Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Противоопухолевая активность и другие биологические свойства новых производных колхицина и колхамина

РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР МИНЗДРАВА РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

На правах рукописи

Для служебного пользования Экз. №

УДК: 616-006:577.15/19 546.944.615

ЕНИКЕЕВА ЗУЛЬФИЯ МАХМУДОВНА

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ И ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА И КОЛХАМИНА

(14.00.14 - онкология; 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискаиие ученой степени доктора биологических наук

Ташкент - 2000

Работа выполнена в Республиканском Онкологическом Цент Минздрава Республики Узбекистан.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Исамухамедова М.А. Доктор биологических наук Хушбактова З.А. Доктор химических наук, проф. Ташмухамедова А.К.

Ведущая организация:

Ташкентский Фармацевтический институт.

Защита состоится " 4 " ¿¿(¿ХЖ-У 2000 г. в " ^ " час на заседании Специализированного Совета Д. 015.82.01 Республиканском Онкологическом Центре Минздрава Республи Узбекистан по адресу: 700095, Ташкент-95, ул.Фароби, 383. тел.: (95 71) 46-05-13, 46-98-80.

Автореферат разослан " " 2000 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, *

д.м.н. МУХАМЕДАМИНОВIII.1

Актуальность проблемы. Прогресс в лечении злокачественных новообразований определяется появлением новых противоопухолевых препаратов. В настоящее время разрабатываются новые представители уже известных групп препаратов, обладающих лучшей переносимостью и большей эффективностью. Известно, что применение противоопухолевых препаратов при многократном введении вызывает иммунодепрессию. Перспективным в эффективности противоопухолевой терапии является создание препаратов, обладающих, наряду с высоким противоопухолевым, иммуностимулирующим действием.

Среди антибластомных средств различной природы значительное место занимают природные соединения и их полисинтетические аналоги с антимитотическим действием. В последние годы возрос интерес к веществам с подобным механизмом действия в связи с появлениям таких эффективных препаратов как таксаны (паклигаксел и доцетаксел) /Bissety М. С-, 1995, Boyd М, 1994/. Успешно применяются винкаапкалоиды (винкристин, винбластин и полусинтетический виндезин), лактон подофиллотоксин, создаются и входит в практику онкологов новые дериваты на их основе.

Группа митозтормозящих средств начиналась с алкалоида колхицина - митотического яда, который в силу токсичности и небольшой широты терапевтического действия позднее был заменен менее токсичным природным аналогом колхамином. Наличие функционально-активных центров в молекуле колхицина и колхамина позволяет провести их направленную модификацию с целью расширения спектра биологического действия и создания полифункциональных противоопухолевых и иных препаратов, что явилось задачей, решению которой посвящена настоящая работа.

Известно, что колхицин и колхамин обладают радиосенсибшшзирующим действием, на чем основано их применение совместно с телегаммотерапией /Грим МЛ, Малкинсон Ф.Д., 1963/, поэтому изучение радиомодифицирующих свойств новых менее токсичных производных алкалоидов является весьма актуальным в свете усиления чувствительности опухолей к рентгеновскому излучению.

Разработка лекарственной формы и изучение хронической токсичности препаратов - этапы многоступенчатого исследования лекарственных средств, которые нашли отражение в настоящей работе.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является создание новых биологически-активных полифункциональных соединений на основе колхицина и колхамина со сниженной токсичностью и высокой противоопухолевой, радномодифицирующей и полиплоидирующей активностью. В этой связи были поставлены следующие задачи:

- Химическое моделирование молекул колхицина и колхамина с целью получения полифункциональных молекул, сочетающих митозтормозящий эффект колхицина о алкилирующим механизмом действия привнесенных фрагментов.

- Разработка методов синтеза и выделения новых веществ.

- Изучение структур полученных соединений химическими и физико-химическими методами.

- Установление основных фармакологических свойств и выявление закономерности "структура-активность" новых производных трополоновых алкалоидов на основе изучения их токсических свойств, митотической, противоопухолевой и других видов биологической активности.

- Выявление перспективных соединений в ряду новых производных трополоновых алкалоидов в качестве потенциальных средств лечения злокачественных новообразований на основе использования различных тест-систем, таких как цитологическое действие соединений на клетки Allium сера L., асцитные и солидные опухоли мышей и крыс, эксплантанты опухолей человека в условиях органного культивирования, а также сравнение их активности с известными противоопухолевыми препаратами.

Исследование механизма противоопухолевой активности перспективных соединений на основе изучения их митотической активности, влияния на синтез нуклеиновых кислот, изучение их иммуномодулирующего действия, воздействия на репарацию стволовых гемопоэтических клеток, антиокислительной активности.

- Создание новой лекарственной формы Дэкоцина и изучение ее токсикологических свойств.

Научная новизна. Разработано новое направление в химии трополоновых алкалоидов-введение алкилирующих агентов, фрагментов молекул, отвечающих за радиомодифицирующие свойства и других синтонов, специфически увеличивающих активность исходной молекулы алкалоида за счет полифункционального действия полученных дериватов, сочетающих антимитотический эффект исходного колхицина с эффектом введенных фрагментов. На основе этого синтезированы новые оригинальные соединения. Разработаны их методы синтеза и выделения. Строение новых веществ изучено химическими и физико-химическими методами. Установлена парамагнитная активность ряда полученных соединений, степень которой коррелирует с биологической активностью.

Впервые обнаружена и изучена противоопухолевая активность большого ряда новых производных алкалоидов колхицина и колхамина как на опухолях человека "in vitro", так и на опухолях животных "in vivo". На широком спектре опухолей in vivo показана высокая противоопухолевая активность ряда соединений, отобранных в предварительных экспериментах.

При изучении механизма действия наиболее активных соединений (Дэкоцина, К-42 и К-48) установлено, что вещества сочетают алкилирующее' действие с антимитотическим, проявляя большую избирательность к опухолевым клеткам, различны в своем иммунологическом действии, антиокислительных свойствах, влиянии на систему обновления популяции кроветворных клеток, а также

лутагенном воздействии на клетки костного мозга.

Исследования хронической токсичности Дэкоцина в лекарственной }юрме (2% мазь) показало хорошую переносимость препарата кивотными.

Впервые изучалась радиомодифицирующая активность новых 1роизводных колхшшиа, 6 соединений оказались с более выраженной )адиосенсибнлизирующей активностью, чем у колхицина.

При изучении полиплоидной активности новых дериватов выявлен )яд более эффективных и менее токсичных соединений, чем колхицин, [ля селекции растений.

В результате изучеиия биологических свойств новых прчизводных рополоиовых алкалоидов установлены некоторые закомерности заимосвязи структуры и активности, что позволяет планировать альнейший поиск биоактивных соединений в данном ряду природных оединений.

Практическое значение. В результате проведенных исследований становлено, что из изученных соединений наиболее перспективными вляются соединения Дэкоцин, К-42 и К-48, последние препараты аходятся на стадии представления в Фармакологический комитет РУз. [экоцин в виде 2%-ной мази, прошел предклииические )армакологические испытания и представлен на рассмотрение Фармакологического комитета РУз.

При изучении радиомодифицирующей активности . новых оединений отобраны два вещества со значительной адиосенсибилизирующей и противоопухолевой активностью, наряду со ниженной токсичностью, для использования в сочетании с облучением.

При изучении полиплоидизирующей активности новых соединений ыявлен ряд более эффективных препаратов, чем колхицин, для глекции растений (рекомендация CAO ВАСХНИЛа по применению репарата Дадакол (К-55) при получении полиплоидов различный астений от 30.11-1988).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Синтезированы новые биологически-активные полифункциональ-ые соединения на основе алкалоидов колхицина и колхамина со шженной токсичностью и высокой противоопухолевой, щиомодифицирукпцей и полигшоидирующей активностью за счет ¡едснин алкилирующих групп и синтонов, направленно эдифицирующих активность получаемых дериватов.

2. Изучение биолошческой активности позволило обнаружить из мученных соединений в экспериментах на опухолях человека "in vitro" > активных веществ для дальнейших исследований. На опухолях "in vo" отобраны наиболее перспективные вещества (Дэкоцин, К-42 и К-S) с высокой противоопухолевой активностью. Найдены 2 соединения [-18 и К-19) с сочетанием значительной радиосенсибилизирующей и

противоопухолевой активности.

3. Механизм противоопухолевого действия отобранных соединений обусловлен сочетанием их антимитотической активности со значительным подавлением синтеза нуклеиновых кислот в опухолевых клетках, а также различием в их иммунологическом действии, антиокислительных свойствах, влиянии на систему обновления популяции кроветворных клеток.

4. Для Дэкоцина разработана лекарственная форма в виде 2% мази с двумя основами и проведено исследование хронической токсичности мази Дэкоцин-1, что позволяет рекомендовать препарат для клинических испытаний.

Апробация работы. Материалы, включенные в работу, докладывались и обсуждались на Всесоюзных совещаниях по экспериментальной химиотерапии опухолей (Черноголовка, 1981, Москва; 1986), на республиканской конференции химиотерапевтов (Ташкент, 1986), на I съезде онкологов РУз с международным участием (Ташкент, 1994), на I съезде онкологов СНГ (Москва, 1997), на симпозиуме "Медицина и охрана здоровья" (Тюмень, 1997), на всесоюзных совещаниях по радиобиологии (Свердловск, 1980, Пермь, 1981, Челябинск, 1986), на 8-й конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Рига, 1991), на I и III международных конференциях по химии природных соединений (Ташкент, 1994, Бухара, 1998), на конференциях молодых ученых в Институте химии растительных веществ (Ташкент, 1997, 1998, 1999, 2000); на республиканской конференции "Перспективы в создании новых лекарственных препаратов" (Ташкент, 1998).

Публикации. Результаты диссертации изложены в 77 научных публикациях, из них 17 статей в рецензируемых журналах, 11 авторских свидетельств и 3 патента РУз.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 322 машинописных страницах, в том числе 280 страниц основного текста, и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы" и 6 глав, в которых обсуждаются результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 351 наименование работ, а также приложения, где представлены спектральные данные новых соединений (40 рисунков), данные изучения 26 новых веществ в NCI (26 рисунков), а также ВФС Дэкоцина. Диссертация содержит 35 таблиц, 11 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В Главе 1 диссертационной работы собраны данные по противоопухолевому действию и токсикологии природных и синтетических аналогов колхицина, рассмотрены такие важные аспекты механизма действия колхицина как антимитотический, через воздействие

на тубулины на молекулярном уровне, воздействие на синтетические процессы в клетке, приведены имеющиеся в литературе данные об иммунологическом действии алкалоида, а также о его радиомодифицирующих свойствах. Так же кратко охарактеризованы Среднеазиатские колхицинсодержащие растения - основные природные источники ценного алкалоида и приведен обзор соединений, полученных разными авторами на основе колхицина и колхамина. Химические превращения колхицина по кольцам А, В и С нами рассмотрены параллельно с изменением физиологической активности приведенных соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

УФ-спектры новых соединений снимали на приборе СФ-20 фирмы "Бекман", в этаноле, ИК-спектры - на приборе UR-I0 в вазелиновом масле и в таблетках КВг, ПМР-спектры - на приборе XL-100 Varían в CDClj, Масс-спектры - на приборе "МАТ-311" с непосредственным вводом вещества в ионный источник. Данные элементного анализа соединений отвечали вычисленным.

