Автореферат и диссертация по медицине (14.03.08) на тему:Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

На правах рукописи

ПАСТУШКОВА ЛЮДМИЛА ХАНИФОВНА

ПРОТЕОМНЫЙ ПРОФИЛЬ МОЧИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2015

I з МАЙ 2015

005568770

005568770

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

доктор физико-математических наук, профессор Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией системной биологии Федерального государственного бюджетного научного

учреждения «Научно-исследовательский институт зГ0Да Виктор Гаврилович биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа Федерального

государственного бюджетного научного

учреждения "Научно-исследовательский институт Васильев Андрей Валериевич питания

доктор медицинских наук, профессор, начальник медико-социального управления государственного общественного объединения «Московский Дом „ _ .. ..

ветеранов войн и Вооруженных См» Радченко Сергеи Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится «8» июля 2015 г. В 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д.76А.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru') и на сайте Института медико-биологических проблем Российской академии наук (www.imbp.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д.76А. (www.imbp.ru).

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета, /У

доктор биологических наук С^С^С^^Се^С.. М.А. Левинских

Актуальность проблемы

В настоящее время одним из интенсивно развивающихся направлений системной биологии является протеомика, изучающая белковый состав клеток, тканей, биологических жидкостей, организмов с использованием высокопроизводительных методов масс-спектрометрии (Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев E.H., Григорьев А.И., 2014; Mischak Н„ Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou А., 2011; Metzger J. et. al., 2013). Протеомика появилась в результате постепенного развития и усложнения классических методов исследования белков, начиная с гравиметрических и фотометрических до диск-электрофореза, градиентного и двумерного электрофореза. В настоящее время достаточно уверенно поддаются идентификации до 15,5 тысяч белков человека (Court М. et al., 2011; Bensimon А., Heck A.J.R., Aebersold R., 2012). Известно, что все функции организма человека осуществляются белками, что справедливо и для адаптации, которая реализовывается путем изменения спектра и количества работающих белков, которые формируют мультибелковые комплексы, с одной стороны, и сложные функциональные и динамичные сети, с другой (Терентьев A.A., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В., 2009; Bose В., 2013). Организация в функциональные модули отражает сложность и разнообразие протеома на субклеточном, клеточном и органном уровне. Белки, синтезируемые в различных типах клеток, имеют значительное представительство в биологических жидкостях организма человека, таких как кровь, моча, слюна, конденсат выдыхаемого воздуха (Hiemstra T.F. et al., 2011; Metzger J. et al., 2013). Состав этих сред может дать представление о механизмах адаптационных перестроек функций, что имеет громадное фундаментальное значение для физиологии, поскольку вскрывает пути приспособления сложной системы, которой является живой организм, поддерживающий постоянство состава внутренней среды, и осуществляющий активный поиск наиболее оптимального и устойчивого состояния, к необычному и никогда не встречавшемуся в эволюции биосферы Земли фактору - невесомости (Нефедов ВЦ, Ясайтис A.A., Новосельцев В.Н., 1991; Наточин Ю.В., 2008).

Экстремальные условия представляют собой один из немногих способов, позволяющих вызвать отклонение гомеостаза у здорового человека, для распознавания механизмов поддержания постоянства состава внутренней среды и сохранения резервов здоровья, адаптивного потенциала организма (Балаховский И.С., Наточин Ю.В., 1973; Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006; Leach Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin Yu.V., 1998; Norsk P. et al., 2000; Drummer C. et al., 2000; Kotovskaya A.R.,

Fomina G.A., 2013). Список методов (условий), этически дозволенных и доступных для воздействий на здорового человека, приводящих к отклонению его гомеостаза, относительно короток и включает в себя физические нагрузки, использование фармпрепаратов, манипуляции с питанием (Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев E.H., Григорьев А.И., 2014; Edwards L.M. et al., 2012) или директивные изменения в солепотреблении (Titze J. et al., 2002), функциональные нагрузочные пробы (Носков В.Б., 2013), экологические исследования, включая воздействие экстремальных температур, гипербарии и гипоксии и, наконец, космический полет (Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Моруков Б.В., Ларина И.М., Григорьев А.И., 1998; Оганов В.Б., 2003; Корнилова Л.Н., Алехина М.И., Темникова В.В., с соавт., 2006; Фомина Г.А., Котовская А.Р., 2008; Kozlovskaya I.B. et al., 1988; Oganov V.S. et al., 2010).

В связи с современными аналитическими возможностями и фундаментальными научными запросами гравитационной физиологии возникает интерес к изучению белкового состава мочи, поскольку моча, как одна из биологических жидкостей организма человека, представляет собой привлекательный материал для использования в клинической диагностике и для теоретических исследований (Ларина И.М, с соавт. 2012; Mischak Н„ Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou А., 2011; Metzger J. et al., 2012). Возможность многократного, самостоятельного (без помощи медперсонала) и не обременительного, неинвазивного сбора представительного для протеомики биологического материала, каковым является моча, принципиально важна в космической физиологии. Недостатками мочи, как источника данных о белковом составе внеклеточной жидкости, является низкая концентрация в ней белков, что выдвигает дополнительные требования к чувствительности аналитических методов (Николаев E.H., 2007; Nagaraj N. et al., 2012), высокая вариабельность белкового состава (Образцова O.A., 2013), обусловленная функциями почки по поддержанию водно-электролитного гомеостаза, а также предполагаемая трудность интерпретации результатов, полученных при исследовании данного биоматериала от здорового человека

Протеомика достигла наиболее впечатляющих успехов в плане практического применения ее достижений именно в области исследований протеома мочи (Не J.C. et al., 2012). Проект Human Kidney и Urine Proteome Project (HKUPP) (http://eurokup.org) был инициирован в 2005 году в рамках HUPO для содействия протеомным исследованиям в области нефрологии, понимания функции и патогенеза заболеваний почек, поиска биомаркеров и развития теоретических протеомных исследованиях в этой области (Vlahou А. et al., 2009; Не J.C. et al. 2012).

4

Факторы космического полета вызывают адаптивные изменения во всех физиологических системах организма человека (Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1990; Баевский P.M., с соавт., 2000; Оганов В.Б., 2003; Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004; Котовская А.Р. 2008; Носков В.Б., 2013). Это отражается на качественном и количественном составе белков, которые участвуют в адаптивных реакциях. Очевидно, белки, изменение уровня которых наблюдается в экстремальных условиях, не могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры развития заболеваний, поскольку они участвуют в естественном молекулярном ответе организма в процессе адаптации к изменению условий жизнедеятельности (Пахарукова H.A., 2010; Трифонова О.П., 2011; Киреев К.С., 2013; Образцова O.A., 2013; MischakH. et. al., 2011; Metzger J. et. al., 2012).

Анализ белков с использованием различных биохимических методов, выполнявшийся ранее в космической биологии и медицине, не давал возможности прямого сравнения результатов в виду различной чувствительности и специфичности методов. Список исследованных белков в крови конкретного космонавта редко достигал 50 параметров (Попова И.А., с соавт., 1988; Григорьев А.И., Ларина И.М., 1999; Ларина И.М., 2003; Millet С. et al., 2001). Это является существенным ограничением при изучении механизмов изменения функций, поскольку большинство функций организма человека осуществляются значительно большим числом белков. В свою очередь, это не позволяло получить и проанализировать целостную картину происходящих изменений. Современные протеомные методы дают возможность определять сотни белков за один хромато-масс-спектрометрический анализ с высокой точностью, специфичностью и чувствительностью (Nagaraj N. et al., 2012; Rodriguez-Suärez E. et al., 2014), что позволяет получить данные, пригодные для непосредственного сопоставления друг с другом и создать картину изменений композиции белков при воздействии факторов космического полета. Для понимания того, как формируются физиологические реакции на различные воздействия, необходимо перебросить концептуальные и функциональные мостики от генетики к белкам, от белков к клеткам, далее к органам и системам в организме (Hester R.L., Iliescu R„ Summers R., Coleman T.G., 2011).

Таким образом, значение новых методов современной системной биологии имеет теоретический и прикладной аспекты, так как, основываясь на понимании физиологической адаптации здорового человека в экстремальных условиях, дают возможность разработать эффективные меры профилактики и коррекции

неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.

5

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлась характеристика протеома мочи здорового человека в норме и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета для выявления и валидации биомаркеров адаптивных процессов.

В ходе работы решались следующие задачи:

- исследовать протеом мочи здорового человека (мужчин в возрасте от 19 до 54 лет);

- изучить возрастные особенности протеома мочи здоровых добровольцев;

- идентифицировать постоянную и вариабельную части протеома мочи здорового человека в нормальных условиях жизнедеятельности;

- изучить вариабельность белковой композиции мочи в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормы потребления соли в РФ;

- изучить характер адаптивных перестроек протеома мочи при воздействии различных факторов космического полета;

- исследовать характер адаптивных перестроек протеома мочи в острый период реадаптации после длительных космических полетов;

- адаптировать современные биоинформационные технологии для построения сетей молекулярных взаимодействий на основании данных по протеому мочи здорового человека.

Научная новизна

С помощью высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-масс-спектрометрии впервые охарактеризован протеом мочи здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 54 лет, отобранных специальной врачебно-экспертной комиссией. Анализ протеома мочи позволил изучить и выявить возрастные особенности здоровых добровольцев.

Впервые показано, что белки, которые являются постоянными в протеоме мочи здорового человека, при его исследовании в течение длительного промежутка времени (530 суток), по своим молекулярным функциям и биологическим процессам, в которых они участвуют, имеют низкую функциональную связанность между собой.

Впервые показано, что протеом мочи может служить индикатором различных физиологических состояний организма здорового человека. В проведенных исследованиях проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность белкового состава мочи здорового человека.

Впервые установлено, что состояние некоторых физиологических систем здоровых молодых мужчин изменяется в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормального суточного потребления соли в РФ (4-12г/сут.).

Анализ белковой композиции мочи впервые позволил выявить белки, принимающие участие как в функциях периода острой адаптации к антиортостатической гипокинезии, а также восстановительного периода после завершения эксперимента.

Впервые идентифицированы белки, которые демонстрируют ассоциативную связь с функциями выделительной системы и чувствительностью к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена.

Биоинформационными методами анализа, а также методом ручной аннотации белков и биологических процессов, впервые удалось связать хорошо известные и документированные ранее факты и физиологические особенности состояния космонавтов в первые сутки после завершения полетов, с выявленными в моче белками, участниками различных процессов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Практическая значимость работы заключается в идентификации белков, определении их тканей-продуцентов, биологических процессов, характеризующих протеом мочи здорового человека. Характерные изменения протеома мочи, обусловленные возрастными особенностями метаболизма и его регуляции, следует учитывать в клинически-ориентированных исследованиях протеома мочи, а также при поиске фармакологических мишеней для терапии.

