Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Противоишемическая защита печеночного трансплантата с помощью липина - водорастворимого препарата липидной природы

На правах рукописи

ШАГИДУЛИН Мурат Юнусович

ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКАЯ ЗАЩИТА ПЕЧЕНОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА С ПОМОЩЬЮ ЛИПИНА - ВОДОРАСТВОРИМОГО ПРЕПАРАТА ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ

(экспериментальное исследование)

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы 14.00.16 - Патологическая физиология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ Научно-Исследовательском Институте трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: академик РАН и РАМН доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: НИИ Физико-химической медицины МЗ РФ

Защита состоится "28" марта 2005 г.

В 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.055.01. При ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ По адресу: 123182, Москва, ул.Щукинская, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ

Автореферат разослан "_" Февраля 2005г.

Валерий Иванович Шумаков Нина Андреевна Онищенко

Леонид Ильич Винницкий Игорь Михайлович Ильинский

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.055.01 доктор медицинских наук, профессор

Ольга Павловна Шевченко

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Смертность от острой печеночной недостаточности (ПН) достигает 70-80 % и даже 90 %. Хроническая ПН занимает 8 место среди причин временной нетрудоспособности и 7 место среди причин первичного выхода на инвалидность [Тарабарко Н.В. 1997]. Известно, что средний срок жизни при первичном билиарном циррозе не превышает 5,5 лет от времени установления диагноза, а смертность при хронически активном гепатите составляет более 50 % в течение 6 лет от момента постановки диагноза; первичный склерозирующий холангит ведет к смерти в течение 5-7 лет. Высокая смертность и недостаточная эффективность существующих терапевтических методов лечения предопределили тот факт, что в последние 20-25 лет при необратимых поражениях печени стали осуществлять полную замену этого органа, путем трансплантации донорской печени. Резкое расширение списка заболеваний, при которых показано выполнение трансплантации печени, обусловило дальнейшее развитие гепатотрансплантологии, а также предопределило медицинскую и социально-экономическую значимость этого вида операций. В результате число пересадок печени в развитых странах мира стало из года в год увеличиваться. По данным международного регистрационного центра к концу 1992 г. в мире было выполнено 19268 трансплантаций печени, к началу 1995 г. уже выполнено 32000 пересадок, а за период с 1990 по 2000 г. - 86379, а в 2002 г. только за 1 год выполнено более 11500 трансплантаций трупной печени. [Dousset 1992, International figures on organ donation and transplantation 2000]. Существенно улучшились результаты этих операций, особенно в 80-90 годы прошлого столетия, благодаря разработке новых типов консервирующих растворов, созданию и использованию новых эффективных иммуносупресантов, а также разработке новых схем иммуносупрессии. В результате годичная выживаемость печеночных трансплантатов превышает 80% [Тарабарко Н.В. 1997].

Полагают, что важнейшим фактором, определяющим успех пересадки печени, является использование для трансплантации исходно полноценного донорского органа [Beizer F.O. 1988, Blankenstein J.DJ991. Gubematis G., 1989 Jamiesson N.V.

РОС. • ' • - ^я

r •• ■ \

__

1987]. Между тем после воздействия гипоксии в организме донора, операционной травмы на этапе изъятия и трансплантации, а также воздействия холодовой ишемии на этапе консервации и транспортировки - донорская печень часто оказывается не в состоянии адекватно и немедленно функционировать после трансплантации. Наличие неблагоприятного функционально-метаболического фона в организме реципиента лишь усугубляет опасность пересадки первично ^функционирующего трансплантата.

Отсутствие достоверных экспресс методов, позволяющих объективно оценить функциональное состояние печеночного трансплантата до пересадки, вынуждает хирургов жестко ограничивать круг потенциальных доноров, совершенствовать технику изъятия органов и преднамеренно сокращать сроки консервации. Такие вынужденные меры еще больше обостряют существующую повсеместно нехватку донорских органов. В результате до 50 % потенциальных реципиентов умирают, не дождавшись подходящего донорского органа [Шумаков В.И. 1994].

Изложенные обстоятельства обусловили необходимость продолжения поиска путей и методов повышения противоишемической резистентности донорской печени на этапе ее консервации, так и в реперфузионном периоде [Beizer F.О. 1993, Jamieson 1993, Bilzer М. 2000, Clavien P.A. 2000].

В работах, специально посвященных проблеме противоишемической защиты трансплантата [Онищенко H.A. 1987, Шумаков В.И. 1998], отмечается, что одним из ведущих патогенетических механизмов ишемического повреждения органов -является активация процессов перекисного окисления липидов клеточных мембран. Между тем, отсутствие водорастворимых медикаментозных препаратов липидной природы с антиоксидантным механизмом действия долгое время тормозило исследования по использованию таких препаратов для повышения качества противоишемической защиты трансплантатов.

Отсутствие данных о целесообразности использования новых водорастворимых мембранстабшшзирующих препаратов липидной природы с антиоксидантными свойствами в составах консервирующих растворов и реперфузионных сред для повышения противоишемической резистентности печени позволило нам сформулировать цели и задачи исследования.

Цели и задачи исследования

Цель работы: повышение надежности противоишемической защиты донорской печени путем дополнительного включения в составы консервирующих и реперфузионных сред «Липина» - водорастворимого препарата липидной природы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1) создать стенд для выполнения в стандартных условиях - отмывки печени, заполнения ее консервантом и осуществления реперфузии;

2) провести комплексное изучение характера гистологических, цитологических и биохимических изменений в печени во время консервации в стандартном растворе НТК - гистидин-триптофан-кетоглютарат в зависимости от сроков хранения и последующей реперфузии;

3) изучить эффективность использования «Липина» - водорастворимого препарата липидной природы в составе НТК при консервации в зависимости от сроков хранения и длительности реперфузии печени;

4) изучить эффективность дополнительного включения препарата Липин в состав реперфузионного раствора для повышения надежности защиты печени от реперфузионного повреждения.

Научная новизна полученных результатов

Впервые проведено комплексное гистологическое, цитологическое и биохимическое исследование последовательности и взаимосвязи развития деструктивных изменений в изолированной печени:

1) при консервации (до 18 - 22 часов) при £=4-6 °С в стандартном растворе НТК и в растворе НТК, модифицированном включением в него «Липина» препарата липидной природы.

2) при реперфузии стандартным раствором Кребс-Хензиляйт (КНВ) при г=37 °С, а также раствором КНВ, модифицированном включением в него «Липина» - водорастворимого препарата липидной природы.

