Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Анте- и интранатальные факторы прогноза эффективности сбора пуповинной крови для безвозмездного донорства

На правах рукописи

СПИРИДОНОВА Елена Игоревна

АНТЕ- И ИНТРАНАТАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА ЭФФЕКТИВНОСТИ СБОРА ПУПОВИН НОЙ КРОВИ ДЛЯ БЕЗВОЗМЕЗДНОГО ДОНОРСТВА

14 00 29 - гематология и переливание крови 14 00 01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаш кандидата медиш

х ГЬЬ70

Москва - 2007 г

003175570

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клиничеекии центр доской гематолог ии, онколо1ии и иммуночогии» Федерального а!енгства по здравоохранению и социальному разви гию Российском Федерации

Научные руководители

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

О А Майорова М А Курцер

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Л А Жерьбцов Т А Федорова

Ведущее учреждение Санкт-Петербургский Государственный Университет им И П Павлова

Защита яиссергации состоится 30 ноября 2007 г в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208 050 01 в Федеральном юсу дарствен ном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской 1ематочогии, онколшии и иммунологии» Росздрава

(117997 I СГ1-7, Ленинский проспект 117, корпус 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального г ос) дарственно! о учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии онкологии и иммунологии» Росздрава

Автореферат разослан «_»___________2007 года

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

В М Чернов

Актуальность темы

Пуповинная кровь (ПК) является уникальной средой отражающей колебания параметров в системе «мать-плод» Исстедования последних лет показали чго плацента пуповина и циркулирующая кровь плода содержат большое количество клеток-предшественников ростовых факторов и цитокинов, определяющих развитие плода в пренагальныи и ранний постнатальный период (Orkin S , 1997, Lo W 1999) Физиологические и патологические состояния течения беременности оказывают влияние на клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных (Arovnta 2004 Ьоякова Е В , 2006 Румянцев С А , 2007) Исследования значимости факторов обычно проводятся без учета притодности пуповинной крови дня хранения в банках пуповинной крови (БПК) предназначенных для обеспечения материала для неродственной трансплантации Вчияние различных факторов здоровья матери расовой и национальной принадлежности родителей течения антенатального периода, родов, характеристик состояния плода и новорожденного на количество собираемой пуповинной крови предназначенной для сохранения в банках н}повиннои крови и ее состав фрагментарно проанализировано в публикациях в зарубежной литературе (Shlebak А , 1998, Arovnta , 2004, Solves Р 2005) Гем не менее аналогичный подробный анализ для российской популяции не проводился, поскольку отсутствовали предпосылки для заготовки пуповинной крови с трансплантационными целями

Сбор образцов достаточного объема является одним из лимитирующих моментов работы государственных БПК чго делает чрезвычайно важным прогнозирование получения образцов пуповинной крови достаточной клеточности и объема на основании особенностей антенатальною и интранатального периода Применение счожпых методик отбора доноров и прогнозирования качества образцов пуповинной крови в рхчинной работе родовспомогательных учреждений неприменимо поскольку донотнительная натрузка на персонал приводит к снижению количества получаемых образцов (Broxmeyer Н , 2004)

Своевременное прогнозирование количества гемопо-зтических стволовых клеток и их пролиферативнои активности а так же учет факторов оказывающих влияние на состзв и биологические свойства клеток ПК является актуальной задачей при проведении сбора ПК Наличие несюжиого алгоритма работы позволяет максимально быстро обучить персонал работе по заютовке ПК, однако применение методик работ разработанных в других учреждениях без учет специфики ведения беременности, наблюдения за буд\щсй матерью и плодом особенностей организации родовспоможения в различных странах а

также учреждениях с отличающейся интенсивностью работы приводит к значительному сужению донорского контингента, сбору образцов ПК недостаточного объема и со сниженным содержанием клеток (Jones J , 2003 Sparrow RL, 2002, Askari S, 2005)

В связи с этим целью настоящего исследования является определение влияния состояния здоровья матери течения беременности и родов, состояний перинатального риска на эффективность сбора пуповинной крови доношенных новорожденных для алло1енных неродственных трансплантаций