Практическая значимость работы заключается, кроме того, в выявлении белков, которые могут представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме здорового человека при действии факторов космического полета, а также использоваться как стандарты при определен™ концентрации других белков в моче.

Полученные данные об изменениях протеома мочи в контролируемых условиях существенно расширяют современные представления о возможных механизмах влияния различного уровня приема соли (6 - 12 г/сутки) на организм человека.

Результаты исследования показателей, характеризующих протеомную композицию мочи при действии факторов космического полета, дают более полное представление о механизмах реадаптации физиологических систем организма человека к земной гравитации после завершения продолжительного полета.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Протеом мочи здорового человека, при изучении его высокотехнологическими методами на основе хромато-масс-спектрометрии, отличается вариабельностью, связанной как с возрастными особенностями метаболизма, так и с уровнем двигательной активности и характером рациона питания.

2. Анализ протеома мочи здорового человека в условиях действия на организм различных факторов выявляет сотни белков-участников адаптивных процессов, большинство из которых в этой связи ранее не изучалось.

3. Биоинформационные методы анализа позволяют верифицировать белковый состав образцов мочи через известные биохимические процессы и физиологические особенности состояния человека, как при наземном моделировании эффектов космического полета, так и при исследовании космонавтов после их завершения.

4. Данные протеома мочи, наряду с построением и анализом молекулярных сетей с участием выявляемых белков, предоставляют гипотезы о новых механизмах адаптации организма здорового человека.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены и обсуждены на следующих

конференциях: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009

год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и

разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического

комплекса России на 2007-2012 годы», 25-27 ноября 2009 г., Москва; French-Russian-

Belorussian Conference: Neurovascular impairment induced byen vironmenta lconditions:

molecular, cellular and functional approach. - French-Russian conference, Angers University,

France, 10-14 March 2010; 3 1 "Annual International Gravitation Physiology Meeting: Trieste,

Italy, 13 - 18 June, 2010; IV Всероссийской конфсрснции-школе «Фундаментальные

вопросы масс-спектромегрии и ее аналитические применения», Звенигород, 2010; V

Российском симпозиуме «Белки и пептиды», 8 —12 августа 2011, Петрозаводск; 2-ой

8

Международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика. Протеомика. Биоинформатика", Новосибирск, 2011; 10Л HUPO World congress, Geneva, Switzerland, September 4-7, 2011; Космическом форуме 2011, посвященном 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина, 18 - 19 октября в Звездном городке; Международном симпозиуме, посвященном итогам выполнения проекта «МАРС-500», Москва, 23-25 апреля 2012; 33Л Annual International Society for Gravitational Physiology Meeting, «Life in Space for Life on Earth», Aberdeen - United Kingdom, 18-22 June 2012; Proteomic Forum Berlin, Germany, 17 - 21 March, 201311th Annual World Congress HUPO, Boston, Massachusetts, USA, September 9-13, 2012; в Докладах III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», в Казани, 22-24 ноября 2012; 8th International Conference on «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» BGRS/SB-2012, Novosibirsk, Russia June 25-29,2012; 12th Annual World Congress HUPO, Yokohama, Japan, September 14-19,2013; «Human in space symposium» Cologne, Germany, July, 2013; French-Russian Conference «Head out water immersion symposium & Baroreflex and heart rate variability» Angers, France 28-30 April, 2014; The Ninth International Conference on Bioinformatics of Genjme Regulation and Structure/Systems Biology, Novosibirsk, Russia, June 23-28, 2014; 13th Human Proteome Organization World Congress, October 5-8, Madrid, 2014.

По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, в том числе, 17 статьи в журналах из перечня Высшей Аттестационной Комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 23.12.2014 г.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке программ Президиума РАН и Роскосмоса, а также грантов президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» и РФФИ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 303 страницах и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 6 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка

литературы, включающего 325 отечественных и 686 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 20 рисунками, 3 графиками, 1 схемой.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объем и условия исследований

Содержание и общий объем проведенных исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1. Объем и структура исследований

Эксперимент Количество участников Средний возраст Число образцов

Здоровые добровольцы 52 добровольца 36,5 года (19-54) 52

520-суточная изоляция в гермообьекте 6 добровольцев 31 год (25-37) 84

105-суточная изоляция в гермообьекте 6 добровольцев 33 года (25-41) 144

21-суточная АНОГ(-6°) 8 добровольцев 32 года (20-44) 56

5 - суточная «сухая» иммерсия 14 добровольцев 25 лет (21-29) 182

Длительные космические полеты (169199 суток) 15 космонавтов 43 года (35-51) 45

Члены дублирующих экипажей 12 космонавтов 43 года (36-50) 24

Общее количество образцов: 587

Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Использовали образцы мочи 52 здоровых добровольцев в возрасте 19-54 лет, не подвергавшихся воздействиям и находившихся в привычных условиях жизнедеятельности.

Моделирование действия факторов космического полета в наземных условиях (105 и 520-суточные изоляции в гермообьекте, 5-суточная «сухая» иммерсия) проводили на экспериментальных стендах ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Общие условия проведения комплексных испытаний, циклограмма исследований, научно-практические цели экспериментов описаны Козловской И.Б. (2008), Моруковым Б.В. (2011). 21-суточная АНОГ -6° проводилась на базе исследовательского центра МЕОЕБ (Тулуза) во Франции.

Исследования влияния факторов космического полета на протеомный профиль мочи были выполнены в рамках космического эксперимента «Протеом» до и после

ю

завершения длительных (169-199 суток) экспедиций на орбитальной космической станции МКС с участием 15 космонавтов.

В качестве контроля использовались образцы дублеров космонавтов. Эти лица проходили аналогичную подготовку, имели тот же рацион питания и водопотребления, что и члены основного экипажа. Все обследуемые космонавты и дублеры добровольно участвовали в эксперименте «Исследование протеома крови и мочи у основных и дублирующих членов экипажей до и после космических полётов на МКС (Протеом)».

Материалом для протеомного анализа мочи служила средняя порция второй утренней фракции, которая является наименее вариабельной по белковому составу и поэтому наиболее пригодной для протеомных исследований (Fiedler G.M. et al., 2007; ZurbigP. etal.,2011).

Взятие проб мочи у космонавтов проводилось за 30-45 суток до старта и на 1-7-е сутки после приземления, у испытателей-добровольцев - в фоновом периоде, во время воздействия и после его завершения. Добровольцы, принимавшие участие в наземных экспериментах, были допущены врачебно-экспертной комиссией ГНЦ РФ — ИМБП РАН к проведению испытаний. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ-ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследованиях, было получено добровольное информированное согласие. Протокол эксперимента «Протеом» был одобрен Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН и Международным экспертным советом по исследованиям на человеке на МКС (HRMRB).

Методы исследований

Каждый образец мочи предварительно центрифугировали 10 минут при 4°С, 2 ООО g для удаления загрязнений в виде крупных мертвых клеток, их фрагментов, отбирали надосадочную фракцию, которую замораживали при температуре -80°С для длительного хранения. В дальнейшем замороженные образцы размораживали при комнатной температуре и повторно центрифугировали 10 минут при 4°С, 2 000 g.

Процедура подготовки образцов для протеомного анализа состояла из следующих этапов (Fliser D. et al., 2005; Mischak H. et al., 2007; Валеева О.А. с соавт., 2011):

1) концентрирование образцов (надосадочной жидкости) центрифугированием с использованием фильтров Amicon Ultra Ultracel-15 3k при 2 000 g, 50 минут, +4°C, до 20-ти кратного уменьшения объёма;

2) высушивание образцов в вакуумном концентраторе при +30°С;

3) восстановление (перерастворение осадка в буфере для восстановления - 0,2 М Tris основной (pH 8,5), 2,5 мМ EDTA, 6М Guanidine-HCL, добавление ДТТ - 15 минут при 70°С) и алкилирование (добавление йодацетата натрия - 30 минут при комнатной температуре в темноте) выделенной белковой фракции для денатурации белков, разрыва S-S мостиков и предотвращения обратного образования дисульфидных связей;

4) осаждение белков ацетоном с 0,1% ТФУ при -20°С 8-19 часов и получение сухого белкового осадка (при последовательной промывке три раза этанолом с перерастворением осадка, полученного центрифугированием при 2 ООО g, 10 минут, +4°С);

5) трипсинолиз - образец растворяли в ABB ((NH^HCCb) буфере (pH 8,0) до конечной концентрации 1 мг/мл белка, определенной методом по Бредфорду (Bio-Rad), и добавляли трипсин 1:60 по массовым частям к белку и инкубировали при 37°С 8-12 часов.

С целью оценки вариабельности масс-спектров образцов мочи выполняли прямое профилирование образцов, после их концентрирования до 20-ти кратного уменьшения объема. Очистка и концентрация белков из проб мочи осуществлялась с помощью магнитных частиц MB-HIC («Bruker Daltonics») для специфического захвата протеинов и пептидов на основании гидрофобного взаимодействия перед последующим масс-спектрометрическим анализом методом MALDI-TOF (Fiedler G.M. et al., 2007). Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре Autoflex III TOF/TOF («Bruker Daltonics»), работающем в положительном линейном режиме в диапазоне масс от 1 000 до 17 000 Да. Далее по каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) для каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»). Эти данные экспортировали в таблицы MSExcel, и значения площадей в повторных измерениях усредняли. Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ Flex Analysis 3.0 и Statistica 6.0. Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уипкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows) (Tiss A. et al., 2007; Пахарукова H.A., с соавт., 2009).

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на системе, состоящей из

хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и гибридного масс-

спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия) - масс-спектрометра ионного

12

циклотронного резонанса, совмещенного с линейной квадрупольной ионной ловушкой, использующейся для накопления ионов и получения спектров фрагментации (МС/МС) ионов, индуцированных столкновением. Весь анализ осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Германия) в 2-х стадийном режиме автоматического измерения спектров.

Биоинформационные методы в анализе результатов включали поиск и идентификацию белков по базе данных IPI-human (международные индексы белков, International Protein Index) (version 3.65; 86379 sequences; 34740770 residues) при помощи программы Mascot (Matrix Science, Великобритания; version 2.0.04) (Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S., 1999) на основе списка из точных масс пептидов и масс их фрагментов. Первым этапом поиска является сравнение измеренных масс продуктов МС-МС пептидов для всех записей последовательностей в базе данных с теоретическими масс-спектрами фрагментации. По степени совпадения определялся Mascot Score, являющийся индексом достоверности того, что детектируемым пептидам соответствует определенный белок из конкретной базы данных. Использовались следующие основные параметры для поиска: 1) enzyme - trypsin; 2) peptide tolerance ±5 ppm; 3) MS/MS (fragments) toletrance ±0,5 Да. В списке белков, полученном в результате Mascot-noncKa, достоверными считались только те белки, для которых были идентифицированы 2 и более триптических пептида с рейтингом (Score) более 24. Для автоматического отбора и сравнительного анализа пиков белков, результаты Mascot-поиска обрабатывались с помощью специальной программы, разработанной в лаборатории профессора Е.Н. Николаева (Агрон И.А. с соавт., 2010).