Использовали ТСХ на: а) закрепленном слое окиси алюминия; б) закрепленном слое силикагеля ЛС 5/40 М для ТСХ с 13% гипса; в) пластинках Silufol. Системы растворителей: I - хлороформ: метанол 24:1; II - хлороформ: бензол: ацетон: метанол 20:5:4:3; III - хлороформ: бензол: ацетон: метанол 20:5:4:8; IY - хлороформ: гептан: метанол 20:5,5:3,5. В качестве проявителей применяли реактив Драгендорфа, пары йода, растворы ниншдрина и нитропруссида натрия.

В работе были использованы белые беспородные крысы в количестве 1329, а также 4144 мыши (белые беспородные, линии BL57/6, BALB/c и СБА).

Исследования по определению острой токсичности соединений проводили на 225 мышах-самцах линии BALB/c, на 658 мышах-самцах линии BL57/6, на 120 белых беспородных мышах-самцах со средним весом 20-25 г 2-3 месячного возраста и 362 белых беспородных крысах-самцах весом 110-130 г в возрасте 6 месяцев. Определение острой токсичности осуществляли с помощью пробит- и регрессионного анализа (Урбах В.Ю., 1964). Максимально переносимые дозы (МИД) при 10-кратном введении веществ определяли непосредственно на животных-опухоленосителях в ходе подбора терапевтических доз (ТД).

Противоопухолевую активность соединений исследовали на четырех перевивных опухолевых штаммах крыс: карциносаркоме 256 Уокера (КСУ), саркоме-45 (С-45), саркоме М-1 (С-М-1), карциноме Герена и на пяти мышиных штаммах: саркоме 180 (С-180), асцитной карциноме Эрлиха (АКЭ), аденокарциноме тонкого кишечника (АКАТОН), аденокарциноме толстого кишечника (АКАТОЛ) и раке шейки матки (РШМ-5), полученных из банка штаммов ОНЦ. Штаммы

опухолей перевивали согласно инструкциям (Софьина З.П. и др. 1980). Количество животных в опытных группах от 6 до 10, в контрольных группах-согласно инструкциям (Софьина З.П. и др. 1980).

При оценке противоопухолевой активности изучаемых соединений были использованы следующие показатели: процент торможения роста опухоли, средняя продолжительность жизни экспериментальных животных (Ларионов Л.Ф., 1962, Чернов В.А., 1964, 1871; Софьина З.П. и соавт., 1980). При изучении токсического действия препаратов в процессе терапевтического опыта были определены коэффициент роста опухоли, потеря массы тела и селезеночный индекс, опыт прекращали не ранее, чем через 7 дней после последнего введения препарата животным. Контролем служили группы животных с введением им: 1) физиологического раствора, 2) колхамина, и 3) циклофосфана. Работу по изучению противоопухолевой активности Дэкоцина, К-42 и К-48 проводили совместно с Султановой Д.Ш. и Баленковым О.Ю.

Изучение митотического индекса новых соединений на криптах кишечника (Епифанова О.М., 1963) проводили на мышах линии С57В1/6 в течение суток, которым вводили внутрибрюшинно изучаемый препарат в дозе 1/2 ЛД16.

Оценка МИ и цитотоксического действия колхицина и его производных на клетки опухоли СаРа (совместно с к.м.н. Кузнецовой H.H.) производилась радиометрическим методом путем измерения уровня синтеза ДНК по включению клетками меченного Н3-тимидина /Добрынин Я.В., 1961/. Измерение проводилось с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика фирмы "Beckman" в жидкости ЖС-8. Параллельно спектрофотометрически определяли изменения суммарного количества НК в клетках по методу Спирина, а также количество белка по Лоури.

Дня изучения воздействия соединений на синтез НК паралельно в клетках костного мозга и опухолевого штамма РШМ-5 был использован метод включения Н3-тимидина и Н'-уридина. Клеточные суспензии в количестве 1 млн/1мл в каждой пробе на среде 199 проинкубировали с веществами в разных случаях 10 и 40 минут (37°С), затем вносили меченые предшественники НК в количестве 1 mkKu на пробу и инкубировали 2 часа (37°С). Последующую обработку образцов проводили по известным методикам (Чиссов В.И. и др., 1993). Количество импульсов в минуту подсчитывали на жидкостном сцинтиляционном счетчике "Rackbeta - 1217" (LKB, Швеция) в сцинтиляционной жидкости ЖС-7А или ЖС-8 с эффективностью счета по тритию 35-40%, учитывая значение фона флакончиков и сцинтилятора, при участии к.б.н. Александрова В.В.

Для определения мутагенной активности соединений на клетках костного мозга мышей линии BALB/c, использовали цитогенетический метод, предложенный Фордом в модификации Халматовой М.Х. и др., 1991. Отбор, анализ и регистрацию аберраций хромосом проводили

согласно методическим рекомендациям (1974) совместно с к.б.н. Гильдиевой М.С.

Изучение действия соединений на численность штнтелообразующих клеток (АОК) в селезенке после 8-кратного введения веществ в терапевтической дозе проводили на мышах линии BALB/c с перевитым опухолевым штаммом АКАТОН с помощью метода юкального гемолиза эритроцитов (Erne и Nordin, 1963).

Изучение влияния соединений на численность эндогенных солониеобразующих единиц в селезенке (КОЕс) проводили на мышах 7ИНИИ BALB/c на 9-е сутки после облучения в дозе 6 Гр (Till J.E., Мс. Zulloch Е.А., 1961; Петров Р.В., Чередеев А.Н., 1974) совместно с Заленковым О.Ю.

Изучение антиокислигельной активности соединений проводили на ликросомальной фракции из печени мышей /Арчаков А.И., 1968/. \ктивность ПОЛ в опытах в аскорбат-зависимой системе окисления 1зучалн по выходу малонового диальдегида (МДА) /Косткж B.JI., 1983/. 1репараты растворяли в спирте. Данные выхода МДА определялись по 6 пмерениям.

Радиомодифицирующие свойства соединений изучались при общем щиократном гамма-облучении в диапазоне летальных доз ЛД1600-ЛД95.99/з0 600-900р), на аппарате "АГАТ-РМ", источник Со™, мощность дозы >блучения составила 100 р/мин. Препараты вводили в количестве 1/2 1Д,6 за 15 мин до облучения животных. Животным контрольной группы •водили растворитель в том же объеме. Влияние соединений на юстрадиационную гибель животных оценивали по величене ФИД фактор изменения дозы), представляющей соотношение СД50/30 для сытной и СД50/30 для контрольной групп. Наблюдение за животными ели в течение 30 дней совместно с к.м.н. Голощаповой Ж.А.

Изучение хронической токсичности препарата Дэкоцин в виде 2%, 0%, 20% мази проводили путем смазывания на предварительно ыстриженный участок кожи размером 2x2 см ежедневно в течении двух [есяцев на 80 белых беспородных крысах обоего пола согласно Правилам доклинической оценки безопасности фармакологических редств", М. 1991. Контрольной группе животных в аналогичных словиях опыта кожу смазывали эмульгатором, на основе которого отовилась мазь Дэкоцин. Один раз в неделю определяли массу тела, розодили комплексные гематологические и биохимические сследования. После завершения срока эксперимента на части животных з каждой группы проводили патоморфологические исследования. За :ивотными, оставленными в группах, проводили наблюдение в течение 1 :есяца, после чего их обследовали в том же объеме совместно с к.м.н. ежеповым Ж.

Цитологическое действие соединений на клетки корешков Allium ера L. изучали методом давленых ацетоорцеиновых препаратов Лаушева З.П., 1970) и затем исследования продолжились на семенах гслковицы Morus alba (Атабекова А.И., 1971), которые замачивали в

течение 24 часов в растворах препаратов, взятых в концентрациях 0,01; 0,05 и 0,10%. Контролем служили водные растворы колхицина тех же концентраций и вода. При изучении действия производных колхицина на семена шелковицы в каждом варианте обрабатывали и высевали по 100 семян шелковицы гибридной комбинации "Зимостойкой х 7-67" (2п=28) совместно с к.б.н. Огурцовым К.С.

Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли по методу Стьюдента-Фишера, применительно к биологическим исследованиям (Лакин Г.Ф., 1973). Достоверными считали различия на уровне значимости Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА И КОЛХАМИНА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СТРОЕНИЯ

Наличие функционально-активных центров в молекуле колхицина и колхамина позволило провести их направленную модификацию с целью расширения спектра биологического действия. Нами модифицировались молекулы этих алкалоидов привнесением в положения С7 и СЮ алкилирующих групп и синтонов, в результате получены моно- и бифункциональные производные колхицина и колхамина, имеющие различные заместители в трополоновом и гептадиеновом циклах алкалоидов (таблица 1).

В работе описывается получение аминокислотных производных колхицина и колхамина (серосодержащих /К-1,2,3,4,5,6/ и ароматической /К-24/), а также производных изотиурония /К-21/ и меркаптоэтиламина /К-22/, этилениминного /К-25/, окси-/К-12,13,14,17,28/ и хлорэтиламин-ных /К-16,20,15,29/ производных по трополоновому кольцу. Получены дезацетилированные производные по гептадиеновому кольцу с различными аминозаместителями в трополоновом кольце /К-7,8,18, 19,23,26,27/, проводилось нитрозирование вторичной аминогруппы колхвминовых производных /К-30,31/, алкилирование азота гептадиенового кольца окисью этилена /К-32,35,37,41,43,44,47,52/, окисью пропилена /К-55/, эпи-и эпитиохлоргидрином /К-53, К-54/, введение мочевины /К-50,60/, с последующим хлорированием этаноламиновых производных колхицина и колхамина /К-33,36,38,42,45,48,51,61/, а также получение комплексных соединений с хлоридами Со, Мп, Fe и сульфатом ванадила на основе К-18- нового малотокенчного производного колхицина (Еникеева З.М. с соавт., 1981, 1983, 1985, 1986, 1987, 1988, 1990, 1991, 1992, 1994, 1996, 1997, 1998, 1999).

Структуры новых соединений доказывали методами спектрального (УФ, ИК, ПМР, ЭПР, масс-спсктроскопией) и элементного анализа, ^ также химическими превращениями и качественными реакциями.