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи

1 Определить акте- и интранатальные факторы, влияющие на объем собираемой пуповинной крови, взятой в обработку в БПК

2 Определить особенности течения беременности и родов, оказывающие влияние на клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных из образцов, допущенных к дальнейшему хранению

3 Изучить анте- и интранатальные факторы влияющие на содержание гемопоэтических к теток-предшественников в образцах пуповинной крови допущенных к дальнейшему хранению

4 И ¡учить возможность использования в качестве трансплантационного материала пуповинной крови, полученной при различных состояниях внутриутробной гипоксии

5 Разработать алгоритм подбора доноров для сбора пуповинной крови для крупных государственных банков пуповинной крови

Научная новизна

Подробно охарактеризован клеточный состав п> повинной крови доношенных новорожденных из образцов, принятых для обработки и хранения в государс1вснном ЬПК Показано изменение клеточного состава пуповинной крови в зависимости от течения и сроков беременности и родов состояния физического развития и пола новорожденного

Установлено что наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности не влияет на количество и состав лейкоцитарного пула

Увеличение длительности безводного периода и периода изгнания пчода, внутриутробной гипоксии, обвитии пуповины новорожденных, приводит к повышению содержания количества лейкоцитов в пуповинной крови

Количество CD34+ клеток имеет тенденцию к повышению при увеличении массы новорожденного, зависит от массы плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4-х родов по сравнению 1 - 3-ми роками Показано что

количество СЭ34+ клеток в ПК статистически значимо выше при острой гипоксии плода во время родов и статистически значимо ниже при хроиичсскои гипоксии плода в период беременности

Практическое значение

Получены значения, характеризующие состав леикоцигов ПК которые рекомендуется использовать в качестве факторов, определяющих показания и противопоказания к сбору ПК для безвозмездного донорства ГС К Кроме того полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток

Разработан комплекс практических рекомендаций по усовершенствованию технологических операций отбора доноров и сбора ПК для последующей трансплантации изменен перечень относительных противопоказаний к донации ПК

Научно-практическое значение имеет тот факт, что различные состояния острой и хронической гипоксии плода не требующие реанимационного пособия приводят к повышению количества лейкоцитов и гемопоэтичсских клеток-предшественников и не являются противопоказанием к отбору потенциальных доноров для неродственных трансплантаций

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКЦ детской гематологии онкологии и иммунологии Росздрава ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г Москвы» Центра планирования семьи и репродукции Департамента здравоохранения I Москвы

Результаты работы доложены X Съезде педиатров России Москва в феврале 2006 и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов, Москва в апреле 2006 Всероссийской конференции РНОИ, Курск в мае 2006 Российском конгрессе «Новые технологии в перинаюлогии» Москва в ноябре 2006

Апробация работы

Материалы работы доложены на совместной конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГОУ ВПО Р1 МУ Центра планирования семьи и репродукции Департамента здравоохранения г Москвы I УЗ «Ьанк стволовых клеток Департамента щравоохранения г Москвы» ф[ У «Федеральный научно-клиниче ский центр детской гематологии онкологии и иммунологии» Росздрава 10 апреля 2007 г

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клиническии центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор - член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук, профессор А Г Румянцев), на базе отдела молекулярной и экспериментальной гематологии онкологии и иммунологии (зав - д м н Румянцев С А ), отделения забора и доставки пуповинной крови, лаборатории контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г Москвы» (директор - д м н , профессор О А Майорова) родильного отделения Центра планирования семьи и репродукции Депратамента здравоохранения г Москвы (главный врач - д м н , профессор М А Курцер)

По теме диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ в отечественных изданиях и 3 - в зарубежных

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на _ страницах машинописною текста и состоит из

введения, обзора литературы, описания материатов и методов исследования трех гав собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя

литературы включающего _ отечественных и _ зарубежных источников Работа

иллюстрирована__таблицами и__рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика.