Затем, для определения места образования, функции выявленных в моче белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют, использовались биоинформационные ресурсы: UniProt KB (Magrane М., Consortium U., 2011), Tissue-specific Gene Expression and Regulation (TiGER) [Liu X. et al., 2008] и Gene Ontology (GO) (Ashburner M. et al., 2000).

Для анализа тканеспецифичности экспрессии и тканевой локализации белков,

выявленных в моче, использовались базы данных TiGER (LiuX. et al., 2008), The Human

Protein Atlas (Uhlen M. et al., 2010), Pax DB (Wang M. et al., 2012), UniProt KB (Magrane

M., Consortium U., 2011), DAVID (Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009). Для

определения молекулярных функций, биологических процессов и клеточной

локализации Gene Ontology использовалась база данных UniProt-GOA (file:

gene_association.goa_human, Submission Date: 5/13/2013) (Dimmer E.C. et al., 2012). Для

13

оценки сверхпредставленности биологических процессов, молекулярных функций, связанных с выявленными белками, использовался Hypergeometric test (Fisher's exact test) с поправкой на множественное сравнение Benjamini-Hochberg. Расчеты проводились с помощью программы BiNGO (Maere S., Heymans К., Kuiper M., 2005). Сверхпредставленные процессы - это статистически значимо более представленные процессы в группе белков по сравнению с определенной референсной (контрольной) группой. В качестве контроля выбирались все белки человека, для которых известны биологические процессы. Оценка представленности тканей проводилась с помощью программы DAVID (Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009), в которой использовался метод EASE score с поправкой Benjamini на множественное сравнение и база UPtissue. Построение ассоциативных генных сетей между белками осуществлялось с помощью AND System (Demenkov P.S., Ivanisenko T.V., Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., 2011).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев.

Возрастные изменения

Известно, что протеом мочи характеризуется большой биологической вариабельностью, которую определяют не только генетическое различия индивидуумов, но и нормальные вариации почечной функции, которая оказывает влияние на концентрацию в моче тех или иных компонентов. Качественное изучение протеома мочи избавлено от влияния части из этих факторов и связано с частотой выявления белков, а не с концентрацией.

Исследование вариабельности протеома мочи в норме выполнено при анализе белковой композиции мочи 52 здоровых добровольцев в обычных условиях жизнедеятельности. Было идентифицировано 259 различных белков, для 141 из них тканевая принадлежность оказалась известной. Белки, присутствующие в моче, представляют почти все ткани организма. Наибольшая их часть синтезируется в печени (32), почках (17), в клетках крови (13) (табл. 2).

Таблица 2. Тканевая представленность белков по базе данных TiGER

Ткань Число белков

1 2

мочевой пузырь 3

1 2

клетки крови 13

кости 9

костный мозг 8

толстая кишка 4

глаза 4

сердце 8

почки 17

гортань 11

печень 32

легкие 1

мышцы 7

поджелудочная железа 9

периферическая нервная система 1

простата 13

кожа 10

тонкая кишка 1

мягкие ткани 10

селезенка 8

желудок 6

гонады 8

тимус 1

язык 7

Данные белки являются участниками 715 биологических процессов, происходящих в различных клетках и тканях организма. Наибольшую группу составили внутриклеточные процессы (139), затем - процессы метаболизма и каскады сигнальных путей (117) (табл. 3).

Таблица 3. Группы биологических процессов, выявленные с помощью программы Gene Ontology

Группы процессов Число белков

1 2

Регуляция на организменном уровне 68

Развитие и рост организма 10

Развитие и рост органов и тканей 51

Иммунная система 96

Внутриклеточные процессы 139

Рост и развитие клеток 18

Регуляция внеклеточного матрикса 6

Клеточная подвижность 28

Клеточная адгезия, взаимодействия 43

Регуляция ферментативной активности 29

1 2

Метаболизм и каскады, сигнальные пути молекул 117

Ответ на стимул 56

Передача и регуляция сигнала 26

Гемостаз 19

Участие в воспаление 9

ВСЕГО 715

Выявление возраст-зависимых изменений состава белков в моче показало, что с возрастом число различных белков в моче здорового человека слабо, но достоверно увеличивается (Я = 0.566, р-уа1ие=1.24Е-05) (рис. 1).

кол-во белков

400

зоо 200 100 о

10 20 30 40 возраст

♦ кол-во белков

-Л инейная (кол-во

белкое!

Рисунок 1. Зависимость количества белков от возраста испытуемых

По современным представлениям, анатомо-функциональное старение в самих почках отражается на составе белков, выводимых с мочой (Glassock R.J., Rule A.D., 2012). Известно, что возрастное снижение веса почек начинается с 40-50 лет, к 70-80 годам достигает 10-30% (Rao U.V., Wagner H.N. Jr., 1972). Co временем происходит отложение коллагена в боуменовой капсуле, медиальная гипертрофия и гиалиноз артериол (Mancilla Е. et ai., 2008; Rule A.D. et al., 2010).

Была исследована зависимость между молекулярной массой экскретируемых белков и возрастом добровольцев. Оказалось, что с возрастом достоверно увеличивается их средняя молекулярная масса (R= 0.428558, p-value=0.00079) (рис. 2).

Рисунок 2. Зависимость средней молекулярной массы белков мочи от возраста

Среди анализируемых белков были выделены 23 белка, которые достоверно чаще встречаются в моче с увеличением возраста обследуемых (р<0.05). Для 21 из них тканевая принадлежность известна. Один белок - регулятор передачи сигналов через рецепторы, сопряженные с С-белком (ЯОЗЫ) достоверно исчезает с возрастом (табл. 4).

Таблица 4. Белки, достоверно чаще встречающиеся в моче с увеличением возраста добровольцев (р<0.05)

Название белка Название гена Молекулярная масса, kDa R p-value

1 2 3 4 5

Галектин-З-связывающий белок LGALS3BP 65,33 0,66 3.28Е-05

Ингибитор плазменной протеазы серинового типа SERPINA5 45,67 0,62 0,01

Фибронектин FN1 262,62 0,61 0,01

Маннан-связывающая лектин сериновая протеаза 2 MASP2 75,7 0,55 0,01

Дезоксирибонуклеаза-1 DNASE1 31,43 0,54 0,01

Аминопептидаза N ANPEP 109,54 0,54 0,01

Кубилин CUBN 398,74 0,53 0,01

Коллаген альфа-1 (VI) цепь COL6A1 108,53 0,50 0,01

Рецептор тирозин киназного белка UFO AXL 98,34 0,50 0,01

Рецептор липопротеина 2 низкой плотности LRP2 521,96 0,50 0,01

Полимерный рецептор иммуноглобулина PIGR 83,28 0,50 0,01

Эндосалин CD248 80,86 0,49 0,01

ICOS лиганд ICOSLG 33,35 0,49 0,01

Гелсолин GSN 85,70 0,47 0,01

Глюстерин CLU 52,50 0,46 0,01

Лизосомные альфа-глюкозидазы GAA 105,32 0,45 0,01

1 2 3 4 5

Молекулы клеточной адгезии 4 CADM4 42,79 0,45 0,01

Рецептор G-белка семейства С GPRC5C 48,19 0,44 0,02

Гомолог белка Roundabout 4 R0B04 107,46 0,43 0,02

CMRF35- подобная молекуле 9 CD300LG 36,06 0,42 0,02

Не - рецепторный белок тирозин - фосфатазы SIRPA 54,97 0,42 0,02

Поджелудочная альфа-амилаза AMY2A 57,71 0,40 0,03

Инсулиноподобный фактор роста-связывающий белок 7 IGFBP7 29,13 0,39 0,05

Для этих 23 белков, с помощью программы ЕШСО было выявлено 30 сверхпредставленных процессов, которые были объединены в 9 групп (табл. 5).

Таблица 5. Группы процессов для 23 белков, достоверно чаше встречающихся в моче человека с увеличением возраста

Группы процессов Число процессов

Клеточная адгезия и межклеточные взаимодействия 4

Метаболизм и каскады, сигнальные пути 4

Регуляция на организменном уровне 7

Гемостаз 5

Внутриклеточные процессы («домашнее хозяйство») 5

Развитие и рост органов и тканей 1

Иммунная система 2

Развитие и рост организма 1

Ответ на стимул 1

ВСЕГО 30

Таким образом, среди значимо коррелирующих с возрастом сверхпредставленных процессов можно отметить процессы, связанные с адгезией, функциями иммунной системы, метаболизмом углеводов, обменом витамина D, регуляцией апоптоза дендритных клеток, гемостазом и другие.

1.1. Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей

Достоверные источники для оценки вариабельности содержания тех или иных белков в моче у здоровых лиц малочисленны (Sun W. et al., 2009; Liu X. et al., 2012; Lei T. et al., 2013). Используя преимущество контролируемых условий комплексного

эксперимента с длительной изоляцией в гермообъекте (в течение 520 суток), было проведено исследование протеомного состава мочи 6 здоровых добровольцев. В образцах мочи участников эксперимента было обнаружено 256 различных белков, семь из которых присутствовали на протяжении всего исследования: эпидермальный фактор роста, полимерный рецептор иммуноглобулина, ингибитор сериновых протеаз плазмы, белок АМВР, цитокератин 1, коллаген альфа-1 (VI) цепи, сывороточный альбумин. Согласно базе данных "ПОЕЯ, синтез этих постоянных белков распределен по более чем 20 тканям. Наибольшим количеством белков оказались представлены печень, плазма и моча (все 7 белков); следующими тканями по представленности являются кожа и тромбоциты (6 белков). Статистический анализ сверхпредставленности тканей показал, что печень является наиболее статистически значимо представленным органом. Согласно полученным данным, 5 из 7 постоянных белков могут экспрессироваться в печени, и попадать в мочу из крови. Вторым статистически значимо представленным источником постоянных белков оказались клетки крови.

Чтобы выяснить, насколько постоянные белки являются связанными в молекулярно-генетических сетях, реконструировали ассоциативную генную сеть с помощью программы АЫ05у51ет, в которой постоянные белки были стартовыми вершинами (хабами) (рис. 3).

Рисунок 3. Ассоциативная сеть взаимодействия постоянных белков протеома мочи.

