Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Псевдотуберкулез в Сибири

На правах рукописи

ЧЕСНОКОВА Маргарита Валентиновна

ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗ В СИБИРИ (ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ, ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ)

14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в ГУ Иркутском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Марамович Александр Семенович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский

институт эпидемиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации

заседании диссертационного совета Д 001.50.01 при ГУ Научном центре медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН по адресу: 664025, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ Научного центра медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН.

доктор биологических наук Мамонтова Лилия Михайловна доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Ботвинкин Александр Дмитриевич доктор медицинских наук, доцент Борисов Виктор Александрович

Защита состоится

Ж» »¿¿¿¿л

2004 г. в

час на

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент /

В.М. Коган

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Более 40 лет прошло с момента открытия эпидемического псевдотуберкулеза на Дальнем Востоке России, и сейчас ареал этой инфекции выходит далеко за его пределы. Ежегодно в Российской Федерации в течение последних 10 лет псевдотуберкулезом перебо-левают в среднем 9.5 тыс. человек, а на Сибирь приходится 63% всех заболевших. Значимость этой инфекции возрастает в связи с преимущественным поражением детей до 14 лет (72% от всех заболевших), а также нередким развитием рецидивов и вторично-очаговых форм [Малов И.В., 1995].

Несмотря на достигнутые успехи в изучении многих аспектов псевдотуберкулеза актуальность этой проблемы сохраняется до сих пор [Ющенко Г.А., 2000, Сомов Г.П. и др., 2001]. Прежде всего требуют своего изучения эпидемиологические и экологические особенности псевдотуберкулеза в различные по интенсивности периоды эпидемического процесса.

В настоящее время в Сибири преобладает спорадическая заболеваемость псевдотуберкулезом, хотя на некоторых территориях ежегодно регистрируются острые эпидемические вспышки. Трудности диагностики спорадического псевдотуберкулеза, связанные с полиморфизмом клинических проявлений и длительностью проведения бактериологического анализа, не обеспечивают раннего установления диагноза. Эпидемиологический анализ причин и условий появления локальных эпидосложнений этой инфекции также имеет ретроспективное значение и не отвечает целям оперативной эпидемиологической диагностики. Возникает настоятельная необходимость в усовершенствовании лабораторной диагностики псевдотуберкулеза, основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая экспрессно обнаруживаетДНК Yersiniapseudotuberculosis в клиническом материале и в пищевых продуктах [Cheong H.I. et al., 1996; Kaneko S. et al., 1995; Gaston J.S. et al., 1999], обладает высокой специфичностью, возможностью выявлять низкие концентрации возбудителя инфекции в различном материале [Белохвостов А.С., 1995; Erlich H.A. et al., 1991], что открывает перспективу ее широкого практического использования [Аксенов М.Ю., Гинцбург АЛ., 1993].

Особое значение приобретает использование молекулярно-ге-нетических методов внутривидового генотипирования при мониторинге за возбудителем псевдотуберкулеза с целью повышения эффективности эпидемиологического

До настоящего времени применительно к псевдотуберкулезу не разработана важная составная часть эпиднадзора - предэпидемичес-кая диагностика, направленная на изучение предпосылок и предвестников, определяющих развитие и оценку состояния эпидемического процесса.

Цель и основные задачи исследования

Цель работы - оптимизация системы эпидемиологического надзора на основе изучения особенностей эпидемиологических проявлений этой инфекции в Сибири и использования современных мо-лекулярно-генегических методов исследования в клинической и эпидемиологической практике.

Для достижения поставленной цели следует решить следующие задачи:

1) изучить эпидемиологические особенности и установить основные тенденции эпидемического процесса при псевдотуберкулезе в Сибири, оценить ситуацию по этой инфекции на основании результатов серологических исследований;

2) определить основные причины возникновения вспышек псевдотуберкулеза и дать их эпидемиологическую характеристику;

3) определить динамику размножения, длительность сохранения псевдотуберкулезного микроба бактериологическим методом (БА) и ПЦР в искусственной почвенной экосистеме при разных температурных условиях и изучить закономерности его циркуляции в овощехранилищах;

4) разработать методические приемы ПЦР-анализа для повышения эффективности клинической и эпидемиологической диагностики псевдотуберкулеза;

5) изучить возможность применения молекулярно-генетического внутривидового типирования Y. pseudotuberculosis в системе микробиологического мониторинга и при расследовании причин возникновения очагов псевдотуберкулеза;

6) провести сравнительный анализ клинико-эпидемиологичес-ких особенностей этой инфекции в зависимости от плазмидного спектра возбудителя и наличия суперантигена YPM;

7) усовершенствовать систему эпидемиологического надзора на основе предэпидемической диагностики псевдотуберкулеза с учетом современных эпидемиологических особенностей этой инфекции и использования результатов молекулярно-генетических методов исследования.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

- На основе ретроспективного анализа заболеваемости определены три группы административных территорий Сибири, отличающихся по уровню пораженности населения псевдотуберкулезом. Установлены основные эпидемиологические закономерности псевдотуберкулеза в современных условиях: снижение удельного веса вспышек и преобладание спорадических случаев инфекции в структуре общей заболеваемости; наличие в последние годы эпидемических вспышек в детских социальных учреждениях; снижение заболеваемости "организованных" детей дошкольного возраста и школьников с преимущественным вовлечением в эпидемический процесс "неорганизованных" детей; сдвиг сезонного подъема на летний период, обусловленный действием постоянных и дополнительных факторов передачи инфекции.

- С использованием диффузионных камер установлены два варианта переживания возбудителя в почвенной экосистеме: с утратой плазмиды pYV 47 MDa и размножения авирулентных клонов или с сохранением его патогенных свойств при снижении концентрации микроорганизмов.

- Разработан новый способ подготовки проб для ПЦР, основанный на химической устойчивости псевдотуберкулезного микроба. Высокая чувствительность ПЦР достигалась за счет избирательного выделения ДНК только из К pseudotuberculosis, устойчивого к 0.72% раствору гидроокиси калия, что обеспечивало снижение концентрации индигенной микрофлоры в диагностическом материале. Научная новизна способа подтверждена патентом на изобретения № 2153671 от 27.07.2000 г. "Способ подготовки проб для диагностики псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции" (приоритет от 7.09.1999 г.)

- Дана оценка диагностической значимости ПЦР как метода, существенно повышающего эффективность лабораторных исследований. Показано, что наиболее информативным материалом для выявления специфических фрагментов ДНК служат испражнения во все периоды болезни, а кровь - во время лихорадки и при затяжном течении инфекционного процесса.

- Предложена и апробирована усовершенствованная схема бактериологической диагностики псевдотуберкулеза с использованием ПЦР, позволяющая целенаправленно вести поиск возбудителя для оперативного выяснения причин и условий возникновения спорадических случаев болезни и при расшифровке эпидемических вспышек.

- Впервые в качестве дополнительного методического приема для установления эпидемиологических связей при расследовании причин возникновения очагов псевдотуберкулеза применен метод ПЦР-генотипирования с произвольными праймерами.

- Впервые установлено существование в Иркутской области двух автономных очагов псевдотуберкулеза с разным плазмидным спектром возбудителя, отличающихся по уровню, динамике заболеваемости, сезонности и распределению заболевших по возрастным группам. Различия в плазмидном спектре не оказывают влияние на формы проявления эпидемического процесса по интенсивности, но способствуют более тяжелому клиническому течению заболевания с преобладанием генерализованных и вторично--очаговых форм и не связаны с наличием суперантигена YPM.

- Впервые методом риботипирования изучен геномный полиморфизм Y. pseudotuberculosis. Установлено, что 94,6% штаммов имеют риботип 1', а идентифицированный риботип 6' характерен только для Сибири.

Теоретический аспект исследования включает в себя установление основных эпидемиологических закономерностей псевдотуберкулеза в современных условиях, которые существенно отличаются от эпидемиологических особенностей псевдотуберкулеза в период интенсивных эпидемических вспышек. Показана резервуарная роль почвы в сохранении псевдотуберкулезного микроба, которая вместе с мелкими млекопитающими лежит в основе реализации возможности попадания возбудителя на конечные факторы заражения человека. Установлено существование двух очагов псевдотуберкулеза с характерным плазмидным профилем возбудителя и тяжестью клинического течения болезни, что не отражается на формах проявления эпидемического процесса по интенсивности. Показана возможность оптимизации эпиднадзора на основе предэпидемической диагностики. Определены предпосылки и предвестники осложнения эпидемиологической ситуации при псевдотуберкулезе, где приоритетным направлением служат результаты ПЦР-анализа, обосновывающие комплекс превентивных мер в системе управления эпидемическим процессом при псевдотуберкулезе.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

1) Разработаны и предложены для использования в практической деятельности учреждений здравоохранения и ЦГСЭН МУ-11-12 "Методические рекомендации по лабораторной диагностике псев-

дотуберкулеза", утвержденные Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 3.02.1997 г.

2) Совместно с сотрудниками Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера разработано пособие для врачей "Микробиологический мониторинг за иерсиниями", утвержденное Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого Совета МЗ РФ 23.12.2003 г.

3) Результаты исследования отражены в руководстве "Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний в 2-х томах" (Саратов, 1998 г.) для специалистов, занимающихся лабораторной диагностикой особо опасных и других природно-очаговых инфекций в научно-исследовательских учреждениях и в практическом здравоохранении.

4) Составлены методические рекомендации "Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции", утвержденные директором НИПЧИ 18.07.2000 г.

5) Депонированы восемь штаммов Y. pseudotuberculosis в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб": №№ КМ-175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, как тест-штаммы, принадлежащие к 5', 3', 7', Г, 6', 2', 4' риботипам соответственно и № КМ-160 - штамм, имеющий в составе хромосомы ген суперантигена YPM.

6) На основании результатов исследования составлен приказ ЦГСЭН в Иркутской области и Комитета здравоохранения администрации Иркутской области от 25.01.2001 г. № 13/49 "О проведении эпидемиологического надзора за иерсиниозами".

7) Разработанные приемы лабораторной диагностики псевдотуберкулеза у людей нашли отражение в методических рекомендациях МР 3.1.003-2003 "Тактика клинико-эпидемиологического, лабораторного обследования и лечения больных псевдотуберкулезом", утвержденные Главным государственным санитарным врачом по Иркутской области и Председателем Комитета здравоохранения администрации Иркутской области.

8) Научные и практически значимые результаты работы используются в лекциях по эпидемиологии, микробиологии и профилактике псевдотуберкулеза для слушателей курсов специализации и усовершенствования врачей противочумной службы и общей медицинской сети на базе отдела микробиологии чумы с группой подготовки кадров и на выездных семинарах в соответствии с утвержденными МЗ РФ программами.