В большей мере, чем у других аминопроизводных, введение хлорэтиламинных фрагментов как в трополоновое, так и в гептадиеновое кольцо, ведет к появлению парамагнитных свойств. Исходя из теоретических соображений, расчетов спектров ЭПР, можно предположить, что местом наибольшей вероятности нахождения неспа-ренного электрона является трополоновое кольцо. Повидимому, образование свободного радикала обусловлено понижением энергии разрыхляющих молекулярных орбигалсй фрагмента >1Ч-С1О-С9=0 трополонового кольца, вследствие склонности его к фотовозбуждешпо, куда может происходить делокализация электронной плотности неспаренного электрона азотсодержащих заместителей на стадии КПЗ, дополнительно распределяющаяся по трициклической системе колхицина. При этом нейтрализуется положительный заряд трополонового кольца, что может создать эффект парамагнитного состояния, как у гомотропилия, который существует в виде радикала с константой сверхтонкого взаимодействия 3,9 Гс в спектре ЭПР /Гордон А., 1976/.

Во-вторых, мы полагаем, образуются пары кето-амишшх и окси-иминных таутомеров, которые обнаруживаются в УФ и ИК-спектрах соединений, однако последняя пара таутомеров (N=€,,,-0,-011) в силу меньшей акцепторной способности иминной группы в сравнении с карбонильной не может активно участвовать в создании ароматической 6-л-электронной системы трополона, тем самым способствуя возникновению избыточной электронной плотности в цикле, что также может являться причиной появления у соединений парамагнитных свойств.

СТРОЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТРОПОЛОНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ

Таблица I.

№ Шифр СНЗСТ«^"^. а, «1 Эмпирическая формула Моле <уляр ный всс Температура плавления (<ЭС)

к. 1?.,

1 2 3 4 5 6 7

I К-1 ЫН£НСН,СН, 5 СООН СИ, гчнсосн, 516 165-170 (р)*

2 к-г ынснсн,сн, 5 ¿ООН сн, С,,НКМ,0,8 48В 147 (р)*

3 к-з СООН ноос ¿НСН^ - SCH-.Cn нн Лн №1сосн, С48Н54Н40И5, 974 140 (р)*

4 5" К-4 СООН ноос снсн.я - ясн,сн ынсн, 919 190 (р)*

К-5 т-снсн^н соон" ШСОСН, СцНз^О^, 488 140-190

6 К-6 ГМН-СНСН^Н СООН инсн, 460 205-207

7 К-7 МНСНСН,СН,{ СООН сн, ш. 474 210-212 (р)*

в к-8 çooh nooq çhch,s-sch,çh йн nh nh, c„h.„n4o,,s. 892 170-172

9 к-24 nh-снсн,- ¿оон nhcoch, CVir-NA 532 270(b)*

10 к>9 NH, nhcoch, c„h,4n,0, 384 255-257

11 к-10 nh, nh, c„h"n,0, 342 165-167

12 к-11 NHCHXH-.OH nhcochj CaHMN,0, 428 106-108

k-i3 nhch,ch,oh NHCOCH, HCl 118-120

13 к-18 nhch,ch,oh NH, c,,h,„n,0, 386 106-108

14 К-16 nhchxhxi NHCOCH,HCl C„H„N,0,C,, 483 200(b)'

15 К-23 nhchxhxi NH, ' HCl c„h„,n,o4c„ 440 178-180

16 к-25 CH, ада 410 124

n<1 CH, nhcoch,

17 К-22 nhch,ch,sh nhcoch, c„h,,n,0,s 444 124

18 К-21 nhch,ch,sçnh, nh NHCOCHj NC1 c,4h3,n40,c,, 527 S3(p)* 116-118(5)

19 К-14 nhchxhxh nhch, c,,h,„n,0, 400 95

20 к-19 nhch,ch,oh nhch,nc1 c„h,»n,0,ci 436 122-124

21 к-15 nhchxhxi NHCH, HCl c„h„n,04ci, 455 285-290

22 К-17 n(ch,ch,oh), nhcoch, c„h„n,o7 472 178-189

23 К-26 n(ch,ch,oh), nh, 430 163(b)*

24 К-20 n(ch,ch, ci ), nhcoch,nc1 c„h„n,0xi, 547 140(p)*

25 к-27 n(ch,ch,c1 ), NH, ■ HCl c„h,j4,04ci, 504 180

26 К-28 n(ch,ch,oh), nhch, c,4h„n,o. 445 150-153

27 к-29 n(chxh,ci ), NHCH,HCl c,4h„n,o4ci, 518 170-173(p)

28 к-30 nhch,ch,oh n(no)ch, c„h„n,ot ^430_ 156-158

29 к-31 n(chxh,oh), n(no)ch, C,tH„N,0, 473 125-130

30 к-32 nhch,ch,oh n(ch,)ch,ch,oh C,4H,J4,04 445 68-72

31 к-33 nhchxhxi N(CH,)CH,CH,CI HCl c,4h„n,o4ci, 518 182

32 К-41 n(ch,ch,oh), n(ch,)ch,ch,oh c*h«n,o7 488 71-73

33 lK-42 n(chxhxi ), n(ch,)ch,ch,cihci c„,h„n,04ci4 563 220

34 к-43 n(chxh,ci ), n(ch,)chxh,cihci 527 214

35 к-44 n(ch,ch,oh), nhchxh,oh c„h,4n,07 474 128-130

36 к-45 n(ch,ch,ci ), NHCHXHXI HCl c,,h„n,o4c]4 567 143-148

37 к-47 N(CH,CH,OH), n(ch,ch,oh), c„h,„n,0„ 518 140-142

38 к-48 n(ch,ch,ci ), n(ch,ch,ci),'hci с„н,^,04с1, 628 1 19-200(r)

39 К-35 nhchxhxh nhch,ch,oh 430 10S-110

40 к-36 nhchxhxi nhchxhxihci с„н„^,04с1, 504 130

41 к-37 nhch,ch,ûh n(chxh,0h), C„H,4N,O, 474 110-1 12

42 К-38 NHCHXHXI n(chxhx1),hci c„h„n,o4ci4 567 160

43 к-50 nhch,ch,oh nhconh, C„h„n,0„ 430 124-130

44 к-60 n(chxh,oh), nhconh, c.4h„n,o, 473 125 (p)

45 k-61 n(chxhxi), NHCONH, HCl C4H,„N,0,CI, 1547 196-200 (p)

46 к-52 NH, nhch,ch,oh c„h,4n,o, 3r6 96

47 к-53 nh, /0\ nh-chxh-ch, c„h,,n,o5 398 107

48 к-54 nh, /S\ c2,h,7n,o.s 414 112

nh-chxh-ch,

49 к-55 nh, ch3 nhchxhoh cjjh^jo, 430 95-100

50 к-56 nhchxhxh NHvFeCl,

51 к-57 NHCHXH,OH nh, v,0,

52 к-58 NHCHXH,OH nh, CoCI, c,4h,4n,06c1, со 636 53

53 к-59 nhchxhxh nh,mnci, C,4HuN,0(C1, Mn 632 206

54 Кол хицин och, nhcoch, c,,h,5no<, 399 155-157

55 Колха мин och, nhch, c,,h23no5 356 185-186

(р)*-разлагается; (в)*-возгоняется.

Новые соединения относятся к известным группам веществ, содержащих неспаренные электроны, связанные либо со всей молекулой, либо, по крайней мере с большей ее частью /Ингрэм Д., 1972/, что обусловливают разнообразную химическую и биологическую активность этих молекул. В частности, это увеличивает способность к более легкому п-тг- или п-тс взаимодействию с тубулинами. Повидимому, этим можно объяснить большую активность новых колхицеинамидов при получении полиплоидных форм растений. С другой стороны, введение в организм веществ в виде радикалов может увеличивать повреждение клеток облучением и обусловить более выраженные радиосенсибилизирующие свойства новых веществ. Наконец, более высокая противоопухолевая активность новых колхицеинамидов также может быть обусловлена повышенной алкилирующей способностью радикалов, либо бирадикалов, которые могут образоваться при дополнительном введении алкилирующих групп в В-кольцо. Не исключено, что молекулы, имеющие в своем строении два участка свободнорадикалыгого характера могут быть причастны к остановке митоза за счет межспиральных сшивов в ДНК из-за наличия пространственно разнесенных неспаренных электронов. Это особенно характерно для соединений с ал кил и рую щи ми группами, находящимися в разных частях молекулы, таких как К-42 и К-48. Для этих соединении возможен интеркалирующий механизм противоопухолевого действия.

Также выраженной парамагиитностью обладают производные по С-7. К чисто спиновому магнетизму у заместителей по С-7 примешивается орбитальный магнитный момент, что приводит к появлению в их спектрах узкого сигнала с §-фактором 2,0023 и ряда широких сигналов, как например, с g-фaктopoм 2,177 (К-52). Такая возможность может быть реализована в результате взаимодействия конца внедренного в С-7-Ы- фрагмента с СО трополонового кольца.

Сходный эффект появляется при введении парамагнитных нитроксильных радикалов в структуру известных противоопухолевых препаратов /Эмануэль Н.М., 1980/, обусловливающих более чем на порядок снижение токсичности при сохранении или даже увеличении противоопухолевой активности с одновременным появлением радиосенсибилизирующих свойств.

ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ И АНТИМИТОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТРОПОЛОНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ

Токсичность колхицина, колхамина и их новых производных меняется от вида животных. Крысы, как правило, более чувствительны к этим веществам, чем мыши, но имеются вещества, чувствительность к которым выше у мышей, чем у крыс, это К-26, К-27, К-38 и К-43. Картина острого отравления для колхицина, колхамина и почти всех их

производных довольно однотипна: при внутрибрюшиннои введении соединений в ЛД50, у животных с первых суток снижается реакция на болевые и тактильные раздражители, угнетается двигательная активность, и на фоне адинамии через 3-7 суток наступает смерть.

ТОКСИЧНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА

Таблица 2.

шифр вещества мыши/крысы шифр вещества мыши/крысы шифр вещества мыши/крысы

лд„, лд,„ лд,„

I группа II группа III группа

К-9 100 К-Ю 300 К-14 175 100

К-11 82 25 К-18 230-250 70 К-19 300 185

К-13 37 К-50 160 К-15 350

К-16 50 12 К-23 200 240 К-30 95 38

К-22 50 К-26 200 К-32 250 90

К-21 100 К-60 180 К-33 100 70

К-17 35 К-27 180 200 К-28 80

К-20 40 К-61 250 К-31 70

К-1 300 260 К-7 1500 350 К-29 110

к-з 240 150 К-8 240 120 Г1041 75 50

К-5 100 К-5 4 190 К-42 126 105

К-24 100 К-5 5 220 К-43 50 120

К-25 100 1,6 К-35 120 К-2 1100 150

колхицин 3,9 К-З 6 250 К-4 700

IV фуппа К-37 К-6 495

К-56 200 К-З 8 250 290 колхамин 56 30

К-57 75 К-47 150 105

К-58 96 К-48 1422 773

К-59 50 К-45 150 75

*Р<0,05.

