Автореферат и диссертация по медицине (14.03.08) на тему:Характеристика протеомного профиля сыворотки крови здорового человека при воздействии факторов космического полета

На правах рукописи

ПАХАРУКОВА НАТАЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-2 СЕН 2010

Москва-2010

004607860

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

кандидат биологических наук Мошковский Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится « » С£Ит9й№ 2010 г. на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 при Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН), г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а

Автореферат разослан « 19 » июлЯ_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

В настоящее время протеомика активно развивается во многих странах мира и занимает ведущие позиции в научных программах современной прикладной и фундаментальной биологии, а также фармацевтики и смежных с ней дисциплин. С развитием протеомихи связывают большие надежды по внедрению новых подходов в диагностике различных заболеваний и создании новых лекарственных соединений [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002]. Однако, несмотря на ведущиеся во всем мире исследования по направленному поиску биомаркеров различных патологических состояний, систематическое изучение протеома здорового человека только начинается. Отдельные попытки охарактеризовать вариабельность белков печени [Zhang X. et al., 2006], панкреатического сока [Chen R. et al., 2005] и плазмы крови [Nelsestuen G.L. et al., 2005], предпринятые в недавних исследованиях, не дают представления о групповой вариабельности белков в большой выборке обследуемых и об изменениях белковой композиции за длительный период времени. Кроме того, большой интерес представляет характеристика вариабельности белковой композиции у специально отобранной группы здоровых людей для определения интервала физиологической нормы различных белков внутри человеческой популяции.

Очевидно, что протеом здорового человека в состоянии сохранения организмом его функциональных резервов чрезвычайно пластичен. Помимо значительных различий протеомного профиля у разных индивидуумов и естественных колебаний индивидуального протеома во времени, существуют вариации количественного содержания и качественного состава белков, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий. Так, на протеом сыворотки крови могут оказать влияние различные факторы: питание (содержание в пище жиров и белков), курение, занятия спортом, длительный постельный режим [Anderson N.L. and Anderson N.G., 2002] и циркадианные ритмы [Linkowski Р. et al., 1998].

При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах, имитирующих отдельные стороны космической экспедиции, человек сталкивается с непривычными для него условиями. Изменения, происходящие в организме, затрагивают все системы органов, в том числе модифицируется и белковый состав крови. С помощью различных биохимических методов (например, радиоиммуннологического анализа, иммунодиффузии, электрофореза в ацетатцеллюлозном геле) были проанализированы изменения многих гормонов белковой

природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) [Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999], компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980: Герцик Ю.Г., 2004], белков системы свертывания крови [Фомин, А.Н., 1981] и «острой» фазы [Ларина О.Н., 1992; 2006], ферментов [Маркин A.A., 2001], в т.ч. протеолитических [Тигранян с соавт., 1987]. Протеомные методы для анализа изменений белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не использовались.

Сыворотка крови человека является удобным объектом для исследований, поскольку содержит белки практически всех тканей организма, и изучение ее протеомного состава может дать достаточно полную информацию о физиологическом состоянии организма. Однако присутствие в ней солей и высококопийных белков, среди которых содержание альбумина и глобулинов составляет более 90%, и большой динамический диапазон концентраций белков (10-11 порядков) [Anderson N.L. et al., 2004] значительно затрудняет анализ белковой композиции при использовании одного конкретного методического подхода. Поэтому для комплексной оценки протеома сыворотки необходимо сочетание различных технологических платформ (как разделения сложных белковых смесей, так и детектирования белков). Технология прямого протеомного масс-спектрометрического профилирования сочетает предварительное фракционирование образцов сыворотки на магнитных частицах или других носителях, которые связывают белки с определенными свойствами, и масс-спектрометрический анализ смеси пептидов и белков, ионизированных с помощью матрицы. Данная технология является высокопроизводительной, позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков (до 17000 Да) и белковых фрагментов, составляющих так называемый низкомолекулярный субпротеом, а также посттрансляционные модификации (PTMs) белков. Оценка изменений многих компонентов низкомолекулярного субпротеома и PTMs белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не проводилась. Таким образом, использование протеомных подходов дает возможность уточнить и дополнить картину изменений композиции белков сыворотки при воздействии факторов космического полета, что приведет к пониманию молекулярных механизмов сохранения гомеостаза в экстремальных условиях среды и позволит в будущем разработать принципиально новые средства профилактики неблагоприятных последствий действия микрогравитации. Характеристика состояния здоровья человека в гипоксической аргоносодержащей среде представляет интерес в плане ее возможного использования в замкнутых объектах различного назначения (возможно, и на космической станции) для обеспечения

пожаробезопасности.

Цель работы; характеристика протеомного профиля сыворотки крови здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета и в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. Задачи исследования:

1) выбор наиболее воспроизводимого метода прямого протеомного профилировали! сыворотки крови;

2) изучение групповой и индивидуальной вариабельности протеома сыворотки крови здорового человека;

3) оценка изменений протеомного профиля сыворотки после длительных космических полетов и при воздействии условий модельных .экспериментов (антиортостатической гипокинезии, «сухой» иммерсии, изоляции в гермообъеме);

4) характеристика изменений белковой композиции сыворотки крови в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды.

Научная новизна работы

Впервые была проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека за длительный период времени (до 12 месяцев). Были выявлены наиболее пластичные и стабильные компоненты протеомного профиля. Охарактеризованы изменения белковой композиции сыворотки крови, включая пептиды, полноразмерные белки и их изоформы, фрагменты и метаболиты после длительных космических полетов и в ходе различных наземных экспериментов (1-суточная антиортостатическая гипокинезия, 7-суточная «сухая» иммерсия, 105-суточная изоляция в гермообъеме, 9-суточная изоляция в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде) с помощью технологии прямого масс-спектрометрического профилирования. Теоретическая и практическая значимость работы

В ходе данной работы были обнаружены белковые компоненты, характеризующиеся высокой индивидуальной и групповой вариабельностью внутри группы здоровых лиц, что ограничивает использование данных белков как потенциальных биомаркеров различных дизрегуляторных состояний и дисфункций в физиологии, а также патогенетических маркеров в клинической протеомике. Белки и пептиды, обладающие незначительной дисперсией в группе здоровых лиц, напротив, могут представить важную информацию о состоянии здоровья при резком изменении их уровня.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Техно логическая платформа, включающая прямое масс-спектрометрическое профилирование после префракционирования сыворотки крови на магнитных частицах МВ WCX является информативным и воспроизводимым методом анализа ее белковой композиции;

2. Низкомолекулярный субпротеом сыворотки крови здоровых лиц в условиях обычной жизнедеятельности характеризуется значительной групповой и индивидуальной вариабельностью;

3. Длительные космические экспедиции и эксперименты с моделированием воздействия факторов космического полета вызывают функциональную перестройку белковой композиции сыворотки крови, проявляющуюся в изменении пиков белков «острой фазы» и липидного обмена, а также протеолитических ферментов.

4. 9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды приводит к уменьшению площадей пиков большинства изученных пептидов, белков и белковых фрагментов, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на следующих конференциях; VII, VIII, IX конференциях молодых ученых специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 9 апреля, 2008 г., 14 апреля, 2009 г., 14 апреля, 2010 г.); 17-ом международном симпозиуме «Человек в космосе» (Москва, 7-11 июня, 2009 г.); 30-ом и 31-ом международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Сиань, Китай, 24-29 мая, 2009 г., Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня, 2009 г.); 3-ей протеомной конференции стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 25-27 ноября 2009 г.); Российско-французско-белорусской конференции «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.). Список публикаций по материалам диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.

Работа выполнена в лаборатории «Метаболизм и иммунитет» ГНЦ РФ - ИМБП

РАН в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», при поддержке программы ОБН РАН, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ-3402.2008.4 и РФФИ № 08-04-01533-а.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов и списка литературы. В диссертации приведены 17 таблиц и 28 рисунков. Список использованной литературы содержит 93 отечественных и 161 зарубежных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследований

Объект исследования: В качестве объекта исследований были использованы пробы сыворотки крови здоровых мужчин, в том числе космонавтов, совершивших длительные орбитальные полеты на МКС (7 человек), и добровольцев, участвовавших в модельных экспериментах (27 человек). Также была исследована индивидуальная (у 15 человек) и групповая вариабельность протеома (в группе из 58 человек) в привычных условиях жизнедеятельности. Указанные здоровые обследуемые являлись группой сравнения для всех экспериментов. Общий объём проведённых исследований представлен в табл. 1. Программы исследований всех экспериментов были одобрены комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Все обследуемые были ознакомлены с условиями проведения экспериментов и подписали информированное согласие на добровольное участие в них.