Крупными красными шарами выделены постоянные белки. Мелкие красные шарики - добавленные при реконструкции новые белки, показывающие отдельные взаимодействия между парой белков.

Из представленной сети видно, что постоянные белки оказались не сильно связанными друг с другом. Анализ сверхпредставленности молекулярных функций и

биологических процессов ОепеОто1о{*у показал низкую функциональную связанность этих белков между собой. Полученные данные позволяют заключить, что идентифицированные белки могут представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме здорового человека, а также использоваться как стандарты при определении концентрации других белков в моче.

1.2. Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковый состав мочи

На характер протеома мочи воздействует целый комплекс факторов. Один из основных из них - это питание, в том числе, поступление в организм основных нутриентов, включая соль. Концепция идеального кардиоваскулярного здоровья, разрабатываемая в США, предусматривает регулирование потребления соли в качестве критически важной компоненты программы. Следует отметить, что нормы потребления соли в РФ в настоящее время выше, чем в Америке и Европе.

Анализ влияния различного уровня солепотребления на протеом мочи проводился в несколько этапов. Первоначально определялся список белков, непосредственно связанных с различным режимом приема соли внутри эксперимента, затем анализировались ткани, в которых данные белки преимущественно экспрессируются, и, наконец, выполнялся анализ сверхпредставленных процессов, в которых данные белкн участвуют.

Анализ включал в себя сравнение всего протеомного фенотипа, характеризующего композицию мочи в различные периоды эксперимента, как на регламентируемом приеме соли, так и на не контролируемом солепотреблении.

Было показано, что при 105-суточной изоляции в контролируемых условиях частота выявления 21 белка в моче достоверно коррелирует с изменением режима приема соли (табл. 6).

Таблица 6. Белки, частота выявления которых в моче достоверно коррелирует с солепотреблеиием

Название белка Название гена Я р\а1 аф'иБ!

1 2 3 4 5

Кадерин-1 СОН1 0,89 7,00Е-06 0,00

Гемопексин НРХ 0,89 7,69Е-06 0,00

Антиген СБ 14 дифференциации моноцитов СЭ14 0,84 8,37Е-05 0,04

Соль-активируемая липаза желчи СЕЬ 0,86 3,37Е-05 0,01

1 2 3 4 5

Альфа-1 цепьколлагена VI COL6A1 0,85 7,47Е-05 0,01

Цистатин-С CST3 0,86 7,04Е-05 0,01

Цистатин-М CST6 0,84 9,1ЗЕ-05 0,01

Гелсолин GSN 0,83 0,00 0,01

Ингибитор интер-альфа-трипсина тяжелой цепи Н4 ITIH4 0,84 0,00 0,01

Рецептор гиалуронана 1 эндотелия лимфатических сосудов LYVE1 0,85 6.00Е-05 0,01

Глутаминил-пептидциклотрансфераза GPCT 0,83 0,00 0,02

а-1Ч-ацетилглюкозаминидаза NAGLU 0,82 0,00 0,02

Фибронектин FN1 0,81 0,00 0,03

Эндосалин CD248 0,80 0,00 0,03

Молекулы клеточной адгезии4 CADM4 0,80 0,00 0,03

Ь-лактатдегидрогеназа В цепь LDHB 0,80 0,00 0,03

Хондроитинсульфат протеогликан 4 CSPG4 0,79 0,00 0,03

Бета-амилоидбелка А4 АРР 0,78 0,00 0,03

Аминопептидаза N ANPEP 0,78 0,00 0,04

Кишечнаямальтаза-глюкоамилаза MGAM 0,785 0,00 0,04

Каппа-цепи^У-Р/ регион Л - 0,77 0,00 0,04

Примечание: R - коэффициент корреляции Пирсона: corr p-value - p-value с поправкой Бенджамини Хокберга (BenjaminiHochberg) на множественность сравнения: adjust- поправка на множественность сравнения.

С помощью программы АКОу1зю была определена ассоциативная сеть взаимодействия данных белков с ЫаС1, где крупными красными шарами выделены белки, достоверно коррелирующие с солепотреблением (рис. 4).

О

AMPN

Рисунок 4. Ассоциативная сеть взаимодействия белков с №С1, выявленных с

помощью программы ANDvis¡o. Мелкие красные шарики - добавленные при реконструкции молекулярных цепей «новые» белки (т.е. не выявляемые в данном исследовании), черные линии с зелёными точками показывают отдельные взаимодействия между парой белков.

Для 13 белков, достоверно коррелирующих с солепотреблением, была определена тканевая принадлежность с помощью базы Tiger (табл. 7).

Таблица 7. Список тканей, являющихся преимущественными источниками белков, связанных с уровнем солепотребления в контролируемых условиях

Ткани Число белков

клетки крови 1

кости 2

костный мозг 1

сердце 1

почки 1

печень 2

поджелудочная железа 1

кожа 2

мягкие ткани 2

В этих тканях в 90 биологических процессах участвуют белки, связанные с солепотреблением. Наиболее сверхпредставленными процессами среди них оказались: метаболизм (анаболизм и катаболизм) гликозаминогликанов; структурный морфогенез; процессы клеточной адгезии; организация внеклеточного матрикса.

На основе данных, полученных в 105-суточной изоляции, было выполнено построение протеомного фенотипа с использованием программы 50М - метода машинного обучения с построением самоорганизующихся карт. Основной принцип построения таких карт состоит в том, что белки с похожей временной динамикой частоты идентификации у испытуемых группируются вместе, в то время как белки с различной динамикой стремятся локализоваться в различных областях карты. Для выделения протеомных фенотипов использовалось цветовое кодирование двумерной мозаики, отражающее на карте кластеры белков, обладающих повышенной (красный цвет) или пониженной (синий цвет) частотой выявления. Таким образом, в каждой временной точке эксперимента формировался единый ландшафт, представляющий собой «портрет» соответствующего протеомного фенотипа.

В дальнейшем эти изображения использовались для оценки сходства образцов и выбора дифференциальных характеристик. Частота выявления белков существенно менялась по ходу эксперимента, что отражалось в изменениях протеомных фенотипов. С помощью метода машинного обучения с построением самоорганизующихся карт,

экспериментальные точки были последовательно сгруппированы по трем временным периодам: «раннему», «промежуточному» и «позднему» (рис. 5).

ВЛЧОО шакяоптл »зля,

ПВ : 1 сои И ООП <а

& як ж

№ да т

Л т К 14

т 9 ПО" * ¿СП ВМ М

т зя

«

поел

СЛОКЧЛКШ

: паапжтл

¡(ЯЛ-И)

НАЧиО и гот -ц

* _

■&Г кг

гчв

V Й ПСУГ

ШШШШШ ижчяыб

ПРОШЖЯОЧНЫЙ

Рисунок 5. Галерея ландшафтов белков, построенная с помощью

самоорганизующихся карг, иллюстрирующая частоту их выявления в различных временных точках эксперимента.

Подобная кластеризация позволила увидеть, как состояние физиологических систем добровольцев систематически и последовательно изменялось в течение эксперимента (табл. 8).

С помощью биоинформационных подходов было выявлено влияние изменений в уровне солепотребления (6-12г/день) как на динамику протеома мочи здоровых людей в контролируемых условиях, так и на активность протекающих биологических процессов.

Оказалось, что в начальный период контролируемого солепотребления в 12 г/сут отмечались: максимальная активность синтеза белка, активация адаптивной иммунной системы, провоспалительных белков. Также активировались процессы ангиогенеза, клеточной адгезии, процессы почечной экскреции натрия и регуляции водного баланса.

Таблица 8. Суммация эффектов, наблюдаемых при различном уровне

Временной диапазон Начальный Промежуточный Конечный

1 2 3 4

до изоляции и 7-11 неделя эксперимента 12-15 неделя

неделя изоляции 1 -6 неделя эксперимента

эксперимента и 2 недели после

потребление N801 12 г/день (1-6 неделя) 9 г/день (недели 7-9), 12 г/ день (неделя 10) и 6 г/день (неделя 11) 6 г/день (недели 12-15)

1 2 3 4

активированные биологические процессы1 воспаление, клеточная адгезия, свертывание крови, протеолиз, ангиогенез, связывание Са 2 +, внеклеточные процессы деление клеток, липидный обмен, развитие кожи, ороговение, ремоделирование хроматина, ответ на окислительный стресс и гипоксию, регуляция апоптоза метаболические процессы малых молекул, внутриклеточные процессы, связывание Гу^ 2 +, ответ на цинк, гибель клеток, рецептор, связанный с О-белком, регуляция артериального давления (ренин / ангиотензин)

активированные сигнальные пути2 иммунный ответ, нервная система, нуклеотиды, метаболизм аминокислот и липидов пищеварительной системы, метаболизма, регенеративные процессы (\Vnt-сигнальный путь и биосинтез 1\(-гликама) реакция на стресс (р53-, МРМ-сигнальный путь), метаболизм энергии (биосинтез убихинона)

активированные ткани печень, почки, поджелудочная железа, (частично кожа) мышцы яички, желудок, (частично печени и почек)

общая экспрессия белка увеличенная и высокая убывающая низкая

процент активации белков 27% 20%

процент инвариантных3 белков >50%

Примечание: 1) обогащенный анализ; 2) PSF анализ; 3) представляющие собой «шум» и единичные белки в единичных образцах.

В промежуточный период исследования, при солепотреблении 6-9 г/день, выявлялись снижение экспрессии белков на 7%, по сравнению с начальным периодом исследования. Активировались процессы, связанные с клеточным метаболизмом, ремоделированием хроматина, ответом на окислительный стресс и гипоксию, регуляцией апоптоза, липидным обменом, ремоделированием мышц. PSF анализ выявил

активацию белков, связанных с деятельностью пищеварительной системы, активностью регенеративных процессов (Wnt-сигнальный путь и биосинтез N-гликанов).

На заключительном периоде исследования (12 - 15 недели эксперимента и период восстановления) отмечался самый низкий уровень экспрессии белка. Активировались метаболические процессы, в т.ч. внутриклеточные процессы, опосредованные связыванием с Mg2, гибелью клеток, рецептор-зависимые процессы, осуществляемые по G-белок-зависимым сигнальным путям, а также процессы, связанные с регуляцией артериального давления. PSF выявил активацию процессов, связанных с реакцией на стресс (р53-, МРМ-сигнальный путь), а так же с действием половых гормонов.

При этом белковая композиция мочи за неделю восстановительного периода не возвращалась к фоновым значениям, что указывает на инертность биологических процессов, в которые были вовлечены данные белки-участники.