9) Результаты исследования нашли отражение в трех коллективных монографиях: Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней в Сибири / Под ред. ГГ. Онищенко. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 213 с; Эпидемиологический надзор за особо опасными и природно- очаговыми инфекциями в условиях Крайнего Севера / Под ред. И.Я. Егорова, А.С. Марамовича, А.Д. Ботвинкина. -Якутск, 2000. - 341 с; Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т., Малов И.В., Марамович А.С. Псевдотуберкулез. - Новосибирск: Наука. - 2003. - 320 с.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Особенностями эпидемического процесса при псевдотуберкулезе в Сибири являются смена групп риска, снижение значимости эпидемических вспышек в общей структуре заболеваемости, изменение продолжительности сроков воздействия определенных факторов и причин, обусловливающих динамику сезонного подъема.

2. Сроки сохранения возбудителя псевдотуберкулеза в почве в зависимости от температурных условий, сопровождающиеся или потерей плазмиды вирулентности pYV 47 MDa и преобладанием ави-рулентных клонов в популяции возбудителя, или сохранением патогенных свойств с постепенным снижением концентрации Y. pseudotuberculosis.

3. Эпидемиологическая и диагностическая значимость ПЦР в лабораторной диагностике псевдотуберкулеза.

4. Оценка результатов молекулярно-генетического внутривидового типирования Y. pseudotuberculosis (риботипирование, ПЦР с произвольными праймерами) в системе микробиологического мониторинга и при эпидемиологическом расследовании причин возникновения очагов псевдотуберкулеза.

5. Особенности плазмидного спектра и наличия суперантигена YPM Y. pseudotuberculosis не оказывают влияние на формы проявления эпидемического процесса по интенсивности, а связаны с различной степенью тяжести клинического течения болезни.

6. Теоретическое и организационно-методическое обоснование предэпидемической диагностики псевдотуберкулеза в системе эпидемиологического надзора.

Апробация работы

Изложенные в работе материалы представлены на: международном симпозиуме "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 1995); 4th Russia-Japan International Medical Symposium (Irkutsk, Russia, 1996); VII и VIII-м съездах Всероссийского научно-

практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997; 2002); 7th International Congress and 8th International Symposium on Yersinia (Tijdschrift, Niderlands, 1998; Turku, Finland, 2002); 3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000); международной конференции "Инфекции, обусловленные иерси-ниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции" (Санкт-Петербург, 2000); международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Всероссийской научно-практической конференции "Генная диагностика особо-опасных инфекций" (Саратов, 2000); на международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002); 4-ой международной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Современные технологии в диагностики особо опасных инфекционных болезней" (Саратов, 2003); VI Российском съезде врачей инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003); на заседании Иркутского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (апрель, 2004).

Публикации

Работа выполнялась в рамках четырех научных тем (№ ГР 01.9.10033778, Инв.№ 02.960.005341; № ГР 01.9.60000193, Инв. № 02.9.80005185; № ГР 01.9.60000190, Инв.№ 02.2.00100479; № ГР 01.2.00013854). Полученные результаты исследования нашли отражение в трех монографиях, одном руководстве, одном патенте на изобретение и 58 научных статьях и тезисах, в том числе 14 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 3 - в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 415 источников, в том числе 242 отечественных и 173 зарубежных авторов. Работа изложена на 280 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 46 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Оценка проявлений эпидемического процесса любой инфекционной болезни базируется на современных методах лабораторного исследования. В связи с этим в работе, наряду с классическими методами диагностики псевдотуберкулеза (БА, РИГА), широко использовались молекулярно-генетические исследования, приобретающие специфическое направление для целей эпидемиологического анализа.

Эпидемиологический анализ. Оценка эпидемиологических проявлений псевдотуберкулеза в Новосибирской, Тюменской, Иркутской областях, Алтайском, Красноярском краях, Республике Саха (Якутия) за 1982-2001 гг. проводилась по разработанной нами программе "EPIDDAT", основанной на общепринятых методах эпидемиологического анализа с позиций системного подхода, предложенного ИЛ. Шаханиной и др. [1987].

Бактериологическийметод. Бактериологический анализ клинического, полевого (773 больных, 722 грызуна, 10941 смыв с объектов окружающей среды) и экспериментального материала выполняли согласно общепринятой методике [Инструкция..., 1990] с предварительной щелочной обработкой материала 0.72% раствором КОН в 0.5% растворе NaCl в течение 30 секунд [Fukushima H. et al., 1988].

Серологический метод. Для выявления антител к Y. pseudotuber-culosis в 11918 сыворотках крови людей использовали РНГА с эрит-роцитарным псевдотуберкулезным диагностикумом производства НИИ вакцин и сывороток (Санкт-Петербург).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Обследовано 492 больных с подозрением на псевдотуберкулез (739 анализов), 269 мелких млеко -питающих и 613 смывов с объектов окружающей среды. Перед исследованием в ПЦР осуществляли пробоподготовку испражнений больных, тонкого кишечника грызунов, смывов с объектов окружающей среды разработанным нами способом. Подготовку проб крови проводили по методике, описанной С.Н. Радюк и др. [1996], мочи -по H.I Cheong et al., [1996]. Постановку ПЦР выполняли в объеме 25 мкл. Для приготовления реакционной смеси использовали "Набор для амплификации" (ООО "Лаборатория МЕДИГЕН", Новосибирск). Праймеры Inv 1 и Inv 2 [Nakajima H. et al., 1992], YP 3 и YP 4 [Wang R. F. et al., 1997], S 1 и S 2 [Ito Y. et al., 1995] синтезированы в ЗАО "Синтол" (Москва). Праймеры Yers 1 и Yers 2 [Skurnik M., Wolf-Watz H., 1989] входили в набор для ПЦР "Иерспсевдоампли-10

тест" фирмы "Ниармедик Плюс" (Москва). Амплификацию проводили на термоциклере "Терцик" МС-2 ("ДНК- Технология", Москва) по программам в соответствии с используемыми праймерами.

Учет результатов проводили с помощью гель-электрофореза в 1.5% агарозе при напряжении 8-10 в/см в течение 30-45 мин. Регистрацию продуктов амплификации ДНК проводили с помощью гель видеосистемы с программным обеспечением "Gel Imager" ("ДНК-Технология", Москва).

Искусственная контаминация испражнений. В пробирки, содержащие 1.0 г испражнений, вносили от 109до 10 м.к. Y. pseudotuberculosis И-742 и добавляли ЗФР до конечного разведения 1:10. В качестве контроля использовали неконтаминированные пробы испражнений. Высевы на среду БТС проводили непосредственно после контаминации (1 день), а также на 5 и 10 дни после выдерживания при температуре +4°С.

Для сравнительного анализа вариантов выделения ДНК из Y. pseudotuberculosis в искусственно контаминированных испражнениях человека использовали: 1) получение лизата клеток путем прогревания при 100°С в течение 10 минут [Lou Q. et al., 1997]; 2) фе-нолхлороформный метод экстракции ДНК с применением "Набора для выделения ДНК" (ЗАО "Ниармедик плюс", Москва); 3) лизис бактерий гуанидинизотиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на стеклянном носителе согласно наставлению к "Набору для выделения ДНК" (ООО "Лаборатория МЕДИГЕН", Новосибирск); 4) метод выделения плазмидной ДНК по D.S. Holmes, M.A. Quigley [1981]; 5) патентованный нами метод. В ПЦР использовали праймеры Yers 1, 2; Inv I, 2 и YP 3, 4. Всего исследовано 276 проб.

Искусственная контаминация смывов. Для искусственной контаминации смывов использовали Y. pseudotubeivulosis И-742. Смывы с капусты помещали в пробирки с 10 мл ЗФР, в которые вносили по 1 мл от 107 до 102 м.к./мл псевдотуберкулезного микроба (конечное разведение 1:10). В качестве контроля использовали неконтаминиро-ванные смывы с капусты. Высев материала проводили через 6 часов, на 1, 2, 3 и 5 сутки после инкубирования при +4°С и исследовали в ПЦР и БА. Пробоподготовку проводили патентованным нами методом. Использовали праймеры Yeis 1, 2 и Inv 1, 2. Проведено исследование 80 проб.

Заражениеэкспериментальныхживотных. Экспериментальных животных (15 морских свинок и 28 белых мышей) заражали интрагас-трально через зонд культурой К pseudotuberculosis И-742 и Y. pseudo-

tuberculosis И- 746 соответственно в дозе 109 м.к./мл в 10% растворе бикарбоната натрия. У морских свинок прижизненно через 24 часа после заражения в течение 10 дней ежедневно проводили забор крови из сердца (0.5 мл) для БА и ПЦР исследования. У павших животных и у животных, выведенных из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца на 18 день опыта, бактериологически исследовали печень, селезенку, кровь и тонкий кишечник. Белых мышей выводили из эксперимента также воздушной эмболией сосудов сердца на 1, 3, 7, 10, 15 и 21 сутки после заражения. Отрезок тонкого кишечника исследовали в БА, ИФА, РАЛ и ПЦР. Подготовку проб крови морских свинок к исследованию в ПЦР проводили методом С.Н. Радюк и др. [1996], тонкого кишечника морских свинок и белых мышей - разработанным нами методом. Для амплификации использовали праймеры Inv 1, 2. Для обнаружения антигена У. pseudo-tuberculosis в ИФА использовали "Тест-систему псевдотуберкулезную иммуноферментную" производства НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург), в РАЛ - псевдотуберкулезный латексный диагностикум Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток. Всего исследовано 307 проб.