Циклограмма отбора образцов крови: Пробы крови российских космонавтов-мужчин были получены за 45-60 суток до начала полета и на 1-ые и 7-ые сутки после окончания экспедиции. В эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-15°) (АНОГ) отбор проб крови осуществляли за 8 часов до начала эксперимента и через 24 часа после начала эксперимента в каждой серии; в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией - за 7 суток до начала воздействия, на 7-ые сутки эксперимента и на 7 сутки периода реадаптации; в эксперименте со 105-суточной изоляцией - за 15 и 7 суток до начала изоляции, на 16-17, 51-52, 85-86 сутки изоляции и через 7-8 и 14-15 суток после ее окончания; в эксперименте с 9-суточной изоляцией в барокамере - за 2 суток до начала эксперимента, в день начала эксперимента за 3 часа до «погружения», на 6-ые и 9-ые сутки изоляции и на 1-ые сутки периода восстановления. Для определения индивидуальной вариабельности протеомного профиля в привычных условиях жизнедеятельности у 5 здоровых мужчин отбирали пробы крови на 1-ые, 2-ые, 6-ые, 9-ые, 14-ые, 21-ые, 28-ые; 45-ые; 60-ые сутки. Также у 5 человек были проанализированы изменения масс-спектров сыворотки крови через 6-7 месяцев, и у 10 человек - через 11-12 месяцев. Отбор проб проводили утром, натощак. Все участники имели заключение врачебной экспертной комиссии о состоянии их здоровья на момент обследования.

Получение проб сыворотки крови: Образцы крови оставляли на 30 минут при комнатной температуре для формирования сгустка, далее центрифугировали при 4500g в течение 15 минут без охлаждения, затем аликвоты сыворотки замораживали при температуре -80°С.

Предобработка образцов сыворотки с использованием магнитных частиц:

Очистка и концентрация белков из проб сыворотки осуществлялась с помощью наборов магнитных частиц MB WCX, MB IMAC Си, MB WAX. Все шаги пипетирования

растворов, отделения магнитных частиц и нанесения на MALDI-мишень AnchorChip (600/384) выполнялись роботом ClinProtrobot с помощью программы ClinProtRobot 1.3 («Bruker Daltonics»). В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксикорнчную кислоту (0,3 мг/мл в растворе ацетон/этанол в соотношении 1:2). Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Использовали растворители высокой степени очистки («Мегск», Германия).

Таблица 1. Объём проведенных исследований

Эксперимент Количество участников Средний возраст (max-min) Количество проб

Длительные космические полеты (169-199 суток) 7 космонавтов-мужчин 43 года (35-51) 21

24-часовая антиортостатическая гипокинезия (-15°) -контрольная группа (6 чел.); -группа с применением десмопрессина (6 чел.); 26 лет (22-39); 26 лет (22-39) 24

7-суточная «сухая» иммерсия - контрольная группа (5 чел.); - группа с применением низкочастотной электромиостимуляции (5чел.); - группа с применением механической стимуляции опорных зон стопы (6 чел.) 25 лет (23-29); 25 лет (21-31); 23 года (21-26) 48

105-суточная изоляция в гермообъеме 6 чел. 33 года (25-41) 42

9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды (13,53%, 28,26%, 58,21%) 4 чел. 32 года (25-46) 20

Групповая вариабельность 36 чел. 11 чел. 11 чел. 25 лет (21-29); 35 лет (31-39); 45 лет (40-51) 58

Индивидуальная вариабельность 12 чел. 34 года (20-51) 61

Префракционирование образцов сыворотки с использованием микронаконечников ZipTip С18: Концентрирование и обессоливание белков с помощью микронаконечников ZipTip С18 проводили в соответствии с протоколом производителя («Millipore»). Проба сыворотки (1,5 мкл) была разбавлена в 10 раз и подкислена 1% раствором трифторуксусной кислоты (ТФУ). Наконечник промывали 100% ацетонитрилом, затем 0,1% ТФУ. Далее образец 10-15 раз пропускали через наконечник для связывания пептидов и белков, после чего промывали 0,1% ТФУ. Затем белки элюировали раствором ацетонитрила и 1% ТФУ в соотношении 3:2. Элюат помещали в чистую пробирку и смешивали с а-циано-4-гидроксикоричной кислотой (0,3 мг/мл в

растворе ацетон/этанол=1:2) в отношении 1:10, затем 0,8 мкл раствора бьшо нанесено на мишень MALDI-TOF AnchorChip (600/384).

Масс-спектрометрические измерения: Масс-спектры (диапазон масс от 1000 до 17000 Да) были получены на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF (Broker Daltonics), работающем в положительном линейном режиме. Калибровка масс-спектрометра осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»).

Анализ масс-спектров: По каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»)). Эти данные экспортировали в таблицы MS Excel, и значения площадей в повторных измерениях усредняли. Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ Flex Analysis 3.0 и Statistica 6.0 (кластерный анализ, древовидная кластеризация, мера расстояния -евклидово расстояние).

Статистический анализ: Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows). Межгрупповые отличия считали достоверными при р<0,05.

Тандемная масс-спектрометрия и идентификация отличающихся пиков: Идентификацию достоверно отличающихся пиков проводили посредством прямого MS/MS анализа на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF («Bruker Daltonics») с помощью метода LIFT. Интерпретацию MS/MS спектров осуществляли с использованием программы BioTools («Bruker Daltonics»), соединенной с сервером Mascot (www.matrixscience.comV Некоторые пики были определены на основании сопоставления точного значения m/z пика в спектре и его идентификации в данных других исследователей.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор воспроизводимой технологии для прямого протеомного профилирования сыворотки

Для выбора наиболее воспроизводимого метода при анализе протеома сыворотки были проверены следующие технологии прямого масс-спектрометрического профилирования: префракционирование образцов магнитными частицами MB WCX (принцип катионообменной хроматографии), MB IMAC Си (металл-афинная хроматография), два варианта обработки проб магнитными частицами MB WAX (анионообменная хроматография), с очисткой элюата магнитными частицами MB HIC (обращенно-фазовая хроматография) и без нее; и микрохроматографическими насадками ZipTip С18 (обращено-фазовая хроматография). Сыворотка крови здорового донора была префракционирована в 10 повторах, и с каждого повтора получено по 4 спектра. Спектры, резко выделяющиеся из общего набора данных («выбросы»), не учитывали при расчете коэффициента вариации (CV) метода. Таким образом, для определения наиболее воспроизводимого метода принимали во внимание количество «выбросов» и значение

коэффициента вариации. Количество выбросов и коэффициенты вариации для каждого метода пробоподготовки приведены в табл. 2.

Таблица 2. Количество выбросов и значения коэффициентов вариации для различных методов префракционирования сыворотки крови

Метод префракционирования Количество выбросов (% от общего числа спектров) Коэффициент вариации,%

ZipTip C18 13 (32,5%) 60,0%

Магнитные частицы MB IMAC Cu 7 (17,5%) 14,6%

Магнитные частицы MB WCX 4(10%) 15,9%

Магнитные частицы MB WAX 9 (22,5%) 50,2%

Магнитные частицы MB WAX с дополнительной очисткой элюата MB HIC C8 4(10%) 38,1%

Наибольшее количество неудачных спектров и самое высокое среднее значение коэффициента вариации было получено с использованием микронаконечников ZipTip С18. Обработка проб магнитными частицами MB WAX также показала высокую техническую вариабельность метода, которая, однако, снижалась при проведении дополнительной очистки пептидно-белковой смеси с помощью магнитных частиц MB HIC (табл. 2). В случае с использованием ZipTip Cl8 низкая воспроизводимость может объясняться тем, что все этапы протокола проводились вручную, когда как предобработка сыворотки с помощью магнитных частиц была полностью автоматизирована и проходила в контролируемых условиях температуры и влажности. Высокое значение коэффициента вариации для метода с использованием магнитных частиц WAX связано с необходимостью дальнейшей очистки элюата. И действительно, было показано, что после дополнительной обработки проб аналитическая ошибка стала меньше (50,2% vs 38,1%). Однако наличие большого числа этапов и длительное время проведения протокола (около 2 часов) также отрицательно сказываются на воспроизводимости данного метода. Пробоподготовка образцов сыворотки с помощью магнитных частиц MB MAC Си показала самое низкое значение коэффициента вариации, но количество спектров-выбросов было выше, чем при использовании MB WCX (табл. 2). Спектры, полученные с помощью MB WCX, образовали однородную группу и имели наименьшее число выбросов; значение коэффициента вариации было также невысоким, что свидетельствует о том, что данная технология пробоподготовки образцов является самой воспроизводимой. По данным других исследователей, значения коэффициентов вариации для методов предобработки сыворотки на магнитных частицах MB HIC СЗ, MB HIC С8, MB HIC C18 находились в диапазоне от 11 до 26% [Zhang X. et al., 2004; Baumann S. et al.,

2005], что соответствует полученным в данной работе результатам для магнитных частиц MB WCX и MB IMAC Си. В дальнейшем, прямое протеомное профилирование сыворотки крови в нормальных условиях жизнедеятельности, а также в космических полетах и наземных экспериментах проводили на магнитных частицах MB WCX с помощью робота ClinProt.

