Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Психофармакологическая активность настоя и экстрактов незабудки полевой

На правах рукописи

ПОЛОМЕЕВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

ПСИХОФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАСТОЯ И ЭКСТРАКТОВ НЕЗАБУДКИ ПОЛЕВОЙ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 г'др 20(2

Томск-2012

005013795

005013795

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Суслов Николай Иннокентьевич Официальные оппоненты:

Крылова Светлана Геннадьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-Исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория онкофармакологии, ведущий научный сотрудник

Новожеева Татьяна Петровна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория нейробиологии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития России

Защита диссертации состоится «_»_2012 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В современном обществе состояния повышенной тревожности и невротические расстройства являются серьезной медицинской проблемой. По прогнозам ВОЗ к 2020 году тревожно-депрессивные состояния наряду с заболеваниями сердечно-сосудистой системы станут одной из ведущих причин потери трудоспособности населения [Соловьева А.Д., 2007]. По некоторым данным каждый четвертый житель планеты когда-либо перенес то или иное психическое расстройство [Лит-виндев C.B., 2007]. В США по результатам общенациональных исследований тревожные расстройства выявляются у 28,8% населения, тяжелые формы депрессии у 16,2%. В Великобритании в 2006 году количество выписанных рецептов на антидепрессанты возросло до 31 млн. Кроме того, непрерывный рост уровня заболеваемости наблюдается и в странах с совершенно иной культурой, таких как Китай и Япония [Ушкалова A.B., 2007а; Монтгомери С., 2007]. В России распространенность тревожных и депрессивных состояний достигает 6-7%, при этом специалисты отмечают неуклонный рост числа этих заболеваний [Булдакова Н.Г., 2006]. Актуальность проблемы невротических расстройств определяется сочетанием психической патологии с соматической, нередким затяжным течением и клинической гетерогенностью. Например, распространенность депрессии у соматических больных достигает 22-33%, а у больных с тяжелыми хроническими заболеваниями - 60% [Ушкалова A.B., 2007а]. По данным В.Д. Тополянского и М. В. Струковской (1986), 45% соматической патологии в своей основе имеют невроз, а у 30% соматических больных соматизация невротических расстройств играет существенную роль в патогенезе заболевания. В настоящее время в связи с ростом и распространением уровня заболеваемости тревожно-депрессивными расстройствами по всему миру их лечению уделяется самое пристальное внимание. В свою очередь, это приводит к увеличению потребления психотропных препаратов. К средствам, применяемым для лечения невротических расстройств, относятся транквилизаторы, антидепрессанты, психостимуляторы, адаптогены и т.д. В настоящее время они широко исползуются в общемедицинской практике, так как способны оказывать влияние не только на психические, но и на соматические проявления тревоги и депрессии. Однако прием данного ряда препаратов очень часто сопровождается проявлением нежелательных побочных эффектов: повышенная возбудимость (психостимуляторы, ноотропы), сонливость, нарушения памяти, внимания (транквилизаторы, нейролептики), а также симптомы соматических нарушений, например, сухость слизистых, нарушение сердечного ритма, запоры и т.д. Кроме того, у веществ синтетического происхождения выше риск гепатотоксическош, нейро-

токсического и кардиотоксического действия. Важно учитывать также возможность лекарственной зависимости и синдрома отмены.

Необходимо отметить, что при пограничных психических расстройствах, нередко наблюдаются отказы пациентов принимать анксиолитики либо же продолжать лечение ими, вследствие возникновения побочных эффектов. Особенно это актуально для людей, занимающихся активной профессиональной деятельностью и лиц пожилого возраста. Очень часто необходима терапия не собственно тревожных состояний, а вторичных невротических расстройств, проявляющихся в форме кратковременной тревоги. В этом случае необходима коррекция общего психического состояния пациента с эпизодическим купированием возникших состояний, а не длительный курс лечения. Таким образом, использование высокоактивных синтетических анксиолитиков не всегда целесообразно. В этом случае рациональнее назначать препараты или средства, улучшающие общее психическое состояние больного, способные уменьшать тревогу без негативного влияния на психомоторные и когнитивные функции. Такими препаратами являются в первую очередь лекарственные средства растительного происхождения, преимущество которых заключается в низкой токсичности, относительно редком индуцировании аллергических реакций, возможности более длительного и безопасного применения. В связи с этим настоящее время наблюдается тенденция предпочтения пациентами препаратов растительного происхождения [Впвкш Б.Р., 2000]. Для терапии тревожно-депрессивных расстройств фитопрепаратами важным качеством является наличие мягкого анксиолитического и седативного эффектов. Такое действие лекарственных средств растительного происхождения обеспечивает их явную предпочтительность в терапии легких форм тревоги и депрессии, которые гораздо более распространены, чем «большие» депрессивые и тревожно-фобические расстройства. Кроме того, необходимо учитывать то, что психические расстройства могут носить рецидивирующий характер. Поэтому рекомендуется проведение поддерживающей терапии в течение полугода или более, а в некоторых случаях и пожизненно. В этих условиях на первый план выступает безопасность и хорошая переносимость препарата. Таким образом, применение фитопрепаратов в терапии тревожно-депрессивных расстройств приобретает особое значение, а их разработка оказывается актуальной и востребованной.