Таким образом, проведенный биоинформационный анализ позволил выявить широкий круг физиологических процессов, реагирующих на модуляции солепотребления, и показать их взаимосвязи и действующие механизмы. Часть из них могла быть прямо связанной с регуляцией солевого гомеостаза (например, ремоделирование, внеклеточный матрикс). Однако большинство биологических процессов не исследовались ранее у здорового человека в связи с изменениями состава рациона. Изменения протеома мочи в контролируемых условиях жизнедеятельности были связаны не только с режимами солепотребления, так как динамика изменений карт SOM не следовала буквально за изменением уровня соли в рационе. Вторым по значимости фактором, систематически воздействующим на добровольцев в изоляции, являлась гиподинамия.

2. Исследования протеома мочи здорового человека в условиях наземного

моделирования факторов космического полета 2.1. Анализ протеома мочи в антиортостатической гипокинезии (АНОГ)

Гиподинамия является одним из значимых факторов воздействия на организм здорового человека во время антиортостатической гипокинезии. В образцах мочи, собранных в течение 21-суточной АНОГ у 8 добровольцев, не подвергавшихся дополнительным воздействиям, было выявлено 169 различных белков, некоторые из которых присутствовали в моче постоянно. К ним относились 6: эпидермальный фактор роста, белок АМВР, остеопонтин, уромодулин, простагландин-Н2 D-изомераза, сывороточный альбумин. Этот список пересекался с аналогичными перечнями

постоянных белков в других экспериментальных ситуациях, в которых обследовались здоровые люди; таких, как длительная изоляция в гермообъекте, космические полеты, «сухая» иммерсия. Обоснованным представлялось заключение, что появление в моче этих белков не только характерно для здоровых мужчин, но они характеризуются постоянным присутствием в моче, при различных экстремальных воздействиях.

Другая группа белков появлялась в моче транзиторно, в определенный период АНОГ (табл. 9).

Таблица 9. Транзиторно появляющиеся белки мочи в эксперименте с АНОГ

относительные сутки экспериментального периода

-7 5 16 21 + 1 +3 +6

нет богатый цистеином секреторный белок 1 гамма- глутамил- гидролаза манноеил-олигосахарид-1,2-альфа-маннозидаза 1А альфа-1 цепь коллагена СЗ-компонент комплемента Кад-герин 11

пептид ил-пролил-цис/трансизомераза фибулин-5 антиген CD9

урокиназный активатор плазминогена IgGFc-связывающ ий белок

гистон Н2В тип 1-D

Анализ биологических функций данных белков позволил сделать заключение, что в начальном периоде эксперимента активируются процессы, играющие роль в мужской фертильности, регуляции свертывания крови, процессы протеолиза, фибринолиза, клеточной адгезии, поддержания гомеостаза. В дальнейшем активируются процессы, связанные с обменом олигосахаридов; но сохраняется вовлеченность и регуляции протеолиза. В восстановительном периоде, последовательно активизируются процессы, связанные с регуляцией метаболизма коллагена и затем - системы комплемента. Позднее отмечается усиление процессов, которые обеспечивают взаимодействие клеток сосудистой стенки друг с другом для поддержания ее целостности, а также биологические процессы восстановления в местах адгезивных межклеточных контактов, в том числе, связанные с актиновым цитоскелетом.

Выявленные во время АНОГ белки синтезируются в различных тканях организма. Однако печень, почки и клетки крови являются основными тканями-продуцентами белков (табл. 10).

Таблица 10. Тканевая представленность белков,выявленных в моче добровольцев во время 21 суточной АНОГ.

Ткани Число экспрессируемых белков

1 2

мочевой пузырь 5

клетки крови 9

кости 7

костный мозг 7

толстая кишка 5

глаза 3

сердце 6

почки 9

гортань 9

печень 25

легкие 1

мыщцы 1

поджелудочная железа 8

периферическая нервная система 1

простата 8

кожа 7

тонкая кишка 1

мягкие ткани 5

селезенка 4

желудок 3

яички 2

тимус 1

язык 4

Девять тканей из этого перечня оказались относительно сильнее представлены в изученном протеоме по отношению к тканевой принадлежности белков из базы данных протеинов мочи человека. Среди 9 сверхпредставленных тканей, белки которых встречались в экспериментальных образцах, специфическими являлись семенники и почки, активация экспрессии белков в которых отмечена в течение первой недели и на выходе нз эксперимента, а также, для почек, - в ранний период адаптации (табл. 11).

Таблица 11. Дннамика сверхпредставленных тканей

относительные сутки экспериментального периода

-7 5 16 21 + 1 + 3 + 6

1 2 3 4 5 6 7

Плазма Плазма Плазма Плазма Плазма Плазма Плазма

1 2 3 4 5 6 7

Плазма Плазма Плазма Плазма Плазма Плазма Плазма

Желчь Желчь Желчь Желчь Желчь Желчь Желчь

Моча Моча Моча Моча Моча Моча Моча

Слюна Слюна Слюна Слюна Слюна Слюна Слюна

Поджелу- Поджелу- Поджелу- Поджелу- Поджелу- Поджелу- Поджелу-

дочная дочная дочная дочная дочная дочная дочная

железа железа железа железа железа железа железа

Лимфоциты Лимфоциты Лимфоциты Лимфоциты Лимфоциты Лимфоциты Лимфоциты

Мочевой Мочевой Мочевой Мочевой Мочевой Мочевой Мочевой

пузырь пузырь пузырь пузырь пузырь пузырь пузырь

семенные почки почки почки

пузырьки

Почки, как эффекторный орган водно-солевого обмена, играют центральную роль в ранних реакциях организма на условия АНОГ. Поэтому ожидаемыми оказались выявление 9 белков, принимающих участие в функциях почек в моче добровольцев -участников АНОГ: калликреин-1, аминопептидаза, кининоген-1, витамин К-зависимый белок, остеопонтин, мегалин, уромодулин, кубилин, эпидермальный фактор роста (табл. 12).

Таблица 12. Динамика почечных белков

Название белка относительные сутки эксперимента

-7 5 16 21 +1 +3 +6

калликреин 1 + + + + + + +

кининоген-1 + + + + + + +

витамин K-зависимый белок Z + + + + + + +

остеопонтин + + + + + + +

мегалин + + + + + + +

уромодулин + + + + + + +

кубилин + + + + + + +

эпидермальный факторроста + + + + + + +

аминопептидаза А + - - - + + +

Примечание: «+» - данный белок выявляется в пробе,«-» - данный белок не выявляется в пробе

Их функции, динамика частоты выявления в АНОГ содержат новый аспект в изучении функций почек в ответ на предъявленное воздействие.

Так же была определена динамика 13 белков, выявленных в моче во время АНОГ, принимающих участие в работе сердечно-сосудистой системы. Среди них присутствует тиоредоксин. Это стресс-индуцируемый белок, защищающий клетки от различных видов

повреждений; он так же осуществляет функции и в сердечно-сосудистой системе, появляется в моче добровольцев на 16 сутки АНОГ и исчезает к 3 суткам восстановительного периода (табл. 13).

Таблица 13. Дииамнка белков сердечно-сосудистой системы

Название белка относительные сутки эксперимента

-7 5 16 21 +1 +3 +6

альбумин + + + + + + +

церулоплазмин + + + + + + +

эндотелиальный рецептор протеина С + + + + + + +

калликреин-1 + + + + + + +

кининоген-1 + + + + + + +

остеопонтин + + + + + + +

простагландин-Н2 О-изомераза + + + + + + +

несекреторная рибонуклеаза + + + + + + +

кадерин-2 - + - + + - -

урокиназный активатор плазминогена - + - - - - -

цистатии-С - + + + + - -

гамма- глутамилтранспептидаза 1 - - - - - + +

тиоредоксин - - + + + - -

Примечание: «+»- данный белок выявляется в пробе,«-» - данный белок не выявляется в пробе

Часть этих белков осуществляет свои функции во внеклеточной жидкости (KLK1, KNG1), их динамика выявления во время АНОГ, является новым фактом, подлежащим экспериментальной верификации.

Гипокинезия или длительный постельный режим сопровождается уменьшением костной массы, в том числе, снижением минеральной плотности костей нижней половины скелета, и приводит к развитию структурно-функциональных изменений волокон постуральных мышц. В данном эксперименте с АНОГ была определена динамика 22 белков, участвующих в функциях костно-мышечной системы (табл. 14).

Таблица 14. Динамика костно-мышечных белков

Название белка относительные сутки эксперимента

-7 5 16 21 + 1 +3 +6

1 2 3 4 5 6 7 8

простат - специфический антиген + + + + + + +

витронектин + + + + + + +

кадгерин-1 + + + + + + +

тетранектин + + + + + + +

1 2 3 4 5 6 7 8

миелоидный клеточно-специфический богатый лейцином гликопротеин + + + + + + +

СВ44 антиген + + + + + + +

остеопонтин + + + + + + +

макрофагальный колониестимулирующий фактор 1 + + + + + + +

несекреторная рибонуклеаза + + + + + + +

муцин-1 + + + + + + +

проэпидермальный фактор роста + + + + + + +

фруктозо-1,6-бисфосфатаза + + + + + + +

мультимерин-1 + + - + + + +

активатор плазминогена урокиназного типа - + - - - - -

кадерин-2 - + - + + - -

индуцируемый пролактином белок - + - + + + +

хондроитшМ-сульфат протеогликан - + + + + + +

цистатин-С - + + + + - -

дипептидаза 1 - + + + - + +

бета-2 микроглобулин - - + + + + -

белок 8100-А8 (кальгранулин А) - - - - + - +

альфа-1 цепи коллагена - - - - + - -

Примечание: «+» - данный белок выявляется в пробе, «-»- данный белок не выявляется в пробе

Из представленных данных видно, что часть белков этой группы выявлялась с высокой частотой на протяжении всего эксперимента. Но другая часть - имела определенную динамику обнаружения в образцах. Так, белок кальгранулин А появлялся только на первые и шестые сутки после эксперимента. Известно, что белки 8100 принимают участие в регуляции процессов обмена Са2+, фосфоршшрования, организации цитоскелета. Возможно, эта динамика сопряжена с хорошо известными процессами, наблюдаемыми в условиях реальной или моделируемой гравитационной разгрузки.

Полученные данные показывают, что в начальном периоде эксперимента происходят процессы адаптации к факторам антиортостатической гипокинезии, выражающиеся в активации процессов, играющих роль в мужской фертилыюсти, свертывании крови, протеолизе, фибринолизе, регуляции адгезии, поддержании гомеостаза. В течение эксперимента усиливаются биологические процессы, связанные с протеолизом, обменом олигосахаридов.

