнаружились некоторые различия в клинических проявлениях

действия ПУВА-терапии и процедур ВЛОК при распространенном вульгарном

и экссудативном псориазе. В частности, при вульгарном псориазе отмечалась

меньшая положительная динамика инфильтрации высыпаний в группе

гемолазеротерапии (с 2,53±0,15 до1,75±0,11 баллов), тогда как более

выраженный регресс инфильтративных проявлений наблюдался в группе,

получивших ПУВА-терапию. В случае экссудативного псориаза

положительные сдвиги в динамике исследуемого показателя статистически не

различались в 2-х первых группах, составляя к концу курса 1,73±0,19 балла

(р<0,05) и 1,94±0,23 балла (р<0,05) и соответственно, при этом в группе

сравнения регресс инфильтрации, безусловно, присутствовал, но в значительно

меньшей степени. При оценке скорости регресса инфильтрации у пациентов в

37

зависимости от формы псориатического процесса и примененного метода фототерапии, у больных вульгарным псориазом II группы уже со 2-й недели лечения выявлено достоверное уменьшение данного показателя (р<0,05), тогда как статистически значимое снижение выраженности инфильтрации у пациентов I группы наблюдалось только к концу лечения.

При оценке регресса эритемы было выявлено, что и у больных с распространенной вульгарной, и с экссудативной формами псориаза BJIOK вызывает более выраженное уменьшение этого симптома по сравнению с ПУВА и базисной терапией. При этом скорость регресса данного симптома была примерно одинаковой у больных вульгарным псориазом в I и II группах, в то время как у пациентов с экссудативным псориазом преимущество гемолазеротерапии по сравнению с ПУВА можно было наблюдать уже со второй недели лечения.

Оценка влияния проведенной терапии на такой клинический симптом как шелушение, показала, что к концу лечения во всех группах наблюдалось достоверное уменьшение этого признака. При этом наилучшие результаты наблюдались у пациентов, проходивших гемолазеротерапию.

Что касается такого симптома, как зуд, выраженное улучшение по данному признаку наблюдалось во всех группах (р<0,05), отличие заключалось лишь в сроках его купирования. Так, среди больных II группы купирование признака отмечалось в среднем после 6 процедур (66,7%), тогда как уже после 3 процедуры BJIOK у 75,86% больных I группы с жалобами на зуд, данный клинический симптом существенно снижался, а после 4-5 процедур полностью исчезал, что достоверно превышало показатели II группы (р<0,05).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что гемолазеротерапия

является эффективным методом воздействия на проявления псориатического

процесса. При этом максимальный результат от применения

моногемолазеротерапии (снижение индекса PASI на 23,2 балла) наблюдался в

отношении островоспалительных явлений, характерных преимущественно для

38

клиники экссудативного псориаза (зуд, эритема, шелушение), которые регрессировали уже на первых процедурах. Однако, следует отметить ограниченное влияние БЛОК на такой симптом, как инфильтрация кожи.

Эти данные позволяют сделать вывод о том, что использование БЛОК эффективно у больных псориазом и может применяться в виде монотерапии псориаза в случае отсутствия выраженных инфильтративных проявлений. Таким образом, подводя итоги оценки действия различных методик фототерапии на клинические проявления псориаза, частоту и сроки их регресса, можно сказать, что внутривенное лазерное облучение крови имеет преимущество перед ПУВА-терапией по скорости купирования островоспалительных явлений (эритема, шелушение, зуд), что очень актуально для лечения экссудативной формы псориаза. Вместе с тем, БЛОК значительно уступает ПУВА-терапии в плане регресса инфильтрации, что снижает результативность при средней и тяжелой степени течения заболевания.

Оценка результатов общего клинического исследования крови показала, что динамика гематологических показателей к завершению терапии была незначительной и существенно не различалась в обеих группах.

При анализе биохимических показателей в большинстве случаев, среди пациентов, получивших БЛОК, по сравнению с больными, которым была проведена ПУВА-терапия, изменение уровня исследуемых показателей липидного обмена произошло до величин, характерных или наиболее приближенных к диапазону здоровых лиц. Вместе с тем, не удалось выявить достоверных различий в динамики данных показателей, в зависимости от клинической формы псориатического процесса.