Использование метода комплексной динамической морфометрии отдельных структурных элементов печеночной ткани (клеток, ядер) позволило установить,

что наиболее информативным показателем тяжести ишемического повреждения печени при консервации и реперфузии, а также наиболее значимой характеристикой защитных свойств консервирующих растворов служит степень выраженности полиморфизма ядер гепатоцитов. Показано, что увеличение количества малых «голых» ядер и увеличение количества гепатоцитов со светлой цитоплазмой в цитограммах служит объективной мерой тяжести деструктивных изменений в печени при консервации в растворе НТК как без, так и с введением в их состав Липина.

По морфометрическим критериям предложено использовать значения энтропии и коэффициента относительной организации системы, рассчитанные по площади и оптической плотности ядер для количественной характеристики степени тяжести ядерного полиморфизма.

Впервые при консервации и реперфузии печени проведено комплексное исследование нарушений липидного обмена в печени, включающее исследование интенсивности процессов ПОЛ, оценку количественного содержания фосфолипидов, жирных кислот (насыщенных и ненасыщенных) и холестерола, а также показателей адекватности энергетического обмена - содержание адениннуклеотидов и их дериватов, глутатиона и ферментов цитолиза (трансаминаз). Выявленные изменения липидного обмена - активация процессов ПОЛ, повышение уровня некоторых фосфолипидов (лизофосфатидилхолина, фосфатвдилинозитола), а также некоторых жирных кислот (С 15:0, С 16:0, С 16:1, С 18:0, С 18:1, С 22:0) на фоне уменьшения других жирных кислот (С 18:2, С 19:0, С 20:0, С 20:3, С 20:4чу6) и холестерола - рассматриваются как результат сочетанного воздействия при консервации и реперфузии печени повреждающих (развитие энергодефицита и 02 - парадокса) и адаптационных факторов (фармако-холодовое хранение) на клетки печени.

Впервые показано, что, добавляя в состав консервирующего раствора (НТК) препарат Липин можно повысить противоишемическую резистентность печени и ослабить ее повреждение во время реперфузии по исследуемым показателям. Повышение противоишемической резистентности печени выражалось в ослаблении процессов ПОЛ, в повышении содержания лизофосфатидилхолина, в повышении содержания холестерола и концентрации адениннуклеотидов, а также в снижении выхода ферментов цитолиза (АЛАТ, АСАТ, ЛДГ) в перфузат при

реперфузии. Гистологически повышение противоишемической резистентности характеризовалось достоверным уменьшением площади дистрофически измененных зон в печени, снижением количества патологически измененных ядер, т.е. появлением достоверно большего количества клеток, повреждение которых обратимо.

При добавлении Липина к раствору Кребс-Хензиляйт при реперфузии печени удалось существенно уменьшить выраженность реперфузионного повреждения, уменьшить мозаичность рисунка печени, уменьшить полиморфизм ядер гепатоцитов, а дискомплексацию печеночных балок наблюдать в виде мелких и одиночных очагов.

Практическая значимость работы

Предложенные морфологические (морфометрические) критерии для оценки состояния паренхимы печении и определения степени тяжести дистрофических изменений в ней позволяют проследить динамику развития деструктивных процессов при длительном воздействии консервирующих растворов и при реперфузии.

Доказана возможность усиления противоишемической защиты печени растворам НТК и пролонгирования сроков консервации за счет дополнительного включения в их состав водорастворимого антиоксиданта Липин.

Разработан стенд для проведения пролонгированной перфузии донорской печени с использованием миниатюрного оксигенатора. Стенд позволяет оптимизировать режимы отмывки и заполнения печени консервантом, а также режимы реперфузии печени после консервации, т.е. позволяет стандартизировать экспериментальное исследование влияния консервирующих растворов и новых медикаментозных препаратов на печень крыс.

Доказана возможность дополнительного усиления противоишемической резистентности печени после консервации в растворе НТК за счет реперфузии ее перфузатом, в состав которого включен Липин.

Апробация результатов диссертации

Апробация работы состоялась 22 октября 2003 года на меж лабораторной конференции в ГУ НИИ Трансплантологии и Искусственных органов МЗ РФ. Основные положения и результаты диссертации были доложены на 1-м съезде трансплантологов Украины (Запорожье, 1995), на 2-м съезде трансплантологов Украины (Киев, 2000), на съезде трансплантологов Австрии: Austrotransplant-Kongress 1994 (Retz, 1994), на 12 th Annual Meeting and International Conference of the Academy of Surgical Research (Мюнстер, Германия, 1996), на XXXII съезде Европейской ассоциации хирургических исследований (Корфу, Греция, 1997), на съезде трансплантологов Австрии Austrotransplant-Kongress 1999 (St. Wolfgang,

1999), на международном симпозиуме: Falk Symposium 117 (Мюнхен, Германия,

2000).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, из их 12 статей в ведущих профессиональных изданиях (5 публикаций на русском языке) и 15 тезисов докладов в материалах Украинских и международных конгрессов и конференций. Получено 2 патента Украины на изобретения: №31297-А от 15.12.2000 года «Способ консервации печени» и №1771-111 от 1.06.2000 года «Способ диагностики гидропической дистрофии печени».

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы; главы, характеризующей материал работы и использованные в ней методы; 3 глав по результатам собственных исследований; заключения; выводов и практических рекомендаций; списка литературы содержащего 36 на русском и украинском языке и 255 западноевропейских и американских источников. Диссертация содержит 19 таблиц и 16 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Работа выполнена на печени 74 крыс: 50 самцов породы Sprague Dawley (Forschungs institut für versuhstierzucht, Himberg, Австрия) в возрасте 5 месяцев, весом 270 - 300 г. и 24 беспородных самцов в возрасте 6-8 месяцев, весом 300-

320 г. На отработку методик эксперимента нами дополнительно израсходовано 8 беспородных самцов. Нами было выполнено 148 экспериментов.

Исследование противоишемической защиты печени выполнено с использованием консервирующего раствора НТК. Для усиления противоишемической защиты печени в этот раствор добавляли водорастворимый препарат липидной природы «Липин» (яичный фосфатидилхолин) в дозе 0,1 мг/мл. В результате эксперимент был представлен двумя группами опытов (таб.1).

Таблица 1

Общее количество животных (крыс) и количество экспериментов, выполненных

на ткани изолированной печени

Группы Составы консервирующих растворов Количество животных Количество экспериментов после консервации печени через Количество экспериментов после реперфузии печени через

2-8 час 18-22 час 10 мин. 60 мин.

