Автореферат и диссертация по медицине (14.03.08) на тему:Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности

На правах рукописи

Трифонова Оксана Петровна

ОЦЕНКА ПЛАСТИЧНОСТИ ПРОТЕОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ

14.03.08 Авиационная, космическая и морская медицина 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 СЕН 2011

Москва 2011

4853507

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) и в Учреждении Российской академии медицинских наук Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

доктор биологических наук Лисица Андрей Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Воронков Юрий Иванович

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

диссертационного совета Д 002.111.01 при Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН), г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а

РАН

Защита состоится

на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Анализ протеома плазмы крови позволяет выявлять белковые биомаркеры, практическая значимость которых определяется перспективой использования в сфере молекулярной диагностики и мониторинга эффективности лечения широкого спектра заболеваний (N.L. Anderson, N.G. Anderson, 2002). Крупномасштабное изучение протеома плазмы крови было проведено под эгидой международной организации HUPO (Human Proteome Organization). В рамках проекта HUPO Plasma Proteome Project (НРРР) было идентифицировано 7884 белка, как обобщенный результат 95 исследовательских проектов (Omenn G.S. et al., 2005, Klie S. et al., 2008). За последние 10 лет при исследовании различных заболеваний протеомными методами в плазме и сыворотке крови было выявлено более 200 потенциальных биомаркеров, однако, только единицы из них обладали высокой специфичностью. Первым и на настоящий момент единственным примером практического применения результатов протеомики стал многопараметрический тест OVA1, одобренный в 2009 году Американским агентством FDA для диагностики рака яичников (Anderson N.L., 2010, Hortin G.L. et al., 2010). Одной из причин такой низкой эффективности протеомных исследований является проблема биологической вариабельности контрольного биоматериала, остро стоящая в клинической протеомике.

При обнаружении в крови белков, потенциальных биомаркеров, необходимо знать, какой степенью изменчивости обладает концентрация данных белков в норме (так называемая пластичность протеома), а также - границы внутри- и межиндивидуальных различий1. Anderson&Anderson в 2002 году согласно опубликованным данным о вариабельности ряда белков, таких как протромбин, миоглобин, гаптоглобин, интерлейкин, С-реактивный белок, липопротеины выдвинули гипотезу, что индивидуальные изменения уровня белков во времени должны быть как минимум вдвое ниже чем вариабельность внутри популяции (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Недавно Todd Н. Corzett с соавторами (2010) провели статистический анализ внутрииндивидуапьной вариабельности протеома плазмы крови с помощью дифференциального гель электрофореза (Corzett Т.Н. et al., 2010). Их результаты показали, что групповая вариабельность значительно превышает индивидуальные изменения протеома во времени, которые, в свою очередь, сравнимы с технической погрешностью метода. Однако авторы не принимали во внимание ни состояние здоровья, ни образ жизни, ни пол обследуемых.

1 Внутрииндивидуальная вариабельность - индивидуальные изменения уровня белков в течение времени. Межиндивидуальная вариабельность - различия протеома между разными индивидуумами в группе.

Помимо значительных отличий между протеомными профилями индивидуумов и естественных изменений индивидуального протеома во времени, существуют вариации, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Характеристика изменений белковой композиции плазмы крови является основой для изучения молекулярного ответа человека в новых условиях существования. При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах («сухая» иммерсия, длительная изоляция и др.) организм человека реагирует на непривычные для него условия. Изменения затрагивают все системы органов, что отражается на качественном и количественном составе белков крови. Так с помощью различных биохимических методов были выявлены изменения гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) (Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999), компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) (Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980; Рыкова М.П. с соавт., 2001, 2004, 2006), белков системы свертывания крови (Фомин, А.Н., 1981) и «острой» фазы (Ларина О.Н., 1992; 2006), ферментов, в т.ч. протеолитических (Тигранян с соавт., 1987).

Протеомный анализ для оценки изменений белкового состава жидкостей тела здорового человека во время космических полетов и наземных модельных экспериментов начали применять совсем недавно. Впервые, в нашей лаборатории для анализа изменений протеома сыворотки крови здоровых добровольцев был применен метод прямого масс-спектрометрического профилирования после предварительного фракционирования на магнитных частицах (Пахарукова H.A. с соавт., 2010, Pakharukova N.A. et al., 2011). Метод позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков и белковых фрагментов, однако может применяться только для определения молекул с весом до 17 кДа.

Широко распространенным методом анализа сложных белковых смесей в широком диапазоне молекулярных весов является двумерный гель-электрофорез (2-DE) (O'Farrell Р.Н., 1975). С помощью 2-DE можно осуществлять визуальное картирование протеома плазмы крови, проводить относительный количественный анализ и поиск дифференциально экспрессируемых белков.

Несмотря на активно ведущиеся исследования по протеомному профилированию патологических состояний, понятие «норма» в протеомике до сих не определено. Можно полагать, что качественный и количественный состав белков может изменяться в пределах заложенной на генетическом уровне нормы реакции, однако систематизированные представления о мере пластичности/консерватизма протеома плазмы крови здорового человека при воздействии на его организм различных факторов среды или условий жизнедеятельности в настоящий момент отсутствуют.

Целью работы являлась качественная и количественная оценка вариабельности белков плазмы крови здорового человека при воздействии на организм различных факторов, включая факторы, моделирующие эффекты микрогравитации. В рамках достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Получить методом двумерного электрофореза и охарактеризовать протеомную карту плазмы крови здорового человека после удаления мажорных и концентрирования минорных белков.

2. Выявить достоверно различающиеся по уровню содержания в плазме крови белки, определяющие внутри- и межиндивидуальные различия (пластичность) протеома здоровых людей.

3. Выявить изменения протеома плазмы крови здорового человека, вызванные воздействием экстремальных факторов («сухая» иммерсия и длительная изоляция).

4. Сопоставить пластичность протеома плазмы крови, обусловленную экстремальными условиями жизнедеятельности, с известными данными об изменении уровня содержания белков в плазме крови при патологии.

Научная новизна

Впервые было проведено исследование по выявлению пределов вариабельности протеома плазмы крови, характерных для нормального человека, в том числе связанных с экстремальными воздействиями. С помощью метода двумерного электрофореза были оценены изменения в протеоме плазмы крови здоровых людей в ходе наземных экспериментов по моделированию отдельных факторов космического полета - 7-суточная «сухая» иммерсия и 105-суточная изоляция в гермообъекте. Впервые показано, что колебания состава протеома проявляются как признаки адаптивной пластичности протеома, в частности, в период восстановления после перенесенного воздействия.

Практическая значимость работы

В работе решена проблема оценки пластичности протеома плазмы крови, препятствующая медицинскому освоению результатов протеомных исследований. Определены доверительные интервалы коэффициента вариации, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, а отражают физиологическую норму реакции организма. Установлено, что для отдельных белков масштаб этих колебаний сопоставим с изменением уровня белков плазмы, наблюдаемым при патологии. Получена важная информация с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Двумерный гель-электрофорез в сочетании с пробоподготовкой с использованием пептидных микрогранул (РгйеоМтег™) для удаления мажорных и концентрирования минорных белков является информативным и воспроизводимым методом анализа протеома плазмы крови здорового человека в диапазоне концентраций от 10"4 до 10"7 М.

2. Пребывание человека в условиях длительной изоляции в гермообъекте не вызывает выраженных изменений в протеоме плазмы крови, что сопоставимо с индивидуальными изменениями во времени, наблюдаемыми в условиях обычной жизнедеятельности.

3. Экстремальные условия жизнедеятельности, моделирующие эффекты микрогравитации («сухая» иммерсия), вызывают в период реадаптации после перенесенного воздействия существенные изменения содержания белков плазмы крови у здорового человека.

4. Адаптивное изменение уровня содержания белков крови, выявленных у здоровых добровольцев в экстремальных условиях жизнедеятельности, также наблюдается у пациентов как неспецифическая реакция организма в связи с развитием заболевания.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на 8 научных конференциях, в том числе и международные: 3-я протеомная конференция стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); Российско-французско-белорусская конференция «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.); 31-ый международный симпозиум по гравитационной физиологии (Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010 г.); 18-й международный симпозиум «Человек в космосе» (Хьюстон, США, 11-15 апреля 2011г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на /¿Г страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В диссертации приведены таблиц и рисунка. Список использованной литературы содержит ¿У отечественных и

У//

зарубежных

источников. 6

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы исследования

Исследовали образцы плазмы крови 16 здоровых добровольцев, прошедших врачебно-экспертную комиссию ИМБП РАН и допущенных к участию в модельных экспериментах: 1 - 7-суточная «сухая» иммерсия - 5 мужчин в возрасте 23 - 29 лет, пробы крови отбирали за 7 суток до начала эксперимента, на 7-е сутки проведения эксперимента и через 7 суток после окончания эксперимента (период реадаптации); 2 - 105-ти суточная изоляция в гермообъекте - 6 мужчин в возрасте 26-41 лет, пробы крови отбирали за 6-7 суток до начала эксперимента, на 17, 51-52 и 85-86 сутки проведения эксперимента и на 7-8-е сутки после окончания эксперимента (период реадаптации); 3 - внутрииндивидуапьная вариабельность в норме - 5 мужчин в возрасте 26 - 48 лет, пробы крови отбирали на 1-е, 14-е и 21-е сутки в привычных условиях жизнедеятельности. Процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ - ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, было получено письменное Информированное согласие. Методы исследования

Получение образцов плазмы крови. Пробы крови у испытуемых отбирали из локтевой вены утром натощак. ЭДТА плазму крови получали стандартным методом, замораживали и хранили при -80°С до проведения дальнейших протеомных исследований.