2. Характеристика вариабельности иротеомного профиля сыворотки крови

здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности

2.1. Групповая вариабельность протеомного профиля сыворотки крови

Для определения межиндивидуальных различий белковой композиции были получены протеомные профили сыворотки здоровых мужчин трех возрастных групп: от 20 до 30 лет (36 человек), от 30 до 40 лет (И человек), от 40 до 50 лет (11 человек). В каждом масс-спектре сыворотки крови в среднем было получено 174 MS-пика. После составления таблицы масс всех пиков с указанием их площадей, были рассчитаны коэффициенты вариации для каждого пика во всех возрастных группах. Оказалось, что средний, по всем пикам, коэффициент вариации в возрастной группе от 20 до 30 лет был равен 37 %, от 30 до 40 лет - 40,2 %, от 40 до 50 лет - 50,6% (общее CV по всем группам = 42,6%). Данные значения намного превышают ошибку метода профилирования (15,9%), что свидетельствует о достаточно высокой групповой вариабельности протеомного профиля. Оказалось, что среди изученных групп здоровых лиц пики с коэффициентами вариации >50% составляют 21% от всех пиков протеомного профиля, а пики с небольшой дисперсией (CV<30%) - 29%. Таким образом, большую часть пиков протеомного профиля составляют пики с умеренной групповой вариабельностью (CV от 30 до 50%). Коэффициенты вариации некоторых пиков приведены в табл. 3. Так, высокие значения коэффициентов вариации имели фрагменты интер-а-трипсинового ингибитора, СЗ и С4а комплемента, а-цепи фибриногена, антитромбина III и высокомолекулярного кининогена (табл. 3), а среди полноразмерных белков - аполипопротеины CI, CHI, Р2-микроглобулин и цистатин С. Также были обнаружены пики, имеющие относительно небольшую дисперсию среди групп здоровых мужчин: это фрагменты транстиретина и ß-цепи a2-HS-гликопротеина (табл. 3). Необходимо отметить, что величина коэффициентов вариации пиков фрагментов СЗ-комплемента, Р2-микроглобулина и транстиретина была примерно одинакова во всех группах. Однако разброс пиков высокомолекулярного кининогена, интер-а-трипсинового ингибитора, аполипопротеинов CHI и АН среди мужчин от 40 до 50 лет был значительно больше, чем в других группах, что свидетельствует о том, что вариабельность данных белков увеличивается с возрастом.

Таблица 3. Групповая вариабельность пиков протеомного профиля сыворотки крови

здоровых лиц

Идентификация [ссылка] m/z, Да коэффициент вариации, % Ошибка метода, %

20-30 лет 30-40 лет 40-50 лет

Интер-а-трипсиновый ингибитор, фрагменты FVillanueva J. et al„ 20061 996 56,6 65,4 81,6 25,1

2272 46,8 27,5 160 16,2

СЗ комплемент, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006; Lopez M.F.et al„ 2007] 1450 33,8 45,4 68,4 11,1

1692 31,2 51,1 48,8 16,2

1865 61,7 115 79,4 10,1

2022 198 ИЗ 120 16,2

8931 61,2 41,6 41,7 13,9

C4a комплемент, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] 1741 68,8 62,8 59,3 18,2

1897 52,5 48,3 28,6 16,2

3208 31,5 55,7 22,2 14,2

Высокомолекулярный кининоген, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] 1945 62,8 73,8 105 10,9

2082 61,9 55,2 109 17,5

2210 60,9 55,8 99,7 14,5

Фибриноген, а-цепь, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] 1617 25,9 56,9 52,8 13,8

2863 55,3 43,5 57,1 22,7

Антитромбин III, фрагмент [Allard L. et al., 20041 4475 50,6 64,2 42,2 16,2

Аполипопротеин All, фрагмент [Nomura F. et al., 2004] 7804 29,3 37,7 54,4 14,2

Аполипопротеин CI [Ward D.G.et al., 2006] 6432 55,2 77,7 91,8 17,3

6630 67,3 88,5 95,5 17,7

Аполипопротеин CIII [Bondarenko P.V. et al.,1999] 9135 30,4 41,5 61 16,2

9424 26,2 29,3 45,3 И

Р2-микроглобулин [Nelsestuen G.L. et al., 20051 11730 51,7 54,7 53 12,1

Цистатин С [Zinkin N„ 2008] 13300 81,2 69,6 81,9 22,1

Транстиретин, фрагмент [Lopez M.F. et.al.,20071 2902 23,6 29,4 31 16,2

ß-цепь сй-Ш-гликопротеина, фрагмент [Mitchell B.L. et al., 20051 2741 21,6 27,9 39,5 18,6

Аполипопротеин All [Rossi L.etal.,2006] 8675 22,7 18,5 52 16,2

Таким образом, протеомный профиль сыворотки крови обладает значительной групповой вариабельностью, что проявляется в уровне интенсивности MS-пиков различных белков (аполипопротеинов CI, CIII, р2-микроглобулина, цистатина С) и фрагментов белков высокомолекулярного кининогена, системы комплемента, интер-а-трипсинового ингибитора, фибриногена. Высокая групповая вариабельность различных

форм аполипопротеинов может объясняться особенностями питания и двигательной активности у здоровых лиц. Остальные белки относятся к "белкам острой фазы", проявляющим опсонизирующую, антипротеолитическую и бактериостатическую активность [Алешкин В.А. с соавт., 1988]. Возможно, что эта белки являются наиболее пластичной частью протеома сыворотки крови, поскольку их активация или дезактивация обеспечивает адекватную реакцию организма на воспалительные процессы различной этиологии. Высокие коэффициенты вариации пиков, являющихся фрагментами белков, указывают на индивидуальные особенности активности протеолитических ферментов в сыворотке крови.

2.2. Индивидуальная вариабельность протеомного профиля сыворотки крови

В данной части работы изучали изменчивость протеомного профиля у 5 здоровых мужчин за 24 часа, 7, 14, 21, 28, 45, 60 суток, 6 месяцев и у 10 здоровых мужчин за 12 месяцев. Было обнаружено, что протеомный профиль за 24 часа практически не изменялся, о чем свидетельствуют невысокие значения коэффициентов вариации всех пиков (от 13 до 19%, среднее СУ = 16%). Анализ протеомных профилей, полученных каждую неделю в течение месяца, а затем на 45-ые и 60-ые сутки, показал значительную индивидуальную вариабельность пиков двух форм аполипопротеина С1 (т/г=б431; 6630 Да, СУ=52,3 и 55,7% соответственно) и фрагмента высокомолекулярного кининогена (пз/г=1945 Да, СУ=73,2%) (рис. 1). Площади данных пиков изменились более чем в 2 раза в течение одной недели у большинства испытателей.

Компоненты протеомного профиля, обладающие низкой групповой вариабельностью - аполипопротеин АП (т/г=8675 Да), фрагменты транстиретина (т/г=2902 Да), кластерина (т/г=1279 Да) и Р-цепи а2-Н8-гликопротеина (т/г=2741 Да) (табл. 5) - незначительно изменялись во времени у здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности (рис. 2). Интересно, что недавно транстиретин вошел в состав панели маркеров для дифференциальной диагностики рака яичника и доброкачественных опухолей малого таза

^Ъttp://www.шedicalnewstodav.com/articles/1637бl.Dhp')■ Безусловно, низкая

индивидуальная и групповая вариабельность этого бежа увеличивает его диагностическую значимость.