Изучение выживаемости У. pseudotuberculosis в почве. Для изучения сохранения и динамики размножения У. pseudotuberculosis в почве применены диффузионные камеры объемом 10 мл с мембранными фильтрами "Synpor" с величиной пор 0.17 мкм [Родзиковский А.В., 1989]. В почвенную суспензию погружали 5 мембранных камер, в которые стерильным шприцем вводили У. pseudotuberculosis до концентрации 104 м.к./мл. Проведено две серии опытов: первая - с серой лесной почвой и дерново-карбонатной почвой при +18-20°С и +4-6°С (использовали двухплазмидный штамм У. pseudotuberculosis И-743); вторая - с дерново-карбонатной почвой при +4-6°С (использовали двух-плазмидные штаммы У. pseudotuberculosis И- 743, И- 747и одноплазмид-ные штаммы У. pseudotuberculosis И- 745, И- 746). В качестве контроля ДНК в одну из камер вводили псевдотуберкулезный микроб, разрушенный при 100°С в течение 30 минут. Пробы по 0.5 мл для БА и ПЦР забирали раз в неделю стерильным шприцем через отверстие в камере, которое обеззараживали 70°С спиртом и запаивали медицинским клеем БФ-6. Проводили полную идентификацию выделенных культур. Изучали способность к аутоагтлютинации и кальцийзависимость У.pseudotuberculosis на среде ВМ. Определяли % вирулентных и авиру-лентных клеток псевдотуберкулезного микроба. Для исследования в ПЦР пробы почвы обрабатывали "Набором для выделения ДНК (ООО

"Лаборатория МЕДИГЕН", Новосибирск). Использовали праймеры Yers 1, 2 и Inv 1, 2. Концентрацию псевдотуберкулезного микроба в мембранных камерах вычисляли по КОЕ и параллельно методом серийных разведений проб в ПЦР [Емельяненко Е.Н., 1997]. Концентрацию микробных клеток выражали в показателях десятичного логарифма (lg м.к./мл). Исследовано 520 проб.

Внутривидовое типирование штаммов. Проведено риботипиро-вание 112 штаммов псевдотуберкулезного микроба по методу F. Gri-mont, P.A.D. Grimont [1995]. Плазмидный профиль 447 штаммов изучали по T.Kieser [1984]. ПЦР-генотипирование 24 штаммов Y. pseudotuberculosis с праймерами АР 40-47 [Akopyanz N. et al., 1992] осуществляли по программе, предложенной S. Makino et al. [1994]. Обработку результатов выполняли по компьютерной программе "Analyze Gel Imager" ("ДНК-Технология", Москва). Ген урm суперантигена YPM изучен у 40 штаммов псевдотуберкулезного микроба.

Статистическиеметоды. Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики [Бессмертных Б.С., Ткачева М.Н., 1961] и с помощью статистических пакетов Statistica for Windows 6.0 и SPSS 11 с вычислением средней арифметической (М), среднего квадратичного отклонения (d), средней ошибки (m), критерия достоверности t Стьюдента, хи-квадрата (x2), коэффициента соответствия (r), средних геометрических титров антител (lgx). Диагностическая чувствительность, специфичность и эффективность ПЦР определялась по критериям, описанным Е.Н. Гараниной и др. [1987].

Сравнительный анализ клинических проявлений псевдотуберкулеза на вспышках выполнен совместно с ассистентом кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского института канд. мед. наук И.А Шурыгиной. Раздел работ по изучению динамики высеваемости Y. pseudotuberculosis в овощехранилищах проведен совместно с врачом Хабаровской противочумной станции канд. мед. наук В.Ф. Дзюбаком. Риботипирование штаммов Y. pseudotuberculosis изучено совместно с сотрудниками Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера зав. лабораторией бактериальных инфекций, докт. мед. наук, проф. Г.Я. Ценевой и канд. биол. наук Е.А. Воскресенской на базе лаборатории иерсиниозов Парижского института им. Пастера (Франция, проф. Е. Carniel).

Эколого-эпидемиологические особенности псевдотуберкулеза в Сибири в современных условиях

В Сибири нсевдотуберкулез занимает первое место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций бактериальной этиологии. Число случаев в год достигает более 6 тыс., показатель заболеваемости 28.1%ооо. На Сибирь, где проживает 16% населения России, приходится 63% от всех заболевших псевдотуберкулезом в стране, на Дальний Восток - 7.8%, на Европейскую часть РФ - 29.2%. Выборочное серологическое обследование населения на отдельных территориях сибирского региона позволило не только получить информацию о степени распространения псевдотуберкулеза среди населения, но и оценить истинную эпидемиологическую ситуацию по этой инфекции на определенной территории. Так инфицирование животноводов и рабочих мясокомбинатов в Иркутской (2.8%), Новосибирской областях (5.2%) и Республике Саха (Якутия) (0.18%) является показателем относительного неблагополучия по псевдотуберкулезу среди сельскохозяйственных животных. Серологический мониторинг при обследовании групп населения, связанных с сельским хозяйством (чабаны, ветеринары), позволил обнаружить в 0.78% антитела к Y. pseudotuberculosis в диагностических титрах в Республике Тыва - единственной территории сибирского региона, где псевдотуберкулез официально не регистрируется. Выявление высоких титров антител в сыворотках людей в эпидемиологически благополучный период, установленных нами также в Республике Саха (Якутия) и Иркутской области, подтверждает наличие невыявленных случаев псевдотуберкулеза, что нацеливает эпидемиолога на оценку качества клинико-лабораторной диагностики и объема проводимых про-тивопсевдотуберкулезных мероприятий.

По уровням заболеваемости в сибирском регионе можно условно выделить три основные группы территорий (рис.1):

1. Территории с высоким уровнем заболеваемости (более 32.0%ооо), который превышает федеральный показатель более чем в 4 раза (Кемеровская, Новосибирская, Томская области, Алтайский край);

2. Территории со средним уровнем заболеваемости (в пределах 8.0-31.9%ооо), которая выше федеральной в 2-3 раза (Тюменская, Республика Хакасия) или незначительно превышает ее (Иркутская область);

3. Территории, где заболеваемость ниже федерального (0.1-7.9%ооо) показателя (Республики Алтай, Бурятия, Саха (Якутия),

Рис. 1. Территориальное распространение заболеваемости псевдотуберкулезом в Сибири (1988-2001 гг.) на 100 тыс. населения.

Красноярский край, Омская, Читинская области) или не регистрируется (Республика Тыва).

Анализ многолетней динамики заболеваемости показал, что повсеместный рост псевдотуберкулеза в Сибири отмечался с 1982 по 1989-1990 гг. (I период). Затем наблюдалось резкое снижение количества заболевших. Это совпало с введением в эти годы обязательного лабораторного подтверждения диагноза при регистрации псевдотуберкулеза, согласно приказу МЗ СССР № 654 от 1989 г. С 19911992 гг. по настоящее время (II период) установился практически стабильный уровень заболеваемости в Новосибирской, Иркутской областях и в Республике Саха (Якутия), снижение - в Алтайском крае и рост - в Красноярском крае, Тюменской области. Причины увеличения уровня заболеваемости на некоторых территориях Сибири связаны с повышением активности действия факторов переда-

чи инфекции, а также ограниченным объемом проводимых в настоящее время профилактических мероприятий.

Распределение заболевших по возрастным группам свидетельствует о большей пораженности детей (6.2±0.2%оо), чем взрослых (0.9±0.04%оо). Снижение уровня эпидемического процесса на территориях сибирского региона в 1991-2001 гг. (II период) происходит за счет детского населения, при этом заболеваемость взрослых не изменялась. Однако, если в I периоде достоверно чаще болели дети, посещающие детские дошкольные учреждения, то во II - в эпидемический процесс более интенсивно вовлекаются "неорганизованные" дети (рис. 2). Это свидетельствует о том, что снижение заболеваемости "организованных" детей явилось следствием нейтрализации общих факторов передачи инфекции благодаря введению предупредительных мер - регламентации использования овощных блюд и других пищевых продуктов, не подвергавшихся термической обработке, а также ограничением или отсутствием свежих овощей в меню детских дошкольных учреждений. В то же время продолжают действовать факторы передачи в бытовых условиях, вызывая спорадический характер заболеваемости детей домашнего воспитания и взрослых.

Внутригодовое распределение псевдотуберкулеза на отдельных территориях указывает на почти одновременную активизацию механизма передачи возбудителя и причин, определяющих сезонность

Рис. 2.

Заболеваемость псевдотуберкулезом среди детских коллективов на 10 тыс. данного возраста (%оо) за 1982-1990 гг. и 1991-2001 гг.

эпидемического процесса. Подъем заболеваемости со значительным среднемесячным темпом нарастания сезонной волны (64.8±19.0%) начинается в холодный период года (декабрь-февраль) и заканчивается в летние месяцы (май-июль), занимая по продолжительности в среднем 164±7.1 дня. В эпидемический процесс в этот период вовлекается 55.6±3.2% заболевших, сезонная эпидемическая надбавка составляет 13.9±2.5% и на большинстве территорий пик сезонного подъема приходится на апрель и май. Не установлены достоверные различия в характеристике рассмотренных выше показателей сезонности в определенные по интенсивности периоды эпидемического процесса (I и И), что свидетельствует о закономерной активизации постоянно действующих факторов передачи инфекции на исследуемых территориях, однако отмечается смещение сезонного подъема на летние месяцы года.

В Сибири в I периоде зарегистрировано 50 вспышек с общим числом пораженных более 2000 человек, что составило 23.9% от всех заболевших псевдотуберкулезом. Наиболее высокий удельный вес вспышечной заболеваемости в этот период отмечался в Республике Саха (Якутия) - 80.9%, в Тюменской (23.5%) и Иркутской (20.8%) областях. Во II периоде вспышечная заболеваемость псевдотуберкулезом снизилась в 2.8 раза и составила 8.6%. Хотя число вспышек увеличилось до 72, количество заболевших на них уменьшилось с 45.7±14.0 до 25.2±6.4 человек. Это свидетельствует о том, что целенаправленное проведение противоэпидемических мероприятий по купированию вспышек существенно ограничивает вовлечение в эпидемический процесс значительного числа людей, но не влияет на уровень спорадической заболеваемости.

Результаты многолетних наблюдений в Иркутской области определили две очаговые территории по псевдотуберкулезу - на северо-западе (Усть-Илимский, Нижнеилимский, Братский, Тайшетский, Заларинский, Тулунский и Зиминский районы) и на юге области (г.г. Иркутск, Ангарск, Слюдянка). В этих очагах с 1987 по 2003 гг. зарегистрировано 16 эпидемических вспышек с вовлечением в каждую от 10 до 226 человек. Как правило, преимущественно поражались возрастные группы 3-6, 7-14 и 15-19 лет из детских дошкольных учреждений, средних школ, профтехучилищ, летних спортивно-оздоровительных лагерей, воинских гарнизонов. Перечисленные коллективы представляли ведущие "группы риска", где чаще возникали эпидемические вспышки. Однако, в последние годы наметилась тенденция к выявлению эпидемических вспышек в школах-

интернатах, специализированных коррекционных школах, детских домах и приютах, где в отличие от муниципальных детских учреждений в меню с целью витаминизации обязательно присутствуют блюда из сырых овощей и заготавливается овощная продукция на длительное хранение. На вспышках осенне-зимнего периода основным фактором передачи служили овощи нового урожая, а при возникновении эпидемических осложнений поздней весной и летом, наряду с овощами длительного зимнего хранения, первостепенное значение приобретала ранняя овощная продукция.