Получение обедненной фракции плазмы крови методом удаления мажорных и концентрирования минорных белков. Обедненную фракцию плазмы крови получали с помощью микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad, США). 1 мл плазмы крови добавляли к спин-колонке с микрогранулами, дальнейшие шаги выполняли согласно инструкции производителя. На выходе получали 300 мкл элюата, замораживали и хранили при -20°С.

Проверку качества обеднения плазмы крови проводили по наличию пиков одно - (m/z=66,5 кДа) и двухзарядного (m/z=33,3 кДа) ионов альбумина с помощью прямого масс-спектрометрического профилирования цельной плазмы и обедненной фракции, полученной после обработки микрогранулами ProteoMiner™. Для этого подкисленные растворы плазмы и обедненной фракции пропускали через обращеннофазовые наконечники ZipTip С18 (Millipore, Франция). Полученный элюат смешивали с матрицей (синаповая кислота (SA)) в соотношении 1:1 и наносили на MALDI мишень AnchorChip (Bruker Daltonics, Германия). Спектры получали в линейном режиме на масс-спектрометре с времяпролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 18- 120 кДа.

Проведение двумерного электрофореза. Для выравнивания анализируемых двумерных электрофореграмм по общему белку перед проведением анализа методом двумерного электрофореза концентрацию белка в образцах обедненной фракции плазмы крови определяли по методу Брэдфорда (Bradford М.М., 1976) на вертикальном фотометре УНИПЛАН™ (Пикон, Россия). Измерение проводили по оптической плотности растворов при длине волны 530 нм. Пересчет оптической плотности в концентрацию осуществляли линейной аппроксимацией методом наименьших квадратов калибровочной прямой, построенной с использованием стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина.

Для разделения белков по изоэлектрической точке аликвоты образца обедненной фракции плазмы крови, соответствующие 200 мкг белка, разводили буфером (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% CHAPS, 0,5% Амфолит pH 3-10 и 50мМ ДТТ) до конечного объема 200 мкл и наносили на 11 см стрип с иммобилизованным нелинейным градиентом pH 3-10 (Bio-Rad). Изоэлектрическое фокусирование проводили на приборе Protean IEF Cell (Bio-Rad) по следующей схеме: активная регидратация в течение 14 часов, 250 В в течение 30 минут, 5500 В до 35000 Вч и 800 В в течение 10 часов. Затем стрипы промывали в уравновешивающем буфере (6М мочевина, 50мМ Tris-HCI pH 6,8, 20% глицерин и 2% SDS) сначала с добавлением 1% ДТТ, а потом 2,5% акриламида по 30 минут соответсвенно. Для разделения белков на основании различия их размеров (молекулярных масс) и пространственных конфигураций стрипы переносили на самодельные 4%-12% Tris-HCI полиакриламидные гели (13,3x8,7 см). Разделение проводили в ячейке Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) в несколько стадий: 15 минут при 50 В, 30 минут при 150 В и около 40 минут при 175 В при постоянном охлаждении. Гели окрашивали 0,1% раствором Coomassie Brilliant Blue (СВВ) R-250 (Sigma). Для усреднения технической погрешности метода каждый образец анализировали в двух-трех повторах.

Получение и анализ изображений гелей. Изображение гелей получали с помощью калибровочного денситометра Molecular Imager® GS-800™ (Bio-Rad) в режиме трансмиссии с разрешением 300 точек на дюйм. Анализ изображений гелей с определением интенсивности белковых пятен проводили с помощью программного пакета GelEditor (ИБМХ РАМН). Сводные данные интенсивности пятен по всем гелям переносили в Excel для дальнейшего анализа.

Анализ данных. Все данные в работе представлены как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки достоверности изменений и воспроизводимости метода вычислялся коэффициент вариации (CV) интенсивности для каждого пятна как отношение стандартного отклонения величины к ее среднему значению (CV=SD/M*100%).

Анализ распределения образцов по кластерам проводили с помощью иерархического кластерного анализа методом невзвешенного попарного арифметического среднего (программа Statistica 6.0). Расстояние между объектами (образцами плазмы крови) вычисляли с использованием коэффициента корреляции между профилями интенсивности белковых пятен на геле. Робастность результатов кластерного анализа оценивали путем моделирования выборок из эмпирического распределения значений интенсивности белковых пятен.

Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0). Межгрупповые отличия считали достоверными при р<0,05.

Идентификация белковых пятен методом масе-спектрометрнческого анализа пентидных фрагментов (PMF). Вырезанные вручную из геля белковые пятна отмывали обесцвечивающим буфером (100 мМ бикарбоната аммония (NH4HC03) в 50 %. растворе ацетонитрила), дегидратировали 100% аценитрилом и подвергали трипсинолизу. Элюат пептидов смешивали с матрицей (2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB)) и наносили на MALDI мишень AnchorChip.

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре с время-пролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics) в рефлекторном режиме в диапазоне масс 800 - 4500 Да. Полученные спектры обрабатывали с помощью программы FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics). Определение пиков в спектре осуществлялось алгоритмом SNAP после предварительного вычитания базовой линии типа «top hat» и сглаживания за счет удаления шумов с помощью математического фильтра методом Savitzki-Golay. В масс-лист включались только пики, для которых отношение сигнал/шум превышало 5. Перекалибровку масс-спектров проводили по пикам аутолиза трипсина с массой 842,509 Да и 2211,104 Да.

Поиск белков по набору масс пептидов проводили в программе Mascot v.2.1 (MatrixScience, Великобритания). Параметры поиска были следующие: база данных - NCBIr, вид организма - Homo sapiens, используемый фермент - трипсин, возможные модификации - Oxidation М, Propionamide С и точность определения масс пептидов - 100 ррт. Идентификацию белка считали достоверной, если вычисленный для него эмпирический критерий «Mascot score» превышал 63.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека

Для создания протеомной карты здорового человека использовали двумерные электрофореграммы 60 образцов обедненной фракции плазмы крови, полученной после удаления мажорных и концентрирования минорных белков с использованием микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad). Данный метод позволил значительно снизить концентрацию таких высокопредставленных белков, как альбумин и иммуноглобулины.

Всего было получено 150 двумерных электрофореграмм, то есть по 2-3 повтора на каждый из анализируемых 60 образцов. После окрашивания гелей Coomassie Brilliant Blue подсчитывали количество визуализированных белковых пятен на всех двумерных электрофореграммах. При подсчете не было выявлено статистически достоверных различий показателя среднего количества регистрируемых белковых пятен ни между экспериментами, ни между группами образцов в одном эксперименте (табл. 1). 8

Таблица 1. Среднее количество регистрируемых белковых пятен на электрофореграмме обедненной фракции плазмы крови в группах образцов

Эксперимент Группа образцов Среднее кол-во пятен на геле

В группе В эксперименте

7-суточная «сухая» иммерсия №1 -5 118±17 117±15

№6-10 129±14

№11 - 15 111±13

Внутрииндивидуальная вариабельность в норме №16-20 119±18 125±16

№21-25 124±15

№26 - 30 132±14

105-суточная изоляция в гермообъекте №31-36 119±13 121±13

№37 - 42 119±14

№43 - 48 118±13

№49 - 54 124±12

№55 - 60 124±12

Среднее количество регистрируемых пятен на всех 150 двумерных электрофореграммах, полученных в ходе выполнения данной работы, составило 120±15. Эти данные соответствуют результатам других исследований, в которых изучали плазму крови человека методом 2-DE, с учетом размера гелей (13,3x8,7 см) и способа визуализации белков (Coomassie Brilliant Blue) (Ahmed N. et al., 2003, Kalenka A. et al., 2006, Archakov A. et al., 2009). На основании приведенных в таблице 1 данных можно утверждать, что условия модельных экспериментов не влияли на количество регистрируемых белковых пятен на двумерной электрофореграмме, и в ходе проведения исследования были достигнуты условия воспроизводимости анализа плазмы крови методом двумерного электрофореза.

Для белковых пятен, регистрируемых на полученных двумерных электрофореграммах, анализировали встречаемость на всех 150 гелях. Результаты анализа приведены на гистограмме, показанной на рисунке 1.

Рисунок Т. Гистограмма распределения частоты встречаемости регистрируемых белковых пятен на полученных гелях обедненной фракции плазмы крови здоровых добровольцев.

Видно, что 40% белковых пятен наблюдали на всех полученных гелях (100%). Более

70% пятен наблюдались не менее чем на половине гелей, и только 30% встречались менее

9

чем на 50% гелей. Редко встречающиеся пятна чаще всего характеризовались низким уровнем интенсивности, и их низкая воспроизводимость может объясняться как технической погрешностью метода протеомного анализа, так и пределом чувствительности выбранного метода визуализации белковых пятен (Coomassie Brilliant Blue, до 10"7-10"SM).