Материалом исследования служила пуповинная кровь 1013 доношенных новорожденных, родившихся на 37-41 неделе гестации (медиана составила 40 недель) в ЦПСиР ДЗ I Москвы (гл врач - дни, проф Курцер МА) и Родильном доме №10 Управления здравоохранения ЮЗАО г Москвы (гл врач - Оземковская Е П ) за период с 2004 по 2006 год, принятая к дальнейшей обработке и хранению в регистре ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г Москвы» (директор - д м н , проф Майорова О А )

Поскольку ряд показателей оценивались ретроспективно по данным медицинской документации, то не во всех случаях количество данных, включенных в расчет совпадает с количеством образцов пуповинной крови Сведения об общем объеме проведенных исследований представлены в табл 1

Таблица 1.

Объем проведенных исследований

Наименование показателей Количество

Общее количество образцов пуповишюй крови 1013

Сведения о течении беременности 722

Сведения о количестве предшествующих родов 1004

Способ родоразрешения 1004

Масса плаценты 990

Степень зрелости плаценты 722

Сведения о течении родов 722

Подсчет клеток крови 1013

Клиническая характеристика беременности

Особенности течения беременности проанализированы у 722 рожениц и представ тены в таблице 2 Из 722 обследованных рожениц полностью здоровы - 367

Таблица 2

Особен поста течения беременности

№№ Состояние Без патологии 1 почовпна беременности 2 поювина беременности 1 и 2 половина беременности

1 Анемия 681 10 28 3

2 Инфекционные заболевания 517 72 121 12

3 Угроза прерывания беременности 422 176 41 43

4 Патология почек у матери 675 47

5 Фетоплацентарная недостаточность 698 9 14 1

6 Внутриутробная гипоксия 634 88

7 Ожирение у матери 703 19

Кчипическая характеристика родов

Из 1004 новорожденных 585 родились в результате первых родов 340- вторых 63 -третьих и 16 - роды четвертые и более (12 человек - 4-е роды, 2 человека - 5-е и 2 человека - 6-е) Процент мальчиков и девочек среди групп, соС1авленны\ по порядковому номеру родов не отличался В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну Масса плаценты проанализирован в 990 спучаях Средняя масса

плаценты в группе составил - 580,57±4,92, диапазон 77,0 г - 1138,0 г Течение и осложнение родов прослежены у 391 новорожденного Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения (табл 3) Медиана длительности безводною промежутка составила 5 часов (от 20 минут до 19 часов 20 минут) Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 минут (от 10 минут до I часа 35 минут)

Медиана гестационного возраста составила 40 недель, диапазон - 33-42 неделъ В исследование вошли пациенты, родившиеся на 37-41 неделе гестации т к родившихся на других сроках было не достаточно для сравнения (на 33 неделе - 1 человек, на 34 неделе -1 человек, на 36 неделе - 1 человек и на 42 неделе - 2 человека) Медиана гестационного возраста у девочек составила 40 недель (диапазон - 33-42), у мальчиков - 40 недель (диапазон - 36-42)

Таблица 3.

Распределение мальчиков и девочек по полу и способу родоразрешения.

Кол-во пациентов Мальчики Девочки Всего

Кесарево сечение 26 17 43

Вагинальные ролы 498 463 961

Всего 524 480 1004

Клиническая характеристика состояния новорожденных.

Из 1004 образцов для которых доступны данные относительно пола ребенка мальчиков и девочек было 524 (52,2%) и 480 (47,8%) соответственно Средняя масса при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18 25 г диапазон 2270-5000 г), чем у девочек (3467,23±18,17 г, диапазон 2300-4650 г) (/><00001) Ш 391 новорожденных у 58 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (56 - зеленые воды и 2 - кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода, у 45 - во время беременности была диагностирована внутриутробная гипоксия плода, у 90 -отмечалось обвитие пуповины при рождении у 27 - отмечалось внутриутробная задержка развития плода Медиана гестационного возраста в группе без внутриутробной задержки развития составила 40 недель (диапазон - 33-42), а в группе с задержкой развития - 38 недель (диапазон - 37-41) Все 186 новорожденных, у которых имеются сведения о степени зрелости плаценты на момент родов, были разделены на три группы степень зрелости плаценты 1-10 человек, степень зрелости плаценты 2-72 человека и степень зрелости плаценты 3 - 104 человека