В соответствие с химической модификацией изученные вещества были разделены на 4 группы (Таблица 2): I- аминопроизводные колхицина по С-кольцу, II- производные дезацетилколхицина с различными заместителями по ЫН2-грулпе В-кольца, III-

аминопроизводные колхамина по С-кольцу и их алкилированные аддукты по К-мет ильной группе В-кольца и 1У- комплексные соединения с металлами переходной группы V, Мл, Ре, Со, где в качестве лиганда использован К-18.

Все новые соединения обладают значительно сниженной токсичностью в 10-300 раз в сравнении с исходными алкалоидами. Установлена зависимость токсичности от химической структуры соединений, показано влияние замещений как в трополоновом, так и геитадиеновом кольце алкалоидов, а также влияние их парамагнитности. Как видно из Таблицы 2, токсические свойства веществ коррелируют со

свойствами оснований: увеличение этих свойств у аминопроизводных колхицина ведет к уменьшению их токсичности.

Антимитотическое действие колхицина известно, сохранение этого свойства необходимо для его производных как потенциальных противоопухолевых препаратов. Нами исследоватась митогическая активность алкалоидов в сравнении с новыми производными на криптах кишечника мышей в течении суток.

Значения миготического индекса (МИ) эпителия крипт кишечника в различные сроки после введения препаратов представлены в Таблице 3, из которой видно, что все производные колхицина и колхамина, за исключением К-22 вызывают увеличение митотического индекса уже через 1 час после введения (максимально в 3 раза по сравнению с контролем и в 1,5 раз - с колхицином). Затем количество митозов нарастало в течение 3 часов, достигало максимальных значений и сохранялась таковым или увеличивалось в течение 6 часов.

МИТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС ЭПИТЕЛИЯ КРИПТ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА (в %) ПРИ ВВЕДЕНИИ ЖИВОТНЫМ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА

____Таблица 3.

Шифр Время исследования, часы

1 3 6 12 18

К-9 12,16+0,17 22,07+0,49 21,0610,40 20,5410,36 3,9310,18

К-11 13,60+0,17 22,07+0,49 22,31+0,57 - 3,35+0,14

К.-13 12,10+0,08 17,1910,41 18,92+0,02 - 5,19+0,13

К-17 11,05+0,11 11,62+0,07 23,18+0.22 2,94+0,22

К-16 11,70±0,15 23,05+0,66 16,9110,31 - 9,5010,09

К-20 11,04±0,08 26,46+0,28 25,1810,87 - 7,62+0,12

К-1 7,39+0,17 20,96+0,55 18,0510,46 - -

К-3 7.89+0,18 22,13±0,31 21,0910,45 - -

К-5 8,30+0,11 19,65+0,31 19,62+0,18 - -

К-21 15,88±0,13 16,13+0,42 20,53+0,24 - 8,8610,21

К-22 5,86+0,11 5,93±0,08 4,71+0,07 - 5,27+0,03

К-24 6,62+0,27 20,76+0,28 7,76+0,03 - 7,6310,18

К-25 11,12+0,20 13,14+0,18 29,24+0,09 - 6,11+0,14

Колхицин 10,29+0,20 21,76±0,31 35,73+0.26 - -

К-2 7,69±0,18 20,26+0,32 25,71+0,45 - -

К-4 8,24±0,20 20,9110,16 8,94+0,50 - -

К-6 11,65+0,16 . ' 15,1610,35 12,9610,41 -

К-12 13,72±0,08 19,55±0,42 7,15+0,14 - 5,0910,27

К-19 10,07+0,18 23,24+0,46 38,92+0,33 - 5,5910,22

Колхамин 9,96+0,17 19,93+0,36 31,61+0,62 30,76+0,59 5,4510,37

К-10 14,25±0,15 15,13+0,31 6,4110,12 2,63+0,07 4,0410,14

К-54 13,04+0,48 24,06+0,04 17,19+0,33 - 10,5110,3

К-1 В 1 1,63+0,27 19,6810,13 27,6810,39 - 5,59+0,22

Контроль 5,54±0,08 5,56+0,30 6,3110,28 - 6,62+0,08 |

Таким образом, все новые аналоги трополоновых алкалоидов обладают статмокинетической активностью на криптах кишечника интактных животных, однако, несколько сниженной, чем у природных алкалоидов, что свидетельствует о меньшем поражающем действии новых соединений на эти активно пролиферирующие клетки.

При изучении цитотоксических и антимитотических свойств соединений на клетках рака поджелудочной железы человека (СаРа) наблюдалось увеличение митотического индекса опухолевой ткани после воздействия новыми производными (93-120%о), в то время как МИ колхицина был равен 80%о, а у интактных клеток МИ составил 52%о.

Статмокинетические свойства соединений были подтверждены на изучаемом штамме воздействием их на синтез ДНК по включению Н3-тимидина, суммарного количества нуклеиновых кислот и по содержанию белка. Отмечена меньшая цитотоксичность новых производных при их более значительном МИ в опухолевой культуре. Также новые соединения в большей концентрации, чем колхицин, вызывали получение 50%-ного клеточного эффекта по изменению содержания нуклеиновых кислот и белка.

Т.о. МИ новых производных на интактных клетках крипт кишечника несколько ниже, чем у колхицина и колхамина, а на опухолевых клетках - выше, что указывает на большую избирательность производных к опухолевым клеткам.

При оценке цитологического действия новых производных колхицина на клетках корешков АШит сера Ь., взятых в одинаковых концентрациях и при равном времени инкубации, учитывали количество клеток в определенной фазе митоза, степень плоидности и наличие дегенеративных повреждений в клетке. Эффект цитостатических препаратов на клетки меристемы лука подобен таковому на клетки человека и животных (Ап(о51е\у1г О., 1987), АШит-тест предлагается нами для использования в скрининге и первоначальном изучении потенциальных противоопухолевых препаратов с антимитотичсским действием.

В зависимости от введенного радикала, как показывают исследования, проведенные по АНшт-тесту, новые вещества могут: а) интенсивно ингибировать митозы, вызывать дегенерацию ядер, пикноз, б) тормозить деление клеток в мета- и профазе более чем на 80%; в) вызывать полиплоидию с дальнейшим ростом клеток. Таким образом, при первичном скрининге было показано, что возможно дальнейшее изучение новых соединений в качестве противоопухолевых, синхронизирующих и полиплоидных веществ.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОСТАТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА РАКОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ ЧЕЛОВЕКА (в Национальном институте рака США, NCI)

Цитостатическая активность 26 новых соединений изучалась в Национальном институте рака (NCI) США на панели из 60 линий опухолей человека, на которых соединения тестировались в 5 концентрациях при десятикратном разведении (от 10"4 до 10"8 М/л) при 48-часовой инкубации клеток с веществами, затем исследовался белок SRB для определения жизнеспособности клеток и их роста. Использовались субпанели лейкемии, немелкоклеточного рана легкого, рака кишечника, ДНС, меланомы, рака яичников, почки, предстательной и молочной желез. На рисунке 1, где представлены "кривые ответа на дозу", обусловливающие активность Дэкоцина при исследовании на каждом из перечисленных опухолевых штаммов, каждая кривая создана, исходя из % роста против loglO соответствующих концентраций для каждой клеточной линии. Кривые клеточных линий сгруппированы в субпанели. Горизонтальные линии соответствуют значениям: при +50 (50%-ное подавление роста клеточных линий - GL50), 0 (полное подавление роста - TGL), -50 (50%-ный лизис клеток -LCS0). Концентрации, соответствующие точкам, где кривые пересекают горизонтальные линии - это значения GL50, TGL и LC50 соответственно. Каждая концентрация выражается как log¡0 (молярная или г/мл).

Мы выражаем глубокую признательность NCI за проведенное тестирование наших соединений, а также проф. Сыркину А.Б. за содействие в организации этого исследования. Нами была проведена обработка полученных данных и эти результаты приводятся в качестве материалов, иллюстрирующих широту противоопухолевого действия новых полученных нами соединений.

Среди исследованных веществ были аминокислотные (К-1, К-2, К-4, К-5 и К-8) и изотиоурониевые производные (К-21), моно- и диоксиэтиламинные производные (К-18, К-19, К-26, К-44, К-41, К-30, К-50, К-60) колхицина и колхамина, среди которых были N-нитрозопроизводное (К-30) и два мочевинных аналога (К-50 и К-60). Также были изучены 12 хлорэтиламинных производных алкалоидов.

Получение среднего значения по данным опухолевого роста всех субпанелей в определенной концентрации (X) дает представление о влиянии препарата в данной концентрации на все изученные опухоли, это-индекс эффективности препарата, который характеризует широту действия каждого вещества. Далее, исходя из ЛД50 и молекулярной массы веществ, появляется возможность прогноза дальнейшего исследования этих веществ как в эксперименте, так и в клинике. Руководствуясь данными регрессионного анализа было подсчитано, что для аналогов колхицина МПД для мышей ниже или соответствует МПД для человека. Исходя из молекулярной массы новых соединений (400-700), доза 104

М/л составит 40-70 мг/кг, что зачастую выше их МПД, доза же 10"5 М/л будет равна 4-7 мг/кг, что, как правило, значительно ниже их МПД, и дает возможность при высокой активности веществ в этой дозе дать положительный прогноз для их дальнейшего применения.

Оксиэтиламинные производные колхицина и колхамина

Воздействию на всю панель из 60 штаммов Дэкоцина (К-18) отвечает I (суммарный индекс) 78 в дозе 10'4 М/л и 70 в дозе 10'5 М/л, что характеризует чувствительность всех линий к действию препарата на 78 и 70%. Наиболее чувствительными являются линии лейкемии, мелкоклеточного рака легкого и колоректального рака (рис. 1).

Для этой группы веществ, где соединение К-18 известно своим противоопухолевым действием на животных и проявляет высокую активность с 2=70-78 в двух дозах на всей панели человеческих опухолевых культур, можно предположить, что его аналоги, имеющие более высокий 2 (выше 70) также должны проявлять достаточно высокое противоопухолевое действие. Так, соединение К-50 оказывает более выраженное митозтормозящее действие, что и проявляется с его Е=80-73, по-видимому, в силу дополнительного воздействия мочевиной на микротрубочки АНиЬа Б., ВЬаКасЬагуа В., 1997/. Однако введение мочевины в К-26 с получением вещества К-60 не увеличивает противоопухолевой активности исходного соединения (К-26), по-видимому, из-за высокой активности исходного соединения. Нитрозирование же К-19 с получением К-30, увеличивает его противоопухолевую активность на лейкозной субпанели. Кроме того, его высокое цитостатическое действие проявляется в минимальной дозе - 10'7 М/л, что в сочетании с токсичностью диктует необходимость дальнейшего исследования этого соединения. В целом, оксиэтиламинные производные, за исключением К-44, проявляют высокий цитостатический и цитолитический эффект. Самыми активными веществами этой группы являются К-19, К-26, К-41 и К-50.