Оценка воспроизводимости аналитического метода (определение технической погрешности 2-DE). Воспроизводимость метода двумерного электрофореза анализировали с помощью расчета коэффициента технической вариации. Для этого по техническим повторам анализа образцов оценивали разброс стандартного отклонения относительно средней величины интенсивности каждого пятна на двумерной апектрофореграмме. На гистограмме распределения коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен, наблюдавшихся на полученных двумерных электрофореграммах, видно, что для 45% пятен коэффициент составил менее 20%, и только для 22 пятен из 140 проанализированных (16%) он превысил 30% (рис. 2).

10 20 30 40 50 60 70 £0 SO 100 Kds ф ф ициент тек нической вариации (34)

Рисунок 2. Гистограмма распределения коэффициента технической вариации метода для регистрируемых белковых пятен на двумерных электрофореграммах обедненной фракции плазмы крови.

В среднем по всем образцам коэффициент технической вариации интенсивности белковых пятен составил 22%, что совпадает с данными других авторов, использовавших метод двумерного электрофореза для анализа протеома плазмы крови человека (Corzett Т.Н. et al, 2006, Winkler W. et al., 2008).

Аннотирование мастер-геля. В качестве мастер-геля была взята двумерная электрофореграмма с максимальным количеством регистрируемых белковых пятен. На таком геле было визуализировано 140 белковых пятен, 70 из которых выявлялись более чем на 70% всех полученных в ходе данной работы электрофореграмм. Результаты идентификации пятен методом масс-спектрометрического картирования пептидных фрагментов показали, что на полученной протеомной карте наиболее интенсивно окрашенные группы пятен относились к следующим белкам плазмы крови: витронектин,

протромбин, сывороточный альбумин, а-, (3- и у-цепи фибриногена и аполипопротеины A-I, A-IV и Е. Путем сопоставления результатов масс-спектрометрической идентификации белковых пятен на мастер-геле с аннотированными электрофореграммами плазмы крови человека, депонированными в базе данных SWISS-2DPAGE (http://www.expasy.ch/swiss-2dpage/viewer), было установлено, что полученная протеомная карта обедненной фракции плазмы крови совпадает с типовой картиной разделения белков плазмы крови методом 2-DE.

Для дальнейшего анализа были определены 70 пятен с высокой частотой встречаемости (регистрировались не менее чем на 70% гелей) и относительно низкой погрешностью измерений (коэффициент технической вариации не более 25%).

Анализ внутри- и межиндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови здоровых людей в норме

Внутри индивидуальная вариабельность. Изменчивость протеома плазмы крови изучали у 5 здоровых мужчин за три недели их обычной жизнедеятельности. Обработка значений интенсивности анализируемых белковых пятен на двумерных электрофорераммах по трем точкам эксперимента показала, что средний коэффициент внутрииндивидуальной вариабельности в течение периода обследования составил 22±13%. Этот уровень вариабельности сравним с погрешностью метода анализа, что подтверждается графиком рассеяния среднего коэффициента внутрииндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности анализируемых белковых пятен (рис.3).

Коэффициент внутрииндивидуальной вариации (%)

Рисунок 3. Распределение среднего коэффициента внутрииндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен на 20 электрофореграмме для образцов плазмы крови, полученных от 5 здоровых добровольцев на 1-е, 14-е и 21-е сутки обследования в обычных условиях жизни.

Видно, что практически все точки па графике рассеяния расположены близко к линии, проведенной под углом 45°. Следовательно, средние индивидуальные колебания интенсивности соизмеримы с различиями между техническими повторами для большинства

анализируемых белковых пятен. Полученные данные показывают, что в заданных условиях проведения исследования (выборка из 5 человек и достаточно ограниченное время мониторинга - на протяжении 3-х недель) не наблюдалось существенных изменений в составе протеома плазмы крови, обусловленных изменчивостью во времени.

Анализ данных об изменении интенсивности белковых пятен индивидуально для каждого из 5 добровольцев указал на неинформативность усредненных показателей. Несмотря на то, что средний уровень внутрииндивидуальной вариабельности для некоторых пятен оказался незначителен, а для других был сравним с технической погрешностью метода анализа, в ряде случаев индивидуальные колебания оказались значимыми. Так, у одного добровольца интенсивность пятна кластерина на 14-й день обследования уменьшилась более чем в 2 раза по сравнению с 1-м днем, а на 21-й день - вернулась к первоначальному значению. У другого добровольца интенсивность этого пятна, наоборот, увеличилась в 1,5 раза на 14-й день обследования. В то же время у остальных трех добровольцев изменение интенсивности пятна кластерина в течение 3-х недель было совсем незначительным, в пределах 10-15%. Таким образом, профиль наблюдаемых изменений во времени для каждого человека индивидуален.

Межиндивидуальная (групповая) вариабельность в норме. Для определения межиндивидуальных различий в протеоме плазмы крови здоровых людей в норме были проанализированы обедненные фракции образцов плазмы крови 16 мужчин, полученные в период их обычной жизнедеятельности. Аналогично предыдущей задаче, для каждого пятна вычисляли коэффициент вариации интенсивности между индивидуумами и сравнили с коэффициентом технической вариации метода (рис. 4).

Рисунок 4. Распределение коэффициента межиндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен на двумерной электрофореграмме для образцов плазмы крови, полученных от 16 здоровых добровольцев.

При сравнении графика на рис. 4 с ранее полученными данными по внутрииндивидуальной вариабельности (рис. 3) очевидно, что общее количество пятен, 12

120,00

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

К оэф ф ицие нт меж инд ивидуальмой вариации [%)

характеризующихся высокой межиндивидуальной вариабельностью, значительно превысило количество пятен, характеризующихся высокой внутрииндивидуалыюй изменчивостью. В среднем коэффициент межиндивидуальной вариации составил 50±19%, что более чем в два раза выше, чем аналогичный показатель для индивидуальной вариабельности и для технической погрешности метода. Масс-спектрометрическая идентификация была проведена для пятен, расположенных на рис. 4 ниже линии, проведенной под углом 45°, с коэффициентом межиндивидуальной вариации более 50%, что как минимум в два раза превышает погрешность метода. Таких белковых пятен оказалось 37; результаты масс-спектрометрической идентификации приведены в таблице 2.

Таблица 2. Белки плазмы крови, характеризующиеся высокой межиндивидуальной вариабельностью в норме. Коэффициент вариации усредняли по 16 образцам.

№ п/п Среднее CV/CVTK Название белка (число изоформ) Индекс UniProt Mascot score Биологический процесс*

1 65/16 р-цепь фибриногена (5) Р02675 197 Свертывание крови

2 55/17 a-цепь фибриногена (7) Р02671 209 Свертывание крови

3 68/16 Фактор С4 комплемента, фрагменты (2) P0C0L5 76 Активация системы комплемента Иммунный ответ Воспалительный процесс Врожденный иммунитет

4 81/16 Аполипопротеин A-I (4) Р02647 181 Метаболизм холестерина Метаболизм и транспорт липидов Метаболизм стероидов Транспорт молекул

5 76/19 Аполипопротеин Е (2) Р02649 231 Транспорт липидов Транспорт молекул

6 55/15 Кластерин (аполипопротеин J) (3) PI0909 116 Апоптоз Активация системы комплемента Иммунный ответ Врожденный иммунитет

7 71/19 Аполипопротеин A-IV (2) Р06727 277 Транспорт липидов Транспорт молекул

8 60/19 Витронектин (1) Р04004 89 Адгезия клеток

9 55/27 Плазминоген (3) Р00747 93 Свертывание крови Фибринолиз Трансформация тканей

10 67/20 Иммуноглобулин М (3) Р99001 116 Иммунный ответ

11 64/17 Фактор С1 комплемента (1) Р09871 110 Активация системы комплемента Иммунный ответ Врожденный иммунитет

Примечание: CV - коэффициент вариации; * - согласно данным Gene Ontology (GO).

Среди идентифицированных белков встречаются аполипопротеины A-I, Е и кластерин (аполипопротеин J), которые характеризовались и относительно высокой

внутрииндивидуальной вариабельностью, которая в 1,5 раза превышала техническую погрешность метода. Высокая межиндивидуальная вариабельность различных форм аполипопротеинов может объясняться особенностями как липидного и энергетического обмена, так и двигательной активности у здоровых лиц. Кроме того, высокая изменчивость аполипопротеинов А-1 и Е в крови здоровых добровольцев может быть связана с различным содержанием жиров и холестерина в рационе в течение обследования. Остальные белки, такие, как аполипопротеин А-1У, а-, р-цепи фибриногена, плазминоген, витронектин, фрагменты фактора С4 комплемента и другие, не были выявлены при исследовании внутрииндивидуальной изменчивости. Это указывает, что биологическая вариабельность протеома превышает внутрииндивидуальную изменчивость.