Если принимать во внимание молекулярные аспекты патогенеза психических расстройств, то можно отметить, что одной из причин нарушения защитно-адаптационных механизмов при возникновении тревожных состояний является ас-тенизация нервной системы, которая нередко связана с нарушением биоэнергетических процессов, происходящих в митохондриях. Это приводит к уменьшению и перераспределению нуклеотидного пула в сторону снижения содержания АТФ. Причиной нарушения адаптивной резистентности нейронов в этом случае является

повреждение структурной организации митохондрий и их мембран, что в свою очередь приводит к ухудшению работы ферментов тканевого дыхания [Воронина Т.А., 2002; Buiroughs S., 2007]. Таким образом, эффективная терапия невротических расстройств должна по возможности предопределять коррекцию биоэнергетического состояния митохондрий.

Наиболее ценным источником новых оригинальных соединений, обладающих психотропной активностью, являются те лекарственные растения, которые пока не нашли применения в медицинской практике, но зарекомендовали себя в народной медицине. К таким растениям относится незабудка полевая Myosotis аг-vensis (L.), Boraginaceae. В армянской медицине это растение активно использовалось при лечении депрессивно-тревожных расстройств [Растительные ресурсы, 1990]. Предварительные исследования показали ее высокую психотропную активность [Пат. 2335293 Cl, 2008]. В связи с этим представляет интерес более подробно изучить фармакологические свойства извлечений из этого растения. Поскольку по данным народной медицины незабудка полевая проявляет антидепрессантные и противотревожные свойства, то наибольший интерес представляет именно это направление исследования.

Цель работы. Изучить психофармакологические свойства настоя и экстрактов из надземной части незабудки полевой. Задачи исследования.

1. Изучить психофармакологическую активность извлечений из надземной части незабудки полевой с использованием разных экстрагентов и определить наиболее активную форму извлечения и оценить ее химический состав.

2. Исследовать анксиолитический, антидепрессантный, психостимулирующий и ноотропный эффекты наиболее активного извлечения.

3. Провести исследование спектра фармакологической активности извлечения из незабудки полевой в сравнении с референтными психотропными препаратами.

4. Оценить влияние наиболее активной формы извлечения на систему энергопродукции головного мозга крыс в норме и при гипоксии в сравнении с действием на митохондриальные процессы психотропных средств синтетического происхождения.

Научная новизна. Впервые на различных моделях тревоги исследован спектр анксиолитической активности настоя незабудки полевой. Впервые показано, что наиболее активной формой извлечения является водный настой растения, при этом высушивание настоя приводит к утрате активности. Выявлено улучшение процессов памяти под влиянием настоя незабудки полевой у нормальных животных и после перенесенной гипоксической травмы. Показано, что в отличие от феназепама, настой незабудки не угнетает двигательной активности животных, не

нарушает процессов внимания и памяти. Впервые установлено повышение физической работоспособности под влиянием настоя незабудки полевой. Показано, что настой незабудки полевой нормализует сукцинат- и НАД-зависимое дыхание митохондрий, способствуя умеренной активации сукцинатдегидрогеназы после ги-поксического воздействия.

Практическая значимость. Охарактеризован спектр анксиолитической активности настоя незабудки полевой. Показано, что анксиолитическое действие настоя незабудки не сопровождается угнетением активности животных, нарушением внимания и памяти. Установлено, что наиболее активной формой извлечения из травы незабудки полевой является водный настой. Продемонстрированы психостимулирующие свойства настоя незабудки полевой, его способность повышать физическую работоспособность и улучшать процессы памяти у нормальных животных. Выявлен и описан возможный механизм действия настоя незабудки, заключающийся в нормализации кинетики восстановления пиридиннуклеотидов. Доказана целесообразность продолжения исследования настоя незабудки с целью создания препарата, обладающего психостимулирующими, антидепрессантными и анксиолитическими свойствами.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Водная вытяжка из надземной части незабудки полевой (настой) оказывает анксиолитическое, антидепрессантное, психостимулирующее и ноотропное действие. При этом настой незабудки полевой в эксперименте проявил наибольшую активность в отличие от спиртовых экстрактов и сухого водного экстракта.

2. По анксиолитическому действию настой незабудки полевой сопоставим по активности с бензодиазепиновым транквилизатором феназепамом, однако в отличие от него не обладает седативными свойствами и не угнетает двигательную активность животных, в том числе и у животных с активным типом эмоционально стрессового реагирования.

3. Настой незабудки полевой в большей степени, чем феназепам, препятствует гиперактивации сукцинатдегидрогеназы при нормобарической гиперкапни-ческой гипоксии, способствуя нормализации кинетики восстановления пиридиннуклеотидов в митохондриях головного мозга.