Высокомолекулярный кининоген, фрагмент (т/г>1945 Да)

фон 1 7 14 21 28 45 60 период эксперимента, сутки

Рис. 1. Изменение пиков аполипопротеина С1 и фрагмента высокомолекулярного кининогена в течение 60 суток у 5 здоровых мужчин

Транстиретин, фрагмент (т/г"2902 Да)

100-

| 50 0 «а о ■ 1 = 1 Уч-лВ^ \

| -50 - X фон 1 7 14 21 28 45 60

-100 период эксперимента, сутки

Аполипопротеин АН (т/г-8675 Да)

100

| 50

и

1 "50 фон 1 7 14 21 28 45 60

-100 период эксперимента, сутки

Рис. 2. Изменение аполипопротеина АН и фрагмента транстиретина в течение 60 суток у 5 здоровых мужчин

Анализ динамики протеомного профиля сыворотки крови за 6 месяцев показал схожие результаты. Так, была отмечена высокая индивидуальная вариабельность аполипопротеина С1 (т/г=6432; 6630 Да) и фрагмента высокомолекулярного кининогена (т/г=1945 Да). Однако прослеживалась также высокая изменчивость площади пика фрагмента СЗ системы комплемента (т/г=1865 Да). Вариабельность данного белка, таким образом, имеет более широкий временной интервал, чем, например, аполипопротеина С1, период изменений которого составлял 1-2 недели (рис. 3). Кроме того, у 4 из 5 испытателей была обнаружена значительная динамика пика инсулина (т/г=5633 Да), что объясняется годичной ритмикой его базальной секреции, зависящей от продолжительности светового дня [Демин Д.Б., 2007], что также может быть причиной обнаруженных нами изменений, так как у некоторых обследованных пробы крови были получены в летнее и зимнее время года.

Площадь пика фрагмента р-цепи а2-Н8-гликопротеина за полгода изменилась незначительно у всех испытателей (рис. 3). То же было справедливо для фрагмента транстиретина (т/г=2902 Да) и аполипопротеина АН (ш/г=8675 Да).

Фрагмент СЗ-комплемента {m/z=1866 Да)

? 150

5 >.

g 100 |

А 50

J

2 3 4 испытатели

Офои

■б месяцев спустя

г1,ГЪ|дг1.Г|,

аг-Нв-гликопротвин, фрагмент (m/z=2741 Да)

50

3 40 '

Е Л 5зо>

а ч 5 20.

о £ ю.

□ фон

nillflfl

16 месяцев спустя

2 3 4 испытатели

Рис. 3. Изменение фрагментов СЗ-комплемента и р-цепи сй-Ш-гликопротеина за 6 месяцев у 5 здоровых мужчин

Анализ профилей проб сыворотки, полученных у 5 здоровых мужчин с интервалом в 12 месяцев, подтвердил полученные результаты: аполипопротеин CI, цистатин С, инсулин и фрагмент высокомолекулярного кининогена составляют наиболее пластичную часть низкомолекулярного протеома сыворотки крови, когда как фрагменты р-цепи а2-HS-гликопротеина, транстиретина, кластерина и аполипопротеин All являются относительно стабильными компонентами. Следовательно, факт увеличения вариабельности аполипопротеина АН с возрастом дополнительно подтверждается незначительными изменениями данного белка во времени у 5 здоровых мужчин (табл. 3). Таким образом, низкомолекулярный субпротеом сыворотки характеризуется значительной групповой и индивидуальной вариабельностью. Так, среднее значение коэффициентов вариации спектров, полученных за 24 часа, составило 16%, за 60 суток -26,4%, за 6 месяцев - 27,5%, за 12 месяцев - 42,3%. Значение коэффициента вариации между индивидуумами было равно 42,6%.

3. Характеристика протеомного профиля сыворотки крови при воздействии факторов космического полета

3.1. Изменения протеомного профиля после длительных космических полетов (169199 суток)

В данном разделе проводился анализ изменений белковой композиции сыворотки после длительных космических полетов. При обработке образцов сыворотки крови космонавтов на магнитных частицах MB WCX было получено, в среднем, 158 MS-пиков в

диапазоне масс от 1000 до 17000 Да с отношением сигнал/шум=5. Таким образом, появилась возможность охарактеризовать изменения не только полноразмерных белков, но и их фрагментов, метаболитов и пептидов, динамика которых при воздействии факторов космического полета ранее не оценивалась. На 1-ые и 7-ые сутки после окончания длительной космической экспедиции было обнаружено достоверное снижение полной формы аполипопротеина CI. Данный белок сильно изменяется во времени у здорового человека, что было показано при анализе индивидуальной вариабельности. Однако амплитуда изменений данного белка у здоровых мужчин за 6 месяцев была значительно меньше (рис. 4). Данные изменения могут быть связаны с подавлением синтеза данных белков в печени в период реадаптации ввиду недостатка необходимого количества аминокислот, с одной стороны, и необходимости синтеза мышечных белков -с другой. Так, в работе Stein с соавт. было показано, что синтез фибриногена, а также церулоплазмина, гаптоглобина и СЗ-комплемента в ранний послеполетный период подавлен [Stein Т.Р., & Schlüter M.D., 2006]. Кроме того, после космического полета продолжительностью 175 суток обнаружено достоверное снижение концентраций в крови лизина, треонина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и других аминокислот по сравнению с предполетными данными [Попов И.Г., Лацкевич A.A., 1984].

Аполипопротеин CI (m/z=6630 Да)

600 S 500 = 4 400

I S 300

I S, 200 S 100

□ фон

■ 6 месяцев спустя

■ г-1 спус

2 3 4 5 испытатели

Рис. 4. Изменение полной формы аполипопротеина С1 после длительных космических полетов (п=7) и в привычных условиях жизнедеятельности (п=5) у здоровых мужчин (ПВ-период восстановления).

На 1-ые и 7-ые сутки периода восстановления было также обнаружено достоверное увеличение практически всех пиков фрагментов фибриногена (т/г=2661; 2933; 3192; 3241; 3263; 5904 Да), за исключением пика с т/г=16!7 Да, который был понижен. Сравнение с контрольным исследованием указывает на то, что обнаруженные сдвиги не являются проявлением индивидуальной вариабельности. Полученные результаты могут быть объяснены либо резкой интенсификацией протеолиза в ранний послеполетный

период, либо значительным увеличением концентрации фибриногена, что приводило и к закономерному увеличению его фрагментов. Кроме того, не исключено и сочетание этих реакций. Увеличение концентрации фибриногена наблюдается при острых воспалительных процессах в организме, стрессе [McKenzie J.M. et al., 1963] и снижении уровня физической активности [Козлов A.A. с соавт., 2006]. Некоторые авторы также указывают на увеличение содержания фибриногена после космических экспедиций [Фомин А.Н., 1981; Stein, 2000]. Вероятно, что гемоконцентрация крови и высокая степень эмоционального напряжения космонавтов на заключительном этапе космического полета привели к увеличению содержания фибриногена в крови. На 1-ые сутки периода реадаптации после космических полетов были выявлены разнонаправленные изменения пика СЗ-комплемента. Вероятно, подобные сдвиги связаны с изменением активности протеолитических ферментов. Ранее было показано, что начальный период адаптации после кратковременных полетов связан с активацией калликреин-кининовой системы [Тигранян P.A. с соавт., 1987], которая играет важную роль в регуляции активности каскадных протеолитических систем плазмы крови: кининогенеза, гемокоагулящш, фибринолиза, комплемента и ренин-ангиотензиновой системы, обеспечивающих процессы адаптации и защиты гомеостаза организма [Яровая Г.А., 2001].

3.2. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-15°)

Данный эксперимент состоял из двух серий - с использованием десмопрессина в качестве средства профилактики неблагоприятных эффектов АНОГ и без применения каких-либо фармакологических препаратов (контрольная серия) с участием одних и тех же испытателей. Следует отметить, что небольшая продолжительность данного эксперимента не вызывала ярко выраженных изменений на уровне синтеза или модификации тех белков, которые охватываются данной технологической платформой. Так, при прямом профилировании образцов сыворотки крови, собранных в ходе АНОГ, было получено, в среднем, 148 пиков в диапазоне масс от 1000 до 17000 при обработке проб магнитными частицами MB WCX. В серии с применением десмопрессина было обнаружено достоверное уменьшение пика тромбоцитарного фактора IV (табл. 4), что свидетельствует о снижении активности системы сосудисто-тромбоцитарного (или первичного) гемостаза в крови. Известно, что десмопрессин повышает активность VIII фактора коагуляции и плазминогена без клинически значимого усиления фибринолиза у здоровых добровольцев [Cash J.D. et al., 1974]. Вероятно, что уменьшение пика тромбоцитарного фактора IV связано с влиянием данного препарата на систему

свертывания крови. Некоторые пики, уровень которых изменился в серии в десмопрессином, являются следствием адаптации организма к применяемому воздействию. Увеличение содержания аполипопротеина CI - как полной формы, так и формы с отщепленным треонином и пролином (табл. 4) - является подтверждением развития приспособительных реакций у испытуемых в условиях моделирования микрогравитации. В более ранних исследованиях было продемонстрировано увеличение содержания общего холестерина и понижение содержания липопротеинов высокой плотности в эксперименте со 120-суточной АНОГ [Смирнов К.В. с соавт., 1986; Маркин A.A. с соавт., 2006]. Вероятно, что обнаруженное нами увеличение пиков аполипопротеина CI является компенсаторной реакцией организма, способствующей нормализации уровня холестерина в крови. В контрольной серии эксперимента также наблюдалась тенденция к увеличению пиков данного белка, однако амплитуда изменений была значительно меньше, чем в эксперименте с приемом десмопрессина, и эти сдвиги были недостоверны (табл. 4).