Изменения протеома плазмы крови под воздействием модельных экспериментов

Эксперимент с 7-суточной «сухой» иммерсией. Анализ изменений белковой композиции плазмы крови проводился в ответ на воздействие безопорной среды. Во время «сухой» иммерсии тело испытуемого, погруженного в воду, отделено от нее специальной водоотталкивающей пленкой (Шульженко И.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976), поэтому сила опоры оказывается равномерно распределенной по всей поверхности тела.

На рисунке 5 приведены результаты кластерного анализа образцов плазмы крови, проведенного на основе сопоставления профилей интенсивности анализируемых белковых пятен на гелях.

Рисунок 5. Результаты кластерного анализа образцов плазмы крови, полученных у 5 здоровых добровольцев до (I), после (II) воздействия «сухой» иммерсии и в период реадаптации (III).

Видно, что вся совокупность из полученных в эксперименте образцов разделилась на 2 кластера. Такое распределение объектов по кластерам наблюдали в 943 случаях из 1000 моделированных из эмпирического набора значений интенсивности выборок, что подтверждает нечувствительность результатов кластерного анализа к неоднородностям в 14

результатах измерений. В первый кластер вошли образцы, полученные в период реадаптации, второй кластер образовали образцы, полученные до и после иммерсионного воздействия. Характер распределения указывает, что существенные изменения в протеоме плазмы крови происходили во время реадаптации организма к условиям нормальной гравитации после 7-суточного воздействия гипогравитации.

Средний коэффициент вариации интенсивности анализируемых белковых пятен в образцах, полученных в период проведения эксперимента, составил 46±28%. Это достаточно высокий уровень вариабельности, в два раза превышающий погрешность метода анализа (коэффициент технической вариации). Кроме того, данный показатель в два раза превысил уровень внутрииндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови здорового человека в норме, который составлял 22±13%. Эти данные подтверждают, что наблюдаемые в плазме крови изменения обусловлены воздействием модельного эксперимента, а не являются следствием проявления нормальной изменчивости протеома в течение времени. Построив диаграмму сравнения коэффициента вариации в течение эксперимента с «сухой» иммерсией относительно коэффициента технической вариации интенсивности анализируемых белковых пятен (рис. 6) были выявлены пятна расположенные ниже линии в 45° с коэффициентом вариации более 50%, что указывает на существенное изменение их интенсивности в ходе эксперимента.

Рисунок 6. Распределение среднего коэффициента вариации интенсивности белковых пятен на двумерных электрофореграммах в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией для 5 добровольцев относительно коэффициента технической вариации метода.

Белковые пятна с достоверно изменяющимся уровнем интенсивности и примеры изменения их интенсивности в ходе эксперимента представлены на двумерной электрофореграмме, приведенной на рисунке 7. Видно, что для групп пятен обозначенных цифрами 3, 6 и 7 наблюдали увеличение интенсивности в период реадаптации (III) по сравнению с фоном и последними (7-ми) сутками пребывания в иммерсионной ванне. В

свою очередь, интенсивность белковых пятен в группах 1, 2, 4 и 5 в этот период, наоборот, уменьшилась.

MW ■ ■ -----

«Да

90 t.

• "110 2

60 * » * »gäi

ШП7

V 1-js *

r~14.s

20 l-o 13

6 6 7 PI

2

1

М^ншшВЕШ яШшшШш*

4,5

W

3

Рисунок 7. Двумерная электрофореграмма обедненной фракции плазмы крови здорового добровольца в фоновом периоде и пример изменения интенсивности групп белковых пятен в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией: фон - I, 7-е сутки воздействия - II и период реадаптации - III.

Отмеченные на рисунке 7 группы белковых пятен были идентифицированы как 1,2 - а-и ß-цепи фибриногена, 3, 6, 7 - аполипопротеины A-I, A-IV и Е, 4 - фрагменты фактора С4 комплемента и 5 - сывороточный амилоид Р (табл. 3). В таблице 3 приведены численные данные об изменении интенсивности идентифицированных белковых пятен в ходе модельного эксперимента.

В период реадаптации после окончания иммерсии (+7-е сутки обследования) наблюдали достоверное увеличение (более чем в 2 раза) уровня аполипопротеинов A-I, Е и A-IV по сравнению с фоном и 7-м днем «сухой» иммерсии. При этом на 7-е сутки пребывания в иммерсионной ванне отмечалось незначительное снижение уровня содержания указанных белков. Наблюдаемые сдвиги указывают на изменения в функционировании системы транспорта липидов. Известно, что гиподинамия в космическом полете или модельных условиях приводит к снижению интенсивности определенных обменных процессов (Маркин A.A., Моруков Б.В. и др., 2008). Возможно, наблюдаемое нами столь значительное увеличение уровня аполипопротеинов A-I, A-IV и Е, важнейших апобелков, участвующих в обмене липидов и обладающих антисклеротическим действием (Mahley 16

II. 1ппегагку Т.Ь. е1 а1., 1984), может иметь значение в реутилизации и элиминации из организма избыточного холестерина в период реадаптации.

Таблица 3. Изменения уровня интенсивности идентифицированных белковых пятен в плазме крови здоровых добровольцев в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией (СИ)

№ п/п Название белка Число Сутки обследования

изо форм -7-е 7-е СИ +7-е

1 |3-цепь фибриногена 2 0,043± 0,022 0,05 8± 0,0108 0,006± 0,0009*

2 a-цепь фибриногена 4 0,009± 0,0054 0,012± 0,0024 0,001± 0,0013*

3 Аполипопротеин A-I 3 0,043± 0,0166 0,035± 0,0159 0,122± 0,0209*

4 Фрагменты фактора С4 комплемента 2 0,004± 0,0013 0,005± 0,0012 0,0005± 0,0006*

5 Сывороточный амилоид Р 1 0,002± 0,0012 0,003± 0,0011 Н/Д

6 Аполипопротеин Е 3 0,0022± 0,0004 0,0018± 0,0003 0,006± 0,0008*

7 Аполипопротеин A-IV 2 0,018± 0,0042 0,014± 0,0035 0,04± 0,0092*

Примечание. Все данные представлены в отн. ед. измерения интенсивности, * - достоверное различие с фоном и 7-м днем «сухой» иммерсии (р<0,05); Н/Д - не детектировались.

Как видно из данных таблицы 3, также были выявлены изменения и в системе регуляции гемостаза, проявляющиеся в достоверном уменьшении в период реадаптации уровня интенсивности белковых пятен, относящихся а- и (3- цепи фибриногена. Наблюдаемое снижение уровня фибриногена может быть следствием возрастания объема циркулирующей плазмы (ОЦП) - явления, характерного для первых дней реадаптации к нормальным условиям жизнедеятельности после «сухой» иммерсии (О.Г. Газенко, И.И. Касьян, 1990, Ларина И.М., М.-А. Кусто и др., 2008). С другой стороны, нельзя исключать также и влияние эмоционального стресса, испытываемого добровольцами в ходе иммерсии, на параметры гемостаза. Известно, что адреналин способствует повышению уровня фибриногена в крови (Карагезян К. Г., 1960).

В период реадаптации после иммерсионного воздействия происходило также достоверное изменение уровня содержания сывороточного амилоида Р и фрагментов фактора С4 комплемента (табл. 3). Соответствующие этим белкам пятна практически не регистрировались на электрофореграммах, полученных на +7-е сутки обследования, что говорит о низкой концентрации этих белков, близкой к пределу чувствительности метода анализа. Безусловно, резкое снижение интенсивности пятен, относящихся к фактору С4

17

отражает сдвиги в иммунной системе (Belt К.Т., Caroll М.С. et al.,1984, Dodds A.W., Law S.K., 1990). В исследовании индивидуальных особенностей регуляции уровней белков крови, относящихся к электрофоретическим фракциям al- и а2-глобулинов при 7-суточной иммерсии были выявлены и совокупность эффектов, характерных для острофазной реакции (Ларина О.Н., Беккер A.M., 2009). На основании наших данных мы не могли проследить за особенностями развития реакции острой фазы или уровнем содержания иммуноглобулинов, поскольку эти белки относятся к мажорным и были удалены на стадии пробоподготовки. Известно, что сывороточный амилоид Р тесно связан с С-реактивным белком, главным показателем реакции острой фазы, и работает по тому же механизму запуска иммунного ответа (Pepys М.В., Dash A.C. et al., 1978). Можно предположить, что наблюдаемые изменения в уровне содержания сывороточного амилоида Р и фактора С4 комплемента отражали развитие острофазной реакции организма, вызванной воздействием экспериментальных условий и уменьшающуюся в период реадаптации. Кроме того, уровень сывороточного амилоида Р коррелирует с параметрами, отражающими состояние сердечнососудистой системы, а также уровень физической активности и интенсивность липидного обмена (Jenny N.S., Arnold A.M. et al., 2007). Комплекс факторов «сухой» иммерсии затрагивал все вышеперечисленные системы (Козловская И.Б., 2008), что позволяет говорить о тесной взаимосвязи наблюдаемых изменений. Следует также отметить и высокую межиндивидуальную вариабельность идентифицированных белков в фоновом периоде. Как видно из данных таблицы 3, разброс значений интенсивности пятен а-, ß-цепи фибриногена и сывороточного амилоида Р у разных добровольцев достигал 60%.