Хлорэгиламннныс производные колхицина и колхамина

Для группы колхициновых хлорэтиламинновых производных нужно отметить, что все соединения обладают значительной эффективностью в дозе 10"5 М/л, которая увеличивается в дозе 10'4 М/л, кроме К-23 и К-61, которые активны уже в дозе 10~6 М/л. К-33, К-27 и К-36 активны только в высокой дозе - 10~4 М/л. К-20 и К-29 в 2-3 раза снижают свое цитостатическое действие при 10-кратном разведении. Таким образом, наиболее интересными веществами из группы хлорэтиламинных производных для дальнейших исследований являются К-61, К-20 (для тех локализаций, где возможно контактное применение больших доз препарата), К-23, К-15 и К-38.

1,8

nuuuiiai ^ciisci xiisuiuic j^cvciupinciiiai iiicrapcuuca migrain Dose Response Curves.

Г

-j_

.... О.....

г

• ...4... 0«0«J .....о ..

u| ю et Uapb см1лм (mc4«)

Г

4—

— t

-i-

UtK Ы '—xСинлаа (X

»awS__i. " ~ ^ r^"

Рис. 1. Цитостатическое действие Дэкоцииа (К-18) на панели

МО ■

г

1Л' .

Хлорэтиламинные производные

um : _ .£-¿1 «"-23

~К-48

K-i9

К 27

К-3?

к-зз

К-36

К-42

К-45

1 %

ill 1 1

III 1 1

1 I

ЛДи, М2Д. 2SO &в> 35"о 4й> НО да 106 Z5~0 2SQ ЦО

Оксииилампнныс производные

120 100 80 GO 40 20 О

■ К-18

к-19 ИЯ

К-2'6 $

г-Ш

K-Ü

г!

К

К.-30 к-й)

ГШ г-р

щ

Мв>

¿SO ЗОО ZOO

TS

es

16Q

Аминокислотные и пзотиоуропнсвыс производные кл К~4 KS К-5* К-21

100

оо

со

40

20

0

1

и 1

30ö II

аЛО i ОС | СО

Рис. 2 Суммарная цитостатическая активность веществ (X), исследованных в NCI, расчшанная для концентраций 105 и 10"4 М/л и их ЛДя,

Аминокислотные и изотиоурониевое производиые колхицина и колхамина

Все исследуемые вещества проявляют высокую цитостатическую активность, начиная с дозы 10 6 М/л, а К-5 - с 10~8 М/л. Все соединения

оказывают выраженный цитостатическнй и цитолитический эффект (кроме К-1 в дозе 104 М/л). К-2 лизирует клетки о[1ухоли лейкемии как в дозе 105 М/л, так и 10"6 М/л. Исходя из соотношений индексов эффективности веществ по всей панели наиболее активными из этой серии являются К-2 (87-87), К-5 (88-93%), К-21 (80-90%) и К-8 (79-90%).

Таким образом из 26 исследованных в NC1 новых производных колхицина и колхамина отобраны 12 перспективных веществ для дальнейших исследований in vivo.

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА И КОЛХАМИНА in vivo И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ АСПЕКТОВ ИХ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ

Из результатов предварительного изучения противоопухолевой активности 15 новых производных колхицина и колхамина на 3-х опухолевых штаммах КСУ, С-45 и М-1 оказалось (Таблица 4), что вещества К-18, К-20, К-42, К-43 и К-48 проявляют более высокую активность (на 20-50%), чем колхицин на штаммах КСУ и С-45, соединения К-56 и К-57-оказалнсь более активны на штамме М-1, при этом К-18, К-42 и, особенно, К-48 отличаются как от колхицина, так и от колхамина резко сниженной токсичностью. К-20 и К-43 уступают в токсичности колхамину.

В дальнейшем более глубокому изучению противоопухолевой активности подвергались вещества К-18 (Дэкоцин), К-42 и К-48.

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ АНАЛОГОВ ТРОПОЛОНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ IN VIVO

_Таблица 4.

ЛДИ/МПД Противоопухолевая активность

Вещество мыши крысы КСУ С-45 М- 1

%тормож. ИЭ 9гтормож. ИЭ %тормож. ИЭ

К-1 310 40 260 34 20 1,25

К-3 240 22 250 25 30 1,42

К-13 37 5 29 4 39* 1,64 13* 1,15

К-14 175 100 8,5 52* 2,08 36 1,56

К-19 300 125 10 48* 1,92 49* 2,03

К-18 250 15-20 70 12 62* 2,63 54* 2,17 39* 1,35

К-18-хг 125 180 30 43* 1,75 32* 1,47

К-26-xr 200 240 25 36* 1,56 24* 1,32

К-16 50 2 12.5 2 60 2,50

К-20 40 2,85 12,5 2 63* 2,71 61* 2.56 34* 1,51

К-42 105 12-15 125 7,5 94* 16,67 74* 3,85

К-43 50 120 12 86* 7,17

К-48 1422 150 773 85 98* 50,30 61* 2,56

К-56-Fe 200 50 39* 1,61 63* 2,70

K-S7-VX), 75 15 44* 1,79 59* 2,43

Колхамин 56 30 37,5 3,5 47* 1,89 40* 1-67

Колхицин 3,9 0,4 1,6 0,3 46* 1,85 33* 1,49 37* 1,61

*р>0,05

Изучение противоопухолевой активности ' отобранных веществ Дэкоцина, К-42 и К-48 предварило исследование токсических доз этих соединений: ЛД|(1_50841 МПД при однократном и МПД при 10-кратном введении (Табл. 5). В случае многократного в/б введения Дэкоцина и К-42 в МПД у животных-опухоленосителей отмечалось снижение массы тела и селезенки, однако при этом наблюдался значительный противоопухолевый эффект. Соединение К-48 отличалось резко сниженной токсичностью, и даже в высоких его дозировках (700-800 мг/кг) общетоксические явления у животных исчезали уже через несколько часов. Бри многократном в/б введении К-48 в терапевтических дозах животным-опухоленосителям значительного снижения массы тела и селезенки не наблюдалось.

ТОКСИЧЕСКИЕ ДОЗЫ ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СРАВНЕНИИ С

КОЛХИЦИНОМ И КОЛХАМИНОМ (мг/кг)

_Таблица 5.

Вещество Мыши крысы

лдя МПД (однокр) МПД (10-крат) ЛД» МПД (однокр) МПД (10-крат)

Декоцин 230-250* 105,0* 15-20* 70,0* 30,0* 12,0*

К-42 126,0* 30,0* 12-15* 105,0* 20,0* 7,5*

К-48 1422,0* 800,0* 150,0* 773,0* 340,0* 85,0*

Колхицин 3,0^,9* 2,0* 0,4* 1,6* 1,0* 0,3*

Колхамин 56(42-75) 30,0* 2,0* 30,0* 20,0* 1,4*

*Р<0,05.

Противоопухолевая активность Дэкоцина изучена на спектре из 9 перевивных опухолевых штаммах, влияние этого соединения на рост перевивных опухолей животных было наиболее выраженным на РШМ-5 - 82,61% где при его применении в МПД наблюдалось 14% рассосавшихся опухолей (колхамин в МПД и циклофосфан в дозе 10 мг/кг не вызывали выраженного противоопухолевого эффекта), на АКЭ -СПЖ - 80%, на АКАТОЛе - 67%, на КСУ - 63%, на опухолях АКАТОНе и саркоме 45% торможения был соответственно 52 и 54% (Р<0,05). Карцинома Герена, саркома М-1 и саркома 180 слабо реагировали на воздействие Дэкоцина, однако его противоопухолевое действие превышало действие природных алкалоидов. Более высокий противоопухолевый эффект Дэкоцина в сочетание с меньшей токсичностью в сравнении с колхицином и колхамином позволяет считать его перспективным противоопухолевым препаратом (рис. 3). •

Противоопухолевая активность К-42 и К-48 была изучена на 6 перевивных опухолевых штаммах (рис.4). К-42 и К-48 на всех изученных штаммах проявили достоверный значительный противоопухолевый эффект во всех рассмотренных концентрациях, причем это сопровождалось рассасыванием некоторого количества опухолей. На КСУ эффект соединений составил для К-42 в МПД-96% торможения роста опухоли (30% рассосавшихся опухолей) и для К-48 - 97%. Однако

пШ-.ч

К.Ггрена

АКАТОл

1

С-180

1

АКЭ

Рисунок 3. Сравнительная противоопухолевая активность Дэкоцина и колхамина на спектре экспериментальных штаммов.

для К-48 наибольший процент рассосавшихся опухолей наблюдался при меньших дозах 45 и 65 мг/кг (33,3 и 16,7% соответственно).

На саркоме-45 более активным оказался К-42 (75% торможения роста опухоли, что достоверно сопоставимо с активностью циклофос-фана). У К-48 на С-45 показано 61% торможения роста опухоли, при этом у 11,1 % животных наблюдалась полная регрессия опухолей.

На штамме АКАТОН К-42 вызывал 97% торможения роста опухоли, (2/3 рассосавшихся опухолей), К-48-93%, колхамин на данном штамме проявил незначительный эффект (22% торможения роста опухоли). Циклофосфан подавлял рост опухоли на 62%.

На АКАТОЛе К-42 вызвал 86% торможение роста опухоли, при рассасывании 56% опухолей; для К-48 наблюдалось 85% торможение роста опухоли, при рассасывании 22% опухолей. Колхамин и циклофосфан были при этом менее активны (40% и 27% торможения роста опухоли).

На штамме РШМ-5 К-42 и К-48 подавляли рост опухоли на 84% и 71%, здесь было соответственно 17% и 33% рассосавшихся опухолей. Колхамин и циклофосфан на данном штамме проявили небольшой процент торможения опухолевого роста - 26,08 и 30,43% соответственно.

На штамме АКЭ К-42 в дозе 7,5 мг/кг проявил высокую активность: СПЖ равно 30,9 дней (120,71%) к контролю. СПЖ колхамина в этом опыте составила 27,86% к контролю.

Т.о. изучение токсических свойств соединений и противоопухолевой активности 15 новых производных позволило отобрать 3 новых препарата: менее токсичных, чем колхицин и колхамин, при более значительном противоопухолевом эффекте, который превышает активность колхицина и применяемого в онкологии колхамина иа 20-70%, а также в ряде случаев циклофосфана, использованного в качестве контроля.

LUL

П

u

Ш"

АКЛГ011

'-■T-^WH ]

В"

тг

.4МГОЛ

АКЭ

Рисунок 4. Сравнительная противоопухолевая активность К-42, К-48 и колхамина (% подавления роста и % рассосавшихся опухолей) на спектре экспериментальных штаммов.