Методы исследования

Получение пуповинной крови

Пуповинную кровь получали при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (37—41 недель гестации (медиана - 40 недель)) с учетом информированного согласия матери и отсутствия стандартных противопоставим для донации крови После пережатия и пересечения пуповины, производили пункцию сосудов пуповины системой для сбора крови содержащей 35,5 мл антикоагулянга CPDA (Green Cross Юж Корея) Сбор крови осуществляли в течение 2-15 минут после родов (менее 5 минут - 847 случаев (84 4%) от 5 до 10 минут - 89 случаев (8 7%) и более 10 минут - 68 (6 9%)), до отделения плаценты (п=993 (98,5%)) В случае сбора крови посте отделения плаценты (n— 15 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора Г1К Полученный ма1ериал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анали5у не позднее 18 часов послс процедуры сбора ПК

Определение клеточного состава пуповинной крови

Подсчет клеток крови производился при помощи автоматического счешика клеток крови АВХ Pentra 60 С+ (Франция) и микроскопии окрашенных по методу Паппенгсйма-Крюкова мазков

Коррекция результатов автоматического анализа пуповиннои крови

Степень разведения образцов пуповинной крови антикоагулянтом была рапична и зависела от объема собранной крови Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35 5 мл объем собранной крови колебался в предечах от 20 0 до 170 0 мл Пересчет результатов автоматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца для каждого показателя

Определение количества субпопу чяций лейкоцитов и стволовых клеток

Количество субпопуляций лейкоцитов и гсмопоэтических стволовых клеток опредетяли по экспрессии мембранных маркеров (CD — clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклинальными ашшелами CD34 CD38 CD45 («Becton Dickinson» США) при помощи проточной цитометрии на приборе TACSCalibur («Becton Dickinson», США)

Определение колониеобразующей активности

Колониеобра)ующую активность лейкоцитарной фракции п> повинной крови опреде 1яли при помощи культивирования в течение 14 суток в ме1илцсллюло!с (ютовая

среда содержащая факторы роста «MethoCult 4338», (StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества KOE-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э

• Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1 х 10' эксплантированных клеток

• Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мп пуповинной крови, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови

Определение уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток ПК

Определяли уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов пуповинной крови Исследование проводили при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidium lodid (PI) и определение числа покусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexm V FITC ("Phar Mingen"), согласно инструкциям производителей

Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan ("Becton Dickinson" США) Обработку полученных данных производили при помощи программы WinMDI 2 8 for Windows Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток пуповинной крови определяли как сумму Р1+/Annexm V4 и РГ/Annexin V+ клеток, а уровень некроза, как количество Pl+/Annexin V клеток

Статистическая обработка

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса, для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни Для оценки равенства долей использовали Z-тест Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA lor Windows 8 0, Biostat for Windows

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Объем пуповинной крови является ключевым фактором, оказывающим влияние на решение о направлении образца для дальнейшей обработки и хранения при создании банка пуповинной крови для неродственных трансплантаций Поэтому прогнозирование получения хорошего объема пуповинной крови на основании общедоступных данных

анамнеза матери и характеристик течения родов и состояния плода потенциально способных оказать влияние на объем собираемой ПК

Всего был проанализирован «чистый вес» 1012 образцов пуповиннои крови (масса образца пуповинной крови за вычетом массы мешка для сбора пуповиннои крови и антикоагулянта) В результате оказалось что среднии вес собранной пуповиннои крови составил 85 84±0 84 г (табл 4)

1 аблица 4 Средний вес собранной пуповинной крови

Чистый вес образна

Количество 1012

Среднее значение 85 84

Медиана 81 86

Стандартное отклонение 26,81

Стандартная ошибка средне! о 0 84

Минимальное значение 18,79

Максимальное значение 285 46

Количество предшествующих родов

Есть сведения о 1003 новорожденных 585 образцов ПК потучено от детей родившихся от первых родов 339 образцов - вторые роды, 63 образца - третьи роды и 16 обращов - роды четвертые и более (12 человек - 4-е роды 2 человека - 5-е и 2 человека - 6-е) При сравнении полученных данных достоверных различий объема собранной пуповинной крови от количества предшествующих родов не найдено Однако отмечено недостоверное снижение веса получаемого образца в группе 4-х и более родов (таблица 5)