Эксперимент с 105-суточной изоляцией в гермообъекте. Пребывание человека в условиях ограниченного пространства сопровождается изменением функционирования различных систем организма. Для выявления изменений в протеоме плазмы крови мы проанализировали 30 образцов плазмы крови 6 здоровых добровольцев в условиях модельного эксперимента с 105-суточной изоляцией в гермообъекте.

Средний коэффициент вариации интенсивности анализируемых пятен в период проведения эксперимента составил 27±12%, что немногим превышает средний коэффициент технической вариации метода - 20% (оценен по образцам, полученным от участников изоляции). Оказалось, что только для 5 белковых пятен коэффициент вариации в данном эксперименте превысил 50%, что может указывать на достоверное изменение концентрации соответствующих белков (рис. 8). Таким образом, протеом плазмы крови претерпевает определенные изменения в ходе воздействия модельного эксперимента с изоляцией, но наблюдаемые изменения не столь существенны по сравнению с результатами модельного эксперимента с «сухой» иммерсией.

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00

Коэффициент вариации в эксперименте (%)

Рисунок 8. Распределение среднего коэффициента вариации интенсивности белковых пятен на двумерных электрофореграммах в эксперименте с 105-суточной изоляцией относительно коэффициента технической вариации метода.

Наблюдаемые у участников длительной изоляции изменения связаны с увеличением или уменьшением интенсивности пятен, относящихся к следующим белкам: а- и (3-цепи фибриногена, фрагмент фактора С4 комплемента, аполипопротеины A-I и Е, плазминоген, фактор С1 комплемента и иммуноглобулин М (табл. 4).

Таблица 4. Идентифицированные белковые пятна с изменяющимся уровнем интенсивности у 6 здоровых добровольцев в ходе эксперимента со 105-суточной изоляцией в гермообъекте.

№ п/п Средний cv/cvTex Название белка (количество изоформ) Индекс UniProt MW, кДа Pl Перекрывание последовательности*, %

I 34/12 Аполипопротеин A-I (2) Р02647 30759 5,56 60

2 44/14 Аполипопротеин Е (2) Р02649 36132 5,65 58

3 39/17 Фибриноген а-цепь (1) Р02671 94914 5,7 40

4 32/11 Фибриноген р-цепь (2) Р02675 55892 8,54 51

5 44/25 Плазминоген (3) Р00747 90510 7,04 18

6 46/12 Фрагмент фактора С4 комплемента (1) P0C0L4 192650 6,65 8

7 52/22 Фактор С1 комплемента (1) Р09871 80067 5,82 25

8 40/20 Иммуноглобулин М (2) Р01871 49276 6,35 28

Примечание: CV — коэффициент вариации; MW - молекулярный вес; pl - изоэлектрическая точка и * - перекрывание аминокислотной последовательности белка идентифицированными пептидными фрагментами.

Изменение уровня интенсивности пятен, относящихся к аполипопротеинам A-I и Е, вероятно, связано со сдвигами в липидном метаболизме, которые в свою очередь могли быть вызваны изменением привычного рациона питания и ограничением двигательной активности испытателей. Исследование биохимических показателей крови в экспериментах с длительной изоляцией в гермообъекте выявило определенные отклонения в уровне энергетического, белково-азотистого, нуклеинового и холестеринового обмена (Маркин

19

A.A., Журавлева O.A. и др., 2010). По-видимому, гипокинезия, являющаяся неотъемлемым фактором длительной изоляции в гермообъекте, вызывает изменения в содержании аполипопротеинов плазмы крови. Считается, что изменения липидного состава мембранных структур клеток организма, а также плазмы крови тесно связаны с двигательной активностью человека, зависят от его компенсаторных возможностей по отношению к внешним стрессогенным воздействиям и от глубины сформировавшихся метаболических сдвигов (Заболотская И.В., Маркин A.A., 2001; Найдина В.П., Ларина И.М. и др., 1991).

Изменение уровня фибриногена могло быть связано с «подвижностью» фракции белков острой фазы, уровень которых изменяется в ответ на различные неблагоприятные воздействия: воспаления, обусловленные бактериальной инфекцией, травматическими повреждениями (Алешкин В.А., Новикова Л.И. и др., 1998). В том числе уровень фибриногена может изменяться в связи со стрессогенными периодами эксперимента в начале и конце изоляции.

Обнаруженные изменения уровня интенсивности белковых пятен, относящихся к факторам С1 и С4 системы комплемента и иммуноглобулину М, могут указывать на возможную активацию иммунной системы организма в период изоляции, в ответ на определенные факторы окружения, в том числе - на специфическую микробную среду гермообъекта. Динамичность иммунной системы дает возможность адаптироваться к постоянно меняющимся внешним воздействиям и тем самым характеризует норму функционирования организма (Лебедев К.А., Понякина И.Д., Авдеева B.C., 1991).

При этом, если в эксперименте с изоляцией наблюдали резкие колебания анализируемых белков у отдельных индивидуумов, то в период реадаптации для большинства показателей была характерна тенденция возврата к фоновым значениям, что говорит об адаптационном характере наблюдаемых изменений.

Сопоставление пластичности протеома плазмы крови с изменениями уровня содержания идентифицированных белков при патологии

Обобщая результаты сравнительного анализа двумерных электрофореграмм, полученных как в экспериментах по оценке внутри- и межиндивидуальной (биологической) вариабельности протеома плазмы крови здоровых добровольцев, так и данные экспериментов по моделированию факторов космического полета, было выявлено 12 белков, уровень которых достоверно изменялся. Белки относятся к следующим системам организма: регуляция гемостаза - а-, ß-цепи фибриногена, плазминоген и витронектин; метаболизм липидов - аполипопротеины A-I, A-IV, Е и J (кластерин) и иммунная система - факторы С1 и С4 комплемента, сывороточный амилоид Р и иммуноглобулин М. Как видно из

литературных данных, большинство этих белков присутствует в крови в концентрации 10"7-10"4 М (J. Schaller, S. Gelber et al., 2008). Это в первую очередь свидетельствует о методических ограничениях выбранного способа визуализации с использованием окрашивания Coomassie Brilliant Blue.

В проведенных модельных экспериментах здоровые добровольцы испытывали воздействия, которые находятся в пределах физиологических резервов организма. Соответственно и наблюдаемые изменения белкового состава крови отражали нормальную (адаптационную) вариабельность протеома (так называемую пластичность), не связанную с развитием патологии. В рамках данной работы был проведен анализ с привлечением литературных данных, полученных методом двумерного электрофореза, чтобы проверить сопоставимо ли изменение уровня белков, выявленных у здоровых добровольцев с данными об изменениях, связанных с развитием каких-либо патологических процессов. Соответствующие литературные данные для 7 идентифицированных в модельных экспериментах белков приведены в таблице 5.

Анализ литературы показал, что наблюдаемые в протеомных профилях здоровых добровольцев изменения в большинстве случаев уже были ранее охарактеризованы в связи с патологическими процессами. В большинстве приведенных в таблице 5 работ, описывающих изменение данных белков при развитии патологического процесса, исследователи отмечали изменение уровня белков семейства аполипопротеинов. Нами также было 'выявлено достоверное увеличение уровня аполипопротеинов A-I, Е и A-IV в период реадаптации организма к нормальной гравитации после 7-суточного воздействия «сухой» иммерсии. Уровень этих белков изменялся от двух до шести раз при таких заболеваниях, как острый дыхательный синдром (J.-H. Chen et al., 2004), инфаркт миокарда (P.J. Mateos-Caceres et al., 2004), диабет, нефропатия (A. Lapolla et al., 2008) и различные онкологические процессы (Е.И. Гоуфман с соавт., 2006; H.-L. Huang et al., 2006). Уровень другого белка -плазминогена, который характеризовался высокой пластичностью в эксперименте с изоляцией в гермообъекте - увеличивался в связи с таким заболеванием, как рак поджелудочной железы (М. Bloomston et al., 2006). Необходимо отметить, что изменения уровня белков, выявленные у здоровых добровольцев, меньше или соизмеримы с таковыми, наблюдаемыми при развитии заболеваний.

го

ГО

Таблица 5. Белки, характеризующиеся высокой вариабельностью у здоровых добровольцев, изменение уровня содержания которых по литературным данным наблюдали в связи с развитием патологических процессов.