Из нижеприведенной Табл.6 видно, что изученные нами соединения более эффективны на экспериментальных моделях по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами антимитотического и алкилирующего действия, что позволяет надеяться на большую широту их противоопухолевого действия в клинике, поскольку они обладают полифункциональным, сочетанным влиянием природного алкалоида на лейкозные модели (согласно данным NCI) и опухоли эпидермального происхождения, с влиянием на солидные опухоли, чувствительные к алкилирующим препаратам.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗВЕСТНЫХ ХЛОРЭТИЛАМИННЫХ ПРЕПАРАТОВ, КОЛХАМИНА И ВИНКРИСТИНА НОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ШТАММАХ

Таблица 6.

Вещество ЛД5№ иг/кг КСУ С-45 АКАТОЛ РШМ-5

мыши крысы

Допан 3 +++ +++ _ -

Циклофосфан 100 200 +++ ++ + +

Сарколизин 19-23 1 17-21 +++ +-Н- + +++

Фентирин 110 115 +++ ++ - +

Проспидин 400 400 ++ ++ ++ +

К-42 125 105 +++ ++ +++ +++

К-48 1420 700 +++ ++ +++ ++

Дэкоцин 250 70 ++ ++ ++ +++

Колхамин 56 30 + + + -

Винкристин 4 ++ - ++ ++

Противоопухолевая активность: (-) - менее 30%: (+) - от 30% до 50%; (++) -от 50% до 80%; (+++) - более 80%. (В Таблице 6 действие хлорэгиламинных препаратов и винкристина цитировано по Софьиной З.П. и др., 1980 /122/; Проценко Л.Д., Булкиной З.П., 1985 /111/, действие колхамина-по собственньш экспериментальным данным.)

Действие соединений К-42, К-48 и Дэкоцина (К-18) на синтез нуклеиновых кислот в опухолевых и костномозговых клетках

Важным моментом в изучении механизма противоопухолевого действия новых противоопухолевых соединений является их воздействие на синтетические процессы в нормальных и опухолевых клетках, особенно на синтез нуклеиновых кислот. В литературе представлены разноречивые данные относительно характера воздействия колхицина, колхамина и их производных на синтез нуклеиновых кислот и белка и зависимости эффекта от доз препаратов. С целью выяснения механизма противоопухолевого действия новых соединений изучено воздействие новых соединений на включение Н3-тимидина и Н'-уридииа в клетки костного мозга и опухоли РШМ-5 в сравнении с исходными алкалоидами в широком диапазоне концентраций (от 0,01 до 100 мкг/мл) и различном времени инкубирования (10 и 40 минут).

На рис. 5, где представлены данные этого эксперимента, заметно значительное влияние новых соединений на синтез ДНК и РНК, начиная уже с 10 минут инкубации, которое к 40 минутам усиливается.

1-Колхицнн, П-колхамин, III-К-42, IV-Дэкоцин, V-K-48. Концентрации, мкг/мл: 1-0,01, 2-0,10, 3-1,00, 4-10,00, 5-100,00 10 и 40 - время преннкубации веществ с клетками, минуты.

У| 10 минут

40 минут

Рисунок 5. Торможение веществами включения Н3-тимидина и Н3-уридина в клетки костного мозга (а,б) и в клетки РШМ-5 (в,г).

Установлено, что К-42 и К-48 ингибируют синтез ДНК и РНК в опухолевых клетках в большей степени, чем в клетках костного мозга; при этом подтверждается их избирательность по отношению к опухолевым клеткам, так как их 50%-ная цигостатическая доза на клетках костного мозга в 3 (К-42) и 20 (К-48) раз превышает 50%-ную противоопухолевую дозу. Дэкоцин же в одинаковой степени подавляет синтез НК как в клетках костного мозга, так и в опухолевых. Однако для всех трех соединений важным является факт, что, наряду со снижением токсичности, их цитостатические свойства в отношении опухолевых клеток возрастают.

Цитогенетический анализ исследуемых соединений свидетельствуют о том, что соединения К-42 и К-48 в терапевтической дозе (ТД) не проявляют мутагенных свойств в отношении клеток костного мозга, свойственных как для алкилирующих, так и антимитотических соединений, которые вызывают различные хромосомные аберрации, к-митозы и полиплоидию. Это можно объяснить как резким снижением их общетоксического действия, так и более мягким воздействием на синтез нуклеиновых кислот в клетках костного мозга по сравнению с колхицином. Воздействие Дэкоцина на клетки костного мозга сопровождается более выраженной полиплоидией и более энергичным повреждением активно пролиферирующих клеток, свойственных для тубулининтерактивных реагентов. Это обстоятельство послужило еще одним аргументом при выборе лекарственной формы Дэкоцина для наружного применения.

Известно, что, как правило, многократное введение противоопухолевого препарата в ТД вызывает значительную или полную иммунодепрессию. В этой связи изучение иммуномодулируюмего действия на животных-опухоленосителях 3-х новых соединений (после 8-кратного внутрибрюшинного введения) и колхамина в качестве контроля в ТД показало, что Дэкоцин и К-42 почти вдвое снижают показатель численности АОК (8.500-Дэкоцин; 7.300 -К-42; 15.000 -контроль) по сравнению с контрольной группой с одновременным угнетением веса селезенки и количества спленоцитов. К-48, напротив, повышает количество АОК у опухоленосителей (20.000 АОК на селезенку) и значительно увеличивает вес селезенки и численность спленоцитов по сравнению с другими рассмотренными веществами. Колхамин, одновременно снижает количество АОК (10.000 - колхамин) и спленоцитов (80 106 - колхамин; 120-106 - контроль), что говорит о его большем токсическом действии по сравнению с новыми соединениями.

В связи с этим важно то, что наряду с высоким противоопухолевым эффектом, после 8-кратного применения К-48 в ТД, он обладает стимулирующим действием на иммунный статус животных-опухоленосителей.

При изучении антнокиелнтельной__активности соединений в

системе аскорбат-индуцируемого перекисного окисления липидов обнаружено, что К-42 и Дэкоцин в изученном диапазоне доз является прооксидантом, К-48, проявляет свойства антиоксиданта. Возможно, что антиокислительная активность изученных, соединений коррелирует с их иммуномодулирутошими способностями.

При изучении действия соединений на репарацшо хтврловых гемопоэтических клеток оказалось, что наибольшей стимулирующей активностью на выход КОЕс наряду с колхицином, обладает К-48, причем в широком диапазоне концентраций. Вероятно, данные вещества способствуют дифференцировке КОЕс из незрелых предшественников и являются индукторами колониеегамулирующего фактора на одном из этапов дифференцировки стволовых кроветворных клеток. К-48 может стать веществом, способным восстанавливать организм с угнетенным кроветворением после химио- и радиотерапии, причем его применение для этих целей возможно в минимальных дозах, не вызывающих токсических проявлений (1,0 мг/кг).

СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ДЭКОЦИНА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ

Сочетание противоопухолевых и токсических свойств Дэкоцина свидетельствовало о возможности продолжения его исследования в клинике. Применение его в виде мази дает возможность создать эффективную концентрацию препарата в опухоли, без проявления побочных эффектов.

Известная 0,5% колхаминовая (омаиновая) мазь, применяемая для лечения рака кожи, была аналогом для создания мазевой лекарственной формы Дэкоцина. Исследовались различные концентрации препарата, оптимальной оказалась 2-%-ная концентрация мази. В качестве основы для приготовления мази Дэкоцина были выбраны 2 основы: эмульгатор Т-2 (I) и вазелиново-ланолнновая (9:1)(И). Ввели в состав мази Дэкоцина необходимое количество анестезина, которое составило по отношению в Дэкоцину 5:2. Согласно методам качественной и количественной оценки мази, биофармацевтическим исследованиям и исследованиям качества субстанции при длительном хранении были определены оптимальные прописи для мазевых лекарственных форм синтетического аналога колхицина. Были созданы ФС (фармакопейные статьи) для Дэкоцнна-стандарта, Дэкоцина-субстанция, затем для Дэкоцина-мази (I и II) в соотвествие с требованиями ГФХ1, а также с новыми положениями Фармкомитега РУз.

Изучение_хронической токсичности Дэкошша в виде мази

проводили при накожном нанесении крысам в 3-х дозах: 2%-ной (предлагаемой для применения в клинике), 10% и 20% (т.е.5 и 10-кратное превышение этой дозы) мази. Проводили 60-дневное смазывание

поврежденной и неповрежденной кожи у животных, и последующее наблюдение в течение 30 дней. Показано, что длительное применение препарата в концентрации 2% мази хорошо переносится подопытными животными на протяжении всего эксперимента. Все подопытные крысы этой группы не отличались от контрольных по внешнему виду, общему состоянию, поведению, рефлекторной возбудимости, употреблению корма и воды, приросту массы тела, выделению кала и мочи, а также по морфологическим и биохимическим показателям крови. Состояние кожи в месте нанесения мази и волосяного покрова оставались без видимых изменений.

При применении 10% мази Дэкоцина через 4-5 дней после начала эксперимента на месте смазывания отмечен раздражающий эффект, степень которого усиливалась с дальнейшим применением препарата в течение 15-20 дней. В последующие дни применения препарата раздражающее действие вещества постоянно снижалось, а к концу эксперимента состояние кожных покровов практически не отличалось от такового у контрольных животных. Со стороны гематологических показателей периферической крови отмечено повышение количества лейкоцитов. Гибели подопытных животных в процессе эксперимента не отмечалось.

20% мазь оказалась близкой к полулетальной дозе, через 3 дня у всех животных отмечено раздражение кожи, в дальнейшем - воспаление, нагноение, облысение. Через 1 неделю- резкое и прогрессирующее снижение массы тела, диарея, снижение двигательной активности. На 2-3 неделе после начала опыта часть подопытных животных погибла. В дальнейшем гибели животных не отмечалось, масса тела постоянно прибавлялась, раздражение и воспалительный процесс кожи значительно снизились, а к концу эксперимента состояние кожи в месте нанесения препарата существенно не отличалось от контрольной группы. Со стороны картины периферической крови выявлено снижение количества лейкоцитов, гемоглобина и эритроцитов.

Результаты макроскопического исследования показали, что органы у большинства опытных крыс по форме, величине, цвету и консистенции не отличаются от контроля. В единичных случаях, при смазывании 10% мазыо и у половины крыс, обработанных 20% концентрацией наблюдалось отчетливое увеличение массы надпочечников и снижение массы лимфосодержат,их органов - тимуса и селезенки.