Оценка содержания индикаторных ферментов к концу лечения у

обследованных групп пациентов в зависимости от клинической формы

псориаза, выявила снижение исходно повышенных показателей только среди

больных ВЛОК группы, при этом, независимо от формы псориаза, произошло

приближение содержания индикаторных ферментов к диапазону значений

39

здоровых лиц или их нормализация, тогда как у больных других групп возникшие под влиянием лечения изменения не носили достоверного характера.

Анализ результатов проведенных исследований позволяет сказать, что ВЛОК снижает уровень активности индикаторных ферментов, оказывая определенное противовоспалительное действие на печеночную ткань, способствует оптимизации липидного обмена, нарушение которого является одним из патогенетических механизмов заболевания.

Под влиянием всех методов терапии происходило уменьшение воспалительной реакции в коже на фоне нормализации уровней 1Ь-13 , 1Ь-15 и ТОТ-а, а также уменьшение уроня 1Ь-10 в пределах референтного интервала, на фоне улучшения или разрешения клинических симптомов заболевания. Все это позволяет заключить, что все указанные методы оказывают незначительное иммуномодулирующее действие.

При оценке продолжительности ремиссии у больных псориазом было установлено, что 43,5% из больных группы гемолазеротерапии после лечения чувствовали себя хорошо, жалоб не предъявляли, а достигнутый под влиянием процедур гемолазеротерапии лечебный эффект сохранился у них на протяжении года. Это проявлялось отсутствием характерных клинических симптомов заболевания. Вместе с тем, у 21,7% больных период ремиссии составил менее 6 месяцев, тогда как у 34,8% пациентов свежие высыпания появились к концу первого года после окончания лечения.

Что касается группы ПУВА-терапии, то жалобы на появление свежих высыпаний в течение первых 6 месяцев с момента окончания лечения предъявили 22,2% пациентов, тогда как к концу первого года с аналогичными проблемами обратились еще 61,1% человек, что свидетельствовало о меньшей по сравнению с больными, получавшими лазеротерапию, стабильности достигнутых положительных результатов и достоверно (р<0,05) уступало.

Таким образом, результаты выполненных исследований свидетельствуют о важной роли внутривенной лазеротерапии в лечении псориаза. По-видимому, гемолазеротерапию можно рекомендовать всем больным на ранних этапах лечения, но в наибольшей степени - лицам с экссудативной формой псориаза, имеющим сопутствующую патологию, пациентам старших возрастных групп в связи с тем, что выявляемые нарушения различных органов и систем в наибольшей степени характерны для них. При легком течении заболевания, когда нет необходимости проводить ПУВА-терапию, гемолазеротерапия может быть использована в качестве одного из основных методов физиотерапевтического воздействия.

ВЫВОДЫ

1. Проведенный биоинформационный анализ сетевых взаимодействий генов, с измененной при псориазе экспрессией, позволил построить сигнальный путь, ведущий от интерлейкина-17 через транскрипционные факторы (АР-1 и кВ) к генам-мишеням — матриксным металлопротеазам, являющийся, возможно, одним из ключевых в развитии патологического процесса при псориазе.

2. Экспериментально показано повышение экспрессии генов матриксных металлопротеаз — ММР-1, -9, -12 и1Ь-17 и снижение экспрессии генов 4-х основных компонент транскрипционного фактора АР-1 — С-ДЖ, ЛЖ-В, ЛЖ-О и С-БОБ генов в пораженной псориазом коже.

3. Индукция культуры как первичных, так и иммортализованных кератиноцитов интерлейкином 1Ь-17 активирует экспрессию генов металлопротеаз ММР-1, -9 -12. Ингибирование процесса передачи сигнала от интерлейкина-17 приводит к снижению уровня экспрессии и синтеза матриксных металлопротеаз ММР-1, ММР-9 и ММР-12, что позволяет говорить о важной роли 1Ь-17 в пути активации данных генов.

4. Показано, что экспрессия двух генов класса ЯЮО-белков - 8100А8, 8100А9 повышена (на порядок и более) в псориатических бляшках по сравнению с непораженной кожей пациентов. Показан характер локализации накопления белков генов 8100Л8 и 8100А9 в коже больных псориазом, что свидетельствует об их ключевой роли в развитии патологии.