Территориальная неравномерность в распространении заболеваемости псевдотуберкулезом и активизация факторов передачи инфекции в определенные периоды года связаны с особенностями обеспечения населения овощами и корнеплодами, которые перед реализацией хранились в овощехранилищах различного типа. Круглогодичные лабораторные исследования позволили установить размножение и накопление К pseudotuberculosis на овощах при хранении в условиях низкой температуры овощехранилищ, что объясняет зимне-весенний подъем заболеваемости и позволяет рассматривать овощи нового урожая, заложенные на хранение, в роли основного фактора передачи инфекции. Показано, что в овощехранилищах высевае-мость псевдотуберкулезного микроба с капусты и моркови увеличивается с 1.9-2.4% в декабре до 26.5-28.3% в апреле, с репчатого лука с 1.6% в декабре до 16.3% в июне. Такое постепенное, но интенсивное накопление возбудителя приводило к контаминации тары, стен, пола и стеллажей овощехранилищ вплоть до августа следующего года (рис.3). Отмечено, что такая закономерность установлена только в овощехранилищах "примитивного типа", деревянной постройки, грызу-нопроницаемых, с существенными колебаниями температуры и влажности. В складских железобетонных сооружениях с автоматизированной терморегуляцией и приточно-вытяжной вентиляцией псевдотуберкулезный микроб обнаруживался лишь в отдельных случаях. Ранние овощи контаминируются возбудителем и становятся эпидемиологически опасными уже через 7-10 дней хранения при условии их закладки в овощехранилище, в котором осталась часть продукции прошлого года и выступают в качестве существенного дополнительного фактора передачи возбудителя псевдотуберкулеза, приводя к возникновению эпидемических осложнений в весенне-летний период.

Наиболее вероятное обсеменение овощей псевдотуберкулезным микробом, с одной стороны, происходит в овощехранилищах при загрязнении их фекалиями зараженных мелких млекопитающих,

X XI XII I II III IV V VI VII VIII

месяц

Рис. 3. Динамика высеваемости У. pseudotuberculosis с овощей и оборудования в овощехранилищах.

мигрирующих с наступлением холодов в антропургические очаги, с другой - активизация эпизоотического процесса среди грызунов в местах их концентрации приводит к достаточно интенсивному инфицированию сельскохозяйственных угодий и овощи закладываются на хранение уже инфицированными. Обладая психрофильными свойствами, Y. pseudotuberculosis может размножаться и накапливаться при низкой температуре на корнеплодах и овощах [Сомов Г.П., 1991], загрязненных частицами почвы, уже без участия грызунов, хотя полностью исключить значение последних затруднительно.

Эпизоотологические обследования очаговых территорий, проведенное нами, во время вспышек установило наличие псевдотуберкулезного микроба в популяциях синантропных и диких мелких млекопитающих в Иркутской области от 3.0 до 9.2%, в Республике Саха (Якутия) - до 2.7%, в отличие от планового эпизоотологичес-кого обследования (0.4-0.6%), что свидетельствует о протекании эпизоотического процесса среди мелких млекопитающих различной интенсивности.

Результаты исследований отдельных авторов [Литвин В.Ю. и др., 1998] свидетельствуют об определенной роли почвы в экологии псевдотуберкулезного микроба. Нами проведена серия экспериментов по изучению длительности выживания, динамики численности и изменения патогенных свойств Y. pseudotuberculosis в двух типах нестерильных почв, преобладающих на северо-западе (дерново-карбонатная) и юге (серая лесная) Иркутской области, в зависимости от температурных условий и различного спектра плазмид возбуди-

теля. Установлено, что в серой лесной почве при комнатной температуре двухплазмидный штамм Y. pseudotuberculosis И-743 высевался в течение 35 дней с постепенным снижением концентрации микробных клеток до 5x102 м.к./мл. Специфическая ДНК возбудителя определялась до 8 месяцев. При этом позитивные результаты ПЦР отмечались с обеими парами праймеров (Inv и Yers) до 28 недель (7 мес), что свидетельствовало о наличии как хромосомной, так и плазмидной ДНК Y. pseudotuberculosis. В последующие сроки происходила постепенная потеря патогенных свойств возбудителя, приводя к утрате плазмиды вирулентности pVM 47 MDa. Подобная тенденция установлена и в дерново-карбонатной почве.

В условиях холодовой инкубации (+4-8°С) двухплазмидный штамм Y. pseudotuberculosis И- 743 сохранялся в серой лесной почве в течение 7 месяцев, не переходя в покоящееся состояние, а из дерново-карбонатной почвы одноплазмидные (Y. pseudotuberculosis И-745, И-746) и двухплазмидные (Кpseudotuberculosis И-743, И-747) штаммы возбудителя высевались до 9-11 месяцев. Изучение популяцион-ной изменчивости Y. pseudotuberculosis позволило предположить два возможных варианта пребывания микроба в почвенной экосистеме: 1) утрата плазмиды pVM 47 MDa и размножение авирулентных клонов; 2) сохранение патогенных свойств, но снижение концентрации микроорганизмов. По-видимому, авирулентные клоны могут иметь селективное преимущество при существовании псевдотуберкулезного микроба в сапрофитической фазе. Снижение патогенных свойств возбудителя свидетельствует об ограниченной самостоятельной возможности почвы в передаче инфекции, а отсутствие размножения и образование некультивируемых форм подтверждают и редкие находки Y. pseudotuberculosis в ней [Кузнецов ВТ., 1997; Сомов Г.П., 2001]. Однако Y. pseudotuberculosis может длительно сохраняться в почве за счет постоянного, во все сезоны года, "добавления" вирулентного возбудителя из организма грызунов и накопления до инфицирующей дозы на овощах, загрязненных остатками почвы, в условиях овощехранилищ и складских помещений. Выявленная нами способность возбудителя к длительному существованию в почвенной экосистеме свидетельствует о ее резервуарном значении, которое вместе с мелкими млекопитающими обеспечивает реализацию возможности попадания возбудителя на конечные факторы передачи инфекции.

Применение и оценка полимеразной цепной реакции в системе лабораторной диагностики псевдотуберкулеза

Обоснованным направлением нашей работы стало усовершенствование лабораторной диагностики псевдотуберкулеза с применением молекулярно-генетических методов исследования, в частности ПЦР, основное преимущество которой заключается в быстроте получения результатов и их достоверности, поскольку классические методы (БА, РНГА) не отвечают требованиям ранней диагностики псевдотуберкулеза, что отражается на своевременности эпидемиологического обследования очагов и оперативности проведения противоэпидемических мероприятий.

Нами разработан способ подготовки испражнений для последующего исследования в ПЦР, позволяющий избирательно выделять ДНК только из Y. pseudotuberculosis, устойчивого к 0.72% раствору гидроокиси калия. Индигенная микрофлора под действием щелочи лизируется, удаляется как супернатант после центрифугирования, что позволяет получить концентрат микробных клеток Y. pseudotuber-culosis в диагностическом материале и дает возможность заменить сложные методы экстракции ДНК кипячением, что положено в основу полученного нами патента. Пробоподготовка искусственно кон-таминированных испражнений позволила получить положительный ответ в день обработки образцов с плазмидными и хромосомными праймерами из разведения 103 м.к./мл. Наиболее короткий срок выделения культуры Y. pseudotuberculosis при параллельном проведении бактериологического исследования составил 7-11 суток.

В дальнейшем способ выделения ДНК из псевдотуберкулезного микроба был оценен на белых мышах и морских свинках. Сравнительное исследование тонкого кишечника БА, РАЛ, ИФА и ПЦР методами показало, что частота получения положительных ответов на псевдотуберкулез в ПЦР достоверно превышает эффективность РАЛ в 4.0 (t=9.1, р<0.001), ИФА - 1.5 (t=3.6, p<0.001) и БА - в 1.3 раза (t=2.7, p<0.001). Прижизненное исследование сывороток крови морских свинок установило возможность индикации ДНК Y. pseudo-tuberculosis в течение трех дней после заражения, а в последующие сроки у одних животных обнаружение специфических ампликонов становилось прерывистым, у других - отсутствовало.

Использование ПЦР при исследовании экспериментально кон-таминированных смывов с капусты позволило обнаруживать специфические ампликоны ДНК псевдотуберкулезного микроба уже через 6 часов после "холодового" обогащения из проб с содержанием

105-107м.к./мл в отличие от бактериологического метода, не обеспечивающего выделение культуры в эти сроки исследования. Дальнейшее селективное обогащение в ЗФР в течение 24-48 часов перед амплификацией увеличивало чувствительность ПЦР до 103, а через 72 часа даже до 102 м.к./мл. Положительный бактериологический результат в эти сроки исследования установлен только из проб с концентрацией 105-106 м.к./мл и 104 м.к./мл соответственно.

В дальнейшем ПЦР использована для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза в условиях спорадической заболеваемости. Специфическая ДНК с помощью ПЦР обнаружена в 25.2±2.1% от общего числа обследованных с различными диагнозами, имеющие сходные с псевдотуберкулезом симптомы.

Оценка эффективности ПЦР проведена нами при анализе 153 больных с окончательным диагнозом "псевдотуберкулез", выявленных при спорадических случаях и в период эпидемических вспышек. Установлено, что культуры Y. pseudotuberculosis наиболее часто выделяют при вспышечной заболеваемости (t=6.7, p<0.01), но не ранее 10 дня от начала исследования. Специфические антитела обнаруживаются с одинаковой частотой (50.0-53.8%) на 2-3 неделе заболевания вне зависимости от интенсивности эпидемического процесса (t=0.43, p>0.01). Результат в ПЦР получали в течение первых суток, но достоверно чаще при вспышечной заболеваемости (t=4.5, р<0.01) (табл. 1).

Основную ценность в качестве исследуемого материала представляют испражнения, в которых ДНК Y. pseudotuberculosis обнаружена в

Таблица 1.