1 НТК (контроль) 29 16 27 9 9

2 НТК+липин* 45 16 27 22 22

Всего: 74 32 54 31 31

Примечание: * - в 10 опытах на этапе реперфузии печени в состав перфузата

добавлен Липин.

На разных сроках консервации и последующей реперфузии в опытах проводили морфологические, цитологические, биохимические исследования на 543 образцах ткани печени для сравнительного определения степени жизнеспособности консервируемой печени в зависимости от сроков консервации и реперфузии.

Забор печени для консервации и реперфузии осуществляли под внутрибрюшинном тиопенталовым наркозом в дозе 30-50 мг/кг веса. Инициальную перфузию печени для отмывки и заполнения ее консервирующим раствором, осуществляли на стенде по системе воротной вены под постоянным перфузионным давлением (11-14 мм вод ст.) с помощью перистальтического насоса, создавая объемную скорость перфузии 2,5-3,5 мл/мин/г. При этом использовали консервант НТК без и с липином, охлажденные до (4-6) "С. Параллельно с внутренним охлаждением осуществляли охлаждение печени извне

консервантами той же температуры. Консервацию печени проводили бесперфузионным методом в течение 2,4,6,8,18 и 22 часов при температуре (4-6) °С в растворе НТК как без и с добавлением в их состав Липина.

Реперфузию консервированной печени осуществляли по воротной вене на стенде при 1=37 °С с помощью оксигенированного раствора Кребс-Хензиляйт (КНВ) в течение 10 и 60 минут после 18 часов консервации в растворах на основе НТК. Оксигенация перфузионного раствора проводилась с помощью миниоксигенатора собственной конструкции [Шагидулин М.Ю. и др. 1999, 2000]. Объемная скорость перфузии составляла 2,5-3,5 мл/мин/г. Для исследования возможности усиления защиты печени от реперфузионных повреждений в 10 опытах реперфузию проводили раствори Кребс-Хензиляйт (КНВ) с добавлением Липина в дозе 0,1 мг/мл. После 10 и 60 минут реперфузии печень взвешивалась; производилась резекция участков печени для морфологических, цитологических и биохимических исследований.

Методы морфологических исследований

Для морфологического изучения печени была проведена биопсия печени от 74 крыс. Всего было проведено свыше 2500 исследований.

Для приготовления препаратов, резецированный участок ткани печени фиксировался в 10 % нейтральном формалине. Для исследования изготовлялись парафиновые срезы толщиной 5-7 микрометров, окрашенные гематоксилин-эозином и пикрофуксином по методу Ван-Гизон. Ставили ШИК-реакцию по Мак-Манусу на гликоген. Учитывали: разные виды дистрофии печеночных клеток, наличие гранулярного гликогена, а также выраженность диффузной ШИК-окраски. При микроскопическом исследовании ткани печени учитывались такие изменения как: 1) сохранение дольчатой структуры печеночной ткани; 2) равномерность рисунка паренхимы; 3) наличие и выраженность инфильтрации портальных трактов, холестазы; отек; 4) наличие и характер сосудистой реакции, полнокровие; 5) состояние печеночных балок: дискомплексация, разрушение структуры; 6) дистрофия печеночных долек: отсутствие; слабо-, умеренно- или резко выраженная; изменения всей долыси, или его части; 7) состояние ядер гепатоцитов. Состояние гепатоцитов оценивали на основе разработанных признаков [Зимина Л.Н. 1989, Шагидулин М.Ю. и др. 2000].

Качественную характеристику состояния паренхимы печеночной

ткани дополняли морфометрической. Морфометрия печени проводилась методом случайного выбора в 7 полях зрения. Для получения морфометрических характеристик использовали стандартную масштабную окулярную сетку, которая содержала 289 узлов и 256 квадратов. При увеличении окуляра до 10, объектива до 40 в 5-7 полях зрения определяли следующие параметры: 1) общее количество ядер гепатоцитов на единицу площади; 2) оптическую плотность ядер гепатоцитов; 3) площадь ядер гепатоцитов; 4) количество дистрофически измененных ядер гепатоцитов; 5) площадь паренхимы, поврежденной дистрофическим процессом; 6) площадь синусов, портальных трактов и других непеченочных структур. Количественная оценка площади, плотности ядер гепатоцитов и цитоплазмы осуществлялась с помощью анализатора изображения. По площади ядер гепатоцитов выделяли 3 диапазона измерений: «малые» ядра (от 10 мкм2 до 40 мкм2), «средние» ядра (от 41 мкм2 до 70 мкм2) и «большие» ядра (от 71 мкм2 и выше). По плотности ядер выделяли - «светлые» (от 60 у.е. до 120 у.е.), «умеренные» (от 121 у.е. до 160 у.е.), «темные» (от 160 у.е. и выше). При этом для интактной печени были характерны «средние» ядра по площади и «умеренные» по оптической плотности. Это дало возможность оценить их как условную норму, а другие ядра как имеющие патологические признаки. Все измерения выполняли на компьютерном анализаторе изображения производства МП «АРВЕЛ» (Украина) с использованием программного обеспечения научно-производственной компании «ЕВА» на светооптическом микроскопе МБИ-15.

Подсчеты проводились на препаратах, окрашенных ШИК-реакцией. Нарушения структуры печени характеризовали по 4 степеням тяжести поражения: 1) без существенных нарушений (архитектоника сохранена, гликоген утрачен частично, ослаблены тинкториальные свойства клеток); 2) утончение печеночных балок при сохранении формы, пространственной организации и контактов между гепатоцитами; 3) увеличение размеров гепатоцитов, появление гидропической дистрофии, отсутствие синусов, резкий очаговый полиморфизм ядер, возможные некротические изменения; 4) полная дискомплексация печеночных балок, утрата контактов между гепатоциими, обретение ними округлой формы.

Методы цитологических исследований

Цитологические препараты получали путем множественных отпечатков кусочков печени на предварительно обезжиренных предметных стеклах с последующей фиксацией их этиловым спиртом (96 %) в течение 1-2 минут и окраской по Романовскому-Гимза. Далее с помощью светооптического микроскопа (фирма «Jenaval», Чехословакия) при увеличении 40, цитологические препараты были проанализированы и описаны. При оценке цитологических препаратов учитывали количество и размеры комплексов клеток, наличие и количество «голых» ядер, соотношение нормальных и дистрофически измененных ядер гепатоцитов, непеченочных клеток.

Методы биохимических исследований

Активность процессов перекисного окисления липидов в печени оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой по методике [Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И. 1972] в модификации Андреевой JI.А. (1988).