Апробация и публикации. Основные положения диссертационной работы представлены на X и XI конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2009, 2010). Материалы работы отражены на научно-практической конференции, «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009), на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), на юбилейной конференции молодых ученых по актуальным вопросам клинической и экспериментальной медицины (Санкт-

Петербург, 2010). Материалы диссертации опубликованы в 10 научных статьях и материалах конференций, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов научных исследований.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав, отражающих результаты экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 163 страницах, иллюстрирована 20 таблицами и 11 рисунками. Библиография включает 219 источников, из них 99 -зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на 320 беспородных мышах обоего пола массой 20-25 г, на 40 мышах линии С57В1/6]', 40 мышах линии Ва1Ь/С и 36 беспородных крысах-самцах массой 250-300 г. Животные I категории (согласно сертификату) получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии СО РАМН. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [Страсбург, 1986]. До эксперимента животных содержали в стандартных условиях в пластиковых клетках по 10 мышей и по 10 крыс при 22±2 °С и 12-часовом цикле день/ночь, при свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, а также декапитацию) осуществляли с 9 до 12 ч с целью исключения суточных влияний на метаболизм. Умерщвление крыс проводилось посредством декапита-ции в отдельном помещении под эфирным наркозом, избегая стрессирования остальных особей. Все эксперименты проводили в осенне-зимний период, в том числе и по изучению биоэнергетики, когда наблюдаются умеренные скорости дыхания МХ, а их функциональное состояние характеризуется стабильностью. Регистрация поведенческих показателей осуществлялась в дневное время с 10 до 15 часов.

Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» [Хабриев Р.У., 2005].

Извлечения из незабудки полевой - сырьем для получения извлечений служила высушенная надземная часть (верхушки побегов с цветами и семенами длиной до 25 см), собранная на второй год жизни растения в фазу цветения в Прибайкальском районе Бурятии. Водное извлечение готовили по стандартной фармакопейной методике [Государственная фармакопея СССР XI, 1989.]. Настой содержал 0,0017% флавоноидов в пересчете на рутин. Спиртовые экстракты получали обработкой надземной части незабудки полевой водно-спиртовыми растворами (25%,

40%, 70%, 95%) в течение 1 часа при температуре 80-85 °С и соотношении сырье -экстрагент 1:15. Настой незабудки полевой вводили мышам внутрижелудочно в дозах 0,2 мл/, 0,5 мл/кг, 2 мл/кг, 8 мл/кг. При выборе доз ориентировались на содержание сырья незабудки в рецептах народной медицины.

Препараты сравнения - в качестве эталонного препарата в экспериментах по исследованию анксиолитической активности и состояния биоэнергетики использовали бензодиазепиновый транквилизатор феназепам (ОАО «Валента Фарм»). Препаратом сравнения в экспериментах по изучению антидепрессантных и психостимулирующих свойств являлась настойка женьшеня (ООО «Камелия НПП»),

Поведенческая активность животных изучалась при помощи тестов - «приподнятого крестообразного лабиринта» [KaluefF A.V., 2009], «конфликтной ситуации» [Vogel J., 1971], «принудительного плавания» [Porzolt R.D., 1977], ориентировочно-исследовательского поведения в «открытом поле» [Буреш Я. и соавт., 1991], реакции привыкания, эмоциональной реакции [Brady J.V., Nauta WJ.H., 1953], условного рефлекса пассивного избегания [Буреш Я., 1991]. Изучалось также влияние незабудки полевой на физическую работоспособность [Бобков Ю.Г., 1984] и зоосоциальное поведение [Пошивалов В.П., 1986]. В качестве модели патологии использовалась гипоксическая травма, которую моделировали в условиях гиперкапнической гипоксии в гермообъеме [Бобков Ю.Г., 1989].

Для оценки функционального состояния системы энергопродукции митохондрий головного мозга УВПН оценивали флуориметрическим методом. Исследования проводили на спектрофлуориметре Hitachi М-850 (>.„=350 нм и ет=450 им), УВПН выражали в условных единицах флуоресценции. В качестве субстратов окисления использовали 0,1* 10"3 М сукцинат, а также глутамат и малат по 3 • 10"3 М. В работе применяли ингибитор аминотрансфераз - аминооксиацетат (АОА, 0,5 • 10"3 М) и ингибитор СДГ - малонат (2 • 10"3 М). В условиях утилизации ма-лата и глутамата, применение ингибиторов позволяет выявить "чистое" НАД-зависимое дыхание и вклад в энергообеспечение клетки эндогенного сукцината. Регистрировали УВПН при окислении эндогенных субстратов (метаболическое состояние 2, обозначенное как состояние 2 "покоя" (2п) с соответствующим обозначением УВПН как F2n). Исследовали изменение УВПН при последующем добавлении в среду инкубации 50 мкМ АДФ (переход из метаболического состояния 2п в активное фосфорилирующее и затем состояние "отдыха" (2аф и 2о соответственно), т.е. изучали переход F2n -» F2a$ -» F2o. Регистрировали время перехода митохондрий из метаболического состояния 2п в 2о и из 4п в 4о, скорости перехода из метаболического состояния 2аф в 2о и из 3 в 4о. Метаболические состояния моделирования путем добавления в кювету субстрата окисления и акцептора фосфата [Хазанов В. А., 1999].