№ п/п Название белка Максимальные изменения в модельном эксперименте, кратность/(СУ) Изменение при заболевании (патология), кратность

1 Плазминоген (44%) 2,If рак поджелудочной железы (Bloomston М. et al., 2006)

2 Аполипопротеин A-I |3 (103%) 4,7f диабет, нефропатия (Lapolla A. et al., 2008); 3,Ц инфаркт миокарда (Mateos-Caceres P.J. et al., 2004); t острый дыхательный синдром (Chen J.H. et al., 2004); 6J. рак яичника, рак матки, рак молочной железы (Гоуфман Е.И. с соавт., 2006); 2,0Црак молочной железы (Huang Y.L. et al., 2006)

3 Аполипопротеин A-IV Т2 (60%) 3,3J. идиопатическая артериальная гипертензия легких (Yu М. et al., 2007); J, острый дыхательный синдром (Chen J.H. et al., 2004)

4 Аполипопротеин Е Т5 (60%) f острый дыхательный синдром (Chen J.H. et al., 2004)

5 Сывороточный амилоид Р | (106%) 1,781 болезнь Альцгеймера (Hye A. et al., 2006)

6 Фактор С4 комплемента 110 (78%) 2,031 болезнь Альцгеймера (Hye A et al., 2006); | острый дыхательный синдром (Chen J.H. et al., 2004)

7 Иммуноглобулин М (40%) l,6f болезнь Альцгеймера (Hye A. et al., 2006)

Примечание: СУ — коэффициент вариации; 11 - возрастание/убывание в указанное число раз.

Из данных таблицы 5 следует, что работы, выполненные методом двумерного электрофореза с целью поиска маркеров заболеваний, не учитывали параметры нормальной вариабельности, присущей здоровому организму. Как следствие, среди кандидатов в биомаркеры обнаруживали белки, изменение уровня которых характерно для здорового человека. Поэтому, определение доверительных интервалов, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, остается актуальной научно-практической задачей протеомики.

Полученные данные свидетельствуют, что наблюдаемые во многих протеомных исследованиях изменения белкового профиля в большей степени имеют отношение к понятию физиологической нормы протеома плазмы крови, нежели к развитию патологического процесса. Изучение такого рода изменений может иметь практическое значение с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.

выводы

1. Получена протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека, содержащая 140 белковых пятен, из которых 70 белковых пятен воспроизводились более чем на 70% электрофореграмм и характеризовались коэффициентом технической вариации не превышавшим 25%.

2. Внутри- и межиндивидуальные различия в протеоме плазмы крови здоровых людей в условиях их обычной жизнедеятельности характеризуются коэффициентами вариабельности 22% и 50%, соответственно.

3. Выявлены белки, определяющие пластичную часть протеома плазмы крови. Внутрииндивидуальная вариабельность обусловлена различиями в уровне содержания аполипопротеинов A-I, Е и кластерина (аполипопротеин J), а межиндивидуальная - помимо тех же белков, также связана с различиями в уровне содержания аполипопротеина A-IV, витронектина, плазминогена, фибриногена а- и Р-цепи, факторов С1 и С4 комплемента и иммуноглобулина М.

4. Пребывание здорового человека в контролируемых условиях жизнедеятельности в гермообъекте не вызывает значительных изменений в протеоме плазмы крови.

5. В эксперименте с «сухой» иммерсией значимые изменения в протеоме плазмы крови здоровых добровольцев происходили в период реадаптации после завершения испытания. Наблюдаемые изменения были связаны с достоверным увеличением уровня содержания в крови аполипопротеинов A-I, Е и A-IV и с уменьшением уровня содержания а- и (3-цепей фибриногена, сывороточного амилоида Р и фрагментов фактора С4 комплемента.

6. Изменения уровня белков, характерные для естественного молекулярного ответа организма в процессе адаптации на изменение условий жизнедеятельности аналогичны изменениям, присущим неспецифическому компоненту патогенеза заболеваний.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Application of 2-DE for studying the variation of blood proteome. (Special report) / Oxana Trifonova, Irina Larina, Anatoly Grigoriev, Andrey Lisitsa, Sergei Moshkovskii, Alexander Archakov. // Expert Review of Proteomics. 2010, Jun;7(3), - P.431-438.

2. Изменение белкового состава плазмы крови в эксперименте с 7-суточной "сухой" иммерсией. / Трифонова О.П., Пастушкова Л.Х., Саменкова Н.Ф., Пятницкий М.А., Карузина И.И., Лисица А.В., Ларина И.М. //Авиакосмическая и экологическая медицина, 2010. Т.44. No.5, с.24-28.

3. Выбор допустимой погрешности определения массы пептида при идентификации белков методом пептидного картирования. / А.Л. Чернобровкин, О.П. Трифонова, Н.А. Петушкова, Е.А. Пономаренко, А.В. Лисица. //Биоорганическая химия, 2011. Т.37. №1, с. 132-136.

4. Вариабельность протеома плазмы крови у здоровых людей. / Е.К. Байгарип, В.В. Бессонов, О.И. Передеряев, О.П. Трифонова, С.А. Мошковский, М.А. Карпова. // Вопросы питания, 2011. Т.80. №2, с. 20-25.

5. Investigation of extent of variation in plasma proteome. / Oxana P. Trifonova, Lyudmila K. Pastushkova, Natalia F. Samenkova, Natalia A. Pakharukova, Irina I. Karuzina, Andrey V. Lisitsa, Irina M. Larina. // 3rd Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary, 2009, Book of Abstracts. - P.73.

6. Популяционная протеомика плазмы крови здоровых доноров. / Бессонов В.В., Васильев А.В., Хотимченко С.А., Батурин А.К., Эллер О.И., Передеряев Ю.В., Ведищева Ю.В., Байгарин Е.К., Мошковский С.А., Карпова М.А., Мельник С.А., Сычева A.M., Хряиова Е.В., Фомченкова Е.Я., Ларина И.М., Трифонова О.П., Пастушкова Л.Х., Пахарукова Н.А., Валеева О.А., Доброхотов И.В. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: Сборник тезисов. -Москва, 2009.-С. 201-202.

7. Variation in plasma proteome during 7-day dry immersion. / Trifonova O.P., Pastushkova L.Kh., Samenkova N.F., Pyatnitskiy M.A., Karuzina I.I., Lisitsa A.V., Larina I.M. / French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular Impairment Induced by Environmental Conditions: Molecular, Cellular and Functional Approach», Angers, France, March 10-14, 2010, Book of Abstracts. - P. 28.

8. Исследование методом двумерного электрофореза изменений протеома плазмы крови при длительной изоляции человека. / Трифонова О.П. // Материалы IX конференции молодых ученых специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики: Тезисы докладов. - Москва, 2009. - С. 71-72.

. Proteomic characterization of variation in human plasma during long-term isolation. / Trifonova O.P., Pastushkova L.Kh., Samenkova N.P., Karuzina 1.1., Lisitsa A.V., Larina I.M. // 31s1 Annual International Gravitation Physiology Meeting, Trieste, Italy, 2010. Book of Abstracts, P. 56.

10. Анализ межиндивидуальной вариабельности протеома крови здорового человека. / Трифонова О.П., Пахарукова Н.А., Пастушкова Л.Х., Лисица А.В., Мошковский С.А., Ларина И.М. // Первая международная научно-практическая конференция Постгеномные Методы Анализа в Биологии, Лабораторной и Клинической медицине. Москва, 17-19 ноября 2010, С. 57.

11. Популяционная протеомика плазмы крови здоровых доноров. / Бессонов В.В., Эллер О.И., Передеряев Ю.В., Байгарин Е.К., Мошковский С.А., Карпова М.А., Мельник С.А., Сычева A.M., Хряпова Е.В., Фомченкова Е.Я., Ларина И.М., Трифонова О.П., Пастушкова Л.Х., Пахарукова Н.А., Валеева О.А., Доброхотов И.В. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Сборник тезисов, 6 декабря 2010г., Москва, стр.71-73.

1. Changes in human plasma proteome during 7-day dry immersion. / Oxana P. Trifonova, Lyudmila Kh. Pastushkova, Natalia F. Samenkova, Irina I. Karuzina, Andrey V. Lisitsa, Irina M. Larina. // 18th IAA Humans in Space Symposium, Houston, USA, April 11-15, 2011, Book of Abstracts. -2183.

Заказ № 262-1/08/2011 Подписано в печать 23.08.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Актуальность работы

Протеомика - одно из наиболее динамично развивающихся направлений в области постгеномной молекулярной медицины. Практическая значимость протеомики определяется её направленностью на обнаружение белковых биомаркеров для диагностики и мониторинга лечения социально-значимых заболеваний. Протеом крови человека включает в себя* большинство, если не все, белки человеческого организма. Кровь является доступным биоматериалом, что делает ее удобным объектом диагностической протеомики.

Крупномасштабное изучение протеома плазмы крови было проведено под эгидой международной организации HUPO (Human Proteome Organization) в рамках проекта Plasma Proteome Project (НРРР) (Omenn G.S. et al., 2005). В результате выполнения 95 различных исследований было идентифицировано 7884 белка крови. За последние 10 лет в плазме крови были выявлены белки, связанные с сердечно-сосудистыми, онкологическими, аутоиммунными и нейрогенеративными заболеваниями. Несмотря на то, что на этапе исследований различных заболеваний протеомными методами в плазме и. сыворотке крови было выявлено более 200 потенциальных биомаркеров, только единицы из них обладали высокой специфичностью (Anderson N.L, Anderson N.G., 2002, Anderson N.L., 2010, Hortin G.L. et al., 2010). Так, в 2009 году Американским агентством FDA был согласован многопараметрический тест OVA1 для диагностики рака яичников, что явилось первым примером практического применения результатов протеомики (http://www.fda.gov/NevvsEvents/Nevvsroom/PressAnnouncements/ucml82057.htm).