Для получения экстракта суммарных липидов из печени использовали метод Bligh & Dyer (1959) и Palmer (1971). Разделение индивидуальных фосфолипидных классов проводили по методике [Svetashev i Vaskovsky 1972].

Качественный анализ и отождествление фосфолипидов осуществляли с помощью фосфор-чувствительного реагента Костецкого [Kostetsky E.Y. et all 1975]. Идентификация фосфолипидов выполнялась по методам Vaskovsky (1975) и Gert (1975).

Количественное определение разных классов фосфолипидов и их идентификацию проводили по Васьковскому В.Е. и др. (1975,1985).

Количественный анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили на газожидкостном хроматографе («Carlo Erba», Италия). Метиловые эфиры жирных кислот из липидного экстракта получали по Careau и Dubaco (1978).

Содержание холестерола определяли на хроматографе Chrom 5 (Чехия).

Аминотрансферазы (AJIAT, АСАТ) в перфузате определяли унифицированным динитрофенилгидразным методом Райтмана-Френкеля в модификации Меньшикова В.В. (1987).

Уровень аденнновых нуклеотидов и глутатиона в ткани печени определяли по Jia.Li Luo et all. (1995) методом высоко эффективной жидкостной хроматографии («Beckman», США).

Другие методы

Содержание общего белка в ткани печени определяли по Lowry О.Н. et all. (1951). Для взвешивания животных и донорской печени использовали электронные весы фирмы Hitachi.

Применяли статистические методы обработки медицинской информации с помощью компьютерной программы «Statistica for Windows» версия 5,0 и «Statgraphics plus 5.1» (разработчик StatSoft and Inc. 1984-1995, USA). Анализ проводили используя t-критерий Стьюдента; достоверными считали данные при р<0,05.

Для обоснования эффективности дополнительного применения Липина по общим статистическим критериям были использованы стандартные информационные характеристики, а именно: энтропия (Н) и коэффициент относительной организации системы (RO), который показывает долю морфологической информации, являющейся чрезмерной по сравнению с оптимальной; эта доля обеспечивает: резервную надежность, увеличение адаптационных процессов и компенсаторных возможностей, уровень упорядоченности морфологической системы (Цимбал В.П. 1982, Шилейко A.B. 1985). Для определения числовых значений информационной энтропии (Н), относительной энтропии (h), коэффициента относительной организации системы (RO) пользовались общепринятыми формулами: H=-Xp,log2p,; h=H/Hmax; (где: р, -вероятность и равна 1/N) RO=(l-H/H max)xl00 %=(l-h)xl00 % (где: Н max -максимальная энтропия системы, которая равна log 2 3=1,585).

Выражаю свою сердечную благодарность за помощь в подготовке препаратов для гистологических и цитологических исследований и обработке результатов н.с. Л.С.Донцовой, а также н.с. Т.М.Горидько за помощь в проведении и обработке биохимических исследований липидного обмена в печени. Особую благодарность за помощь и участие в интерпретации полученных результатов выражаю своим неофициальным консультантам д.м.н. И.В.Гомоляко и д.б.н., член-корр. HAH и АМН Украины Н.М.Гулой.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Противоишемическая зашита печени при использовании консервантов на основе НТК

1.1. Характеристика показателей печени после консервации

При исследовании ткани печени крыс после консервации в растворе НТК в течение 18 часов (предельно допустимый срок консервации в р-ре НТК по данным литературы) без медикаментозных добавок, мы подтвердили резкое усиление дистрофического процесса и морфофункциональной недостаточности ткани печени (таб.2).

Таблица 2

Выраженность дистрофического процесса в клетках

печени при консервации в р-ре НТК и в р-ре НТК+Липин (%, М±ш) (п=6-10)

Выраженность дистрофии НТК (контр.)18 час. НТК 22 час. НТК+ Липин 18 час. НТК+ Липин 22 час.

Отсутствует 6,0±0,4 3,8±0,3* 15,0±0,7* 5,1±0,3*

Слабая 31,5±0,8 7,6±0,7* 41,9±1,0* 17,4±0,5*®

Умеренная 35,5±0,9 8,4±0,8* 25,9±0,8* 50,3±0,9*

Значительная 27,0±0,5 80,2±1,0* 17,2±0,7* 27,2±0,5 ®

Примечание: * - по сравнению с контролем (НТК); ® - по сравнению с НТК

22 час.; р<0,05.

Нами была отмечена значительная мозаичность рисунка ткани печени, причем 50 % площади составляли участки с 3-м типом нарушения структуры печени без признаков некроза. Отмечалась тенденция к увеличению количества патологических ядер: слишком малых или слишком больших темных, или почти прозрачных. Количество малых «голых» ядер достоверно возросло на 23 %, а дистрофически измененных светлых цитоплазматических клеток на 20 % по сравнению с исходным уровнем (таб.3). Наблюдали разрушение клеточных мембран. Развитие ядерного полиморфизма на фоне развития дистрофии характеризовалось снижением коэффициента относительной организации ядерной системы гепатоцитов (ЯО) по отношению к норме, что свидетельствовало о снижении жизнеспособности клеток (таб.4).

Таблица 3

Сравнительная характеристика отдельных показателей цетограмм печени после консервации в растворе НТК (18 час.) и после ее реперфузии (60 мин.) (%, М±ш) (п=8-10)

2 Составы Количество Количество гепатоцитов

с растворов малых «голых» ядер со светлой цитоплазмой

а. Исходный 55±2,78 58±2,57

u Консервация Реперфузия Консервация Реперфузия

1 НТК(контроль) 78±1,02* 73±1,52* 78±1,21* 28±1,39*й

2 НТК+Липин 76±1,23* 57±l,20w<? 36±1,27*# 34±1,79**

Примечание: * - по отношению к исходному; - по отношению к контролю;

по отношению к консервации; р<Ф,05.

Уровень МДА в печеночной ткани к этому сроку достоверно увеличился на 21,1 % и составил 80,7±4,9 нмоль/г ткани по сравнению с интактным контролем (63,7±1,1 нмоль/г ткани) (таб.7).

Таблица 4

Коэффициент относительной организации ядерной системы гепатоцитов (ЯО) после консервации печени в растворах НТК и НТК+Липин (18 часов) (N=24)

Растворы RO-коэффициент

Площадь ядер Оптическая плотность ядер

Норма 0,45 0,86

НТК (контроль) 0,27* 0,53*

НТК+Липин 0,40 0,73

Примечание: * по отношению к интактной печени (норма).