ИЗУЧЕНИЕ РАДИОМОДИФИЦИРУЮЩЕЙ И ПОЛИПЛОИДНОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА

Изучение радиосенсибилизирующего действия 32-х новых веществ, которые получены на основе высокотоксичных колхицина и колхамина, обладающих собственной небольшой радиосснсибилизирующей активностью (ФИД 0,90-0,95), показало, что большинство соединений обладает радиосенсибилизирующим действием, ускоряя радиационную

гибель животных, подобно колхицину. Колхицин и колхамин снижают величину среднелетальной дозы на 80-90 р. Среди изученных веществ 6 соединений (К-5, К-17, К-21, К-24, К-18 и К-19) оказались с более выраженной радиосенсибилнзирующей активностью (ФИД 0,70-0,85), которые снижают величину среднелетальной дозы на 200-250 р, причем два - К-19 и К-18 с благоприятным сочетанием сниженной токсичности и выраженнного противоопухолевого эффекта, что предполагает возможность их использования в сочетании с облучением.

При анализе зависимости биологических и физических свойств новых веществ отмечена также корреляция радиосенсибилнзирующей активности с интенсивностью сигналов ЭПР. Новые вещества фличшотся от колхицина наличием парамагнитности. Для сравнения интенсивности сигналов образцы веществ брались с точными навесками и спектры регистрировали в одинаковых условиях. Все полученные спектры ЭПР представлены сигналами в виде уширенных синглетов с величиной g-фактора 2,003-2,002, однако интенсивность сигнала была различной и увеличивалась в ряду колхициновых производных К-1<К-19<К-18<К-17, коррелируя с их радиосенсибилизирующими свойствами.

Так как колхицин не парамагнитен, но обладает радиосенсибилизирующим действием, основа его влияния статмокинетический эффект. В случае же аналогов колхицина, также обладающих статмокинетическим эффектом, эффект их поражающего влияния, возможно, усиливается за счет их парамагнитных свойств, что способствует увеличению последующего действия излучения. Уменьшение же токсичности новых веществ позволяет использовать большие дозы веществ, что также ведет к их более выраженному действию.

При помощи колхицина получено большое количество полиплоидных форм растении. При изучении полиплоидной активности новых дериватов выявлен ряд более эффективных и менее токсичных соединений, чем колхицин, для селекции растений, вызывающих в 2-4 раза большее, чем при обработке теми же концентрациями колхицина, получение полиплоидных форм растений. Наибольшим эффектом обладают вещества К-52-55, особенно последнее в концентрации 0,05% -из 43 полученных растений 27 (63%) полиплоидные, причем при этом образовались не только тетра-, но и октаплоидные формы.

Изучение парамагнитных свойств этих соединений методом ЭПР показало, что в зависимости от характера заместителя изменяются как магнитные параметры, так и вид сигналов ЭПР, интенсивность сигнала коррелирует с способностью веществ вызывать полиплоидию.

ВЫВОДЫ

1. Разработано новое направление в химии алкалоидов колхицина и колхамина - получение полифункциональных соединений парным введением в молекулы алкалоидов цитостатических групп, а также усилением их основности. Активность этих веществ свидетельствует о

заметном вкладе введенных алкилирующйх групп в общий цитостатический эффект митозтормозящих соединений.

2. Разработаны методы их синтеза и выделения. Изучены структуры полученных производных методами УФ-, ИК-, ПМР-, ЭПР- и масс-спектроскопии, показано образование парамагнитных соединений.

3. Все новые соединения обладают в 10-300 раз сниженной токсичностью в сравнении с исходными алкалоидами и выраженной митотической активностью, которая достоверно выше у новых соединений, чем у колхицина, на опухолевых клетках (Сара), тогда как на активно пролиферирующих клетках кишечника интактных животных новые соединения обладают сниженными статмокинетическими свойствами, в сравнении с исходными алкалоидами, что указывает на большую избирательность новых веществ к опухолевым клеткам. Выявлена зависимость между токсичностью, митотической активностью и химической структурой новых соединений. Установлено, что на снижение токсичности оказывает влияние замещения как в трополоновом, так и гептадиеновом кольце алкалоидов, а также появление парамашитности.

4. Предложен быстрый и эффективный цитологический метод первичного скрининга производных митозтормозящих алкалоидов на растительных клетках, который позволяет отобрать вещества по их фазоспецифическому действию. На основе этого метода в зависимости от введенного радикала были отобраны активные противоопухолевые вещества, синхронизаторы деления, а также вещества, вызывающие полиплоидию.

5. У 12 новых синтезированных соединений обнаружена высокая противоопухолевая активность на 60 человеческих раковых клеточных линиях, что позволят прогнозировать их высокую активность в эксперименте in vivo, а также, в последующем, находить локализации, поддающиеся воздействию этих препаратов, в клинике.

In vivo из ряда новых производных алкалоидов на 3-х опухолевых штаммах отобраны наиболее перспективные вещества (Дэкоцин, К-42 и К-48), исследование которых на широком спектре перевивных опухолей показало их высокую противоопухолевую активность, значительно превышающую активность исходных алкалоидов, а также по действию на некоторые опухоли эфффект циклофосфана.

6. Наиболее активные соединения (Дэкоцин, К-42 и К-48) обладают алкилирующим действием, т.е. способностью к ингабированию синтеза ДНК и РНК в опухолевых клетках, при этом подтверждается избирательность соединений К-42 и К-48 к опухолевым клеткам в сравнении с клетками костного мозга, так как их 50%-ная цитостатическая доза на клетках костного мозга намного превышает 50%-ную противоопухолевую дозу, что подтверждает цитогенетический анализ клеток костного мозга после применения их в терапевтических дозах, который показал, что они не проявляют мутагенных свойств, свойственных для алкилирующих соединений. Дэкоцин несколько

отличается по своему действию от этих соединений: он в одинаковой степени подавляет синтез ПК как в клетках костного мозга, так и в опухолевых, его воздействие вызывает различные хромосомные аберрации в клетках костного мозга. Однако для всех трех соединений важным является факт, что, наряду со снижением токсичности, их цитостатические свойства в отношении опухолевых клеток возрастают.

7. Дэкоцин и К-42 после 8-10 введений в терапевтической дозе оказывают на иммунитет супрессорное действие, К-48 - стимулирует иммунитет, что коррелирует с их прои антиоксидантной активностью.

8. Изучение радиомодифицируклцей активности новых соединений позволило отобрать б веществ с более выраженной радиосенсибилизирующей активностью, из которых два соединения (К-19 и К-18) сочетают значительную радиосенсибилизирующую и противоопухолевую активность со сниженной токсичностью.

9. Разработаны 2 лекарственные формы на основе Дэкоцина в виде 2% мази с разными основами: с эмульгатором Т-2 (I) и вазелиново-ланолииовой (II). В результате исследования хронической токсичности Дэкоцина в виде 2% мази Дзкоцин-1, установлено, что она хорошо переносится животными обоего пола при длительном накожном применении и не оказывает токсического действия на функции жизненно важных органов и систем, что позволяет рекомендовать препарат для клинических испытаний. Разработаны ВФС для Дэкоцина в виде этих лекарственных форм и представлены в Фармкомитет РУз для апробации.

10. Высокая противоопухолевая активность, широта действия и низкая токсичность новых противоопухолевых соединений К-42 и К-48 и радиосенсибилизирующая активность соединений К-19 и К-18, позволяет предложить их в качестве перспективных лекарственных средств для дальнейших клинических испытаний.

Список основных научных трудов по теме диссертации Научные статьи

1. Еникеева З.М., Голощапова Ж.А., Тужилкова Т.Н. Токсические, антимитотические и радиомодифицирующие свойства производных колхицина. "Научно-техн. прогресс в биологии и медицине", Киев, 1985, с.414-440 (ДСП).

2. Еникеева З.М., Бегишева А.И., Тыщснко A.A. К вопросу радиосенсибилизирующего действия колхицина и его аналогов. В кн."Лучевое поражение и его модификация", Москва, 1985, с.66-69.

3. Еникеева З.М., Алимов P.A., Миралимов М.М. Создание и испытание предварительно отобранных в эксперименте противоопухолевых препаратов. Химиотерапия опухолей в СССР, 1986 г, N45, с.83-86 (ДСП).

4. Еникеева З.М., Нуманов М.И., Муминова М. Стимулирование фены тутового шелкопряда производными колхицина. Шелк, 1992, №5, с. 10-11.

5. Малицкая Е.И., Еникеева З.М., Айтходжина Н. Действие колхамина и его производных на перекисное окисление липидов микросом печени белых мышей. Доклады Каз. АН, 1996, №1, с. 28-31.

6. Еникеева З.М., Муфтахов А.Г. Комплексные соединения на основе производного колхицина. Химия природных соединений, 1996, №5, с.728-730.

7. Юсупов М.К., Юсупов Р.М., Еникеева З.М. Нахождение ареалов распространения колхицинсодержащих растений Merendcra robusta в Узбекистане. Кимё ва фармация, 1995, N4-5, с.17.

8. Еникеева З.М. Султанова Д.Ш., Алиев Д.М., Миралимов М.М. Качественное и количественное определение Дэкоцина. Кимё ва фармация, 1997, №1, с. 7-11.

9. Еникеева З.М., Султанова Д.Ш., Татарский В.П., Миралимов М.М. Технология исследования мази с Дэкоцином. Кимё ва фармация, 1997, №1, с.29-32.

10. Еникеева З.М., Баленков О.Ю., Султанова Д.Ш., Муратходжаев Н.К. О противоопухолевой активности новых аналогов трополоновых алкалоидов. Узбекский биологический журнал. 1997, №3, с. 64-65.

11. Баленков О.Ю, Еникеева З.М., Александров В.А., Муратходжаев Н.К. Влияние на ДНК-РНК- синтетазную активность в опухолевых клетках костного мозга новых аналогов трополоновых алкалоидов. Доклады АН РУз, 1997, №4, с. 118-119.

12. Баленков О.Ю., Султанова Д.Ш., Татарский В.П., Карибян Е.Э., Еникеева З.М. Синтез и исследование координационного соединения ацетилацетоната меди с колхамином. Химия природных сосдинеиий, спец.вып., 1997, с. 118-119.

13. Баленков О.Ю, Еникеева З.М., Александров В.А., Касымов Ш.К. О механизме цитологического действия новых аналогов колхицина и колхамина. Узбекский биологический журнал, 1997, №6, с.68-71

14. Еникеева З.М., Баленков О.Ю., Султанова Д.Ш., Фузаилова Т.М. Фармакологическое действие препарата Дэкоцина. Сообщение 1. Кимё ва фармация, 1998, №1, с.43-46.

15. Еникеева З.М., Голощапова Ж.А. Токсические и антимитотические свойства ряда производных колхицина. Химия природных соединений, 1998, N3, с.381-383.

16. Еникеева З.М., Баленков О.Ю. Влияние алкалоидов колхицина и колхамина на РНК-ДНК синтетазную активность. Химия природных соединений, спец.выпуск, 1998, с. 129-131.