Патология функционального состояния митохондрий создавалась острой гиперкапнической гипоксией, которая осуществлялась в термокамере объемом 3 л при температуре окружающей среды 22-25 °С. Животных выдерживали в термокамере до наступления первого атонального судорожного вздоха. Состояние системы энергопродукции изучали сразу же после наступления атонального дыхания. Крыс декапитировали под легким эфирным наркозом, для исследований использовали гомогенат мозга.

Для исследования химического состава извлечения из незабудки полевой применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Хро-матографическая система состояла из жидкостного хроматографа с УФ-спектрофотометрическим детектором и системы для сбора и обработки хромато-графических данных "Милихром А-02". Разделение проводили на колонках РгопюЗГЬ- 120-5-С18 АО размером 2.0x75 мм с диаметром частиц 5,0 мкм. Для исследования общего содержания веществ были подобраны условия, способствующие максимальному разделению веществ различной природы в колонке.

При статистической обработке данных экспериментов использовали непараметрический метод парных сравнений по критерию Вилкоксона - Манна - Уит-ни, при этом считали, что различия достоверны, если вероятность нулевой гипотезы не превышала 5% (уровень значимости р<0,05). Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (Х±ш).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные народной медицины описывают незабудку полевую как растение, обладающее противотревожными свойствами. В качестве лекарственной формы используется водный настой, получаемый из надземной части. На начальных этапах работы была изучена зависимость анксиолитической и антидепрессантной активностей настоя от дозы для определения максимально эффективной дозы. В дальнейшем исследование активности экстрактов, полученных при помощи различных растворителей, позволило вьмвить наиболее эффективную форму извлечения и провести дальнейшие фармакологические исследования.

С использованием теста ПКЛ было продемонстрировано, что животные, получавшие настой незабудки полевой, более активно выходят в открытые рукава лабиринта и больше времени проводят в них по сравнению с животными контрольной группы. При этом наиболее эффективными были дозы 0,2 и 0,5 мл/кг (табл. 1).

По числу пребываний в открытых рукавах лабиринта наиболее активными были животные, получавшие настой в дозе 0,5 мл/кг.

Таблица 1

Влияние настоя незабудки полевой на поведение мышей в ПКЛ (Х+m, п=10)

Группа животных, дозы Количество заходов Время нахождения, с

В закрытые рукава В открытые рукава В закрытых рукавах В открытых рукавах В центр, площадке

Конроль 10,86±0,8 3,29±0,68 232,14+10,91 22,29±5,2 45,57±9,23

ФЗ, 1 иг/кг 9±1,02 3,43+0,61 256,86±6,06 25,29±4,06 20,57±4,61

ннп„,2 9,29±1,13 3,86±0,74 221±7,18# 43,86±8,99* 35,14±4,61

ННП„.5 9,71 ±1,04 5+0,49 207,14±9,33# 52,71 ±7,63* # 40,14±5,5

ННП2 9,86±1,2 3,29±0,52 245,14±8,57 30,14±4,55 27,14±8,07

ННП8 9,17±1,7 2,17+0,48 240,67±9,61 28,67±8,03 10,67±3,26

Примечания к таблице. Различия статистически значимы при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с феназепамом.

В условиях конфликтной ситуации по Vogel эффект анксиолитиков выражается в преодолении страха перед аверсивным воздействием (электроболевым раздражением). При этом также увеличивается число подходов к поилке. Проведенные исследования поведения животных в конфликтной ситуации показали, что ННП наравне с ФЗ увеличивал число наказуемых взятий воды в группах, получавших все исследуемые дозы настоя, при этом максимальный эффект также наблюдался в дозах 0,2 и 0,5 мл/кг (увеличение числа наказуемых взятий воды в 3 и в 3,2 раза соответственно по сравнению с контрольной группой), что хорошо согласуется с данными наблюдения поведения животных в ПКЛ (рис. 1а).

К <43 ННП-0,2 ННП-0,5 ННП-2 ННП-8 К ФЗ ННП-0,2 ННП-0,5 ННП-2 ННП-8

а) б)

Рис. 1. Влияние настоя незабудки полевой на число наказуемых взятий воды (а) и на число подходов к поилке (б).

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05: * - по сравнению с контролем, К - контрольная группа, ФЗ - феназепам, ННП-0,2 - настой незабудки полевой в дозе 0,2 мл/кг, ННП-0,5 - настой незабудки полевой в дозе 0,5 мл/кг, ННП-2 - настой незабудки полевой в дозе 2 мл/кг, ННП-8 - настой незабудки полевой в дозе 8 мл/кг.

По числу подходов к поилке наиболее активными были животные после применения настоя в дозах 0,5 и 2 мл/кг (по сравнению с контролем показатели

были больше в 1,8 раз), однако значимых отличий между группами мышей, получавшими настой незабудки полевой в разных дозах, не наблюдалось (рис. 16). Таким образом, с применением моделей ПКЛ и «конфликтной ситуации» было выявлено, что введение настоя незабудки полевой оказывало выраженное анксиолити-ческое действие.