Поскольку НТК раствор характеризуется наличием субстратов, оказывающих не только буферное действие, но и воздействие на метаболизм в печени было решено большее внимание дополнительно уделить изучению энергетического обмена в печени при консервации и реперфузии. Было выявлено (таб. 5), что после консервации печени в НТК происходило достоверное уменьшение по отношению к контролю: уровня адениновых нуклеотидов на 56,6 %; аденилатного энергетического заряда на 65,8 % и уровня АТФ+АДФ на 85,5 %. Содержание продуктов гидролиза адениновых нуклеотидов - ксантина после консервации печени 18 часов в растворе НТК резко возрастало в 45 раз по сравнению с

контролем: с 7,0 до 317±36,6 нмоль/г. (р <0,001), тогда как содержание глутатиона в ткани печени после консервации в растворе НТК 18 часов снижалось на 51,7 % по сравнению с контролем с 5,8±0,76 до 2,8±0,68 нмоль/106 клеток 0x0,05).

Таблица 5

Содержание общего пула нуклеотидов, суммы АТФ+АДФ и аденилатного энергетического заряда в ткани печени после консервации в растворах НТК и НТК+Липин и при различных условиях реперфузии (М±ш) (п=5)

Общий пул нуклеотидов (нмоль/г). АТФ+АДФ (нмоль/г). Аденилатный энергетический заряд

Контроль 5179,0±190,0 4249,01238,0 0,41

НТК (коне.) 2246,0±143,0* 614,0163,9* 0,14

НТК+ Липин (коне.) 2633,0160,2* 810,0162,9* 0,15

НЖ- (10 мин. реперфузии) 2193,0+157,0 1258,01136,0 0,57

НТК+ Липин (10 мин. реперфузии) 1940,01286,3 1207,01349,5 0,31

НТК+Липин (10 мин. реперфузии+ Липин) 3050,0+183,6* 1995,0+185,0* 0,32

НТК- (60 мин. реперфузии) 1731,0+207,6* @ 1275,0+217,0*@ 0,37

НТК+ Липин (60 мин. реперфузии) 2690,0±194,3* р2<0,01 1953,01180,5* 0,36

НТК+ Липин (60 мин. реперфузии+ Липин) 2878,01193,6* P2<o,oi 2175,01194,3* ®*;Р2<0,01 0,38

Примечание: * - по отношению к контролю, р<0,05; ® - по отношению к консервации в группе НТК; * - по отношению к реперфузии в группе НТК.

В группе НТК+Липин в сравнении с группой НТК, наблюдалось более выраженное сохранение нормальной структуры печени. Дистрофические изменения были минимальными и наблюдались, большей частью, в центральной части долек. Некрозы отсутствовали. Общая структура печени повреждалась значительно меньше, что проявлялось повышением количества жизнеспособных клеток в сравнении с группой НТК. ЯО-коэффициент в группе НТК+Липин были более оптимальным при сравнении с группой НТК (таб.4). Количество дистрофически измененных светлых цитоплазматических клеток достоверно

уменьшилось (на 42 %) по сравнению с группой НТК (таб.2). Полиморфизм ядер был незначительный. В группе НТК+Липин отмечено улучшенное энергетическое обеспечение клеток: уровень АТФ+АДФ достоверно увеличился на 24,2 %, суммарное содержание адениновых нуклеотидов увеличилось на 14,7 % по сравнению с группой НТК (таб.5). Уровень ксантина достоверно снижался на 47,6 % по сравнению с группой НТК и составил 166±41,4 нмоль/г. (р <0,001).

1.2. Характеристика показателей печени после реперфузии

При исследовании ткани печени крыс, после ее реперфузии (60 мин.) в группе, где консервация печени проводилась в растворе НТК без медикаментозной добавки через 18 часов хранения общий рисунок печени сохранялся, хотя отмечалась тенденция к утончению печеночных балок и появлению вариантов тяжелого нарушения структуры печени. Определялась тенденция к снижению коэффициента относительной организации ядерной системы гепатоцитов (110) (таб. 6).

Таблица 6

Коэффициент относительной организации ядерной системы гепатоцитов (ЯО) после 10 и 60 мин реперфузии печени, консервация печени в НТК, НТК+Липин

(18 час.) (п=12-16)

Растворы ИО-коэффициент

Площадь ядер Оптическая плотность ядер

Норма 0,45 0,86

НТК+реп10 0,22 0,40

НТК+реп60 0,20 0,69

НТК+Липин+реп10 0,26 0,32

НТК+Липин+реп60 0,29 0,72

НТК+Липин+реп10+Липин 0,27 0,43

НТК+Липин+реп^+Липин 0,30 0,76

Количество малых «голых» ядер после реперфузии достоверно увеличилось на 18 %, а количество клеток со светлой цитоплазмой достоверно снижалось на 30 % по сравнению с исходным уровнем; одновременно отмечено достоверное снижение клеток со светлой цитоплазмой на 50 % по сравнению с завершающим этапом консервации в растворе НТК (таб.3).

После реперфузии отмечено достоверное увеличение: уровня МДА (на 56,8 %), общего холестерола (на 22,7 %) по отношению к завершающему этапу консервации (таб.7), а уровня ЛФХ - на 70 % по отношению к интактному контролю с 6,0+1,0 до 20,0±2,5 мкг Pi/r ткани, (р <0,01).

Таблица 7

Содержание малонового диальдегида и холестерола в печени крыс при 18 час. консервации в растворах НТК, НТК-f Липин и последующей 60-и минутной реперфузии (М±ш) (п=3-5)

Параметры Интактный контроль Консервация в НТК 18 час Реперфузии (коне. НТК) Реперфузия (конс.НТК+ Липин)

МДА нмоль/г ткани 63,7±1,1 80,7±4,9* 186,9±10,7* # 150,1±9,6**®

Холестерол Мг/г ткани 4,93±0,14 5,80±0,84 7,51±0,11*# 5,64±0,79

® - относительно реперфузии в группе НТК; р<0,05. Индекс соотношения насыщенные/ненасыщенные жирные кислоты был достоверно выше (на 32,2 %) по сравнению с показателями в интактной печени и составил 1,18±0,03 (р<0,05). Функциональное состояние печени характеризовалось возрастанием ферментативной активности после начала реперфузии (таб.8). Общий пул адениннуклеотидов достоверно снизился на 66,5 %, уровень АТФ+АДФ на 70 %, а аденилатный энергетический заряд на 9,7 % по отношению к интактному контролю (таб.5). Уровень ксантина увеличился после реперфузии более чем в 10 раз по отношению к контролю и составил 71,5±31,3 нмоль/г (р ¿0,001).