Таблица 4. Изменения пиков белков сыворотки крови (п=6) после 24-часовой антиортостатической гипокинезии (-15°)

Название белка (m/z пика) Параметр Площадь пика, усл.ед.

серия с десмопрессином контр се ольная рия

фон 24 часа АНОГ фон 24 часа АНОГ

Аполипопротеин CI (6630 Да) Медиана 235 286* 99** 117

Нижний квартиль 204 281* 76** 103

Верхний квартиль 254 341* 104** 135

Аполипопротеин CI с отщепленным треонином и пролином (6432 Да) Медиана 79 116* 37** 48

Нижний квартиль 61 85* 30** 36

Верхний квартиль 109 150* 48** 56

Тромбоцитарный фактор IV (7765 Да) Медиана 291 230* 149** 162

Нижний квартиль 270 152* 140** 150

Верхний квартиль 310 242* 188** 175

фибриноген, фрагмент (2661 Да) Медиана 107 76 35** 50

Нижний квартиль 88 56 28** 34

Верхний квартиль 123 95 38** 70

фибриноген, фрагмент (3241 Да) Медиана 125 НО 51** 67

Нижний квартиль 91 100 41** 62

Верхний квартиль 134 129 69** 71

* - достоверное изменение по сравнению с фоном (критерий Уилкоксона, р<0,05);

** - достоверное изменение между фонами двух серий эксперимента (критерий

Уилкоксона, р<0,05)

Кроме того, было показано, что отдельные пики достоверно изменялись не в

течение суток, а спустя определенное время после окончания эксперимента. Скорее всего, обнаруженные нами изменения являются следствием естественной динамики протеомного профиля, хотя нельзя исключать и возможность развития остаточных реакций организма после завершения эксперимента. Например, было обнаружено резкое снижение пика тромбоцитарного фактора IV, которое наблюдалось после АНОГ с применением десмопрессина и усугубилось за 2 недели периода восстановления. При исследовании индивидуальной вариабельности таких резких изменений в площади пика обнаружено не было. Кроме того, было выявлено значительное уменьшение фрагментов фибриногена (т/2=2661; 3241 Да) и высокомолекулярного кининогена, однако их изменение было сопоставимо с индивидуальной изменчивостью данных белковых фрагментов.

3.3. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией

Во время «сухой» иммерсии тело испытуемого, погруженного в воду, отделено от нее специальной водоотталкивающей пленкой [Шульженко И.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976]. Таким образом, сила опоры оказывается равномерно распределенной по всей поверхности тела согласно закону Архимеда. При прямом профилировании образцов сыворотки крови, собранных в ходе эксперимента с 7-суточной «сухой» иммерсией, было получено, в среднем, 170 пиков в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. На последние сутки эксперимента, как в контрольной группе, так и в группах с профилактикой, было обнаружено достоверное уменьшение фрагментов фибринопептида А. Однако в группе с механической стимуляцией амплитуда изменений была ниже, чем в контрольной группе. Уменьшение данных пиков может свидетельствовать о снижении фибринолитической активности крови во время эксперимента. Кроме того, на 7-ые сутки эксперимента в контрольной группе и группе с механической стимуляцией отмечено изменение другого параметра системы гемостаза: снижение пика пептида-активатора коагуляционного фактора XIII (т/г=3953). Данная тенденция продолжалась и в течение периода восстановления. Полученные данные указывают на сдвиги в системе гемостаза во время иммерсии.

В группе с миостимуляцией достоверных изменений данного пептида обнаружено не было. На 7-ые сутки эксперимента достоверно уменьшалась площадь пика белка С4а системы комплемента (ш/г=1741 Да) в группах с профилактикой; в контрольной группе также наблюдалась тенденция к уменьшению, но изменения были недостоверны. К 7-ым суткам периода реадаптации площадь данного пика была близка к фоновым значениям. В то же время другой пик С4а белка (т/г=3208 Да) увеличивался на 7-ые сутки «сухой»

иммерсии. Разнонаправленные изменения в площади пиков одного белка могут указывать на избирательную активацию лротеолитичеишх систем сыворотки крови, что может свидетельствовать о развитии острофазной реакции в ходе эксперимента. Хорошо известно, что белки системы комплемента могут стать объектом действия протеаз при повышении протеолитической активности плазмы крови [Бельтюков П.П. с соавт., 2003]. Кроме того, об активации протеолитических ферментов свидетельствуют данные, полученные нами после завершения длительных космических полетов.

3.4. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме

Эксперименты с изоляцией здоровых лиц в гермообъекте представляют огромный интерес для характеристики вариабельности протеомного профиля, поскольку условия жизнедеятельности обследуемых в гермообъекте (газовый состав воздуха, температура, влажность, микробиологические условия, двигательная активность, режим дня, рацион питания и потребление воды) - максимально унифицируются для всех участников испытаний. В эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме были проанализированы 42 пробы сыворотки крови, полученные в фоновом периоде, во время изоляции и после ее окончания у 6 участников испытаний. Количество пиков в каждом спектре составило, в среднем, 160 в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. Анализ спектров сыворотки крови, полученных в фоновом периоде эксперимента (за 14-15 и за 7-8 суток до начала изоляции) показал, что протеомный профиль менялся незначительно.

При сравнении фона (за 7-8 суток до начала эксперимента) и начального периода изоляции (16-17 сутки) были обнаружены изменения по 80 пикам (50% от всех детектированных пиков). Так, было выявлено достоверное увеличение площади пиков фрагментов комплемента СЗ (рис. 5). Обнаруженные изменения могут указывать на возможную активацию системы комплемента в начальном периоде изоляции, что может объясняться острой адаптацией организма к условиям гермообъекта. На 16-ые сутки изоляции было также обнаружено уменьшение пика фрагмента кластерина (аполипопротеина J), уровень которого оставался пониженным весь период эксперимента. Кроме того, на 16-ые сутки эксперимента было выявлено уменьшение 2 форм аполипопротеина CI (редуцированной формы с отщепленным треонином и пролином (рис. 5) и полной формы) и аполипопротеина CIII. Вероятно, сдвиги в липидном метаболизме связаны с модификацией привычного рациона питания и ограничением двигательной активности испытатглей. По ходу эксперимента прослеживалась высокая вариабельность пиков цистатина С, р2-микроглобулина и аполипопротеина CI, что свидетельствует об их

высокой пластичности даже в контролируемых условиях жизнедеятельности.

^ У* У' ^ У' /////•"

период эксперимента

Аполипопротеин С| (-ТгеРго; тй«6432 Да)

5 160 120

3

I ВО

А 4°

I о

о»^ о»

^ ////у

' Л А- ^ А

^ </ # Ж ж

период эксперимента

Рис. 5. Изменения пиков фрагмента СЗ-комплемента и аполипопротеина С1 с отщепленным треонином и пролином (т/г=б432 Да) в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме (ПВ-период восстановления)

3.5. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды (13,53%, 28,26%, 58,21%)

Пребывание человека в среде повышенного давления связано не только с профессиональной деятельностью (водолазные и кессонные работы) и формой активного отдыха (дайвинг), но и лечебными процедурами: в случае возникновения специфических заболеваний водолазов и дайверов гипербарическое воздействие (лечебная рекомпрессия, гипербарическая оксигенация) является основным методом лечения. Гипербарическая среда отличается от нормобарической величиной повышенного давления, составом газовой среды, вариациями парциального давления кислорода, длительной изоляцией в замкнутом отсеке барокамеры, отличными от воздушной среды температурой и теплопроводностью, процессами насыщения тканей газами [Попова Ю.А. с соавт., 2008]. Эти особенности могут вызвать мобилизацию регуляторных механизмов, обеспечивающих адаптацию организма к новым условиям обитания, что отражается и на динамике белхов крови.