5. На основе разработанной концепции патогенеза предлагается использование экспрессионных профилей генов 8100А8 и 8100А9 для мониторинга степени тяжести заболевания и эффективности лечения псориатической болезни.

6. Предложенная патогенетическая модель использована в качестве оценки эффективности различных методов фототерапии при псоразе:

• Анализ изменений в экспрессии исследуемых генов при лечебном биофизическом воздействии на кожу лазерного излучения низкой интенсивности (Х=1.27нм) показал нормализацию экспрессии исследуемых генов после успешно проведенной терапии у больных псориазом, что указывает на их важную роль в патогенезе псориаза.

• показано, что после успешной гемолазеротерапии экспрессия изучаемых генов класса 8100-белков - 8100А8 статистически достоверно снижается.

7. Полученные лабораторные данные подтверждаются клиническими результатами:

• Оценка результатов различных методов фототерапии при катамнестическом исследовании больных показала, что внутривенное лазерное облучение крови (БЛОК) оказалось весьма эффективным и патогенетически обоснованным методом в лечении легких и среднетяжелых, особенно впервые возникших форм распространенного псориаза, что подтверждено положительной динамикой такого объективного клинического показателя, как РА81. Скорость регресса острых воспалительных явлений (отек, шелушение, зуд), наиболее

выраженных при экссудативной форме пеориатичеекого процесса, при ВЛОК превышает скорость регресса этих явлений при ПУВА.

• При использовании гемолазеротерапии основной пик обострения у обследуемых лиц приходился на период от 12 до 18 месяцев, тогда как при ПУВА-терапии - на первые 6-12 месяцев с момента окончания лечения. При этом последующие обострения заболевания у больных, получавших лечение с использованием лазерного излучения, носили более локальный характер и легче поддавались медикаментозной коррекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Применение гемолазеротерапии на фоне базисного медикаментозного лечения показано для лечения больных легкими и среднетяжелыми формами псориаза, а также на ранних этапах терапии пациентов с тяжелыми формами псориаза, резистентности или непереносимости других терапевтических средств, наличием сопутствующих заболеваний, являющихся противопоказанием к назначению ПУВА.

Учитывая доказанную эффективность и безопасность использованного режима внутривенного лазерного облучения крови целесообразно использование следующих режимов дозирования:

При ограниченном вульгарном псориазе экспозиция воздействия составляет 10 мин., суммарная энергетическая доза лазерного излучения составляет 8-10 Дж.

При распространенном вульгарном псориазе экспозиция воздействия составляет 15 мин., суммарная энергетическая доза лазерного излучения составляет 19-23 Дж.

При экссудативном псориазе экспозиция воздействия составляет 20 мин., суммарная доза лазерного излучения составляет 17-19 Дж.

• При артропатическом псориазе экспозиция воздействия составляет 30 мин., суммарная энергетическая доза лазерного излучения составляет 33-39 Дж.

• Сеансы проводят ежедневно, 1 раз в сутки. Параметры внутривенного лазерного облучения крови: длина волны 0.63 - 0,89 мкм, мощность 1-2 мВт.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. С.А.Брускин, P.M.Абдеев,С.А.Мошковский,А.Л.Пирузян,Д.Н.Серов, И.М.Корсунская, Э.С.Пирузян, М.Т.Миннибаев Протеомные исследования псориаза как подход к идентификации потенциальных мишеней фармакотерапии// Клиническая дерматология и венерология. -№ 1, 2009, с. 28-31.

2. I Korsunskaya, L. Egorenkova, M. Minnibaev, L. Prischepov, A. Hertsen, M. Korsunskaya Infared laser radiation in the therapy of skin ulceration //18th Congress of the European Academy of Dermatology and Venerology, 7-11 октября 2009, Берлин.

3. I Korsunskaya, M. Minnibaev, A. Piruzyan , A. Gertzin. The using of lasers in dermatology//10 th International Congress of Dermatology, 20-24 мая 2009, Прага.