Таблица 8

Содержание ферментов цитолиза в перфузате после реперфузии печени раствором Кребс-Хензиляйт (консервация в растворе на основе НТК 18 час.) (ммоль/гл., М±т) (п=6-8)

Консервант АЛАТ 10 мин. реперфузии АЛАТ 60 мин. реперфузии АСАТ 10 мин. реперфузии АСАТ 60 мин. реперфузии

НТК 0,64±0,01 1,2±0,07 0,6±0,01 1,8±0,21

НТК+Липин 0,52±0,01 0,81±0,06* 0,29±0,04* 0,75±0,11*

Примечание: * - по отношению к НТК, р<0,05.

При реперфузии печени, после консервации в растворе НТК+Липин также наблюдались дистрофические процессы, однако структурных изменений отмечалось значительно меньше по сравнению с контрольной группой -реперфузия после консервации в НТК. Структура ткани печени приближалась к норме, практически, полностью сохраняла свою архитектонику. Выявлялась очаговая гидропическая дистрофия. По сравнению с контрольной группой отмечали снижение (на 24 %) количества участков с дистрофическими изменениями, которые в сумме составляли менее 10 % общей площади паренхимы. Полиморфизм ядер соответствовал исходному уровню. Коэффициент ЯО по площади ядер был более стабильным и указывал на лучшую сохранность ядерного аппарата по сравнению с контрольной группой - реперфузия после консервации в НТК (таб.6). Количество малых «голых» ядер было достоверно меньшее (на 16 %) по сравнению с группой НТК+реперфузия и, практически, соответствовало исходным значениям. Количество клеток со светлой цитоплазмой увеличилось по сравнению с группой НТК+реперфузия (таб.3). Наблюдалось достоверное уменьшение (на 25 %) уровня холестерола (таб.7) и увеличение уровня ЛФХ на 25,3 % по сравнению с группой НТК+реперфузия -26,8+4,9 вместо 20,0±2,5мкг Р5/г ткани (р<0,01). Определялось достоверное уменьшение (на 20 %) уровня МДА по сравнению с группой, где консервация была осуществлена в НТК (таб.7). Реперфузия печени способствовала выходу аминотрансфераз в перфузат, однако, выход АЛАТ и АСАТ в этой группе был достоверно ниже по сравнению с контролем (НТК) - на 32,5 %, и 58,3 % соответственно (таб.8). Отмечено достоверное улучшение энергетического обеспечения клеток через 60 минут реперфузии: содержание АТФ+АДФ на 35 % и суммарного содержания адениновых нуклеотидов на 36 % достоверно увеличивалось по сравнению с группой, где реперфузия выполнялась после консервации в НТК (таб. 5). Содержание ксантина достоверно снизилось на 72,1 %, по сравнению с контрольной группой (реперфузия в течение 60 минут после консервации в НТК) и составило 19,9±7,1 вместо 71,5+31,3 нмоль/г (р<0,001). В группе НТК+Липин наблюдали повышение на 26 % содержание глутатиона по отношению к контрольной группе которое составило 2,7+0,2 вместо 2,0±0,19 нмоль/106 клеток (р<0,05).

Реперфузия печени раствором КНВ+Липин после консервации ее в растворе НТК+Липин в течение 18 часов позволила в еще большей степени защитить консервированную печень от реперфузионного повреждения. В структуре ткани печени преобладал 1-й и 2-й типы нарушений. Участки с дистрофическими изменениями 3-го и 4-го типа не превышали 10 % от общей площади паренхимы. Коэффициент относительной организации клеточной системы был наиболее оптимальный среди исследуемых групп. Количество «голых» ядер возвращалось к исходным показателям. В этой же группе наблюдали достоверно более высокий уровень содержания в печени АТФ+АДФ на 41,3 % и общего пула адениннуклеотидов на 40 % чем в контрольной группе НТК+реперфузия раствором КНВ и тенденцию к неуклонному повышению этих показателей по сравнению с группой, в которой реперфузия проводилась после консервации в растворе НТК+Липин. (таб.5). Уровень ксантина в печени при использовании перфузионного раствора КНВ+Липин был достоверно (на 61 %) ниже, а уровень глутатиона достоверно выше на 35,5 % чем в контрольной группе (60 минут реперфузии печени раствором КНВ, консервированной в НТК). Эти показатели составили 28,2±8,4 нмоль/г и 3,1±0,79 нмоль/106 клеток вместо 71,5±31,3 нмоль/г (р<0,001) и 2,7±0,2 нмоль/106 клеток (р<0,05) соответственно.

Таким образом, с помощью морфологических и биохимических методов было установлено, что дополнительное введение с состав НТК стандартного консервирующего раствора водорастворимого препарата «Липин» обладающего выраженным антиоксидантными и мембранстабилизирующими свойствами можно усилить защитные свойства НТК. Это подтверждается уменьшением развития дистрофических изменений в ткани печени, в гепатоцитах и в их ядрах; достоверным повышением общего пула адениновых нуклеотидов, уменьшением образования МДА в ткани печени и снижением выхода аминотрансфераз в реперфузионный раствор. Используемый препарат «Липин» способствует более выраженной адаптации клеток донорской печени к ишемическим и реперфузионным повреждениям. Особенно выраженное защитное действие, исследованный препарат, проявляет при добавлении его в перфузат на этапе реперфузии, когда оказывается возможным восполнить недостаточные консервирующие и антиоксидантные свойства раствора НТК и оптимизировать тем самым общие результаты противоишемической защиты донорской печени.

ВЫВОДЫ

1. Стенд, предложенный для изолированной перфузии донорской печени с использованием миниоксигенатора, позволяет оптимизировать и стандартизировать режимы отмывки и заполнения донорской печени консервантом, а также режимы проведения ее реперфузии.

2. Комплексное гистологическое и цитологическое исследование печени в сочетании с динамической морфометрией отдельных структурных элементов печеночной ткани и развернутым динамическим исследованием липидного и энергетического обмена - позволяют объективно оценивать тяжесть и стадийность повреждения донорской печени при гипотермической консервации в растворе НТК, а также позволяют судить о степени противоишемической защиты ее при дополнительном включении в консервант водорастворимой мембранстабилизирующей добавки липидной природы -препарата «Липин».

3. Основным гистологическим проявлением ишемического повреждения печени при консервации в растворе НТК является белково-гидропическая дистрофия гепатоцитов и нарастание количества гепатоцитов с дистрофически измененными ядрами. Наиболее информативным показателем тяжести ишемического повреждения является ядерный полиморфизм гепатоцитов по площади и оптической плотности клеток, а объективной интегральной характеристикой его служат значения энтропии и коэффициента относительной организации клеточной системы.