В клинической протеомике, как и в других медицинских исследованиях, остро стоит проблема биологической вариабельности контрольного биоматериала. При обнаружении, в крови белков, потенциальных биомаркеров, необходимо знать, какой степенью изменчивости характеризуется концентрация данных белков в норме, а также границы внутри- и межиндивидуальных различий. Anderson&Anderson в 2002 году представили данные о внутри- и межиндивидуальной вариабельности ряда белков, включая протромбин, миоглобин, гаптоглобин, интерлейкин, С-реактивный белок, липопротеины и другие. Показатели вариабельности составили соответственно 23% и

45%, поэтому авторы предположили, что индивидуальные изменения уровня белков во времени должны быть вдвое ниже, чем вариабельность внутри популяции (Anderson N.L.,

Anderson N.G., 2002). Todd Н. Corzett с соавторами (2010) провели статистический анализ внутрииндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови методом дифференциального гель электрофореза (Corzett Т.Н. et al., 2010). Результаты показали, б что межиндивидуальная вариабельность значительно превышает внутрииндивидуальную, которая, в свою очередь, сравнима с технической погрешностью метода. В данном исследовании авторы не принимали во внимание, ни состояние здоровья, ни образ жизни, ни половые различия испытуемых.

Протеом человека в отличие от генома, который является константным параметром организма и в целом не зависит от физиологических или патологических- условий, напротив, является ситуационным. Состав протеома человека крайне изменчив^ и может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от текущих условий жизнедеятельности и состояния здоровья. Помимо значительных различий протеомного профиля у разных индивидуумов и естественных колебаний индивидуального протеома во времени, существуют вариации количественного и качественного состава белков, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий. Так, показано, что на протеом крови могут оказать влияние различные факторы: питание (содержание в пище жиров и белков), курение, занятия спортом, длительный постельный, режим-(Anderson N.L., Anderson N.G., 2002) и циркадианные ритмы (Linkowski P., Spiegel К., Kerkhofs М. et al., 1998).

При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах, имитирующих отдельные условия космической экспедиции («сухая» иммерсия, длительная изоляция и др.), организм здорового человека реагирует на непривычное для него состояние. Происходящие в организме изменения затрагивают все системы органов, в том числе и белковый состав крови. Анализ изменений белкового состава крови является основой для изучения молекулярного ответа человека в новых условиях существования. С помощью биохимических методов (например, радиоиммуннологического анализа, иммунодиффузии, электрофореза в ацетатцеллюлозном геле) были проанализированы изменения многих белков крови: гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) (Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999), компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) (Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980; Рыкова М.П. с соавт., 2001, 2004, 2006), белков системы свертывания крови (Фомин, А.Н., 1981) и «острой» фазы (Ларина О.Н., 1992; 2006), ферментов, в т.ч. протеолитических (Тигранянс соавт., 1987).

Протеомные методы для анализа изменений белкового состава жидкостей тела здорового человека во время космических полетов и наземных экспериментов начали использовать совсем недавно. В лаборатории протеомики ГНЦ РФ - ИМБП РАН для анализа изменений протеома сыворотки крови был применен метод прямого масс7 спектрометрического профилирования после предварительного фракционирования образцов сыворотки на магнитных частицах (Пахарукова H.A. с соавт., 2010, Pakharukova N.A. et al., 2011). Данная технология позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков и белковых фрагментов, но только в низкомолекулярном диапазоне масс (до 17000 Да). До развития протеомных методов анализ соотношения белковых фракций сыворотки крови проводили с помощью электрофореза в ацетатцеллюлозе (Frenkel M.J. & Blagrove R.J., 1978). Этим методом анализировали изменения после длительных космических полетов и в ходе модельных экспериментов (Ларина О.Н., 1992, 1997, Ларина О.Н., Беккер A.M., 2006). Электрофорез в ацетатцеллюлозе позволяет выявить изменения только в соотношениях групп белков крови (альбумины, глобулины: альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бетта-глобулины, гамма-глобулины), но не предоставляет информацию об отклонениях в содержании отдельных белков.

Изучение протеома с помощью двумерного гель-электрофореза (2-DE) долгое время оставалось единственным методом для анализа сложных белковых смесей, таких как плазма крови (O'Farrell Р.Н., 1975). С помощью 2-DE можно проводить, относительный количественный анализ и поиск дифференциально экспрессируемых белков. Преимуществом 2-DE является его объективность и независимость от исходных посылок об ожидаемых результатах эксперимента. Сравнивая 2-DE с современными высоко производительными методами анализа протеома, следует обратить внимание, что количественный анализ не требует предварительной идентификации белков.

Известно, что анализ протеома плазмы крови как методом двумерного электрофореза, та к и любым другим протеомным методом, затруднен наличием мажорных

•> с белков в очень высокой (10"J - Ю'а М) концентрации (альбумин, трансферрин, иммуноглобулины и т.д.) (Anderson N.L. and Anderson N.G., 2002). Поэтому возникает необходимость удаления мажорных белков, чтобы исследовать белки, представленные в более низких концентрациях и составляющие гак называемую обедненную фракцию плазмы крови.

Несмотря на многолетние исследования по протеомному профилированию патологических состояний, четкое определение понятия «норма» в протеомике на сегодняшний день отсутствует. Качественный и количественный состав белков может изменяться в пределах нормы реакции, очевидно, заложенной на генетическом уровне, что не приводит к развитию патологии. В настоящий момент отсутствуют представления о мере пластичности/консерватизма протеома плазмы крови здорового человека при воздействии на его организм различных факторов среды или условий жизнедеятельности.

Целью работы являлась качественная и количественная оценка вариабельности белков плазмы крови здорового человека при воздействии на организм различных факторов, в том числе моделирующих и эффекты микрогравитации. В работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить методом двумерного электрофореза и охарактеризовать протеомную карту плазмы крови здорового человека после удаления мажорных и концентрирования минорных белков.

2. Выявить достоверно различающиеся по уровню содержания в плазме крови белки, определяющие внутри- и межиндивидуальные различия (пластичность) протеома здоровых людей.

3. Выявить изменения протеома плазмы крови здорового человека, вызванные воздействием экстремальных факторов («сухая» иммерсия и длительная изоляция).

4. Сопоставить пластичность протеома плазмы крови, обусловленную экстремальными условиями жизнедеятельности, с известными данными об изменении уровня содержания белков в плазме крови при патологии.

Научная новизна

Впервые было проведено исследование по выявлению пределов вариабельности протеома плазмы крови, характерных для нормального человека, в том числе связанных с экстремальными воздействиями. С помощью метода двумерного электрофореза были оценены изменения в протеоме плазмы крови здоровых людей в ходе наземных экспериментов по моделированию отдельных факторов космического полета - 7-суточная «сухая» иммерсия и 105-суточная изоляция в гермообъекте. Впервые показано, что колебания состава протеома проявляются как признаки адаптивной пластичности протеома, в период восстановления организма после перенесенного воздействия.

Практическая значимость работы

В работе проведена оценка пластичности протеома плазмы крови, с целью выявления требований к биологическим биомаркерам, необходимые для медицинского освоения результатов протеомных исследований. Определены доверительные интервалы коэффициента вариации, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, а отражают физиологическую норму реакции организма. Установлено, что для отдельных белков масштаб этих колебаний сопоставим с изменением уровня белков плазмы, наблюдаемым 9 при патологии. Получена важная информация с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Двумерный гель-электрофорез в сочетании с пробоподготовкой с использованием пептидных микрогранул (ProteoMiner™) для удаления мажорных и концентрирования минорных белков является информативным и воспроизводимым методом анализа протеома плазмы крови здорового человека в

4 7 диапазоне концентраций от 10 до 10" М.

2. Пребывание человека в условиях длительной изоляции в гермообъекте не вызывает выраженных изменений в протеоме плазмы крови, что сопоставимо с индивидуальными изменениями во времени, наблюдаемыми в условиях обычной жизнедеятельности.

3. Экстремальные условия жизнедеятельности, моделирующие эффекты микрогравитации («сухая» иммерсия), вызывают в период реадаптации после перенесенного воздействия существенные изменения содержания белков плазмы крови здорового человека.

4. Адаптивное изменение уровня содержания белков крови, выявленных у здоровых добровольцев в экстремальных условиях жизнедеятельности, также наблюдается у пациентов как неспецифическая реакция организма в связи с развитием заболевания.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались в ходе следующих конференций:

1) 3rd Central and Eastern European Proteomics Conference, Budapest, Hungary October 6-9, 2009;

2) Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, Россия, 25-27 ноября 2009г.

3) French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular Impairment Induced by Environmental Conditions: Molecular, Cellular and Functional Approach», Angers,

France, March 10-14, 2010;

4) IX «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики, Москва, Россия, 14 Апреля 2010;

5) 31st Annual International Gravitation Physiology Meeting, Trieste, Italy, June 13-18, 2010;

6) I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, 17-19 ноября 2010;

7) Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в I рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, Россия, 6 декабря 2010;

8) 18th IAA Humans in Space Symposium, Houston, USA, April 11-15, 2011.