Для исследования антидепрессантной активности водной вытяжки незабудки была использована модель «принудительное плавание», называемая также реакцией «поведенческого отчаяния». В этом случае животное помещают в неизбе-гаемую стрессовую ситуацию, например, в емкость с водой. В течение первых 6 минут наблюдалось значимое отличие суммарной продолжительности периодов иммобилизации в группах, где животные получали настойку женьшеня (в дозе 1 мл/кг) и настой незабудки в дозах 0,5, 2 и 8 мл/кг, от контрольной группы в 1.5, 1,3, 1,4 и 1,2 раза соответственно (рис. 2).

Таким образом, было показано, что настой незабудки полевой, вводимый животным за три дня до эксперимента и в день эксперимента в дозах 0,5, 2 и 8 мл/кг, проявил антидепрессантную активность.

К ЖШ ННП-0,2 ННП-0,5 ННП-2,0 ННП-8

Рис. 2. Влияние ННП на продолжительность иммобилизации мышей в тесте «принудительное плавание».

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05: * - по сравнению с контролем. К - контрольная группа, ЖШ - настойка женьшеня, ННП-0,2 - настой незабудки полевой в дозе 0,2 мл/кг, ННП-0,5 - настой незабудки полевой в дозе 0,5 мл/кг, ННП-2 - настой незабудки полевой в дозе 2 мл/кг, ННП-8 - настой незабудки полевой в дозе 8 мл/кг.

Для решения вопроса о наиболее эффективном способе получения извлечения из незабудки были проведены исследования психофармакологической активности извлечений, полученных с использованием этилового спирта различной концентрации. С использованием 25, 40, 70 и 95% этанола были выделены водно-спиртовые экстракты. Кроме того, был получен водный сухой экстракт растения. Исследование данных извлечений проводилось в условиях методики «принудительного плавания» [Рогеок И.О., 1977]. Было отмечено, что в первый период регистрации эксперимента спиртовые экстракты в равной степени снижают время иммобилизации, в то время как в последующие 10 минут эффект оказал только

11

водный настой. Водный высушенный экстракт не проявил активности. Полученные экспериментальные данные говорят о том, что действующими являются гидрофильные вещества, извлекаемые водой из растения. Таким образом, было решено продолжить изучение психофармакологических свойств незабудки полевой с использованием настоя растения. В дальнейших исследованиях использовали наиболее активные дозы настоя 0,5 и 2 мл/кг.

Тест ориентировочно-исследовательского поведения в «открытом поле» часто используется для изучения анксиолитической активности. Наряду с экспло-ративным поведением он отражает поведенческую реакцию животных на стресс новизны. При этом отмечается определенная динамика поведенческой активности. В первые секунды после помещения в новые условия отмечается торможение поведения, затем оно активируется с усилением исследовательских элементов, а затем снижается в силу реакции привыкания. Эта динамика отражает наличие внутреннего конфликта между страхом перед новыми условиями, подавляющего поведение, и исследовательской потребностью, усиливающей его. В опытных группах ННПоз и ННГЬ (по сравнению с контрольной группой) было отмечено усиление двигательной активности во вторую и третью минуту, в то время как ФЗ подавлял ее. Зафиксированное во втором периоде эксперимента увеличение активности может быть следствием растормаживающего действия в результате снижения тревожности (табл. 2).

Таблица 2

Влияние настоя незабудки полевой на показатели ориентировочно-исследовательского поведения беспородных мышей в «открытом поле» в первую и вторую-третью минуты исследования в условных единицах (Х±т, п=10)

Показатели Период исследования Группы

Контроль ННПо.5 ннп2 ФЗ, 1 мг/кг

Суммарная двигательная активность 1 минута 2б,53±2,28 30,49±1,71 33,21±2,11* 21,86±2,43

2-3 минуты 29,97±3,54 40,22±2,88* 41,32±2,72* 24,94±3,8

Горизонтальная активность 1 минута 16,65+1,65 19,11±1,39 20,76±1,3* 15,51+1,74

2-3 минуты 15,47±2,23 21,64±1,61* 22,29±1,69* 15,34±2,4

Норковый рефлекс 1 минута 7,71+0,65 8,4±0,63# 9,25±1,05# 4,49±0,71*

2-3 минуты 8,44*1,13 12,36±1,36* 13,21±1,27* 5,94±1,24

Вертикальная активность 1 минута 1,74+0,29 2,49±0,35* 2,69±0,48* 1,4+0,32

2-3 минуты 3,82+0,55 4,56+0,55# 4,29+0,56# 2,06±0,4*

Груминг 1минута 0,26+0,09 0,31±0,1 0,31±0,14 0,2± 0,08

2-3 минуты 1,47 ±0,26 0,78+0,15* 0,71+0,19 0,63±0,18*

Дефекация 1минута 0,18±0,08 0,17±0,08 0,21 ±0,09 0,26±0,1

2-3 минуты 0,76±0,19 0,89±0,15 0,82±0,17 0,97±0,29

Примечание к таблице. Различия статистически значимы при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с феназепамом.

Исследование эмоциональной реакции до и после теста «открытого поля» выявило незначительное влияние настоя незабудки на показатели эмоционального реагирования с тенденцией к ее увеличению, что может быть связано с психостимулирующей активностью. Таким образом, результаты данных экспериментов могут служить подтверждением наличия одновременно психостимулирующей и ан-ксиолитической активности у ННП.