Сравнительная эффективность лабораторных методов исследования больных с установленным диагнозом "Псевдотуберкулез"

Формы проявления эпид-процесса Количество больных Диагноз ла-бораторно подтвержден абс (%± т) В том числе:

ПЦР абс (%± т) БА абс (%± т) РИГА абс (%± т)

Спорадическая 83 80 (96.4±2.0) 60 (75.0±4.8) 6 (7.5±2.9) 43 (53.8±5.5)

Вспышеч-ная 70 56 (80.0±4.8) 55 (98.2±1.8) 31 (55.4±6.6) 28 (50.0±6.7)

Итого 153 136 (88.9±2.5) 115 (84.6±3.1) 37 (27.2±3.8) 71 (46.4±4.0)

75.7±3.7%, тогда как в сыворотке крови в 2 раза реже (33.8+5.5%). В испражнениях специфические ампликоны ДНК выявлялись чаще в начальный период (89.9+4.3%) и в период разгара болезни (70.6+5.5%), но даже в стадии реконвалесценции результативность ПЦР оценивалась на достаточно высоком уровне (57.9+11.3%). Что касается сывороток крови, то их исследование наиболее эффективно в начальный период (62.5+17.1%). В последующие сроки болезни возможность выявления ДНК К pseudotuberculosis в крови уменьшается и в период реконвалесценции составляет 9.5+6.4% (рис. 4). Обнаружено, что ДНК У. pseudotuberculosis выявляется в крови преимущественно в лихорадочный период до 5-7 дня от начала болезни, а в более поздние сроки - только при затяжном течении и на фоне подъема температуры. Установлена корреляционная связь (r=0.7+0.06, t= 11.7, p<0.05) между положительным результатом ПЦР и повышенной температурой.

Статистически определен суммарный показатель диагностической эффективности ПЦР, составляющий 90.5%, что подтверждает высокую диагностическую ценность этого метода, обуславливая раннее лабораторное подтверждение диагноза, что определяет оперативность эпидемиологического обследования очагов псевдотуберкулеза.

Существенное значение приобретает ПЦР при расследовании причин эпидемических вспышек, при котором ведущее значение отводится установлению источника и факторов передачи инфекции. Исследование смывов с овощей и оборудования в овощехранили-

Периоды болезни

Рис. 4. Результативность ПЦР при исследовании испражнений и сывороток крови в различные периоды болезни.

шах и на пищеблоках организованных коллективов позволило получить положительный результат в ПЦР в 8.5%, подтвержденных в последующем выделением Y. pseudotuberculosis (1.65%). Исследование грызунов обнаружило позитивные результаты ПЦР в 3.85%, в то время как изолировать псевдотуберкулезный микроб у синантроп-ных мелких млекопитающих удалось в 2.88%. Это позволяет оперативно и достоверно устанавливать основной фактор передачи, выявлять роль грызунов в качестве источника инфекции при расшифровке эпидемических осложнений и своевременно определять направленность противоэпидемических мероприятий.

Микробиологический мониторинг смывов с объектов окружающей среды и кишечника грызунов в период эпидемиологического благополучия в районах Иркутской области показал высокий процент совпадений (55.6%) по обнаружению ДНК Y. pseudotuberculosis и выделению культур (при исследовании смывов r=0.7±0.3, t=22.0, р<0.01; при исследовании грызунов r=0.6±0.04, t=14.3, p<0.01).

Итогом данного направления исследования служит предлагаемая нами усовершенствованная схема бактериологической диагностики псевдотуберкулеза. Суть ее заключается в замене классического бактериологического анализа на псевдотуберкулез, занимающего 25 дней, на сокращенный трехэтапный вариант, включающий ПЦР (рис. 5). Это позволяет установить окончательный лабораторный диагноз на 3-е сутки исследования, тогда как наиболее короткий срок выделения культуры Y. pseudotuberculosis и получения положительного ответа с учетом идентификации 7-е сутки после прямого посева исследуемого материала и 11-е сутки при инкубации материала в условиях низкой температуры. Предлагаемая схема бактериологической диагностики псевдотуберкулеза не только сокращает ход лабораторного исследования за счет прекращения бактериологического анализа ПЦР-отрицательных образцов, но и позволяет вести целенаправленный поиск возбудителя для оперативного выявления причин и условий возникновения спорадических случаев болезни и при расшифровки эпидемических вспышек.

Молекулярно-генетические методы внутривидового типирования возбудителя псевдотуберкулеза в системе микробиологического мониторинга

Новые информационные возможности в системе эпидемиологического надзора по результатам наших исследований приобретает мониторинг за молекулярно-биологической и генетической харак-

I ЭТАП

Подготовка

проб: 1 г материала ♦ 9 мпЗФР (1:10)

|1 М^

II ЭТАП

(4-6 часов после поступления материала)

С=>ПЦР

(3 сутки после поступления материала)

Подготовка проб для ПЦР

I

Холодовое обогащение

Бактериологический высев

III ЭТАП

Щелочная обработка

Подготовка проб для ПЦР

О

ПЦР

(5 сутки после поступления материала)

Р«Ультатов

Выделение и идентификация культур

Рис. 5. Усовершенствованная схема бактериологической диагностики псевдотуберкулеза с использованием метода ПЦР.

теристикой штаммов У. pseudotuberculosis, выделенных от людей, животных и из объектов окружающей среды на отдельных территориях сибирского региона.

Использование плазмид как эпидмаркера при многолетнем наблюдении за псевдотуберкулезом в Иркутской области (17 лет) позволило выявить два типа антропургических очагов, отличающихся постоянством плазмидного спектра штаммов Y. pseudotuberculosis независимо от их происхождения: на северо-западе циркулируют одноплазмидные штаммы (pYV 47 MDa), а на юге - возбудитель не-

сет две плазмиды pYV 47 MDa и pVM 82 MDa. Вероятно, формирование этих очагов носило самостоятельный характер и обусловлено местными природно-климатическими и социально-экономическими условиями. Эпидемический процесс при псевдотуберкулезе для этих очагов отличается по уровню, динамике заболеваемости, сезонности, распределению заболевших по возрастным группам. В южном очаге вспышки наблюдались во все сезоны года, в северозападном - в основном весной и зимой и характеризовались более высоким показателем заболеваемости, чем на юге (7.2+1.1 и 1.7±0.2%ооо), что находит объяснение во времени и продолжительности действия ведущих факторов передачи инфекции. Различия в плазмидном спектре не оказывают влияния на формы проявления эпидемического процесса по интенсивности, так как в обоих очагах практически ежегодно регистрируются вспышки псевдотуберкулеза среди различных возрастных групп, организованных в детские и воинские коллективы. Один и тот же характерный для каждого очага плазмидный профиль обнаружен и при спорадической заболеваемости.

Сравнительный анализ основных клинических проявлений у 449 больных псевдотуберкулезом при вспышечной заболеваемости показал определяющую роль плазмид в особенностях клинического течения этого заболевания. На юге области наличие у возбудителя плазмиды pVM 82 MDa связано с тяжестью клинического течения болезни, приводя к развитию выраженных симптомов интоксикации, частому вовлечению в инфекционный процесс органов желудочно-кишечного тракта и печени, поражению суставов и редким появлением сыпи. На северо-западе эти симптомы менее выражены, а общая клиническая картина болезни протекает легче. В наших исследованиях с А.В. Воропаевым [2001; 2002] установлена способность двухплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis угнетать продукцию иммуноцитокинов по сравнению с одноплазмидными штаммами, что приводит к состоянию иммунологической недостаточности, которое может проявляться преобладанием генерализованных форм псевдотуберкулеза и более тяжелым течением заболевания. Способность вызывать гиперпродукцию провоспалительных цитокинов связывают с обнаруженным у У. pseudotuberculosis суперантигеном YPM, играющим определенную роль в развитии различных клинических вариантов заболевания [Yoshino K.I. et al., 1995; Ueshiba H. et al., 1988; Abe J. et al., 1993, 1997]. Нами показано, что все штаммы Y. pseudotuberculosisу выделенные в обоих очагах, имели одинаковый суперантиген YPM, что не позволяет судить о прямой зависимости

тяжести клинического течения псевдотуберкулеза от наличия урт гена.

С целью внутривидовой дифференциации возбудителя у 112 штаммов, изолированных в период 1987-2000 гг. на семи административных территориях сибирского региона, определены риботипы. Установлено, что в Сибири циркулируют четыре различных риботи-па: 1', 3', 4' и 6'. Преобладающее большинство изученных штаммов принадлежало к риботипу 1', который является доминирующим (94.6%) на всех наблюдаемых территориях региона, на долю риботи-па 3' приходится 2.6%, 4' - 1.7% и 6' - 0.9% исследованных культур. Штаммы 1' риботипа, обнаруживаемые чаще других, выделялись каждый год на всех территориях региона на протяжении периода наблюдения. Они были разнообразны по происхождению - их изолировали от больных в период вспышечной и спорадической заболеваемости, от грызунов, из смывов с объектов окружающей среды. Штаммы, принадлежащие к 4' риботипу, были изолированы только от грызунов, при этом связь этого риботипа с заболеванием человека пока не установлена. Показано, что в ходе двух из восьми изученных вспышек (г. Ачинск Красноярского края, 1998 г., г. Зима Иркутской области, 1998 г.) одновременно от больных были изолированы возбудители двух разных риботипов на одной и той же вспышке, что видимо свидетельствует о возможном заражении людей неоднородной популяцией возбудителя, циркулирующего среди мелких млекопитающих, тем не менее подобный факт требует дальнейшего наблюдения и анализа.

Сравнительное изучение штаммов из других регионов России позволило выявить риботипы, доминирующие в отдельных регионах России: 2' для Северо-Запада РФ, 5' и 7' для Дальнего Востока и 6' для Сибири. Среди штаммов, выделенных в других географических регионах (Западная Европа, Канада, Тунис, Австралия, Новая Зеландия) три риботипа - 2', 3' и 4' оказались идентичными российским штаммам. Напротив, среди зарубежных штаммов ни одного штамма риботипа 1' к настоящему моменту не обнаружено. Вероятно, этот риботип можно рассматривать в качестве специфического для территории России [^ктеязеткауа Е.А е1 а1., 2002]. В целом метод риботипирования имеет весьма перспективное значение для объективного установления причин и ведущих путей передачи псевдотуберкулезной инфекции.