В восстановительном периоде (ВП) активизируются процессы, связанные с метаболизмом коллагена, обеспечивающие прочность костной ткани, внеклеточного

30

матрикса. На 3 сутки ВП активизируется система комплемента; в дальнейшем, на 6 сутки - процессы, которые обеспечивают взаимодействие клеток сосудистой стенки друг с другом для поддержания ее целостности и осуществляющие восстановление в местах адгезивных межклеточных контактов, процессы с участием актинового цигоскелета, регуляция процесса сперматогенеза. Таким образом, подтверждаются старые представления и формируются новые гипотезы о вовлечении различных систем в процессы адаптации и реадаптации к действию на организм антиортостатической гипокинезии.

2.2. Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы, водно-солевого обмена и протеомом мочи в эксперименте с 5-суточной «сухой»

иммерсией

Более срочная реакция перераспределения жидкостных сред тела человека, чем в АНОГ, наблюдается в «сухой» иммерсии (Григорьев А.И., 1980; Суханов Ю.В. с соавт., 1991; Буравкова Л.Б., Ларина И.М., Попова И.А., 2003). Считают, что иммерсия является моделью, воспроизводящей этот эффект с высокой степенью соответствия данных изменений таковым в космическом полете. Условия иммерсии индуцируют заметное ухудшение функций сердечно-сосудистой системы, вызывая тахикардию покоя и уменьшение ударного объема, а также другие изменения (Иванов Г.Г. с соавт., 2011; Bart V. et al., 2007). Использование протеомных методов анализа белкового состава мочи и биоинформационных подходов (системы ANDSystem) позволило выявить в образцах мочи добровольцев, участников 5-суточной сухой иммерсии, 9 белков, осуществляющих свои функции в ССС (рис. 6).

Рисунок 6. Ассоциативная сеть выявленных белков ССС системы с помощью корреляции программой ANDvisio.

Частота выявления этих белков в образцах мочи характеризовалась различной динамикой в ходе эксперимента (рис. 7).

Фон - S ИМ 2 ИМ 4 ИМ 5 ПВ+3

Рисунок 7. Динамика белков мочи, выполняющих функции в сердечнососудистой системе в 5-суточной «сухой» иммерсии. 1- сывороточный альбумин, 2 - фетунн А, 3- цистатин-С, 4- Е-кадхерин, 5- витамин О связывающий белок, 6- перлекан, 7- калликреин-1, 8- кнниноген-1, 9-эпидермальный фактор роста.

Белки кининоген-1 и калликреин-1 относятся к калликреин - кининовой системе, которая вместе с ренин-ангиотензиновой системой регулируют тонус сосудов и обеспечивают оптимальный уровень оксигенации тканей. Связь между этими системами осуществляется на уровне проренина, который активируется калликреином, а также ангиотензин превращающего фермента, участвующего в деградации брадикинина и образовании ангиотензина II. Показано, что через 24 часа после начала иммерсионного воздействия происходит подавление активности ренин-ангиотензиновой системы, в частности, вдвое снижается активность ренина плазмы, повышаются диурез и экскреция натрия. Частота выявления в моче калликреина 1 (КЬКЛ), снизившись вначале СИ, затем нарастала до 100% и не восстанавливалась до фоновых значений в течение недели после окончания иммерсии, что свидетельствует об интенсивности вовлечения калликреин-кининовой системы в регуляторные функции в иммерсии, что ранее не изучалось.

Были также идентифицированы белки, которые демонстрируют чувствительность организма человека к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена (на 4 сутки эксперимента по сравнению с фоновыми значениями) (табл. 17).

Таблица 17. Корреляции частоты выявления отдельных белков с параметрами водно-солевого обмена _ _

Белки Корреляция частоты встречаемости белка с параметром водно-солевого обмена R p_val

1 2 3 4

MGA HUMAN Водопотребление 0,96 0,01

KLK1_HUMAN Экскреция жидкости -0,87 0,0 5

1 2 3 4

Экскреция натрия -0,97 0,01

Частичный водный баланс 0,96 0,01

ряогнимАЫ Экскреция жидкости -0,90 0,04

Экскреция натрия -0,87 0,06

Частичный водный баланс 0,90 0,04

сивы нимли Экскреция натрия -0,88 0,05

КШ1_НиМАЫ Водопотребление -0,87 0,06

05ТР_НиМАЫ Частичный водный баланс 0,91 0,03

Экскреция натрия -0,94 0,02

Изучение физиологических функций выявленных белков может, с одной стороны, подтвердить уже устоявшиеся представления о физиологическом ответе на иммерсионное воздействие, а с другой - предоставить новую информацию о ранее неизвестных механизмах адаптивного процесса.

3. Исследования протеома мочи здорового человека в условиях длительного космического полета

Космический полет воздействует на организм человека комплексом факторов, среди которых микрогравитация является ведущим и не воспроизводимым (с большой продолжительностью) на Земле. Возможность на молекулярном уровне выявить механизмы приспособления человека к земной силе тяжести после длительного пребывания на околоземной орбите дает возможность лучше понять направленность и диапазон физиологических изменений в организме человека, происходящих в условиях космического полета.

В первые сутки после длительных полетов в образцах мочи космонавтов было выявлено 243 различных белка, среди которых отмечались 34 протеина, которые встречались хотя бы один раз в трех повторах хромато-масс-спектрометрического анализа, но не обнаруживались, ни в пробах мочи фонового периода, ни в образцах, собранных космонавтами на 7 сутки после КП, ни в моче членов дублирующих экипажей. То есть они с большой вероятностью могут рассматриваться как «специфические» именно для воздействия условий КП. Тканевая принадлежность этих белков была определена согласно базе данных ТЮЕ11 (табл. 18).

Таблица 18. Тканевая принадлежность 34 специфичных для КП белков по базе данных ТЮЕК

Число

Орган, ткань организма белков

легкие 1

жкт (в т.ч. гортань, язык) 6

костный мозг 3

почки, мочевой пузырь 3

глаза 2

печень 2

кожа 1

сердце 2

предстательная железа 3

клетки крови 3

мышцы 3

селезенка 1

Для специфичных в условиях КП белков с помощью программы ВП^ГСО были определены 63 сверхпредставленных процесса. Наиболее сверхпредставленным, среди них, оказался процесс регуляции гомеостаза электролитов и минеральных веществ. Три белка, включенные в эту биологическую функцию (утероглобин, (3-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3), - также являются участниками системы антиоксидантной защиты, активация которой является специфичным для +1 суток сверхпредставленным процессом. Вторым по значимости процессом оказалась регуляция водного баланса организма, связанная с функцией почек. Всего для первых суток после приземления достоверно выявлялось 10 сверхпредставленных процессов.

Далее была осуществлена попытка связать основные из выявленных 63-х сверхпредставленных процессов с физиологическими изменениями, происходящими в различных системах организма в ранний восстановительный период, что ранее не осуществлялось.

В них вошли 9 процессов, связанных с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена; 3 процесса - с мышечной системой; 3-е функциями сердечнососудистой системы; 9-е перекисным окислением липидов и системой антиоксидантной защиты; 11-е иммунной системой; 5-е системой гемостаза; и 2 - с обменом веществ (рис. 8).

Peiy ляцая транспорта

роосоросии

(Сшоиын

мдгвпя 11 белок)

Ответ на нироперекнс ,, ,

Метабола»!

И ЛНИМДОГ

(1 белок)

реактивны* реактивные

форм кислорода (2 белка)

окислительный стресс (И белков) Катаболшм перекиси подоролл, клеточный ответ на реактивные кислорода (2 белка)

Рисунок 8. Примеры некоторых процессов первых суток после космического полета

Девять биологических процессов, которые связаны с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена (Таблица 19) определяют в организме человека, как транспорт воды, так и транспорт ионов.

Таблица 19. Процессы, связанные с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена

Биологические процессы Белки

1 2

Транспорт воды и водный обмен

Регуляция реабсорции осмотически свободной воды в нефроне аквапорин-2

Клеточный ответ на водные стимулы

Регуляция водного гомеостаза CD 63, протеин С, аквапорин-2, Р-субъединица гемоглобина, титин, просапозин

Системный почечный процесс аквапорин-2, Р-субъединица гемоглобина

Т ранспорт ионов

Ионный транспорт карбоновая ангидраза 1, протеин С, а-альбумин, Р-субъединица гемоглобина, калъпротектин, липокалин-1, просапозин, eIF-6, аквапорин-2, Ig лямбда -7 chain С регион, Ig kappa chain V-I регион Ni, агрин, титин, CD 63,

Транспорт бикарбонатов карбоновая ангидраза 1, р-субъединица гемоглобина

Регуляция транспорта ионов CD 63

Клеточный ответ на ионы магния фруктозо-1,6-бисфосфатаза 1

Транспорт кислорода через мембрану эритроцитов аквапорин-2

Так, в образцах мочи космонавтов после продолжительных полетов выявлялся аквапорин 2, белок апикальной мембраны эпителия собирательных трубок почек, формирующий молекулярный водный канат (пору) для переноса воды через липидный бислой мембран. Показано, что активация регуляции со стороны вазопрессина усиливает экскрецию аквапорина-2 с мочой, который поступает в мочу в составе экзосом небольшого размера. AQP2 может теряться при нарушении внутриклеточной рециркуляции, а также в состоянии усиленной почечной реабсорбции воды (Zhang Н., Tao L., Jiao X., 2007; Fröhlich М., Deen P.M., Klipp E.A., 2010). Именно этот процесс является характерным для состояния почки после приземления космонавтов. Практически все белки, указанные в Таблице 19, являются новыми участниками хорошо известных в космической физиологии процессов. Все белки, обнаруженные в моче участников АНОГ, входят также и в список 17 почечных белков космонавтов и дублеров (Пастушкова J1.X. с соавт., 2013). При сравнении белковой композиции мочи при наземном моделировании эффектов КП (21-суточная АНОГ) с таковыми после длительных космических полетов было показано, что в моче добровольцев не обнаруживается аквапорин-2, что связано, возможно, с более длительным и значимым воздействием на организм космических полетов. Так, от количества аквапорина-2 зависит повторное всасывание воды почками и, как следствие, объем выделяемой мочи, а так же, вероятно, выделяемого с мочой кальция (Peng J., Jones G.L., Watson К., 2000; Fröhlich M„ Deen P.M., Klipp E. A., 2010).