Применение ННП оказало положительное влияние на сохранность и воспроизводимость УРПИ у нормальных животных. Этот эффект отчетливо проявился только при использовании дозы 0,5 мл/кг. Однако, при этом ННП существенно усиливал локомоторную активность в светлом отсеке и число заглядываний в отверстия входа, что могло служить естественным фактором, усиливающим экс-тинкцию павловского страха и, таким образом, способствовало активной элиминации рефлекса. Поскольку эти явления были более выражены после введения настоя в дозе 2,0 мл/кг, вероятно поэтому, и воспроизводимость рефлекса там была хуже. В связи с этим улучшение воспроизведения УРПИ в дозе 0,5 мл/кг можно считать основанием для суждения о его улучшающем влиянии на процессы памяти.

Для дополнительного суждения о ноотропной активности извлечений из незабудки полевой выработку УРПИ проводили на фоне гипоксической травмы, которую моделировали в условиях НГГ. Гипоксия была выбрана как наиболее распространенное патологическое состояние. Было выявлено, что в условиях гипоксической травмы, моделируемой на фоне введения ННП и феназепама, воспроизводимость рефлекса существенно улучшилась (рис. 3).

Рис. 3. Влияние настоя из незабудки полевой на сохранность УРПИ в условиях гипоксической травмы (по доле животных с сохраненным УРПИ).

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05: * - по сравнению с контролем, ИК - группа интактного контроля, ГК - группа гипоксического контроля, ФЗ - феназепам, ННП 0,5 - настой незабудки полевой в дозе 0,5 мл/кг, ННП 2 - настой незабудки полевой в дозе 2 мл/кг.

Величина основных показателей, отражающих состояние рефлекса (факт незахождения в темное пространство или продолжительность пребывания в светлом отсеке) обусловлена не только торможением безусловного рефлекса предпочтения

темного пространства условным рефлексом пассивного избегания (контекстуальной памятью о действии болевого электрошока). Показатели могут также модифицироваться характером активности животного. Высокая двигательная и исследовательская активность может способствовать угашению рефлекса, в то время как снижение двигательной активности и в особенности торможение ориентировочного рефлекса, замедляя время реакций, могут имитировать сохранность памяти о действии электрошока, хотя на деле отражают лишь угнетение поведения. С учетом этих обстоятельств улучшение воспроизведения УРПИ под влиянием ННП, сопровождающееся активацией ориентировочно-исследовательского поведения и улучшением ориентировочной реакции, также нарушенной в результате гипокси-ческой травмы, не вызывает сомнений.

Этого нельзя сказать о высоком уровне сохранности рефлекса в группе животных, получавших феназепам. В этой группе, кроме снижения эксплоративной активности, отмечалось существенное угнетение ориентировочного рефлекса (табл. 3) и снижение двигательной активности, что и создавало имитацию высокой воспроизводимости УРПИ.

Таблица 3

Влияние настоя незабудки полевой на латентное время захождения в темный отсек при выработке рефлекса (ориентировочный рефлекс)

после гипоксической травмы, (Х±ш, п=10)

ик гк ШЩу ннпг ФЗ

лвз 27±9,2 98±15,3* 60,2±12,6* 72,1±13,7* 124,4±13,3*

Примечания к таблице. Различия статистически значимы при р<0,05: * - по сравнению с интактным контролем.

Результат оценки воспроизводимости УРПИ при применении ННП логичнее всего было бы объяснить с одной стороны анксиолитическим действием, снижающим мотивацию к переходу в темное пространство, с другой стороны более высокой сохранностью процессов памяти. Последнее можно утверждать определенно, так как высокая локомоторная активность, не лимитируемая воспоминаниями об аверсивном воздействии в темном пространстве, привела бы к неизбежному заходу в темный отсек до истечения 3 минут у большинства животных. Кроме того, при применении ННП воспроизводимость рефлекса превосходила показатели интактного контроля. В группе ННП0>5, как и у нормальных животных, воспроизводимость рефлекса превосходила активность настоя в дозе 2 мл/кг. При этом в дозе 2 мл/кг отмечалась повышенная исследовательская активность, которая, видимо, ускоряла угашение рефлекса. Таким образом, было показано, что использование настоя незабудки полевой положительно влияет на мнестические

функции у животных, в том числе и при нарушениях высшей нервной деятельности, вызванных гипоксией.

Одной из форм неассоциативного обучения является «реакция привыкания». Она проявляется в снижении исследовательской активности, исходно активированной у животного, помещенного в новые незнакомые условия, лишенные, однако угрожающих и привлекающих стимулов, а также иных релизеров безусловных рефлексов и инстинктивного поведения. Данное снижение развивается поступательно в ряду последовательных помещений животного в те же условия или при длительном непрерывном пребывании в этих условиях. Снижение тревожности ускоряет развитие реакции привыкания, неспецифическая активация замедляет ее. Результаты, полученные в эксперименте по изучению «реакции привыкания» с использованием установки «открытого поля», выявили, что у животных, получавших ННП0,5 и ННП2 наблюдалась исходно более высокая исследовательская и локомоторная активность, чем в контрольной группе. Следует отметить, что феномен привыкания отмечался во всех исследуемых группах. Однако, разница с контрольной группой имела очевидную тенденцию к увеличению от первого дня исследования к четвертому. При этом наблюдалось относительное замедление развития реакции привыкания. Таким образом, механизм действия ННП на поведение заключается в общем возбуждающем действии или усилении систем неспецифической активации, в частности, по-видимому, ретикулярной формации ствола мозга.