После обработки образцов сыворотки крови магнитными частицами МВ \УСХ был получен 151 пик в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. Ввиду небольшого количества испытуемых (4 человека), проводился индивидуальный анализ изменений пиков протеомного профиля. Динамика пиков в эксперименте с изоляцией в гипербарической среде сравнивалась с контрольным экспериментом. В контрольном исследовании были отобраны пробы крови от тех же испытуемых по аналогичной циклограмме спустя 10 месяцев после изоляции в барокамере, поэтому оказалось возможным отделить

изменения, непосредственно связанные с условиями эксперимента, от тех, которые являются следствием индивидуальной вариабельности.

Показано, что в день начала эксперимента (перед «погружением») у всех испытателей были значительно увеличены площади пиков фрагментов высокомолекулярного кининогена (рис. 6) и СЗ-комплемента, что, вероятно, связано с «предстартовым напряжением» в ожидании начала воздействия. Ранее было показано, что период, непосредственно предшествующий «погружению», является одним из наиболее стрессогенных этапов экспериментов, моделирующих водолазные спуски различной продолжительности [Попова Ю.А., 2006].

9-суточная изоляция в гипербарической среде (13,53% 02,28,26% N2,68,21% Аг)

400 1 300 ■ 4200 -¿100-

фон 1 фон 2 6 сутки 9 сутки 1 сутки ГИ ГИ ПВ

период эксперимента

Контрольный эксперимент

5 400 -,

g зоо

1 g 200-I 100

i ü фон 1 сутки в сутки 9 сутки 14 сутки период эксперимента

Рис. 6. Изменение пика фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=1945 Да) в условиях гипербарической среды (13,53% Ó2, 28,26% N2, 58,21% Аг) и в контрольном эксперименте (п=4); ГИ - гипербарическая изоляция; ПВ - период восстановления

На 6-ые сутки эксперимента у двух участников обнаружено значительное увеличение аполипопротеина АН и 2 форм аполипопротеина CI, однако на 9-ые сутки изоляции в барокамере и на 1-ые сутки периода восстановления площади данных пиков опускались ниже фоновых значений у всех испытателей. Кроме того, на 9-ые сутки эксперимента и на 1-ые сутки периода восстановления было отмечено резкое уменьшение площадей пиков тканевого активирующего пептида III, пептида-активатора коагуляционного фактора XIII, тромбоцитарного фактора IV, р2-микроглобулина. Так, площадь пика тканевого активирующего пептида П1 у одного испытателя снизилась более чем в 50 раз (рис. 7). Вероятной причиной снижения уровней данных белков к окончанию эксперимента и в период реадаптации могло быть подавление синтеза белков в печени вследствие ее обратимой дисфункции в условиях повышенного давления [Doran et al., 1985]. Гипоксическая газовая среда также могла быть причиной снижения уровня данных белковых компонентов, что связано с нарушением энергетического обеспечения тканей, приводящим к сдвигам в углеводном, жировом и белковом метаболизме [Сологуб Т.В. с соавт., 2008]. Кроме того, уменьшение аполипопротеинов АН и CI может бьггь связано и с ограничением двигательной активности испытателей, пребывающих довольно

продолжительное время в глубоководном водолазном комплексе ограниченного объема.

9-суточная изоляция в гипербарической среде (13,53% 02,28,26% N2,68,21% Аг)

2500 2000 3 1500 1000 5, 500

фон 1 фон 2 6 сутки 9 сутки 1 сутки ГИ ГИ ПВ

период эксперимента

Контрольный эксперимент

2500 2000 1500 £ 1000 500 О

фон 1 в 9 14 сутки сутки сутки сутки

период эксперимента

Рис. 7. Изменение пика тканевого активирующего пептида III (т/г=928б Да) в условиях гипербарической среды (13,53% О2,28,26% N2,58,21% Аг) и в контрольном эксперименте (п=4); ГИ - гипербарическая изоляция; ПВ - период восстановления

ВЫВОДЫ

1. Технология прямого масс-спектрометрического профилирования в космической биологии и медицине является методом выбора для проведения скринингового анализа пептидов, метаболитов и белков (до 17 000 Да) в оценке изменений субпротеома биологических жидкостей при воздействии факторов космического полета.

2. Префракционирование образцов сыворотки крови на магнитных частицах МВ '№СХ перед прямым масс-спектрометрическим профилированием является информативной и воспроизводимой технологической платформой для характеристики низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека (СУ=15,9%).

3. Протеомный профиль сыворотки крови здоровых лиц (20-50 лет, п=58) в обычных условиях жизнедеятельности характеризуется значительной групповой вариабельностью (СУ=42,6%): большой разброс имеют фрагменты высокомолекулярного кининогена, интер-а-трипсинового ингибитора, СЗ и С4а фрагменты комплемента, аполипопротеин С1, тромбоцитарный фактор IV, (й-микроглобулин и цистатин С. Дисперсия пиков высокомолекулярного кининогена, интер-а-трипсинового ингибитора, аполипопротеинов АН и СШ возрастает с увеличением возраста.

4. Компоненты протеомного профиля сыворотки крови здорового человека могут значительно изменяться во времени: среднее значение коэффициента вариации спектров, полученных за 24 часа, составило 16%, за 60 суток - 26,4%, за 6 месяцев - 27,5%, за 12 месяцев - 42,3%. Наиболее пластичными белками низкомолекулярного субпротеома являются аполипопротеин С1, инсулин, цистатин С, а также фрагмент высокомолекулярного кининогена (т/г=1945 Да). Индивидуальные изменения пластичной

части субпротеома (до 17 000 Да) могут маскировать эффекты воздействий, предъявляемых организму здорового человека.

5. Стабильную часть протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в условиях обычной жизнедеятельности составляют аполипопротеин АН, фрагменты кластерина и транстиретина, что делает их денными маркерами временной деградации белковых компонентов сыворотки при ее длительном хранении в банке биоматериала, а также косвенными маркерами эффективности терапии.

6. Учет параметров групповой вариабельности и темпов проявления индивидуальной пластичности позволяют выделить функциональные сдвиги белковой композиции сыворотки крови после длительных космических полетов и модельных экспериментов. Показано, что эти условия вызывают изменения пиков белков «острой фазы» (ß2-микроглобулин, цистатин С) и липидного обмена (аполипопротеины CI, CHI, АН). Как в периоде реадаптации после завершения космических полетов, так и в модельных экспериментах, регистрируются сдвиги активности протеолитических систем крови, что приводит к изменению паттерна фрагментов белков. Характер изменений определяется условиями конкретного эксперимента.

7. В условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды наблюдались наиболее значительные изменения низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови, проявляющиеся в уменьшении площадей пиков аполипопротеина АН, аполипопротеина CI, тканевого активирующего пептида III, пептида-активатора коагуляционного фактора XIII, тромбоцитарного фактора IV, Р2-микроглобулина, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выбор оптимальной методологической платформы для профилирования сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова H.A. // Материалы VII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ ИМБП РАН: Тезисы докладов. - Москва, 2008. - С. 49-50.

2. Исследование протеома сыворотки крови здорового человека в условиях гипербарии и дыхания кислородно-аргоновой смесью. / Пахарукова H.A. // Материалы VIII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики: Тезисы докладов. - Москва, 2009.-С. 38.

3. Оптимизация метода профилирования сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова H.A., Пастушкова Л.Х., Трифонова О.П., Пятницкий М.А., Власова М.А., Никитин И.П., Мошковский С.А., Николаев E.H., Ларина И.М. // Физиология человека. - 2009. - Т. 35. - № 3. - С. 101-107.

4. Changes of healthy human serum proteome profile during 7-day «dry» immersion. / Pakharukova N.A., Pastushkova L.H., Larina I.M. // 30th Annual International Gravitation Physiology Meeting: Book of Abstracts. - Xi'an, China, 2009. - P.56.

5. Changes of healthy human serum proteome profile after long space flights. / Pastushkova L.H., Pakharukova N.A., Larina I.M., Morukov B.V. // 30th Annual International Gravitation Physiology Meeting: Book of Abstracts. - Xi'an, China, 2009. - P.47.

6. Changes of serum proteome profile during 7-day "dry" immersion / Pakharukova N.. Pastushkova L., Trifonova O., Larina I. // 17th IAA Human in Space Symposium: Book of Abstracts. - Moscow, Russia, 2009. - P.98.

7. Выбор статистического подхода для анализа протеомных профилей сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова Н.А., Носовский А. М., Пастушкова Л.Х., Трифонова О.П., Ларина И.М. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2009. - Т. 43. - № 4. - С. 60-66.

8. Исследование нормальной вариабельности протеомного профиля сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова Н.А., Пастушкова Л.Х., Ларина И.М. // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды»: Тезисы докладов. - Казань, 2009. - С. 129.