4. Корсунская И.М., Герцен А.В., Васина Т.А., Паскачев А.Б., Миннибаев М.Т., Коробченко Е.Ж. Лазероантибиотикотерапия в лечении посттравматических дефектов кожи.// Проблемы амбулаторной хирургии, материалы 10 научно-практической конференции поликлинических хирургов Москвы и московской области. - Москва, 2009, с. 351-354

5. Р. Алеид, Е.В. Калинина, Н.Н. Чернов, М.М. Нурмурадов, А.Н. Саприн, М.Т. Миннибаев, Д.В. Серов, И.М.Корсунская, А.Е. Буткалюк. Антиоксидантный статус больных псориазом после курса внутривенного лазерного облучения крови.// Экспериментальная и клиническая дерматокосметология, № 4,2010, с. 59-61

6. И.М.Корсунская И.М., З.А. Невозинская, Н.Г. Диковицкая, М.Т. Миннибаев, С.Д. Гусева. Выбор тактики терапии аллергического контактного дерматита на лице.// Эффективная фармакотерапия в дерматовенерологии и дерматокосметологии, № 2 июнь, 2010, с. 18-22

7. Л.Ш. Тогоева, М.Т. Миннибаев, И.М. Корсунская Принципы наружной терапии псориаза, Эффективная фармакотерапия в дерматовенерологии и дерматокосметологии, № 3, 2010, с. 22-23

8. Соболев В.В., Золоторенко А.Д., Соболева А.Г., Елкин A.M., Ильина С.А., Серов Д.Н., Потекаев H.H., Ткаченко С.Б., Миннибаев М.Т., Пирузян А.Л. Влияние экспрессии гена FOSL1 транскрипционного фактора АР-1 на псориатический процесс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010, т. 150, № 11, с. 564— 567.

9. Соболев В.В., Стародубцева Н.Л., Соболева А.Г., Рахимова О.Ю., Корсунская И.М., Пирузян Э.С., Миннибаев М.Т., Кривощапов Л.Г., Брускин С.А., Воронько O.E. Роль интерлейкинов в патогенезе псориаза.// Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. № 5 (12) 2010, с.79-84.

Ю.Шахова A.C., Куликов А.Г., Герцен A.B., Миннибаев М.Т., Корсунская И.М., Игнатова Е.В. Сравнительный анализ эффективности пизкоинтенсиного лазерного излучения и ПУВА-терапии в лечении псориаза.// Физиотерапия, бальнеология и реабилитация. № 4, 2010, с. 16-21.

П.Герцен A.B., Корсунская И.М., Миннибаев М.Т. Патент на изобретение № 2393896 RU, зарегистрирован в Государственном реестре изобретение РФ «Способ лазерного лечения различных форм псориаза» опубликовано 10.07.2010, Бюл. № 19.

12.С.А. Ильина, А.Д. Золотаренко, А.Л. Пирузян, М.Т. Миннибаев , С.А. Брускин, В.В. Соболев. Экспрессия генов S100A8 и S100A9 в

пораженной псориатическим процессом коже. Технологии живых систем. - 2010, т.7, № 8, с. 38-44.

13.Шахова А.С., Герцен А.В., Миннибаев М.Т., Игнатова Е.В.Корсунская И.М., Микро- и макро- элементы в терапии акне // Санкт-Петербургские дерматологические чтения, 21-22 октября 2010.

14.I.M.Korsunskaya, Z. Niewozinska, I. Danilin, L. Togoeva, O.Dordzieva, E. Lukyanova, M. Minnibaev. Topical therapy influence on psychic and emotional state of patients with psoriasis// JEADV, volume 24, supplement 4july 2010, Abstract of the 3rd International Congress on Psoriasis July 2010, Paris, France, P 106, page 47.

15.I.M.Korsunskaya, Z. Niewozinska, I. Danilin, L. Togoeva, O.Dordzieva, E. Lukyanova, M. Minnibaev. Mental and emotional state of patients with generalized psoriasis// JEADV, volume 24, supplement 4,july 2010, Abstract of the 3rd International Congress on Psoriasis 1-4 July 2010, Paris, France, P 139, page 60.

16.I.M.Korsunskaya, M. Minnibaev, R. Alied, E. Kalinina, N. Chernov, M. Nurmuradov, A. Saprin, D. Serov. Low-intensity laser radiation effect on antioxidant status in psoriasis// JEADV, volume 24, supplement 4,july 2010, Abstract of the 3rd International Congress on Psoriasis 1-4 July 2010, Paris, France, P 168, page 72.