Из 63 биологических процессов, белки которых были выявлены на 1 сутки после полета, 3 были связаны с функциями мышечной системы, такими, как сборка саркомеров, развитие мышечного волокна, положительная регуляция синаптнческого роста в нервно-мышечном соединении. Уменьшение функциональных возможностей мышечной системы в условиях невесомости до сих пор является одной из основных медицинских проблем в длительных космических полетах. Наиболее очевидным следствием воздействия невесомости является потеря мышечной массы и связанные с ней функциональные нарушения, такие как снижение сократительных свойств мышц, выносливости и работоспособности человека, изменение (перестройка) системы метаборефлекторной регуляции. Очевидно, активация систем протеолиза цитоскелетных белков, таких как десмин, титин, лежит в основе мышечной атрофии, которая, в свою очередь, обуславливает снижение сократительных свойств мышц, выносливости и физической работоспособности (Григорьев А.И., Шенкман Б.С, 2008; Vikhlyantsev I.M. et al., 2011) (табл. 20).

Биологические процессы Белки

Структурно-функциональная организация мышечных клеток

Сборка саркомеров и механосигнальная роль в мышечных клетках титан

Развитие мышечного волокна титан, филамин С

Метаборефлекторная регуляция мышц

Положительная регуляция синаптического роста в нервно-мышечном соединении агрип

Также в образцах, собранных на первые сутки после полета, были выявлены белки, участники процессов, обеспечивающих адаптацию сердечно-сосудистой системы к земной гравитации после завершения КП: транспорта оксида азота, регуляции объемного кровотока, ответа на тироксиновые стимулы (табл. 21).

Таблица 21. Процессы, связанные с сердечно-сосудистой системой

Биологические процессы Белки

Регуляция тонуса сосудов

Транспорт оксида азота Р-субъединица гемоглобина

Регуляция объемного кровотока карбоновая ангидраза 1, CD 63, а-альбумин, аквапорин-2, в-субъединица гемоглобина, Ig лямбда-7 цепь С региона, Ig kappa chain V-I регион Ni, титин, просапозин

Белок сердца, связанный со стрессом

Ответ на тироксиновые стимулы тиоредоксин

Бета-субъединица гемоглобина - это белок, который участвует не только в транспорте кислорода из легких в различные ткани, но и в переносе окиси азота; он также потенцирует активность брадикинина, что приводит к снижению кровяного давления. Специфичным для первых суток послеполетного периода оказался и белок тиоредоксин, относящийся к классу малых окислительно-восстановительных молекул, которые экспрессируются почти во всех тканях организма, включая кардиомиоциты, и имеют важное значение для жизнеспособности клетки. Он выявляется в моче на первые, а также на 16 и 21 сутки АНОГ. Возможно, он появляется не только в 1-ые сутки после полета, но также и во время полета, однако, имелась возможность обследовать космонавтов только на первые и 7 сутки после космического полета.

37

Среди специфичных для +1 суток после КП белков нами были обнаружены те, которые участвуют в 9 процессах, связанных с перекисным окислением липидов, с регуляцией и метаболизмом активных форм кислорода (табл. 22).

Таблица 22. Процессы, связанные с перекисным окислением липидов _и антиоксидантной активностью

Биологические процессы Белки

1 2

Перекисное окисление липидов

Ответ на гидроперекиси липидов глутатион-пероксидаза

Метаболизм реактивных форм кислорода ß-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза,

Регуляция клеточного ответа на окислительный стресс

Ответ на стресс CD 63, утероглобин, протеин С, аквапорин-2, (i-субъединица гемоглобина, Ig лямбда -7 chain С регион, тиоредоксин, Ig kappa chain V-I регион Ni, кальпротектин, глутатион-пероксидаза 3, титнн

Регуляция и метаболизм АФК

Ответ на кислород-содержащие соединения утероглобин, аквапорнн, 2р-субьединица гемоглобина, тиоредоксин, кальпротектин, глутатион-пероксидаза 3

Ответ на реактивные формы кислорода утероглобин, ß-субъедшпща гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3

клеточный ответ на перекись водорода ß-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3

Метаболизм перекиси водорода

Клеточный ответ на реактивные формы кислорода

Катаболизм перекиси водорода

Ранее было показано, что после продолжительных космических полетов у космонавтов обнаруживаются признаки ингибирования процесса перекисного окисления липидов, а также достоверный рост уровня липидного антиоксиданта - токоферола (Маркин A.A., Журавлева O.A., 2001; Selvaraj N. et al. 2008). Отмечалось, что системы иммунитета, гомеостаза и липидного обмена функционируют в тесной связи друг с другом (Бышевский А.Ш. с соавт., 2003). В данном исследовании на первые сутки после

КП были выявлены процессы, связанные с регуляцией функций иммунитета, в которой принимают участие 13 белков.

Таким образом, при изучении белкового состава мочи космонавтов после завершения продолжительных полетов удалось выявить специфические белки, участники физиологических процессов, характерных для процессов реадаптации к земным условиям жизнедеятельности.

Специфичными сверхпредставленными для +1 суток периода восстановления после полета, как правило, были процессы, происходящие во многих клетках и тканях. С помощью ручной аннотации белков и биоинформационных методов, использованных в данной работе, удалось связать хорошо известные и документированные ранее биологические факты и физиологические особенности состояния космонавтов на первые сутки после завершения полетов, с выявленными в моче белками.

Кроме подтверждения на молекулярном уровне механизмов раннего периода реадаптации, были также выявлены процессы, не изученные ранее, но происходящие в организме с участием обнаруженных белков. Построение ассоциативных сетей белок-белковых взаимодействий дало возможность выдвинуть гипотезы о взаимном влиянии и взаимной вовлеченности процессов, происходящих во внеклеточной жидкости при адаптации к КП и моделируемым его эффектам. Исследование протеома мочи человека на первые сутки после окончания КП, в острый период реадаптации организма человека к земной гравитации, позволило выявить многообразие механизмов приспособления организма человека к условиям жизнедеятельности на Земле после длительного пребывания на околоземной орбите.

Таким образом, показано, что использование методов протеомики на основе масс-спектрометрии дает значимые результаты при изучении молекулярных механизмов адаптации организма здорового человека к экстремальным условиям жизнедеятельности. При исследовании в качестве биологического материала образцов мочи удается выявлять сотни различных белков, преимущественно синтезируемых в различных тканях и типах клеток организма. Современные биоинформационные подходы позволяют построить гипотезы об участии выявляемых белков в физиологических функциях. С одной стороны, это подтверждает уже устоявшиеся представления о физиологическом ответе на воздействие, а с другой - предоставляет новую информацию о ранее неизвестных участниках и механизмах адаптивного процесса.

Выводы

1. Использование высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-масс-спектрометрии позволяет выявить в моче здоровых лиц сотни различных белков, принадлежащих большинству тканей организма человека. Вариабельность белкового состава мочи здорового человека зависит от возраста обследуемого, характера рациона питания, уровня двигательной активности. Выявлено 23 белка, которые чаще обнаруживаются в моче с увеличением возраста обследуемых (р<0.05). Отмечается корреляция между возрастом добровольцев и числом белков (11=0.566; р-уа1ие=1.24Е-05), а также их массой (11=0.429; р-уа1ие=0.00079).

2. Во время 520-суточного периода изоляции у добровольцев, при жизнедеятельности в контролируемых условиях, в моче постоянно выявлялись 7 белков, синтезируемых преимущественно печенью и клетками крови и осуществляющих свои функции во внеклеточном пространстве. Анализ молекулярных функций и биологических процессов показал низкую функциональную связанность этих белков между собой. Идентифицированные белки могут представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме здорового человека, а также использоваться как стандарты при определении концентрации других белков в моче.

3. Изменения в уровне солепотребления у здоровых лиц в диапазоне 6-12 г/сут позволили выявить 21 белок, чья частота обнаружения в моче достоверно коррелировала с режимом солепотребления в контролируемых условиях жизнедеятельности на протяжении 105 суток. Биоинформационный анализ протеомных данных методом построением самоорганизующихся карт показал, что эффекты, вызванные изменением солепотребления, проявлялись в изменении активности различных биологических процессов, протекающих с участием выявленных белков. При солепотреблении 12 г/сут отмечена максимальная активность синтеза белка (27%), снижавшаяся на 7% при солепотреблении 6-9 г/сут. Период солепотребления 12 г/сут характеризовался стимуляцией процессов ангиогенеза, клеточной адгезии, почечной экскреции натрия, регуляции водного обмена. В период солепотребления 6-9 г/сут активизировались процессы ремоделирования хроматина, антиоксидантной защиты, липидного обмена, регуляции апоптоза. За неделю восстановительного периода белковая композиция мочи не

возвращалась к фоновому паттерну, что указывает на инертность биологических процессов, в которые были вовлечены данные белки-участники.

4. В ранний период пребывания здоровых добровольцев-мужчин в условиях антиортостатической гипокинезии активируются процессы свертывания крови, протеолиза, фибринолиза, регуляции клеточной адгезии и подавляется активность пролиферации клеток соединительной ткани. Через 3 недели пребывания в АНОГ в организме активизируются процессы: протеолиза, обмена олигосахаридов; но снижается активность процессов образования активных форм кислорода, ангиогенеза, тромбоцитарного гомеостаза. Восстановление функциональной активности биологических процессов после АНОГ носит стадийный характер. Последовательно восстанавливаются: метаболизм коллагена, регуляция системы комплемента, межклеточных взаимодействий эндотелия сосудов, а также пролиферации и адгезии клеток мышечной и костной систем в процессах их ремоделирования.

5. В условиях АНОГ в моче добровольцев выявлено 9 белков — «минорных» участников регуляции водного баланса организма; 13 протеинов, принимающих участие в осуществлении функций сердечно-сосудистой системы и 22 белка, участвующих в регуляции функций костно-мьппечной системы. Большинство из них не исследовались ранее применительно к адаптации организма человека в АНОГ. Белковая композиция мочи за неделю восстановительного периода не восстанавливается до фоновых значений.

6. Изменения белкового состава мочи здоровых лиц в условиях «сухой» иммерсии свидетельствуют об изменении функций почек, а также развитии дисфункции эндотелия сосудов. В этих условиях выявлено 9 белков, осуществляющих свои функции в сердечно-сосудистой системе.

7. В моче 15 космонавтов после завершения полетов продолжительностью от 169 до 199 суток выявлены 34 специфических белка, участвующие в процессах реадаптации организма к земным условиям, которые не обнаруживались ни в пробах мочи фонового периода или образцах, собранных космонавтами на 7 сутки после космического полета, ни в моче членов дублирующих экипажей.

8. Были подтверждены, на молекулярном уровне, ранее известные механизмы

раннего периода реадаптации после продолжительных КП: активация регуляции

гомеостаза электролитов и минеральных веществ (биологический процесс

сверхпредставлены: р-уа1ие = 2.2* 10"6). Также, были выявлены новые участники

биологических процессов периода реадаптации: агрин, играющий центральную роль в

41

формировании и поддержании нервно-мышечных контактов, в дифференциации постсинаптических структур; десмин и титнн, выявляемые в результате протеолиза цитоскелета мышечных клеток. В этих образцах были выявлены белки, участники реадаптации сердечно-сосудистой системы к земной гравитации, обеспечивающие транспорт оксида азота и регуляцию объемного кровотока.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ларина И.М., Кусто М.-А., Пастушкова Л.Х., Васильева Г.Ю., Доброхотов И.В., Истомина В.Э. Со стояние водно-электролитного обмена, функции почек и микроциркуляторного русла кожи, обследуемых во время 7-суточной «сухой» иммерсии //Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2008. - № 5. - С. 29-35.