9. Study of a native variability of serum proteome profile. / Pakharukova, N.A., Pastushkova, L.Kh., Trifonova, O.P., Valeeva, O.A., Larina I.M. // 3rd Central and Eastern European Proteomics Conference: Book of Abstracts. - Budapest, Hungary, 2009. - P. 46.

10. Популяционная протеомика плазмы здоровых доноров. / Бессонов В.В., Васильев А.В., Хотимченко С.А., Батурин А.К., Эллер О.И., Передеряев Ю.В., Ведищева Ю.В., Байгарин Е.К., Мошковский С.А., Карпова М.А., Мельник С.А., Сычева A.M., Хряпова Е.В., Фомченкова Е.Я., Ларина И.М., Трифонова О.П., Пастушкова Л.Х., Пахарукова Н.А., Валеева О.А., Доброхотов И.В. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: Сборник тезисов. - Москва, 2009. - С. 201-202.

11. Исследование протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. / Пахарукова НА., Пастушкова Л.Х., Попова Ю.А., Трифонова О.П., Ларина И.М. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2010. - Т.148. - №1. - С. 42-45.

12. Changes of human serum proteome profile during 7-day "dry" immersion. / Pakharukova N., Larina I., Pastushkova L., Grigoriev A. // Acta Astronáutica, 2010, Epub.: http://dx.d0i.0rg/l 0.1016/i .actaastro.2009.10.014.

13. Прямое протеомное профилирование сыворотки крови в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме. / Пахарукова Н.А. // Материалы IX конференции молодых ученых специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики: Тезисы докладов. - Москва, 2009. -С. 60.

14. Direct proteome profiling of human serum during 105-day isolation. / Pakharukova N.A., Pastushkova L.Kh., Larina I.M. // 31" Annual International Gravitation Physiology Meeting: Book of Abstracts. - Trieste, Italy, 2010. - P.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CV - коэффициент вариации

MALDI-TOF MS - время-пролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (matrix assisted laser desorption ionization time-of-ílight mass spectrometry) MB HIC - магнитные частицы, функционирующие по принципу обращенно-фазового взаимодействия (magnetic beads based hydrophobic interaction chromatography) MB IMAC Си - магнитные частицы, функционирующие по принципу иммобилизованной метал-ион аффинной хроматографии (magnetic beads based immobilized metal ion affinity chromatography) MB WAX - магнитные частицы, функционирующие по принципу слабого анионообменника (magnetic beads based weak anion-exchange chromatography)

MB WCX - магнитные частицы, функционирующие по принципу слабого катионообменника (magnetic beads based weak cation-exchange chromatography) MS/MS - тандемная масс-спектрометрия m/z - отношение массы к заряду, Дальтон

PTMs - поспрансляционные модификации белков (post translation modifications) АНОГ - антиортостатическая гипокинезия ТФУ - трифторуксусная кислота

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 21.07.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,6 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Актуальность работы

В настоящее время протеомика активно развивается во многих странах мира и занимает ведущие позиции в научных программах современной прикладной и фундаментальной биологии, а также фармацевтики и смежных с ней дисциплин. Перед международным консорциумом «Протеом человека», (HUPO, Human Proteome Organization) ставятся задачи инвентаризации всех белков человека, построения молекулярных белковых атласов клеток, органов и тканей, выяснения закономерностей регуляции работы белков при посттрансляционных модификациях, выявления схем белок-белковых взаимодействий и новых маркеров патологических процессов. С развитием протеомики связывают большие надежды по внедрению новых подходов при диагностике различных заболеваний, созданию новых лекарственных соединений и выяснению новых закономерностей функционирования клеток (Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002).

Однако, несмотря на ведущиеся во всем мире исследования по направленному поиску биомаркеров различных патологических состояний, систематическое изучение протеома здорового человека только начинается. Отдельные попытки охарактеризовать вариабельность белков печени (Zhang X., Guo Y., Song Y. et al., 2006), панкреатического сока (Chen R., Pan S., Brentnall T.A. et al., 2005) и плазмы крови (Nelsestuen G.L., Zhang Y., Martinez M.B. et al., 2005), предпринятые в недавних исследованиях, не дают представления о групповой вариабельности белков в большой выборке обследуемых и об изменениях белковой композиции за длительный период времени.

Очевидно, что протеом здорового человека в состоянии сохранения организмом его функциональных резервов чрезвычайно пластичен. Помимо значительных различий протеомного профиля у разных индивидуумов и естественных колебаний индивидуального протеома во времени, существуют вариации количественного содержания и качественного состава белков, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий. Так, на протеом сыворотки крови могут оказать влияние различные факторы: питание (содержание в пище жиров и белков), курение, занятия спортом, длительный постельный режим (Anderson N.L. & Anderson N.G., 2002) и циркадианные ритмы (Linkowski P., Spiegel К., Kerkhofs М. et al., 1998).

Большой интерес представляет характеристика вариабельности белковой композиции у специально отобранной группы здоровых людей для определения интервала физиологической нормы различных белков внутри человеческой популяции. Физиологическая норма указывает на сохранение достаточного уровня функциональных возможностей организма. Для изучения характеристик нормы очень важен отбор здоровых людей, образующих так называемую референтную группу. Референтные группы — это специально отобранные группы людей, состояние здоровья которых определено и однородно (например, космонавты, допущенные к выполнению полетов) (Григорьев А.И. Баевский P.M., 2001).

Для оценки приспособленности организма к изменяющимся условиям среды необходимо упомянуть о понятии адаптивной нормы как результате приспособления организма к длительно действующему фактору, имеющему субэкстремальный характер, что вызывает мобилизацию функциональных резервов при некотором напряжении регуляторных систем. У одних людей это напряжение находится в умеренных пределах, у других оно может быть резко выраженным, что зависит от индивидуальных адаптационных возможностей организма. Из этого следует высокая неопределенность понятия нормы как исходной точки отчета в различных оценочных шкалах. Здоровье обычно отождествляется с отсутствием существенных отклонений от нормы, поэтому является крайне важным понимание того, что есть норма, как определяются отклонения от нее, какие отклонения являются существенными, а какие нет (Григорьев А.И., Баевский P.M., 2007).

При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах, имитирующих отдельные стороны космической экспедиции, человек сталкивается с непривычными для него условиями. Изменения, происходящие в организме, затрагивают все системы органов, в том числе изменяется и белковый состав крови. Характеристика изменений белковой композиции является основой для изучения молекулярного ответа человека в новых условиях существования. С помощью различных биохимических методов (например, радиоиммуннологического анализа, иммунодиффузии, электрофореза в ацетатцеллюлозном геле) были проанализированы изменения многих гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) (Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999), компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) (Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980; Герцик Ю.Г., 2004), белков системы свертывания крови (Фомин. А.Н., 1981) и «острой» фазы (Ларина О.Н., 1992; 2006), ферментов, в т.ч. протеолитических (Тигранян с соавт., 1987). Протеомные методы для анализа изменений белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не использовались. Сыворотка крови человека является удобным объектом для исследований, поскольку содержит белки практически всех тканей организма, и исследование ее протеомного состава может дать достаточно полную информацию о физиологическом состоянии организма. Однако присутствие в ней солей и высококопийных белков, среди которых содержание альбумина и глобулинов составляет более 90%, и большой динамический диапазон концентраций белков (10-11 порядков) (Anderson N.L., Polanski М., Pieper R. et al., 2004) значительно затрудняет анализ белковой композиции при использовании одного конкретного методического подхода. Поэтому для комплексной оценки протеома сыворотки необходимо сочетание различных технологических платформ (как разделения сложных белковых смесей, так и детектирования белков). Технология прямого протеомного масс-спектрометрического профилирования сочетает предварительное фракционирование образцов сыворотки на магнитных частицах или других носителях, которые связывают белки с определенными свойствами, и масс-спектрометрический анализ смеси пептидов и белков, ионизированных с помощью матрицы. Данная технология является высокопроизводительной, позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков (до 17000 Да) и белковых фрагментов, составляющих так называемый низкомолекулярный субпротеом, а также посттрансляционные модификации (PTMs) белков. Оценка изменений многих компонентов низкомолекулярного субпротеома и PTMs белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не проводилась. Таким образом, использование протеомных подходов дает возможность уточнить и дополнить картину изменений композиции белков сыворотки при воздействии факторов космического полета, что приведет к пониманию молекулярных механизмов сохранения гомеостаза в экстремальных условиях среды и позволит в будущем разработать принципиально новые средства профилактики неблагоприятных последствий действия микрогравитации. Характеристика состояния здоровья человека в гипоксической аргоносодержащей среде представляет интерес в плане ее возможного использования в замкнутых объектах различного назначения (возможно, и на космической станции) для обеспечения пожаробезопасности.