17. Еникеева З.М. Этилениминное, окси-и хлорэтиламинные производные Колхицина и их биологическая активность. Химия природных соединений, 1998, №6, с. 782-789.

18. Еникеева З.М., Баленков О.Ю., Султанова Д.III. Изучение влияния новых производных колхицина и колхамина на численность

эндогенных колониеобразующих единиц в селезенке. Химия природных соединений, спец.выпуск, 1999, с. 160-162.

19. Еникеева З.М., Бапенков О.Ю., Султанова Д.Ш., Ибрагимов A.A. Избирательность взаимодействия новых производных колхицина и колхамина со специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК. Химия природных соединений, спец.выпуск., 1999, с. 162-164.

20. Гильдеева М.С., Еникеева З.М., Баленков О.Ю., Султанова Д.Ш. Исследование цитогенетического действия новых производных колхицина и колхамина. Химия природных соединений, спец.выпуск., 1999, с. 155-157.

21. Еникеева З.М., Огурцов К.С., Юсупов P.M. Изучение полиплоидной активности у некоторых производных колхицина. Химия природных соединений, 1999 г., №3, с.402-404.

Патенты

1. Еникеева З.М., Муратходжаев Н.К. Производное колхицина, обладающее противоопухолевым, ■ радиомодифицирующим и антимнтотическим действием. Патент РУ № 4348 14 от 23.11.1995 г.

2. Еникеева З.М., Муфтахов А.Г. Новое комплексное соединение производного колхицина, обладающее противоопухолевой активностью. Патент РУ НДР № 4844 от 24.11.1997 г.

3. Еникеева З.М. Способ получения аминопроизводных колхицина из колхицеина. Патент РУ НДР 9700768.1 от 29.09.1997 г.

Авторские свидетельства

1. Еникеева З.М., Бегишева, А.И Голощапова, Ж.А Тужилкова Т.Н. Производное колхамина, обладающее радиосенсибилизирующим и антимитотнческим действием. Авт. св-во СССР № 926904, 1982 г. (ДСП).

2. Еникеева З.М., Бегишева А.И., Голощапова Ж.А., Отрощенко О.С., Тужилкова Т.Н., Алимов P.A., Фузаилова Т.М. Хлоргидрат 10-дезметокси-10 (N-ди-хлорэтиламино) колхицина,обладающий радиосенсибилизирующим, антимитотнческим и противоопухолевыми свойствами Авт.св-во СССР No 875785 от 22.6 1981г. (ДСП).

3. Еникеева З.М., Бегишева А.И, Голощапова Ж.А, Тужилкова Т.Н. Дихлоргидрат Ю-дезметокси-аминоэтилтиоуроний колхицина, обладающий радиосенсибилизирующим и антимитотнческим действием. Авт.св-во СССР No 1243316, 8.3.1986г. (ДСП)

4. Еникеева З.М., Бегишева А.И., Огурцов К.С., Гатнн Ф.Г. 10-дезметокси-10-ами!Ю-7-К-дезацетил-К-(2-окс1шропил)колхицина, вызывающий полиплоидию у растений. Авт.св-во СССР №.1329122, 8.4. 1987 г. (ДСП).

5. Еникеева З.М., .Муминова М., Нуманов М.И. Способ прединкубационной обработки грены тутового шелкопряда. Авт. св-во СССР Nol561931 от 8.1.1990 г.

6. Еникеева З.М., Кузнецова Н.Н., Димант И.Н., Бегишева А.И., Султанова Д.Ш. 10-дезметокси- 10-Ы,Н,-бис(2-гидроксиэтил)-амино-7-(^ дезацетил) колхицин, обладающий цитостатическим действием на клетки рака поджелудочной железы человека и антимитотическим эффектом. Авт. св-во СССР №.1764289 от 22.5. 1992 г. (ДСП).

Тезисы докладов

1. Еникеева З.М., Тыщенко А.А. Роль КПЗ в механизме взаимодействия колхицина с аминами. "Комплексы с переносом заряда и ионрадикальные соли" Матер. Y Всесоюз. сов. (КОМИС-5), окт. 1981 г. г.Черноголовка.

2. Enikeeva Z.M., Sultanova D., Ogurtsov К., Tatarsky V. The influence of new paramagnetic colchicine analogues on the plants poliploide activity. 8th Conference of young scien tists on organic and bioorganic chem. Riga, 1991.

3. Еникеева 3.M., Баленков О.Ю., Димант И.Н. Характер цитологического действия новых аналогов колхицина в ALLIUM- тесте. Сб. трудов 1-го съезда онкологов Узбекистана с международным участием, Ташкент, нояб. 1994. т.4, с.17-18.

4. Еникеева З.М., Голощапова Ж.А., Тыщенко А.А. Изучение радиосенсибилизирующих свойств новых колхициновых аналогов. Сб. трудов 1-го съезда онкологов Узбекистана с международным участием, Ташкент, ноябрь, 1994. т.4 с. 18-20.

5. Еникеева З.М., Баленков О.Ю., Султанова Д.Ш., Фузаилова Т.М. Изучение нового противоопухолевого препарата Дэкоцин. Сб. тезисов I съезда онкологов СНГ, окт. 1996 г. Москва.

6. Еникеева З.М., Малицкая Е.И. Айтходжина Н. Действие колхамина и его производных на перекисное окисление липидов. Симпозиум "Медиц. и охрана здоровья", Тюмен. мед. акад. 1997 г., г.Тюмень.

7. Enikeeva Z.M., Rejepov J. Investigation of chronic toxicity of perspective anticerogenic preparetion Decocin. Abstracts Third International Symposium on the chtmistri of natural compounds. 19-22 october 1998, Bukhara-Uzbekistan, p. 104.

8. Enikeeva Z.M., Balenkov O.U. Antitumour effect of the new chlorethylamine analogues of colchicine and colchamine. Abstracts Third International Symposium on the chtmistri of natural compounds. 19-22 october 1998, Bukhara-Uzbekistan, p. 114.

КОЛХИЦИН ВА КОЛХАМИН ЯНГИ ТУРЛАРИНИНГ УСМлГА КДРШИ АКТИВЛИГИ ВА БОШК£ БИОЛОГИК ХУСУСИЯТЛАРИ

ЕНИКЕЕВА Зульфня Махмудовна

Ушбу :ш1яа мигозтормозловчи эффектини алкнлловчи ва (ёки) бошка таъсир механизм» билан богланган полифункционал трополон алкалоидларининг олиниши, баъзи структура ва активлиги уртасидаш богаиклик конуниягларига таъриф берилди.

Цитологик таъсири буйича юборилган радикалга кура булинши ингибиторлари ажратилди - потенциал усмага карши моддалар, булиниш синхронизаторлари, шунингдек полиплоидия чакирувчи моддалар.

Барча бошка янги бирикмалар деярли паст токсикликка эга булиб, сезирларли усмага карши эффектга эга. Урганилаётган 26 та янги колхицин алкалоиди турларини АКЦ1 даги Миллий рак инетитутида 60 та одам рак х,ужайрасида урганилганда уларнинг юкори антибластома (цитотоксик ва цитолитик) активлиги аникланди.

Кдйта змлангаи усма штаммпарининг кенг спектрида энг долзарб моддалар (Дэкоцин, К-42 ва К-48) урганилганда уларнинг юкори усмага карши активлиги аникланди, бунда у 20-70% га бошлангич алкалоиддар, шунингдек баъзи доллар да циклофосфан активлигидан юкори эканлиги аникланди.

Янги бирикмаларнинг усмага карши активлиги механизмларини урганишда, уларнинг усмага хужайраларига статмокинетик таъсирига эга эканлиги курсатилди, бу суяк кумиги хужайралари билан солиштирилганда уларнинг усма хужайратари ДНК ва РНК синтезига интенсив ингибицияловчи эффекта билан тасднкланди, бундо, колхицин ва колхаминда тескари суръат кузатилди.

Дэкоцин ва К-42 - пероксидант булиб, иммунитетга сунрессор таъсир этади, К-48 эса - антиоксияант булиб, юкори усмага карши активлигиндан ташкари, х,айвои-усматашувчилар иммунитетами стимуллайди. Бунда К-42 ва К-48 суяк кумиги хужайраларига нисбатан мутаген хусусиятига эга эмас, Дэкоцин эса турли хромосома абберацияларшш чаклради.

Дэкоциннинг доривор шакли ишлаб чикилди, унинг сурункали токснклига урганилди. Узок вак,т тери устига таъсир этилганда \айвонлар томонидан яхши кутарилди ва хаётий мухим аъзо ва тизимларга токсик таъсир этмади, бу уни клиник синов учун тар,спя этилишига асос булади. Излаётган янги бнрикмаларни радиомодификация активлигига текширилганда, юкори радиосенсибилизацияловчи активликка эга булган 6 та турн ажратиб олинди, янги дериватларнинг полиплоидизияловчи активлипши урганиш катор бошка колхицинга нисбатан янада активрок булган, усимликлар селекиияси учун бирикмалар аникланди.

ANTITUMOR ACTIVITY AND ADDITIONAL BIOLOGICAL PROPERTIES OF NEW DERIVATES OF COLCHICINE AND COLCHAMINE

ENIKEEVA Zulfia Marhmudovna

The present study focused on a development of a new class of polyfunctional tropolone alcaloides possessing both mytos downregulation and alkylating activities. Their extra mechanism is provided by ability of included functiohal compartments. Several particularities of relationship between structure and functions were found.

On a basis of cytological activity and type of inserted radicals we made selection of cell division inhibitors: potential antitumor compounds which are sinchronisators of the division and polyploid-induced agents. All of them have significally reduced toxity. Some ones bear enhanced antitumor activity.

26 agents were tested in staadart panels of 60 human tumor cell strains in the National Cancer Institute (USA). High antitumor activity, in good part, was found. A comprehansive study of more power compounds in vivo in animals bearing tumor revealed antitumor activity which was found to be in 20-70% higher than their preceders as well as cyclophosphan.

The study of mechanism of antitumor activity revealed enhanced statmokinetic facilities on tumor cells. This fact was confirmed by higher inhibition function on nuclear acids synthesis in compared with bone marrow cells. Interestingly, this fact appeared to be conversed in a case of colchicine and colchamine. Decocine and K-42 being prooxidants exert depressive influence on immune status. Agent K-48 is antioxidant and possesses both antitumor and immune-induced activity. Moreever agents K-42 and K-48 don't have mutagenic influence on bone marrow cells but action of Decocine leads to chromosome abberations.

We developed a medical composition of Decocine and its long term toxity was studied. A skin application of this drug doesn't resulted in toxic action in normal function of important organs and systems of animals. Taking together the above we recommended it for clinic trials.

The studies of a radiomodificating and polyploid activities of new compounds allows us to select six ones with higher radiosensibilisating facility and others for plant selection investigations.