Результаты эксперимента по исследованию физической работоспособности не показали явного адаптогенного эффекта у незабудки полевой, так как ННП не предотвращал нарушения работоспособности при резком изменении условий плавания. Однако ННП существенно повышал работоспососбность животных как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с животными, получавшими настойку женьшеня.

Исследование влияния настоя незабудки полевой у мышей с разным типом эмоционально-поведенческого реагирования на стресс в условиях «открытого поля» показало, что настой незабудки полевой оказал активирующее влияние на мышей с пассивным типом реакции (Ва1Ь/С), однако у животных с активным типом эмоционально-стрессового реагирования (С57В1Лу) обычного для анксиоли-тиков снижения активности не наблюдалось. Такой эффект можно объяснить наличием наряду с анкиолитическими психостимулирующих свойств.

При исследовании зоосоциального поведения было выявлено, что настой незабудки повышал активность животных в условиях методики, снижал количество угрожающих поз, увеличивал количество эпизодов и время общения, что с одной стороны, естественно улучшает социальное поведение, с другой — является проявлением анксиолитического эффекта в зоосоциальном его аспекте. При этом данный эффект наиболее отчетливо проявляется в группе ННП2.

Таким образом, исследование влияния ННП на поведение животных продемонстрировало, что главными свойствами настоя незабудки являются его анксио-литические свойства, проявляющиеся в различных паттернах поведения от ориентировочно-исследовательского и условно-рефлекторного до социального. Проти-вотревожные свойства настоя дополняются антидепрессантным и психостимулирующим действием. В отличие от бензодиазепинового транквилизатора феназепа-ма, ННП не угнетает двигательную и исследовательскую активность животных.

Исследования фунционального состояния системы энергопродукции in vitro позволили оценить биоэнергетические аспекты действия растительного экстракта на систему энергопродукции головного мозга. Для исследования был использован водный настой из надземной части незабудки полевой в наиболее активной дозе 0,5 мл/кг по анксиолитическому действию. Курсовое введение интактным крысам ННП характеризовалось умеренным возрастанием УВПН во всех метаболических состояниях при окислении как эндогенных, так и экзогенных субстратов. Феназе-пам в норме оказывал активирующее влияние на кинетику восстановления пири-диннуклеотидов, что нашло отражение в более выраженной реакции MX в данной группе крыс на внесение экзогенного сукцината, чем это наблюдалось у интакт-ных животных. По-видимому, наблюдается компенсаторное торможение СДГ, что характеризовалось низкой чувствительностью окисления НАД-ЗС к ингибиторам.

При исследовании состояния системы энергопродукции в условиях гипоксии в группе ННП была обнаружена стабильность УВПН в стационарных состояниях MX при окислении как эндогенных, так и экзогенных субстратов. Как правило, гипоксическое состояние приводит к повышению энергетической нагрузки на MX, заставляя их функционировать в усиленном режиме. Инициируются дополнительные компенсаторные пути окисления сукцината, что характеризуется в эксперименте высокой активностью СДГ. При глубоких низкоэнергетических сдвигах митохондрий (при патологии) дополнительная активация окисления янтарной кислоты опасна в связи с возможностью полной потери энергетической регуляции дыхания. В этих условиях добавление сукцината может привести к бурному, энергетически не контролируемому усилению дыхания и повреждению митохондрий [Кондрашова М.Н., 1977]. Повышение активности СДГ наблюдалось в контрольной группе крыс. В группе животных, получавших настой незабудки, была отмечена умеренная активность СДГ при окислении экзогенного сукцината. При этом скорость восстановления ПН в данных условиях была выше, чем в группе крыс, получавших феназепам, и ниже, чем в контроле, что говорит о подавляющем воздействии синтетического транквилизатора на систему энергопродукции и нормализующем влиянии незабудки полевой. В целом, профилактическое введение животным, перенесшим НГГ, настоя незабудки способствовало переходу MX головного мозга в энергетически контролируемое состояние.

Хроматографическое исследование химического состава настоя незабудки полевой показало, что в нем содержится 21 вещество, из которых было выявлено два катехтина и идентифицировано пять гидроксикоричных кислот. Учитывая незначительное количество флавоноидов в настое незабудки полевой невозможно с точностью утверждать, что именно флавоноиды ответственны за данный эффект. Вероятно, участие в поддержании системы окисления в клетках головного мозга принимают катехины, входящие в комплекс БАВ незабудки полевой.

ВЫВОДЫ

1. Водная вытяжка из надземной части незабудки полевой (настой) в экспериментах на мышах оказывает анксиолитическое, антидепрессантное, психостимулирующее и ноотропное действие.