Цель работы: характеристика протеомного профиля сыворотки крови здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета и в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. Задачи исследования:

1) выбор наиболее воспроизводимого метода прямого протеомного профилирования сыворотки крови;

2) изучение групповой и индивидуальной вариабельности протеома сыворотки крови здорового человека;

3) оценка изменений протеомного профиля сыворотки после длительных космических полетов и при воздействии условий модельных экспериментов (антиортостатической гипокинезии, иммерсии, изоляции в гермообъеме);

4) характеристика изменений белковой композиции сыворотки крови здорового человека в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды.

Научная новизна работы

Впервые была проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека. Были обнаружены наиболее пластичные и стабильные компоненты протеомного профиля. Впервые определены границы индивидуальной вариабельности пиков протеомного профиля сыворотки здорового человека за длительный период времени (до 12 месяцев). Охарактеризованы изменения белковой композиции сыворотки крови после длительных космических полетов и в ходе различных наземных экспериментов (1-суточная антиортостатическая гипокинезия, 7-суточная «сухая» иммерсия, 105-суточная изоляция в гермообъеме, 9-суточная изоляция в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде) с помощью технологии прямого масс-спектрометрического профилирования. Теоретическая и практическая значимость работы

В ходе данной работы были обнаружены белковые компоненты, характеризующиеся высокой индивидуальной и групповой вариабельностью внутри человеческой популяции, что ограничивает применение данных белков как потенциальных биомаркеров различных заболеваний в протеомной диагностике. Белки и пептиды, обладающие незначительной дисперсией в популяции здоровых лиц, напротив, могут представить важную информацию о состоянии здоровья при резком изменении их уровня.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Технологическая платформа, включающая прямое масс-спектрометрическое профилирование после префракционирования сыворотки крови на магнитных частицах MB WCX является информативным и воспроизводимым методом анализа ее белковой композиции;

2. Низкомолекулярный субпротеом сыворотки крови здоровых лиц в условиях обычной жизнедеятельности характеризуется значительной групповой и индивидуальной вариабельностью;

3. Длительные космические экспедиции и эксперименты с моделированием воздействия факторов космического полета вызывают функциональную

11 перестройку белковой композиции сыворотки крови, проявляющуюся в изменении пиков белков «острой фазы» и липидного обмена, а также протеолитических ферментов.

4. 9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды приводит к уменьшению площадей пиков большинства изученных пептидов, белков и белковых фрагментов, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления. Апробация работы

Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

1) VII конференция молодых ученых специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ ИМБП РАН, 9 апреля. 2008;

2) VIII конференция молодых ученых специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 14 апреля, 2009;

3) 30 Annual International Gravitation Physiology Meeting, Xi'an, China, 24-29 May, 2009;

•L

4) 17 IAA Human in Space Symposium, Moscow, Russia, 7-11 June, 2009;

5) IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня, 2009;

6) 3rd Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary. 6-9 October,

2009;

7) Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва. 25-27 ноября 2009;

8) Russian-French-Byelorussian conference «Neurovascular impairments induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approaches». Angers. France, 10-13 March, 2010;

9) IX конференция молодых ученых специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля, 2010, Москва.

Диссертация апробирована 12 мая 2010 г. на секции «Космическая физиология и биология» учёного совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН, протокол № 3. Список публикаций по материалам диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.

1. Пахарукова Н.А., Пастушкова JT.X., Трифонова О.П., Пятницкий М.А., Власова М.А., Никитин И.П., Мошковский С.А., Николаев Е.Н., Ларина И.М.

Оптимизация метода профилирования сыворотки крови здорового человека. Физиология человека, 2009, т.35, No.3, с.101-107;

2. Пахарукова Н.А., Носовский А. М., Пастушкова J1.X., Трифонова О.П. Ларина И.М. Выбор статистического подхода для анализа протеомных профилей сьюоротки крови здорового человека. Авиакосмическая и экологическая медицина, 2009. No.4, с.60-66;

3. Пахарукова, Н.А., Пастушкова Л.Х., Попова Ю.А., Трифонова О.П., Ларина И.М. Исследование протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010, т. 148, №1, стр. 42-45.

4. Pakharukova Natalia, Larina Irina, Pastushkova Ludmila, Grigoriev Anatoly Changes of human serum proteome profile during 7-day "dry" immersion. Acta Astronautica, 2010, http://dx.doi.ore/10.1016/j .actaastro.2009.10.014

Работа выполнена в лаборатории метаболизма и иммунологии ГНЦ РФ - ИМБП РАН в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», при поддержке программы ОБН РАН № 6006/3, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ-3402.2008.4 и РФФИ № 08-04-01533-а.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов, списка литературы. В диссертации приведены 17 таблиц и 29 рисунков. Список использованной литературы содержит 101 отечественный и 161 зарубежный источник.

6. выводы

1. Технология прямого масс-спектрометрического профилирования в космической биологии и медицине является методом выбора для проведения скринингового анализа пептидов, метаболитов и белков (до 17 ООО Да) в оценке изменений субпротеома биологических жидкостей при воздействии факторов космического полета.

2. Префракционирование образцов сыворотки крови на магнитных частицах MB WCX перед прямым масс-спектрометрическим профилированием является информативной и воспроизводимой технологической платформой для характеристики низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека (CV=15,9%).

3. Протеомный профиль сыворотки крови здоровых лиц (20-50 лет, п=58) в обычных условиях жизнедеятельности характеризуется значительной групповой вариабельностью (CV=42,6%): большой разброс имеют фрагменты высокомолекулярного кининогена, интер-а-трипсинового ингибитора, СЗ и С4а фрагменты комплемента, аполипопротеин CI, тромбоцитарный фактор IV, (i2-микроглобулин и цистатин С. Дисперсия пиков высокомолекулярного кининогена, интер-а-трипсинового ингибитора, аполипопротеинов All и CIII возрастает с увеличением возраста.

4. Компоненты протеомного профиля сыворотки крови здорового человека могут значительно изменяться во времени: среднее значение коэффициента вариации спектров, полученных за 24 часа, составило 16%, за 60 суток - 26,4%, за 6 месяцев -27,5%, за 12 месяцев - 42,3%. Наиболее пластичными белками низкомолекулярного субпротеома являются аполипопротеин CI, инсулин, цистатин С, а также фрагмент высокомолекулярного кининогена (m/z=1945 Да). Индивидуальные изменения пластичной части субпротеома (до 17 000 Да) могут маскировать эффекты воздействий, предъявляемых организму здорового человека.

5. Стабильную часть протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в условиях обычной жизнедеятельности составляют аполипопротеин А II, фрагменты кластерина и транстиретина, что делает их ценными маркерами временной деградации белковых компонентов сыворотки при ее длительном хранении в банке биоматериала, а также косвенными маркерами эффективности терапии.

6. Учет параметров групповой вариабельности и темпов проявления индивидуальной пластичности позволяют выделить функциональные сдвиги белковой композиции сыворотки крови после длительных космических полетов и модельных экспериментов. Показано, что эти условия вызывают, изменения пиков белков острой фазы» (р2-микроглобулин, цистатин С) и липидного обмена (аполипопротеины CI, CIII, АН). В периоде реадаптации после завершения космических полетов, как и в модельных экспериментах, регистрируются сдвиги активности протеолитических систем крови, что приводит к изменению паттерна фрагментов белков. Характер изменений определяется условиями конкретного эксперимента.

7. В условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды наблюдались наиболее значительные изменения низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови, проявляющиеся в уменьшении площадей пиков аполипопротеина АН, форм аполипопротеина CI, тканевого активирующего пептида III, пептида-активатора коагуляционного фактора XIII, тромбоцитарного фактора IV, [32-микроглобулина, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для успешного поиска и валидации белковых биомаркеров, обнаруживаемых в низкомолекулярном субпротеоме сыворотки крови, необходимо принимать во внимание границы их групповой и индивидуальной вариабельности в популяции здоровых людей. Белки, характеризующиеся большой дисперсией в группе здоровых лиц, следует исключить из списка потенциальных кандидатов в биомаркеры или следовать стандартным методам отбора здоровых обследуемых для их включения в контрольные группы в клинических исследованиях.

2. Рекомендуется проводить мониторинг показателей липидного обмена, иммунной системы и активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в космических полетах и модельных экспериментах.

3. При проведении как длительных экспериментальных водолазных спусков, так и лечебной рекомпрессии необходимо контролировать показатели синтетической функции печени.