17.Корсунская И.М., Шахова A.C., Герцен A.B., Миннибаев М.Т., Игнатова Е.В. Лазерное излучение и ПУВА-терапия в лечении и реабилитации больных псориазом.// Российский научно-образовательный форум «Мир людей с ограниченными возможностями здоровья, 10-11 ноября 2009, Москва, с. 40—41

18.И.М.Корсунская, Р. Алеид, Е.В. Калинина, Н.Н. Чернов, М.М. Нурмурадов, А.Н. Саприн, М.Т. Миннибаев, Т.Т. Березов, А.Е. Буткалюк. Редокс-зависимая активация антиоксидантной защитной системы у

больных псориазом после внутривенного лазерного облучения крови.// Человек и лекарства, 2009.

19.Корсунская И.М., Невозинская З.О., Гусева С.Д., Миннибаев М.Т., Диковикая И.Г. Выбор тактики терапии аллергического контактного дерматита на лице// Сборник тезисов XI Всероссийского съезда дерматовенерологов и косметологов, Екатеринбург, 9-12 ноября 2010, с. 53.

20.Шахова A.C., Куликов А.Г., Герцен A.B., Корсунская И.М., Гайнулин Ш.М., Миннибаев М.Т., Игнатова Е.В. Сочетанное применение лазерного излучения и ПУВА-терапии у больных псориазом, Материалы VI научно-практической конференции, посвященной памяти профессора A.JI. Машкиллейсона, Москва, 2010, с. 88-89

21.Irina Korsunskaya, Marat Minnibaev, Ivan Danilin. Contact dermatitis of face// 7th EADV Spring Symposium, 13-16 may 2010, Cavtat, Croatia.

22.Korsunskaya Irina,Tamara Karapetian, Zoña Niewozinska, Marat Minnibaev, Ivan Danilin. Phytodermatitis//7th EADV Spring Symposium, 13-16 may 2010, Cavtat, Croatia.

23.Л.Ш.Тогоева, M.T.Миннибаев, Е.Н.Лукьянова, И.М.Корсунская Опыт терапии ладонно-подошвепного псориаза.// Вестник дерматологии и венерологии. №1,2011, с. 91-95.

24.Стародубцева Н.Л., Миннибаев М.Т., Соболева А.Г., Корсунская И.М., Кривощапов Л.Г., Елкин A.M., Яковенко Г.Т., Пирузян А.Л., Брускин С.А. Экспрессия интерлейкина 17 в коже больных псориазом.// Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. № 2 (15). - 2011, с. 38-41.

25.Корсунская И.М., Соболева А.Г., Соболев В.В., Стародубцева Н.Л., Пирузян А.Л., Миннибаев М.Т., Брускин С.А. Изучение действия низкоинтенсивного лазерного излучения на экспрессию генов матриксных металлопротеаз в культуре клеток кератиноцитов

47

человека.// Клиническая дерматология и венерология, №4, 2011, с. 101-105

26.Соболев В.В., Стародубцева H.JL, Пирузян A.JL, Миннибаев М. Т., Саутин М.Е., Туманов В.П., Брускин С.А. Сравнительное исследование экспрессии генов ATF-3 и ATF-4 в пораженных атеросклеротическим процессом сосудах и в коже при псориатическом процессе// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011, т. 151, № 6, с. 659-663.

27. Корсунекая И.М., Соболев В.В., Соболева А.Г., Миннибаев М.Т., Киселева Л.Ф., Щербакова A.B., Грибанова Е.Б., Пирузян Э.С., Брускин С.А. Анализ воздействия лазерного излучения на экспрессию гена FRA-1 в культуре клеток кератиноцитов при лечении псориаза. // Технологии живых систем. 2011., т. 8, № 8, с. 74-78.

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Миннибаев Марат Талгатович

ПСОРИАТИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ: ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПАТОГЕНЕЗА, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, КОМПЛЕКСНАЯ ТЕРАПИЯ

Директор издательства Г. В. Кондратов Редактор И.В. Смирнова

Подписано в печать 14.02.2013. Формат 60X84'/,6. [арпитура Times New Roman. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 3. Тираж 100 экз.

Издательство Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2. Тел.: 8 (495) 609-14-00 (доб. 3018), официальный сайт: www.mma.ru

Издательство Первого МГМУ им. И.М. Сеченова