4. Цитологические критерии оценки тяжести ишемического повреждения гепатоцитов при консервации: вакуолизация цитоплазмы, гидропическая дегенерация и пикноз ядер коррелируют с гистологической картиной повреждения клеток печени. Морфометрический показатель состояния гепатоцитов - увеличение количества «голых» ядер и уменьшение их размеров - может служить объективной мерой тяжести деструктивных изменений в печени при консервации и мерой характеристики защитных свойств консервантов.

5. Консервация печени в растворе НТК по мере увеличения сроков хранения сопровождается не только развитием деструктивных процессов, но и нарушениями биохимических процессов, в частности липидного обмена на фоне развития энергетического дисбаланса. Нарушения липидного обмена характеризуются резкой активизацией процессов перекисного окисления липидов, а также сдвигами в фосфолипидном и жирно-кислотном составах печеночной ткани: происходит повышение уровня лизофосфатидилхолина и фосфатидилинозитола, а также некоторых ненасыщенных жирных кислот; реперфузия усугубляет признаки липидного и энергетического дисбаланса в печени.

6. Мембранстабилизирующий препарат липидной природы Липин, добавленный в раствор НТК - повышает качество и надежность противоишемической защиты печени в этом растворе в пределах допустимых сроков -18 часов консервации: уменьшаются площади дистрофических и нежизнеспособных участков печени, снижается количество патологических ядер в гепатоцитах, достоверно возрастают: содержание АТФ+АДФ, суммарное содержание нуклеотидов и аденилатный энергетический заряд и глутатион, а также снижается ксантин по сравнению с контрольной группой (НТК), тормозится накопление перекисей, снижается выход в перфузат ферментов цитолиза (АЛАТ, АСАТ).

7. Дополнительное включение Липина в состав реперфузионного раствора существенно ослабляет признаки реперфузионного повреждения печени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При консервации донорской печени необходимо строго соблюдать параметры перфузии на этапе отмывки печени от крови и заполнения ее консервирующим раствором.

2. Целесообразно использовать стенд для изолированной перфузии печени со встроенной системой оксигенации (с помощью миниоксигенатора), что позволяет стандартизировать и оптимизировать условия для сравнительного изучения действия фармакологических препаратов на морфофункциональные свойства органа.

3. При консервации печени и других органов целесообразно включать в состав консервантов мембранстаблизирующий препарат Липин, что позволит значительно снизить возникновение консервационно-реперфузионных осложнений в донорском органе.

4. На этапе реперфузии консервированной печени и других органов целесообразно дополнительно использовать мембранстабилизирующий препарат Липин в составе реперфузионных растворов, что позволит резко ослабить выраженность признаков реперфузионного повреждения печени.

5. Водорастворимый мембранстабилизирующий антиоксидантный препарат «Липин» - целесообразно использовать в организме донора на этапе его кондиционирования перед забором донорских органов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мойсюк Я.Г.,Тарабарко Н.В., Долбин А.Г., Сечкин A.B., Шагидулин М.Ю. Организация и развитие программы мультиорганного донорства

// "Клиническая хирургия". -1992. -N 1,- С.15-19.

2. Шумаков В. И., Мойсюк Я. Г., Арзуманов В. С., Тарабарко Н. В., Шагидулин М.Ю. Вопросы хирургической техники и тактики при ортотопической трансплантации печени // "Клиническая хирургия".-1992. -N2,- С.12-17.

3. Деев В.А., Шагидулин М.Ю., Зубков В.И. Динамика уровня диальдегида в переживающей печени в зависимости от состава консервирующего раствора

// Сучаснш проблеми клш1ЧН01 та експериментальжи трансплантологй'. Кшв, 1995.- С.62-63.

4. Шагидулин М.Ю., Стасенко A.A. Влияние мембранстабилизирующих препаратов на морфометрические показатели клеток печени в постишемическом периоде // Клшчна xipypriH.-1995.- N 3.-С.30-31.

5. Гомоляко И.В., Донцова Л.С., Швадчин И.А., Деев В.А., Шагидулин М.Ю. Диагностическая эффективность морфометрических признаков при дистрофии печени //Лабораторная диагностика. - 1998.- N 2(4).- С.55-57.

6. Гомоляко I.B., Шапдулш М.Ю., Донцова Л.С., Дубович Т.О. Вплив недостатньоУ вщмивки судин печшки та яшсть збереження i'i в консервуючому розчин1 // Сучаснш проблеми клшчноТ та експериментально'1 трансплантологй'. КиТв, 1995. - 40 с.

I i

7. Горщько Т. М., Маргтч В. М., Говсеева Н. М., Юнмашевсыаий В. М., Шапдулш М.Ю., Гула Н.М. Вплив консерванта Свроколшз на фосфолшадний склад печшки // Сучаснш проблеми клшчноТ та експериментальноТ трансплантологи. Кшв, 1995. - С.41-42.

8. Сморжевський В.Й., Лгсайчук Ю.С., Шагщулт М.Ю. Значения прецизшноТ судинноТ xipyprii в трансплантацн оргашв та тканин // Сучаснш проблеми клшчноТ та експериментальноТ трансплантологи. Кшв, 1995.- С.170-171.

9. Шапдулш М.Ю. Х1рурпчнатехшка консерваци печшки mypie в експерименп // Сучаснш проблеми кшшчноТ та експериментальноТ трансплантологи. КиТв, 1995.- С.198-199.

10.Шапдулш М.Ю., Стасенко А.А. Вивчення впливу добавки "N" на морфометрични показники гепатоцит1в при консерваци органу // Сучаснш проблеми кшшчноТ та експериментальноТ трансплантологй". Кшв, 1995.- С.199-200.

11.Шапдулш М.Ю. Анаомш, xipypri4Ha техшка консерваци та реперфузп печшки щур ¡в в експерименп // Клшчна xipyprin. -1997.- N 3-4. -С.42-45.

12.Донцова Л.С., Шапдулш М.Ю., Гр1горова I.B., Гулая Н.М. Вплив консервуючих розчшпв Свроколлшз та Свроколлшз+Ы на nepe6ir Д1Строф1чного процессу в печипц uiypie // Юишчна х1рург1я. -1997. -N 3-4. -С.45-49.