ПЦР-генотипирование с произвольными праймерами использовано для установления эпидемиологических связей в период вспы-

шечной и групповой заболеваемости, лучший результат ПЦР-гено-типирования получен с праймерами АР 43 и АР 41. Праймер АР 43 не только подтвердил факт неоднородности штаммов в зависимости от района выделения (юг и северо-запад Иркутской области), но и дал возможность использовать результаты генотипирования в качестве дополнительной метки для углубленного эпидемиологического анализа (рис. 6). Профиль длины ампликонов на вспышке в г. Зима (2000 г.), выявивший генотипическую идентичность штаммов, свидетельствует об однородной клоновой структуре возбудителя в сформировавшемся антропургическом очаге псевдотуберкулеза и указывает на наличие эпидемиологических связей между предполагаемым источником инфекции и больным псевдотуберкулезом через общий фактор передачи. Обнаружение отличий ПЦР-паттернов псевдотуберкулезного микроба, изолированного от грызунов на вспышках в г. Ангарске (1995 г.) и пос. Залари (1987 г.) по сравнению с изолята-ми от заболевших и факторов передачи свидетельствует о циркуляции среди мелких млекопитающих гетерогенной популяции У. pseudo-

г. Ангарск г. Зима пос. Залари

Рис. 6. ПЦР- генотипировакие штаммов Y. pseudotuberculosis с использованием произвольного праймера АР 43: 1 - смыв с капусты; 2,3 -испражнения больных; 4 - тонкий кишечник серой крысы, 5 - смыв с лука; 6 - испражнения больного, 7 - тонкий кишечник домовой мыши, 8 - испражнения больного, 9 и 10 - помет домовой мыши, 11 - маркер молекулярного веса ДНК 100-1000 п.н.

tuberculosis. Однако, преимущественное накопление на факторах передачи и заражение человека происходит только одним генетическим вариантом возбудителя, что подтверждалось нами и при рибо-типировании штаммов Y. pseudotuberculosis. Сопоставление двух методов молекулярно-генетического типирования (ПЦР с произвольными праймерами и риботипирование) позволяет, с одной стороны, предположить на отдельных вспышках отсутствие непосредственной связи заболеваний с грызунами данной популяции, а с другой -свидетельствует о слабой вирулентности этого штамма и селективного отбора другого эпидемического клона возбудителя, способного вызывать заболевания у человека.

Пути совершенствования эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом на основе предэпидемической диагностики

Методические и организационные основы эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом формируются в результате развития теоретических представлений о сущности эпидемического процесса. В период эпидемического распространения псевдотуберкулеза целью и критериями эффективности эпидемиологического надзора являлось уменьшение числа и интенсивности эпидемических вспышек, и поддержание заболеваемости на уровне единичных, не связанных друг с другом, случаев заболеваний. Ведущее значение при этом придавалось: а) санитарно-гигиеническим мероприятиям, в первую очередь, исключение из системы питания сырых овощей, которые служили конечными факторами передачи возбудителя человеку; б) истребительным дератизационным мероприятиям, ограничивающим широкое распространение эпизоотии в популяции грызунов. Комплекс указанных мероприятий в сочетании с круглогодичным лабораторным контролем за степенью инфицированности грызунов и обсеменением объектов окружающей среды имели позитивное значение именно в период массовых эпидемических вспышек.

Социально-экономические преобразования в обществе привели к определенному ослаблению действия факторов передачи инфекции, ограничению территории риска и групп населения, подверженных опасности заражения. Псевдотуберкулез приобрел преимущественно спорадический характер заболеваемости, хотя ежегодно и возникают локальные эпидосложнения по этой инфекции, поражающие в основном детские социальные учреждения и воинские

коллективы. Трудность клинико-лабораторной диагностики в связи с полиморфизмом клинических проявлений и проблема низкой вы-севаемости возбудителя из материала от больных и объектов окружающей среды в период спорадического уровня заболеваемости требовали пересмотра подходов к системе эпидемиологического надзора.

В связи с тем, что эпидемический процесс при псевдотуберкулезе в настоящее время носит прерывистый характер, необходимы комплексные методы оценки эпизоотической ситуации и определения тех "мест риска", где инфекция по ступенчатым путям передачи достигает основных "факторов риска". Поэтому целью эпидемиологического надзора в настоящее время должно стать своевременное установление предпосылок и предвестников возникновения заболеваний в предэпидемический период и предупреждение осложнений эпидемиологической ситуации. Данный подход положен нами в основу дальнейших научных изысканий по повышению эффективности эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом, названный Б.А. Черкасским [1990,2001] предэпидемической диагностикой. Важно было организовать слежение прежде всего за такими факторами, которые могут определять заболеваемость еще до того, как она стала проявляться или повышаться.

Опираясь на опыт, накопленный другими исследователями по профилактике псевдотуберкулеза [Ющенко Г.В., 1986, 1998; Сомов Г.П. и др., 1999, 2001] и, учитывая анализ собственных результатов, нами сформулированы основные предпосылки активизации механизма передачи инфекции, наличие которых может привести к возникновению псевдотуберкулеза на конкретной территории:

неудовлетворительное санитарное состояние населенных пунктов городского типа, прокладка санитарно-технических и тепловых коммуникаций на поверхности земли, что создает благоприятные условия для миграции и пребывания серых крыс, домовых мышей и других видов грызунов в объектах риска;

♦ плановая поставка больших партий ранних овощей в рамках программы северного завоза, их длительная и многоэтапная транспортировка до мест реализации, во время которой может происходить накопление возбудителя в растительных пищевых продуктах в связи с его психрофильностью;

♦ хранение овощей в неприспособленных помещениях перевалочных баз или овощехранилищах деревянной постройки, где продукция доступна для грызунов;

употребление свежих овощей без термической обработки в зимне-весенний период преимущественно в детских организованных коллективах.

В связи с тем, что псевдотуберкулез отнесен к сапрозооноз-ным, нетрансмиссивным природно-очаговым инфекциям [Литвин В.Ю. и др., 1998; Сомов Г.П. и др., 2002], а заболевания людей следует трактовать как "эпидемические проявления эпизоотического процесса" [Белов А.Б., Огарков П.И., 2002], то следовательно заражение человека происходит только при наличии благоприятных факторов, реализующихся в общественном питании или в бытовых условиях. Алиментарный путь передачи через сырые овощи, загрязненные грызунами и длительное время хранившиеся при низкой температуре, определяет характер предвестников осложнения эпидемиологической ситуации. Организационно-методической основой объективного установления предвестников может стать усовершенствованная нами бактериологическая диагностика псевдотуберкулеза с применением ПЦР, которая используется как критерий оценки выделенных нами предвестников осложнения эпидемиологической ситуации. Позитивные результаты ПЦР-анализа объектов окружающей среды сигнализируют о действии конкретных факторов передачи инфекции, способствуя экстренному выявлению обстоятельств возможного заражения человека (табл. 2).

На основании вышеизложенного нами предлагается усовершенствованная схема эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом, которая включает в себя два основных структурных компонента: 1) эпидемиологическую диагностику, состоящую из информационно-аналитической подсистемы (ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ) и подсистемы предэпидеми-ческой диагностики; 2) контрольную (управленческую) подсистему, включающую разработку на основе эпидемиологической диагностики рационального комплекса профилактических мероприятий (рис. 7). Методической основой эпиднадзора служит ретроспективный эпи-данализ, позволяющий выявлять существенные факторы риска, оценивать эффективность противоэпидемических мероприятий и устанавливать предпосылки осложнения эпидемиологической ситуации. Результаты оперативного эпиданализа с применением ПЦР для выявления предвестников свидетельствуют об опасной предэпидеми-ческой ситуации по псевдотуберкулезу для данного места и време-

Таблица 2.

Предвестники и критерии оценки осложнения эпидемиологи-

ческой ситуации

№ п/п Предвестники Критерии оценки

1. Массовое размножение синан-тропных грызунов, приводящее к увеличению их численности на эпидемиологически значимых объскгах, обследованных в плановом порядке Обнаружение ДНК псевдотуберкулезного микроба ПЦР при исследовании тонкого кишечника отловленных грызунов в антропургичсских очагах

2. Нарушение технологии приготовления, хранения и реализации блюд из сырых овощей, несоблюдение санитарно-гигиенического режима на пищевых объектах, выявляемого в ходе осуществления санитарно-гигиенического надзора Положительные результаты ПЦР-анализа при выполнении планового лабораторного контроля овощей, фруктов, воды, готовой пищи и других объектов окружающей среды, взятых на эпидемиологически значимых объектах

3. Регистрация единичных случаев лабораторного подтверждения диагноза псевдотуберкулеза в населенных пунктах, благополучных по этой инфекции в предыдущие 1-2 года Положительные результаты ПЦР-анализа среди группы заболевших, по комплексу клинических признаков сходных с течением псевдотуберкулезной инфекции

ни, определяет необходимость ранней клинико-лабораторной диагностики инфекции на этапах обращения населения за медицинской помощью и позволяет детально изучить молекулярно-биологи-ческие свойства возбудителя, изолируемого от грызунов и из объектов окружающей среды. Это дает возможность оценить территорию по ее эпизоотологической и эпидемиологической значимости, своевременно вмешиваться в ход развития эпидемического процесса при псевдотуберкулезе и рационально планировать объем целенаправленных превентивных мероприятий.

Рис. 7. Усовершенствованная схема эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом Темным цветом отмечены этапы, на которых целесообразно применение ПЦР.

выводы

1. Эпидемиологические закономерности псевдотуберкулеза в Сибири за последние 20 лет характеризуются периодом первоначального повсеместного роста заболеваемости с последующей стабилизацией спорадического уровня при существенном уменьшении удельного веса и интенсивности эпидемических вспышек.

2. Сезонный подъем заболеваемости псевдотуберкулезом обусловлен действием постоянных и дополнительных факторов передачи инфекции за счет различных сроков завоза, хранения овощей и реализации их через пищеблоки организованных коллективов.

3. В последние годы эпидемические вспышки носят выраженный пищевой характер, развиваются остро, преобладают в детских социальных учреждениях. Исходным условием возникновения эпидемических осложнений служит накопление псевдотуберкулезного микроба при хранении растительных продуктов в "примитивных" овощехранилищах и складских помещениях.

4. В антропургических очагах псевдотуберкулеза в период острых вспышек грызуны играют самостоятельную роль в сохранении Y. pseudotuberculosis. Незначительная инфицированность их при плановом обследовании по сравнению с периодом эпидемических осложнений свидетельствует о различной степени течения эпизоотического процесса среди мелких млекопитающих, активизация которого увеличивает эпидпотенциал очага.

5. Возбудитель псевдотуберкулеза способен длительно персис-тировать в нестерильных почвах в зависимости от температурного режима, утрачивая плазмиду вирулентности или, сохраняя патогенные свойства, значительно снижать концентрацию микробной популяции, что указывает на определенное значение почвы совместно с мелкими млекопитающими в попадании Y. pseudotuberculosis на конечные факторы передачи возбудителя инфекции человеку.

6. Способ выделения ДНК Y. pseudotuberculosis, основанный на избирательной устойчивости микроба к гидроокиси калия, обеспечивает снижение концентрации ингибиторов в исследуемом материале и позволяет заменить сложные методики экстракции ДНК кипячением.