Диссертация апробирована 24 июня 2011 г. на секции «Космическая физиология и биология» учёного совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН, протокол № 3 от 24 июня 2011 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.

1. Oxana Trifonova, Irina Larina, Anatoly Grigoriev, Andrey Lisitsa, Sergei Moshkovskii, Alexander Archakov. Application of 2-DE for studying the variation of blood proteome. (Special report) Expert Rev Proteomics. 2010 Jun;7(3): 431-438;

2. Трифонова О.П., Пастушкова JT.X., Саменкова Н.Ф., Пятницкий М.А., Карузина И.И., Лисица A.B., Ларина И.М. Изменение белкового состава плазмы крови в

1 эксперименте с 7-суточной "сухой" иммерсией. Авиакосмическая и экологическая медицина, 2010. Т.44. No.5, с.24-28.

3. А.Л. Чернобровкин, О.П. Трифонова, H.A. Петушкова, Е.А. Пономаренко, A.B. Лисица. Выбор допустимой погрешности определения массы пептида при идентификации белков методом пептидного картирования. Биоорганическая химия, 2011. Т.37. №1, с.132-136.

4. Е.К. Байгарин, В.В. Бессонов, О.И. Передеряев, О.П. Трифонова, С.А. Мошковский, М.А. Карпова. Вариабельность протеома плазмы крови у здоровых людей. Вопросы питания, 2011. Т.80. №2, с. 20-25.

Работа выполнена в лаборатории протеомики ГНЦ РФ — ИМБП РАН и в лаборатории микросомального окисления ИБМХ РАМН в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», при поддержке программы ОБН РАН № 6006/3, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ-3402.2008.4 и РФФИ № 08-04-01533-а.

6. выводы

1. Получена протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека, содержащая 140 белковых пятен, из которых 70 белковых пятен воспроизводились более чем на 70% электрофореграмм и характеризовались коэффициентом технической вариации не превышавшим 25%.

2. Внутри- и межиндивидуальные различия в протеоме плазмы крови здоровых людей в условиях их обычной жизнедеятельности характеризуются коэффициентами вариабельности 22% и 50%, соответственно.

3. Выявлены белки, определяющие пластичную часть протеома плазмы крови. Внутрииндивидуальная вариабельность обусловлена различиями в уровне содержания аполипопротеинов A-I, Е и кластерина (аполипопротеин J), а межиндивидуальная -помимо тех же белков, также связана с различиями в уровне содержания аполипопротеина A-IV, витронектина, плазминогена, фибриногена а- и (3-цепи, факторов С1. и С4 комплемента и иммуноглобулина М.

4. Пребывание здорового человека в контролируемых условиях жизнедеятельности в гермообъекте не вызывает значительных изменений в протеоме плазмы крови.

5. В эксперименте с «сухой» иммерсией значимые изменения в протеоме плазмы крови здоровых добровольцев происходили в период реадаптации после завершения испытания. Наблюдаемые изменения были связаны с достоверным увеличением уровня содержания в крови аполипопротеинов A-I, Е и A-IV и с уменьшением уровня содержания а- и Р-цепей фибриногена, сывороточного амилоида Р и фрагментов фактора С4 комплемента.

6. Изменения уровня белков, характерные для естественного молекулярного ответа организма в процессе адаптации на изменение условий жизнедеятельности аналогичны изменениям, присущим неспецифическому компоненту патогенеза заболеваний.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенной работы с применением микрогранул ProteoMiner™ (BioRad) для удаления мажорных и концентрирования минорных белков, позволили с помощью метода двумерного электрофореза построить и охарактеризовать протеомную карту обедненной фракции плазмы крови здорового человека, содержащую 140 белковых пятен. На полученной протеомной карте хорошо детектировались белковые компоненты плазмы крови - a-, ß-, и у-цепи фибриногена, сывороточный альбумин, витронектин, протромбин и аполипопрогеины А-1, A-IV и Е, что согласуется со стандартной картиной 2-DE геля плазмы крови в базе данных SWISS-2DPAGE (http://www.expasy.ch/swiss-2dpage/viewer). Для анализа пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности было отобрано 70 белковых пятен с высоким уровнем воспроизводимости и коэффициентом технической погрешности менее 25%.

Было показано, что протеом плазмы крови здорового человека характеризуется достаточно высокой межиндивидуальной вариабельностью, в то время как внутрииндивидуальная вариабельность протеома здоровых добровольцев, изученная на протяжении 3-х недель в период обычной жизнедеятельности, лишь незначительно превышает техническую погрешность метода анализа. Коэффициент внутрииндивидуальной и групповой вариабельности протеома плазмы крови здорового человека составили 22±13% и 50±19%, соответственно, при аналитической погрешности метода 2-DE — 22%. Наибольшим коэффициентом внутрииндивидуальной вариабельности характеризовались белки семейства аполипопротеинов - аполипопротеины А-1, Е и кластерин (аполипопротеин J) (средний CV=30±17%). В свою очередь, высоким коэффициентом межиндивидуальной вариабельности помимо выше обозначенных аполипопротеинов A-I, Е и кластерина (аполипопротеин J) характеризовались белки системы липидного обмена - аполипопротеин A-IV, гемостаза - фибриноген и плазминоген, и факторы С4 и С1 системы комплемента, а также иммуноглобулин М. Максимальный показатель межиндивидуальной вариабельности характерен для аполипопротеина А-1 (CV=81%). При этом даже в случае незначительности усредненных показателей внутрииндивидуальной пластичности протеома плазмы крови в течение времени в нормальных условиях жизнедеятельности анализ межиндивидуальной вариабельности показал, что у отдельных индивидуумов эти изменения могут быть существенны и достигать 2-3 раз.

Помимо оценки нормальной вариабельности протеома плазмы крови здорового человека исследовали границы адаптивных изменений протеома плазмы крови здоровых

112 людей при экстремальных физиологических воздействиях. Для анализа использовали образцы плазмы крови здоровых добровольцев, участвующих в экспериментах, моделирующих отдельные условия космических полетов — воздействие «сухой» иммерсии и длительной изоляции в гермообъекте. Полученные данные свидетельствуют о существенных изменениях в протеоме плазмы крови здорового человека в период реадаптации организма к условиям обычной жизнедеятельности после 7-суточного воздействия «сухой» иммерсии. Выявленные изменения затрагивали белки, относящиеся к иммунной системе, системам метаболизма липидов и регуляции гемостаза. На 7-й день периода реадаптации наблюдалось достоверное увеличение уровня аполипопротеинов А-I, А-1У и Е по сравнению с фоном и 7-м днем пребывания в иммерсионной ванне. В то же время, происходило снижение уровня а-, Р-цепи фибриногена, фрагментов фактора С4 комплемента и сывороточного амилоида Р. В эксперименте со 105-суточной> изоляцией анализ образцов плазмы крови позволил выявить изменения уровня белков, участвующих в функционировании системы метаболизма и транспорта липидов - аполипопротеины А-1 и Е, системы регуляции гемостаза - а-, Р-цепи фибриногена и плазминоген, а также в формировании гуморального звена иммунного ответа организма — факторы С1, С4 комплемента и иммуноглобулин М. Выраженность изменений в протеоме плазмы крови в эксперименте с длительной изоляцией оказалась значительно меньше, чем при воздействии модельного эксперимента с «сухой» иммерсией, а наблюдаемые изменения белкового профиля носили ярко выраженный индивидуальный характер.

Заключительной частью данной работы было сравнение результатов модельных экспериментов с участием здоровых добровольцев с опубликованными данными о выявлении в крови биомаркеров методом двумерного электрофореза. Для этого проверили, наблюдали ли столь же выраженное изменение уровня белков, выявленных у здоровых добровольцев в модельных экспериментах с 7-суточной «сухой» иммерсией или 105-суточной изоляцией в гермообъекте, и соответственно отражающие нормальную (адаптационную) вариабельность протеома, при развитии каких-либо патологических процессов. Оказалось, что уровень некоторых выявленных в работе белков изменяется при таких заболеваниях, как острый дыхательный синдром, инфаркт миокарда, болезнь Альцгеймера, диабет, нефропатия, различные онкологические процессы. Следовательно, эти изменения являются по большей части не специфическими для патогенеза данных заболеваний. Наблюдаемые нами изменения уровня этих белков у здоровых добровольцев, были меньше или соизмеримы с таковыми, наблюдаемыми у пациентов с определенными патологическими состояниями. В ходе данной работы было выявлено, что наиболее существенные изменения в уровне содержания идентифицированных белков

113 плазмы крови происходят в период реадаптации организма после экстремального воздействия. Можно предположить, что молекулярные механизмы, включающиеся в период реадаптации, по составу участвующих белков в той или иной степени соответствуют тем защитным механизмам, которые включаются у человека в ответ на заболевание.

Полученные данные свидетельствуют, что изменения белкового профиля в концентрационном диапазоне до 10"7 М в большей степени имеют отношение к понятию физиологической (в том числе - адаптационной) нормы протеома плазмы крови, нежели к развитию патологического процесса. Изучение такого рода изменений может иметь практическое значение с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.