13.Гула Н.М., Горщько Т.М., Маргтч В.М., Говсеева Н.М., Кшмашевсысий В.М., Шапдулш М.Ю. Перикисне окисления фосфолтшв печшки uiypiB за умов перфузц консервуючим розчином Euro-Collins та теля реперфузн розчином Krebs-Henseleit // Тези доповщей УПУкраТнського 6ioxiMi4Horo з'Тзду -Частина I Кшв. -1997. - 126 с.

14.1.В.Гомоляко, Л.СДонцова, М.Ю.Шапдулш, Ш.Швадчш, F.Wrba. Дослщження коеффщента вщносноТ оргашзацп ядерних систем гепатоципв при консерваци та реакцй вщторгнення печшки // В1сник морфологи - 1999. -Т.5. -N2. - С.164-165.

15.Гор4тько Т.М., Гула Н.М., Маргтч В.М., Говсеева Н.М., Кл1машевський В.М., Шапдулш М.Ю. Вивчення впливу Ы-пальм1тоТлетанолам1ну на склад фосфолшцпв та жирних кислот печшки uiypiB при шемн // Укр.бюх1м1чний журнал. - 2000. - Т.72, N 6. -130 с.

16.Шапдулга М.Ю., Деев В.А.,Лисак Л.1.,Стефанов О.В., Кубашко А.В., Roth Е., Tichy F., Sporn Е., Steininger R., Muhlbacher F. Вплив р1зних розчижв на метаб0л1зм аденшових нуклеотщпв та глутатгону при консервуванш i реперфуз1'1 печшки // Трансплантолопя. - 2000.- Т.1, N1. -С.58-60.

17.Шапцулт М.Ю. Використання модел1 ¡зольованоУ перфузи печшки щура для вивчення дн фармаколопчних сполук на жптсшяльтсть печшки в умовах ¡шеми та реперфузн // Трансплантолопя. -2000. -Т. 1, N1. -С.279-281.

18.Горпъко Т.М., Гула Н.М., Маргтч В.М., Говсеева Н.М., Юпмашевський В.М., Шапдулт М.Ю. Вивчення впливу N-пaльмiтoлeтaнoлaмiнy на склад фосфолшвдв та жирних кислот печшки щур ¡в при ¡шеми // Укр.бюх1м1чний журнал. - 2001. - Т.73, N 1.- С.82-87.

19.Гула Н.М., Гортко Т.М., Маргтч В.М., Говсеева Н.М., Юпмашевський В.М., Шаг1дул1н М.Ю. Вивчення впливу Ы-пальмп-ошетаноламшу на склад фосфол1шд1в та жирних кислот шем13ованоТ печгнки щур!в за реперфуз!)

// yKp.6ioxiMi4HHfi журнал. - 2001. - Т.73, N 4. - С.33-38.

20.Schagidulin М. The influence of membrane-stabilising preparation on the preservation of rat liver. // Acta Medica Austriaca, suppl.-1994. - N44.-15 p.

21 .M.U.Sbagidulin, N.M. Gulaya, V.M. Margitich, N.M. Govseeva, T.M. Goridko, V.M. Klimashevsky, S.A. Andreyeshev. Free radical-induced alteration of the phospholipid composition of the rat liver during reperfusion of preserved organ by НТК solution //Jornal of Investigative Surgery. -1996,- N 9.- 218 p.

22.I.Gomolyako, I.Grigorova, M.ShagiduIin, N.Gulaya, N.Klotchkova. Cytological characteristic of the rat liver after reperfusion of preserved organ by НТК and HTK+L solutions //Jornal of Investigative Surgery. -1996.- N 9.- 253 p.

23.V.M.Margitich, N.M.Gulaya, N.M.Govseeva, T.M.Goridko, V.M.Klimashevsky, M.U.Sbagidulin. The peroxidative damage of phospholipids during the reperfusion of preserved in EC rat liver // Poster book XXXII Congress of the European Society for Surgical Research. Corfu. -1997,- P.386-387.

24.M.ShagiduIin, I.Homolyako, L.Dontsova, V.Sayenko, A.Stefanov, F.Wrba, B.Gollackner, E.Sporn, K.Kyriakoulis, R.Steininger, F.MUhlbacher. Protective Effect of Membranstabilizing "Substance L" in Rat Liver Preservation // Acta Chirurgica Austriaca, supl.-1999.- Vol.31.- 27 p.

25.1.Homolyako, M.Shagidulin, L.Dontsova, I.Shvadchin, V.Sayenko, F.Wrba, F.Langer, R.Steininger, F.Mtlhlbacher. The study of different size nuclei corelation in in liver rejection. // Acta Chirurgica Austriaca, supl.-l999.- Vol.31.- 27 p.

26. L.Dontsova, I.Homolyako, F.Wrba, M.Shagidulin, I.Shvadchin. Reversible and irreversible stage of morphological changes in liver allograft // Shock, supl.-2000.-Vol.13.- 62 p.

27. M.Shagidulin, V.Deyev, L.Lysak, K.Boulanov, A.Sefanov, E.Roth, F.Tichy, R.Steininger, F.Muehlbacher Membranstabilisator improves cells energetic metabolism in ischemia and reperfusion of liver transplant // Falk Symposium N117.-2000.- 118 p.

СПИСОК ПАТЕНТОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Шагшулш М.Ю., Саенко В.Ф., Стефанов О.В., Солов'ев A.I., Гомоляко I.B., Деев В.А., Донцова Л.С., Грнорова l.B. Cnoci6 консервацп печшки

// Декларащйний патент Укра'ши на винах¡д №-31297 A 01N1/02.- 15.12.2000.

2. Донцова Л.С., Гомоляко I.B., Швадчш I.O., Шагщулш М.Ю. Cnoci6 д1агностики гщрошчно1 дютрофп печшки // Декларащйний патент Укра'ши на винахщ №-1771 - Ш 6А61В/00,- 01.06.2000.

Принятые сокращения

АДФ - аденозиндифосфат

АСАТ - аспартатаминотрансфераза

АЛАТ - аланинаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфат

КНВ - раствор для реперфузии Кребс-Хензиляйт

ЛФХ - лизофосфатидилхолин

МДА - малоновый диальдегид

НТК - консервационный раствор Бретшнайдер (Custodiol) ПОЛ - процессы перекисного окисления липидов RO - коэффициент относительной организации системы

Заказ № 326 Объем -1 пл. Тираж -100 экз. Подписано в печать 26.01.2005 г. Отпечатано: "Бланкодрук", Киев, ул.акад.Крымского 27.

РНБ Русский фонд

2005-4 48004

.......ч

fa

2 2

V -H*

\ 3 * '

1417