7. В условиях спорадической и вспышечной заболеваемости псевдотуберкулезом ПЦР обладает высокой диагностической эффективностью, обусловливая экстренную постановку диагноза и оперативное проведение эпидемиологического обследования очага.

8. Предложенная нами усовершенствованная схема бактериологической диагностики псевдотуберкулеза сокращает ход исследования до трех суток. Позитивные результаты ПЦР-анализа в эпидемиологической диагностике следует оценивать в качестве сигнала, направляющего дальнейший бактериологический поиск возбудителя в определенном биологическом материале и субстрате окружающей среды.

9. Впервые на юге и северо-западе Иркутской области в зависимости от плазмидного профиля возбудителя выявлены два типа антропургических очагов, отличающихся по уровню заболеваемости, сезонности, распределению заболевших по возрастным группам и плазмидному профилю возбудителя. Наличие у Y. pseudotuberculosis плазмиды pVM 82 MDa не влияет на формы проявления эпидемического процесса по интенсивности, но вызывает более тяжелое клиническое течение болезни, несвязанное напрямую с наличием у возбудителя суперантигена YPM.

10. Методы риботипирования и ПЦР-генотипирования с прай-мерами произвольной последовательности служат объективным критерием оценки результатов эпидемиологического расследования причин возникновения очагов псевдотуберкулеза, и позволяют выявлять генетическую однородность или гетерогенность штаммов возбудителя различного происхождения в период вспышечной и спорадической заболеваемости.

11. Предложены пути повышения эффективности эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом на основе предэпидеми-ческой диагностики, последовательно выявляющей предпосылки и предвестники осложнения эпидемиологической ситуации, наличие которых обосновывает стратегию и тактику профилактических мероприятий.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Эпидемиологическая характеристика псевдотуберкулеза в Иркутске / М.В. Чеснокова, А.С. Марамович, Ю.И. Лысанов, Е.И. Демидова // Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез. докл. регион, науч.-практ. конф. (16-17 сент.1993 г.). - Чита, 1993. - С.153-154.

2. Сравнительный анализ эпидемиологических проявлений псевдотуберкулеза на различных территориях Иркутской области / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович, О.Э. Кулькова // Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-

очаговых инфекционных болезней: Тез. докл. науч.-практ. конф. (окт. 1994 г.). - Иркутск, 1994. - С. 169-170.

3. Многолетняя динамика и сезонность псевдотуберкулеза в Хабаровском крае / В.Ф. Дзюбак, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович, НА Прохина // Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-очаговых инфекционных болезней: Тез. докл. науч.-практ. конф. (окт. 1994 г.). - Иркутск, 1994. - С. 44.

4. Применение серологических методов исследования для оценки эпидемической ситуации при псевдотуберкулезе / И.Я. Егоров,

A.С. Марамович, М.В. Чеснокова и др. // Вост.-Сиб. журн. инфекц. патологии. - Иркутск, 1995. - № 1. - С. 13-14.

5. Особенности эпидемического процесса псевдотуберкулезной инфекции в южном и северо-западном очагах Иркутской области / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович, Р.А. Лемешко // Мед. паразитол. - 1995. - № 4. - С. 27-30.

6. Редкий фактор передачи возбудителя псевдотуберкулеза / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, О.Э. Кулькова и др. // Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ. конф. "60 лет противочумной службы Кавказа". - Ставрополь. - 1995. - С. 79-80.

7. Эпидемиологические закономерности иерсиниозов в Республике Саха (Якутия) / И.Я. Егоров, А.С. Марамович, В.Ф. Чернявский, М.В. Чеснокова, А.В. Тупицина // Журн. микробиол. - 1996. -№ 2. - С. 40- 43.

8. Modeling of Yersinia pseudotuberculosis inflammatory process / LA. Shurygina, V.T. Klimov, M.V. Chesnokova // 4th Russia-Japan International medical Symposium: Abstracts (September 3-8, 1996, Irkutsk). - Russia, 1996. - P. 178.

9. Эпидемиологическая характеристика вспышек псевдотуберкулеза в Иркутской области / В.Т. Климов, А.С. Марамович, М.В. Чес-нокова и др. // Сборник тезисов докладов, посвященный 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области: Итоги, проблемы и перспективы. - Иркутск, 1997. - С. 109-111.

10. Климов В.Т. Эпидемиологические особенности псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в Сибири и на Дальнем Востоке /

B.Т. Климов, М.В. Чеснокова // Журн. инфекц. патологии. - Иркутск, 1997. - Т. 4, № 1. - С. 38-41.

И. Климов В.Т. Эпидемиологические особенности псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в Иркутской области / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович // Материалы научно-практичес-

кой конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (16-17 сент. 1997 г.). - Саратов, 1997. - Т. 1. -С. 64.

12. Псевдотуберкулез на северо-востоке Евразии / И.Я. Егоров, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович, В.Ф. Чернявский // Вопросы региональной гигиены, санитарии и эпидемиологии: Республик, сб. науч. работ. - Якутск, 1997. - Вып. 4. - С. 198-199.

13. Зоонозные инфекции в центральных и южных улусах Республики Саха / И.Я. Егоров, Ю.В. Мирончук, А.С. Марамович, М.В. Чеснокова и др. // Журн. микробиол. - 1997. - № 2. - С. 38-43.

14. Чеснокова М.В. Основные направления эпидемиологического надзора за иерсиниозами / М.В. Чеснокова, А.С. Марамович,

B.Т. Климов // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (28-31 янв. 1997 г.). -М., 1997. - Т.1. - С. 167-168.

15. Егоров И.Я. Эпидемиологическое районирование Республики Саха (Якутия) в отношении зоонозных инфекций / И.Я. Егоров, Ю.В. Мирончук, А. С. Марамович, А.Д. Ботвинкин, М.В. Чеснокова и др. // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 1997. - № 1. - С. 16-20.

16. Epidemiological and clinical characteristics of outbreaks of pseudotuberculosis in province Irkutsk / V.T. Klimov, A.S. Maramovich, LA. Shu-rygina, I.V. Malov, O.V. Mik, M.V. Chesnokova, N.V. Breneva // Medische Microbiologie: 7th International Congress on Yersinia (June 14-16, 1998). -Niederlands, Tijdschrift Voor. - 1998. -Vol. 6. - Suppl. II. - S. 44, P. 135.

17. Псевдотуберкулез / СВ. Балахонов, М.В. Чеснокова, А.С. Ма-рамович и др. // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней: В 2 т.; Отв. ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Ку-тырев. - Саратов, 1998. - Т. 1. - С. 144-165.

18. Полимеразная цепная реакция для диагностики псевдотуберкулеза / В.Т. Климов, А.С. Марамович, Н.В. Бренева, М.В. Чеснокова // Журн. инфекц. патологии. - Иркутск, 1998. - Т. 5, № 4. -

C. 63-65.

19. Некоторые эпидемиологические аспекты и клинико-патоге-нетическая характеристика псевдотуберкулеза в Восточной Сибири / И.В. Малов, А.С. Марамович, В.Т. Климов, В.Т. Леоненко, И.А. Шурыгина, М.В. Чеснокова // Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний; Под. ред. Н.Д. Ющука, Ю.В. Мартынова: Сб. науч. тр. к 70-летию со дня рождения акад. В.И. Покровского. - Вып. 4. - М.: ВУНМЦ, 1999. - С. 380-386.

20. Эпидемиологические и клинико-морфологические особенности псевдотуберкулеза в Иркутской области / В.Т. Климов, А.С. Ма-рамович, И.В. Малов, И.В. Шурыгина, М.В. Чеснокова и др. // Эпи-демиол. и инфекц. болезни. - 1999. - № 4. - С. 29-34.

21. Борьба со вспышками псевдотуберкулеза как пример организации противоэпидемических мероприятий / Н.В. Бренева, А.С. Марамович, М.В. Чеснокова, В.Т. Климов // Актуальные вопросы медицинского обеспечения при чрезвычайных ситуациях и катастрофах: Тез. докл. III ежегод. науч.-практ. конф. (16-17 сент. 1999 г.). - Иркутск, 1999. - С. 24-25.

22. Клинико-эпидемиологическая характеристика вспышки псевдотуберкулеза в воинской части / Л.Ю. Хамнуева, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, ИА. Шурыгина // Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней: Тез. докл. науч. конф. -СПб., 1999. - С. 319.

23. Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней в Сибири / Г.Г. Онищенко, А.Д. Ботвинкин, Е.П. Голубинский, А.Ф. Даниленко, Л.К. Иванова, Т.И. Иннокеньева, А.И. Калинов-ский, СМ. Макеев, А.С. Марамович, Ю.В. Мирончук, В.Н. Михеев,

A.В. Родзиковски, А.М. Титенко, Л.Я. Урбанович, М.В. Чеснокова; Под. ред. Г.Г. Онищенко. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 213 с.

24. Использование полимеразной цепной реакции в диагностике и эпидемиологическом обследовании очагов псевдотуберкулеза / Н.В. Бренева, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович, В.Т. Климов // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Сб. тез. докл. юбилейной науч. конф. (14-15 дек. 1999 г.). - Оболенск, 1999. - С. 28.

25. Шурыгина И.А. Анализ вспышки псевдотуберкулеза в воинской части / И.А. Шурыгина, М.В. Чеснокова, ВТ. Климов // Актуальные вопросы инфекционной патологии: Сб. науч. тр. - Иркутск, 1999. - Вып.2. - С. 88-90.

26. Хамнуева Л.Ю. Некоторые эпидемиологические особенности псевдотуберкулеза в Иркутской области /Л.Ю. Хамнуева,

B.Т. Климов, М.В. Чеснокова // Прошлое, настоящее, перспективы: Материалы регион, науч.-практ. конф., посвящен. 50-летию службы санэпиднадзора в Бурятии. - Улан-Удэ, 2000. - С. 126-128.

27. Характеристика вспышки псевдотуберкулеза в г. Зима Иркутской области / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, Бренева Н.В. и др. // Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология, микробиология и профилактика). - М., 2000. - Ч. 1. - С. 271-276.

28. Изучение выживаемости псевдотуберкулезного микроба в почве методом ПЦР с использованием диффузионных камер / Н.В. Бре-нева, А.С. Марамович, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, А.В. Род-зиковский // Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология, микробиология и профилактика). - М., 2000. - Ч. 1. - С. 266-271.

29. Применение ПЦР в клинической практике для диагностики псевдотуберкулеза/ Н.В. Бренева, АК. Тарбеев, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович // Генодиагностика в современной медицине: Сб. тез. докл. 3-ей Всеросс. науч.-практ. конф. (25-27 янв. 2000 г.). -М., 2000. - С. 324-325.