2. Ларина И.М., Носков В.Б., Ничипорук H.A., Пастушкова Л.Х., Васильева Г.Ю. Влияние десмопрессина на водно-солевой гомеостаз и ортостатическую толерантность в условиях антиортостаза //Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2008. - №6. - С. 3 - 20.

3. Доброхотов И.В., Пастушкова Л.Х., Ларина И.М. Исследование протеома мочи здорового человека // Авиакосмическая и экологическая медицина. -2009. - №3. -С. 3 -11.

4. Пахарукова H.A., Носовский A.M., Пастушкова Л.Х., Трифонова О.П., Ларина И.М. Выбор статистического подхода для анализа протеомных профилей сыворотки крови здорового человека // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2009. - №.4. - С. 60- 66.

5. Трифонова О.П., Пастушкова Л.Х., Саменкова Н.Ф., Пятницкий М.А., Карузина И.И., Лисица A.B., Ларина И.М. Изменение белкового состава плазмы крови в эксперименте с 7-суточной "сухой" иммерсией // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2010. - Т.44. - №.5. - С. 24 - 28.

6. Валеева O.A., Пастушкова Л.Х., Пахарукова H.A., Доброхотов И.В., Ларина И.М. Вариабельность протеома мочи здорового человека в эксперименте с 105-суточной изоляцией в гермообъекте // Физиология человека. - 2011. - Том 37. - № 3. - С. 98 -102.

7. Носков В.Б., Ларина И.М., Пастушкова Л.Х., Доброхотов И.В., Валеева O.A., Купэ М., Кусто М.А., Новоселова A.M. Функционирование почек и состояние

жидкостных сред организма человека в условиях 5-суточной иммерсии // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2011. - Т. 45. - № 6. - С. 22 - 26.

8. Ларина И.М., Колчанов H.A., Доброхотов И.В., Иванисенко В.А., Деменков П.С., Тийс Е.С., Валеева O.A., Пастушкова Л.Х., Николаев E.H. Реконструкция ассоциативных белковых сетей, связанных с процессам регуляции обмена и депонирования натрия в организме здорового человека, на основе изучения протеома мочи // Физиология человека. - 2012. - Т. 38. - № 3. - С. 107 -115.

9. Пастушкова JT.X., Валеева O.A., Кононихин A.C., Николаев E.H., Попов И.А., Ларина И.М., Доброхотов И.В., Иванисенко В.А., Тийс Е.С., Колчанов H.A. Анализ белковых взаимодействий на основе изучения протеома мочи человека в эксперименте со 105-суточной изоляцией // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2012. - Т. 46. - №2. - С. 37 - 43.

10. Пастушкова JI.X., Пахарукова H.A., Новоселова Н.М., Доброхотов И.В., Валеева O.A., М.-А. Кусто, Ларина И.М. Прямое протеомное профилирование мочи и сыворотки крови человека в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2012. - Т. 46. - № 4. - С. 31 -37.

11. Пастушкова Л.Х., Валеева O.A., Кононихин A.C., Николаев E.H., Ларина И.М., Доброхотов И.В., Попов И.А., Почуев В.И., Киреев К.С. Изменения белковой композиции мочи человека после продолжительных орбитальных полетов // Бюллетень экспериментальной биологин и медицины. - 2013. - Т. 15. - № 8. -С.166- 170.

12. Пастушкова JI.X., Киреев К.С., Ларина И.М., Григорьев А.И. Формирование протеома мочи здорового человека (обзор) // Физиология человека. - 2013. - Т. 39. -№2. - С. 43 - 59.

13. Пастушкова Л.Х., Киреев К.С., Кононихин A.C., Тийс Е.С., Попов И.А., Доброхотов И.В., Иванисенко В.А., Носков В.Б., Ларина И.М., Николаев E.H. Обнаружение белков тканей почек и мочевыводящей системы в моче человека после космического полета// Физиология человека. - 2013. - Т. 39. - №.5. - С. 1 - 6.

14. Пастушкова Л.Х., A.C. Кононихин, Е.С. Тийс Е.С., Попов, И.В., Доброхотов, В.А. Иванисенко, E.H. Николаев, И.М. Ларина. Изучение протеома мочи для оценки состояния сердечно - сосудистой системы у человека после космического полета // Российский физиологический журнал. - 2013. - № 8. - С. 945 - 959.

15. Пастушкова Л.Х., Киреев К.С., Кононихин A.C., Тийс Е.С., Попов И.А., Доброхотов И.В., Кусто М-А., Иванисенко В.А., Колчанов H.A., Николаев E.H.,

Почуев В.И., Ларина И.М. Постоянные белки мочи здорового человека в эксперименте с 520-суточной изоляцией //Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2014. - Т.48. - № 1. - С. 48 - 54.

16. Пастушкова Л.Х., Доброхотов И.В., Веселова О.М., Тийс Е.С., Кононихин А.С., Новоселова A.M., Купе М., Кусто М-А, Ларина И.М. Идентификация белков сердечно-сосудистой системы у здоровых лиц в «сухой» иммерсии посредством изучения протеомного профиля мочи // Физиология человека. - 2014. - Т.40. -№3. -С.109- 119.

17. Пастушкова Л.Х. Кононихин А.С., Тийс Е.С., Образцова О.А., Доброхотов И.В., Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Ларина И.М. Выявление значимо представленных биологических процессов по составу протеома мочи на первые сутки после длительных космических полетов // Российский физиологический журнал. - 2015. -№2. (в печати).

18. Pakharukova N.A., Pastushkova L.Kh., Larina I.M., Grigoriev A.I. Changes of human serum proteome profile during 7-day "dry" immersion. //Acta Astronáutica. -2011. - 68. P. 1523—1528.

19. Navasiolava N.M., Pajot A, Gallois Y, Pastushkova L.Kh., Kulchitsky V.A., Gauquelin-Koch G, Kozlovskaya I.B., Heer M, Hand O, Larina I.M., Custaud M-A. NT-ProBNP levels, water and sodium homeostasis in healthy men: effects of 7 days of dry immersion. // Eur J Appl Physiol. - 2011. - Sep;l 11(9):2229-37.

20. Pastushkova L.Kh., Valeeva O.A., Kononikhin A.S., Nikolaev E.N., Larina I.M., Dobrokhotov I.V., Popov I.A., Pochuev V.I., Kireev K.S., Grigoriev A.I. Changes in urine protein composition in human organism during long term space flights. //Acta Astronáutica, 2012. - 81. - P. 430-434.

21. Pastushkova L.Kh., Kireev KS, Kononikhin AS, Ivanisenko VA, Larina IM, Nikolaev EN. Detection of renal and urinary tract proteins before and after spaceflight. Aviat Space Environ Med. 2013 Aug; 84(8):859-63.

22. Pastushkova L.Kh., Kireev KS, Kononikhin AS, Tiys ES, Popov IA, Starodubtseva NL, Dobrokhotov IV, Ivanisenko VA, Larina IM, Kolchanov NA, Nikolaev EN. Detection of renal tissue and urinary tract proteins in the human urine after space flight. PLoS One. 2013 Aug 13; 8(8):e71652.

23. Coupé M., Tomilovskaya E., Larcher F., Diquet В., Pastushkova L.Kh., Kozlovskaya IB., Larina I.M., Gauquelin-Koch G„ Kulchitsky V.A., Custaud M-A., Navasiolava

N.M. Body Fluid Changes, Cardiovascular Deconditioning and Metabolic Impairment Are Reversed 24 Hours after a 5-Day Dry Immersion. // Open Journal of Nephrology. -2013. -3. -P. 13-24

24. Larina I.M., Nikolaev.E.N, Pastushkova L.Kh., Valeeva O.A., Kononihin A.S., Kireev K.S., Tiys E.S., Ivanisenko V.A., Kolchanov N.A. Changes in protein composition of human urine after prolonged orbital flights. The eighth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology/ BGRS/SB 12. // Novosibirsk - Russia -June 25-29. -2012. - Book of Abstracts, P.177.

25. Ларина И.М., Пастушкова Л.Х., Образцова O.A., Доброхотов И.В., Кононихин А.С., Николаев Е.Н., Попов И.А., Киреев К.С., Тийс Е.С., Иванисенко. В.А., Колчанов Н.А. Изменения в протеоме мочи космонавтов после продолжительного космического полета. // В кн.: Доклады III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, 22-24 ноября 2012, С. 87-88.

26. Pastushkova L.Kh., Kireev K.S., Tiys E.S., Kononikhin A.S., Popov I.A., Dobrokhotov I.V., Ivanisenko V.A., Larina I.M., Nikolaev E.N., Kolchanov N.A. Detection of renal tissue and urinary system proteins in the urine after space flight. // Book of Abstracts, 11th Annual World Congress HUPO, Boston, Massachusetts, Sept.9-14. -2012. -P.160.

27. Ларина И.М., Николаев E.H., Пастушкова Л.Х., Валеева О.А., Доброхотов И.В., Кононихин А.С., Киреев К.С., Тийс Е.С., Иванисенко В.А. Изменение белковой композиции мочи космонавтов после продолжительных орбитатьных полётов. // Юбилейная конференция, посвященная 50-летию ИМБП. Москва, 28-30 сент., 2013.

28. Pastushkova L.Kh., Kireev K.S., Kononokliin A.S., Dobrokhotov I.V., Popov I.A., Valeeva O.A., Starodubtseva N.L., Ivanisenko V.A., Demenkov P.S., Tiys E.S., Kolchanov N.A., Larina I.M., Nikolaev E.N. Human urine proteome changes induced by space flight. //Proteomic Forum. - Berlin -2013. -Book of abstracts. - P. 123-124.

29. Pastushkova L.Kh., Kireev K.S., Kononokhin A.S., Dobrokhotov I.V., Popov I.A., Starodubtseva N.L., Ivanisenko V.A., Demenkov P.S., Tiys E.S., Kolchanov N.A., Larina I.M. Nikolaev E.N. Human urine proteome changes induced by space flight. // Book of Abstracts, 12th Annual World Congress HUPO, Yokohama, Japan, Sept.14-19, 2013.

Подписано в печать: 22.04.2015 Тираж: 100 экз. Заказ № 1309 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 wwvv.reglet.ru