2. Настой из надземной части незабудки полевой в эксперименте проявил наибольшую активность в отличие от спиртовых экстрактов и высушенного водного экстракта В водном настое незабудки полевой выявлено наличие 21 вещества, из которых два являются катехинами, а также идентифицированы гидро-ксикоричные кислоты: хлорогеновая кислоты, 1-кофеоилхинная, кофейной, 1,5-дикофеоилхинная, 1,3-дикофеоилхинная.

3. По анксиолитическому действию настой незабудки полевой сопоставим по активности с беизодиазепиновым транквилизатором феназепамом, однако в отличие от него не обладает седативными свойствами и не угнетает двигательной активности животных.

4. Профилактическое введение ННП крысам в большей степени, чем фена-зепам, препятствует гиперактивации СДГ при гипоксии, способствуя нормализации кинетики восстановления ПН в митохондриях головного мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фармакологические эффекты извлечений из надземной части незабудки полевой // Науки о человеке: материалы X конгресса молодых ученых и специалистов. -Томск: СибГМУ. -2009. - С. 117-118 (соавт.: Кайгородцев А.В, Смирнов В.Ю.).

2. Изучение антидепрессивной активности извлечений из незабудки полевой в экспериментах на животных // Материалы научно-практической конференции, посвященной 25-летию создания службы экспериментального биомедицинского моделирования «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины». Томск, 29 октября 2009 г.» : Тез. Докл. -Томск, 2009. - С. 82-84 (соавт.: Кайгородцев A.B.).

3. Растительные средства, способные повышать адаптационный потенциал организма // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2009. - С. 404 (соавт.: Аксиненко С.Г., Поветьева Т.Н.,

17

Нестерова Ю.В., Попова Е.В., Гайдамович Н.Н., Пушкарский С.В., Нагорняк Ю.Г., Кузьмин В.Ю., Смирнов В.Ю.).

4. Анксиолитическая активность водного извлечения из надземной части Myosotis arvensis (Boraginaceae) II Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых 22.04.2010 г. - Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2010. -С. 53-54 (соавт.: Гурто Р.В., Кайгородцев А.В.).

5. Анксиолитические свойства экстрактов лабазника обыкновенного // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых 22.04.2010 г. -Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2010. - С. 54-56 (соавт.: Кайгородцев А.В.).

6. Фармакологическая активность водного извлечения из надземной части незабудки полевой Myosotis arvensis (L.) (Boraginaceae) // Актуальные вопросы медицинского обеспечения войск, подготовки и усовершенствования военно-медицинских кадров. Выпуск ХП. Материалы научно-практической конференции 2010 г. - Томск: Издание ФГОУ ВПО «ВМИ (Томский)» МО РФ, 2010. - С. 118120 (соавт.: Гурто Р.В., Брюшинина О.С., Слепичев В.А., Стыкон Г.А., Кайгородцев А.В., Смирнов В.Ю.).

7. Фармакологическое исследование экстрактов лабазника обыкновенного

//Актуальные вопросы медицинского обеспечения войск, подготовки и усовер-

1

шенствования военно-медицинских кадров. Выпуск XII. Материалы научно-практической конференции 2010 г. - Томск: Издание ФГОУ ВПО «ВМИ (Томский)» МО РФ, 2010. - С 96-98 (соавт.: Кайгородцев А.В.).

8. Исследование противотревожной активности водного извлечения из надземной части незабудки полевой // Науки о человеке: Сборник статей по материалам XI конгресса молодых ученых и специалистов (Томск, 27-28 мая 2010 г) / под ред. Jl. М. Огородовой, Л. В. Капилевича. - Томск: СибГМУ, 2010. - С. 77-78 (соавт.: Кайгородцев А.В.).

9. Анксиолитические и антидепрессивные свойства водного извлечения из надземной части незабудки полевой // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -Т. 151, № 5. -2011. -С. 538-541 (соавт.: Гурто Р.В., БрюшининаО.С., Слепичев В.А., Кайгородцев А.В., Смирнов В.Ю., Суслов Н.И., Удут В.В.).

10. Противотревожные и энергоре1уляторные свойства водного экстракта из Filipéndula vulgaris (rosaceae) И Растительные ресурсы. - Т. 47, № 3. - 2011. -С. 136-145 (соавт.: Венгеровский А.И., Суслов Н.И., Кайгородцев А.В., Удут В.В., Гурто Р.В., Слепичев В.А.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

БАВ - биологически активные вещества

ГК - гипоксический контроль

ЖШ - женьшень в дозе 1 мл/кг

ИК - интактный контроль

ЛВЗ - латентное время захождения в темную камеру

МХ - митохондрии

НАД - никотинамиддинуклеотид

НАД-ЗС - НАД-зависимые субстраты

НГГ - нормобарическая гиперкапническая гипоксия

ННП - настой незабудки полевой

ННП0д - настой незабудки полевой в дозе 0,2 мл/кг

ННП0,5 - настой незабудки полевой в дозе 0,5 мл/кг

ННГ12 - настой незабудки полевой в дозе 2 мл/кг

ННП8- настой незабудки полевой в дозе 8 мл/кг

ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт

ПН - пиридиннуклеотиды

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

УВПН - уровень восстановления пиридиннуклеотидов УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания ФЗ - феназепам

Тираж 100. Заказ № 196. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел.: 53-30-18.