30. Возможность выявления Yersinia pseudotuberculosis в крови методом ПЦР в эксперименте / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, Н.В. Бре-нева, А.С. Марамович // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иер-синиоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции: Материалы международ, конф. (29-31 мая 2000 г.). - СПб. - 2000. - С. 68-69.

31. Использование ПЦР для оценки значимости объектов окружающей среды в системе эпиднадзора за псевдотуберкулезом / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, Н.В. Бренева и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции: Материалы международ, конф. (29-31 мая 2000 г.). -СПб., 2000. - С. 68.

32. Совершенствование лабораторной диагностики псевдотуберкулеза с помощью ПЦР / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, Н.В. Брене-ва, А.С. Марамович // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иер-синиоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции: Материалы международ, конф. (29-31 мая, 2000 г.). - СПб., 2000. - С. 26.

33. Обнаружение суперантигена (YPM) в штаммах Yersinia pseudotuberculosis, циркулирующих на территории Сибири / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, Н.В. Бренева и др. // Проблемы биологической и экологической безопасности: Материалы международ, конф. (22-25 мая 2000 г.). - Оболенск, 2000. - С. 186-187.

34. Скрининговая ПЦР-диагностика полевого материала на иер-синиозы {Yersiniapseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica) / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, Н.В. Бренева, А.С. Марамович // Генная диагностика особо опасных инфекций: Тез. докл. Всеросс. науч.- практ. конф. - Саратов, 2000. - С. 79-80.

35. Оценка эпидемиологической ситуации по природноочаговым инфекциям в районе строительства железнодорожной трассы Эль-га-Зея / В.Ф. Чернявский, А.Д. Ботвинкин, А.С. Марамович, А.И. Ка-линовский, С.М. Макеев, Ю.В. Мирончук, Ю.Д. Очиров, Е.А. Вер-

шинин, М.В. Чеснокова и др. // Лабораторное дело и профилактика: Научно-практическое издание; Под ред. А.П. Протодъяконова,

B.Ф. Чернявского, В.И. Иларова. - Якутск, 2000. - С. 166-170.

36. Природноочаговые инфекции на севере Евразии. 3.1. Бактериальные инфекции / И.Я. Егоров, А.С. Марамович, А.С. Мирон-чук, Ю.В. Чернявский, М.В. Чеснокова и др. // Эпидемиологический надзор за особо опасными и природно-очаговыми инфекциями в условиях Крайнего Севера; Под. ред. И.Я. Егорова, А.С. Марамо-вича, А.Д. Ботвинкина. - Якутск, 2000. - С. 80-189.

37. Особенности клинических проявлений псевдотуберкулеза при спорадическом уровне заболеваемости / И.А. Шурыгина, М.В. Чеснокова, В.Т. Климов и др. // Инфекционные болезни на рубеже XXI века: Материалы науч.-практ. конф. (24-26 мая 2000 г.). - М., 2000. -Ч.Н. - С. 75.

38. Способ подготовки проб для диагностики псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции; Патент на изобретение № 2153671 РФ С1 70 01 № 33/48 / В.Т. Климов, Н.В. Бренева, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович; Иркутс. науч.-иссл. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - № 99119079/14; Заявл. 07.09.1999; Опубл. 27.07.2000, Бюл. № 21.

39. Особенности клинико-лабораторной диагностики псевдотуберкулеза в условиях спорадической заболеваемости / И.А. Шуры-гина, М.В. Чеснокова, В.Т. Климов и др. // Инфекционные болезни в практике терапевта; Под. ред. В.П. Малого: Материалы науч.- практ. конф. с международ, участием. (13-14 нояб. 2001 г.). - Харьков, 2001. -

C. 274-276.

40. Применение полимеразной цепной реакции для ранней лабораторной диагностики спорадического псевдотуберкулеза / М.В. Чес-нокова, В.Т. Климов, Н.В. Бренева и др. // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2001. - № 6. - С. 22-26.

41. Новые аспекты эпидемиологии, клиники и лабораторной диагностики псевдотуберкулеза / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович, Н.В. Бренева, И.А. Шурыгина // Тихоокеан. мед. журн. - Владивосток, 2001. - №2 (7). - С. 104-106.

42. Влияние плазмиды с молекулярной массой 82 МБ на клинические и морфологические проявления псевдотуберкулеза/ ИЛ. Шу-рыгина, И.В. Малов, А.С. Марамович, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова // Сиб. мед. журн.; Специальный выпуск. - Иркутск-Гренобль, 2001.-Т. 26, № 1. - С. 47-52.

43. Вспышка псевдотуберкулеза в Красноярском крае / Н.Г. Зверева, ТА. Садовник, Н.Н. Титков, Г.М. Татаренко, М.В. Чеснокова,

B.Т. Климов // Журн. инфекц. патологии. - Иркутск, 2001. - Т.8, № 4. - С. 55-56.

44. Чеснокова М.В. Оптимизация эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом в современных условиях / М.В. Чеснокова, А.С. Марамович, В.Т. Климов // Материалы VIII съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26-28 марта 2002 г.). - М.: РОСИНЭКС, 2002. - Т.2. - С. 71-72.

45. Влияние Y. pseudotuberculosis на продукцию цитокинов клетками цельной крови доноров in vitro / А.В. Воропаев, И.А. Шу-рыгина, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова и др. // Журн. микробиол. -2002. - № 4. - С. 48-51.

46. Способ подготовки проб для лабораторной диагностики псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, Н.В. Бренева, А.С. Марамович // Молекул, генетика. - 2002. - № 4. - С. 39-41.

47. Иммуносупрессивные свойства плазмиды pVM 82 Yersinia pseudotuberculosis / А.В. Воропаев, И.А. Шурыгина, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2002. -Т. 2, № 4. - С. 49-51.

48. Источники ошибок серологических реакций при иерсинио-зах / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, А.В. Попов и др. // 80 лет Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской федерации. Итоги, проблемы и перспективы: Тез. докл. I съезд гигиенистов, эпидемиол, микробиол. Иркутс. обл. - Иркутск, 2002. -

C. 176-178.

49. Эпидемиологическая характеристика псевдотуберкулеза в Сибири / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2002. - Т. 2, № 3. - С. 68-71.

50. Применение полимеразной цепной реакции для изучения экологических особенностей псевдотуберкулезного микроба / Н.В. Бре-нева, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова и др. // Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении в рамках Международной конфенции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины": Сб. тр. науч.-практ. симпозиума (20-21 июня 2002 г.). -М., 2002. - С. 282-286.

51. Влияние Yersinia pseudotuberculosis на продукцию цитокинов in vitro и in vivo / А.В.Воропаев, И.А. Шурыгина, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова и др. // Проблемы инфекционной патологии в ре-

гионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Тез. докл. науч.-практ. конф. с международ, участием. (29-31 мая 2002 г.). -Новосибирск, 2002. - С. 110- 111.

52. Molecularepidemiological characterization of Yersiniapseudotuber-culosis circulating in different geographic areas of the Russian Federation / EA. Voskressenskaya, V.T. Klimov, G.Ya. Tseneva, E. Carniel, J. Foulon, M.V. Chesnokova // 8th International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku). - Finland. - 2002. - P-92. - P. 89-90.

53. Оценка эффективности полимеразной цепной реакции при расследовании вспышек псевдотуберкулеза / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович и др. // Журн. микробиол. - 2003. -№ 3. - С. 7-11.

54. Чеснокова М.В. Выявление ДНК Yersinia pseudotuberculosis в крови экспериментальных животных в динамике инфекционного процесса / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2003. - № 3. - С. 185-187.

55. Мультиплексная ПЦР в диагностике псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза / В.Т. Климов, А.В. Попов, М.В. Чеснокова, А.С. Марамович // Журн. инфекц. патологии. - Иркутск, 2003. -Т. 10, № 4. - С. 49.

56. Испытание диагностической ценности питательной среды для выделения Yersinia pseudotuberculosis / О.Г. Татарникова, В.И. Кузнецов, М.В. Чеснокова и др. // Журн. инфекц. патологии. - Иркутск, 2003. - Т.10, № 4. - С. 105-106.

57. Полимеразная цепная реакция и ПЦР-генотипирование штаммов Yersinia pseudotuberculosis в комплексном обследовании ан-тропургического очага псевдотуберкулеза / М.В. Чеснокова, В.Т. Кли-мов,А.С. Марамович и др. // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Материалы 4-й Международ. науч.-практ. конф. Государств-участников СНГ (30 сент.-2 окт. 2003 г.). - Саратов, 2003. - С. 195-198.

58. Псевдотуберкулез / И А. Шурыгина, М.В. Чеснокова, В.Т. Климов и др. - Новосибирск: Наука, 2003. - 320 с.

59. Влияние плазмиды pVM 82 MDa Yersinia pseudotuberculosis на клинические и морфологические проявления псевдотуберкулеза / И.А. Шурыгина, И.В. Малов, М.В. Чеснокова и др. // VI Российский съезд врачей-инфекционистов: Материалы съезда (29-31 окт. 2003 г.) - СПб.: ВМедА. - 2003. - С. 445.

60. Влияние биологических свойств Yersinia pseudotuberculosis на взаимодействие микро- и макроорганизма / И.А. Шурыгина, И.В. Ма-

лов, MB. Чеснокова, В.Т. Климов // Тезисы докладов межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР СП. Карпова (7-10 окт. 2003 г.). - Томск, 2003. - С. 44- 45.

61. Закономерности адаптации Yersinia pseudotuberculosis в экспериментальной почвенной экосистеме / Н.В. Бренева, А.С. Марамович, В.Т. Климов, М.В. Чеснокова // Журн. мик-робиол. - 2003. - № 6. - С.37-41.

62. Чеснокова М.В. Предэпидемическая диагностика псевдотуберкулеза в системе эпидемиологического надзора / М.В. Чес-нокова, В.Т. Климов, А.С. Марамович // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2003. - № 6. - С. 7-10.

63. К вопросу о роли плазмиды pVM 82 МДа и гена YPM, кодирующего суперантиген, в клинико-эпидемиологических проявлениях псевдотуберкулеза / В.Т. Климов, М.В. Чеснокова, И.А. Шурыгина и др. // Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003.-С. 209- 211.

Подписано в печать 15.03.2004. Бумага офсетная. Формат 60х841/1

Гарнитура Тайма Усл. печ.л. 1.6 _Тираж 100 экз. Заказ № 060-04._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН

Р - в 8 2 S