Способ родоразрешения

Все 1012 пациентов были разделены на группы согласно способу родора¡решения самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения При сравнении веса получасмог о образца в зависимости от способа родоразрешения достоверных различий не получено (таблица 6) Эти данные находятся в противоречии с некоторыми ¡арубежными авторами считающими, что больший объем ПК удается полунить при самостоятельных родах Однако на наш взшяд в данном случае играют роль факторы обученное™ персонала и созчание оптимальных условии для процедуры сбора в операционной

Таблица 5 Зависимость веса образца ПК от количества предшест вующих родов

Чистын вес образца

Первые роды Количество 585

Среднее значение 85 59

Медиана 81,83

Стандартное отклонение 24,18

Стандартная ошибка среднего 1 00

Минимальное значение 18 79

Максимальное значение 186 67

Вторые роды Количес гво 339

Среднее значение 8631

Медиана 8! 89

Стандартное отклонение 29 25

Стандартная ошибка среднего 1 59

Минимальное значение 23,28

Максимальное значение 251,13

Третьи роды Количество 63

Среднее значение 84,68

Медиана 84 40

Стандартное отклонение 23 53

Стандартная ошибка среднего 2 96

Минимальное значение 33 50

Максимальное значение 151,90

Четвертые роды Количество 16

Среднее значение 76,03

Медиана 76 38

Стандартное отклонение 28 92

Стандартная ошибка среднего 7 23

Минимальное значение 22,15

Максимальное значение 153,98

Р 0,48

Таблица 6 Зависимость веса образца ПК от способа родоразрешения

Чистый вес образца

Кесарево сечение Количество 43

Среднее значение 87,31

Медиана 85 15

Стандартное отклонение 30 27

Стандартная ошибка среднего 4 62

Минимальное значение 33,50

Максимальное значение 162 40

Самостоятельные роды Количество 969

Среднее значение 85 78

Медиана 81,83

Стандартное отклонение 26 66

Стандартная ошибка среднего 0 86

Минимальное значение 18 79

Максимальное значение 285 46

Р 0,715

Длите.¡ыюсть безводного промежутка

Данные о длительности безводного промежутка доступны в историях родов 414 женщин Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часов (диапазон - oi 20 минут до 19 часов 20 минут)

Роды бьпи раиелены на три группы с длительностью безводною промежутка менее 6 часов, 3-10 часов и более 10 часов При сравнении никаких достоверных различий между группами не получено Хотя в группе с длительностью безводною промежутка более 10 часов отмечается некоторое увеличение веса полученного образца (таблица 7) Корреляционной взаимосвязи между весом получаемою образца и длительностью безводного промежутка также не найдено (г-0,06, р=0 243)

Таблица 7 Зависимость веса образна Г1К от длительности безводного промежутка

Чистый вес образца

<6 часов Количество 245

Среднее значение 83,90

Медиана 75 32

СО Стандартное отклонение 25 58

M Стандартная ошибка средне! о 1 63

s о Минимальное значение 43 00

Максимальное значение 166 34

о. с 3-10 часов Количество 106

о U Среднее значение 82,90

э о Медиана 79 59

Стандартное отктонение 23 62

о ю л Стандартная ошибка среднего 2,29

Минимальное значение 41 38

У о Максимальное значение 158 08

3 >10 часов Количество 63

и н Среднее значение 89 40

е: Медиана 83 53

Стандартное отклонение 29 21

Стандартная ошибка среднего 3,68

Минимальное значение 30 11

Максимальное значение 177 76

Р 0 242

Длительность II периода родов

Данные о .гчительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) доступны у 413 ротильниц Медиана длительности этого периода составила 30 минут (диапазон - от 10 минут до 1 часа 35 минут)

Длительность II периода родов быта разделена на 3 группы менее 15 минут, 15-30 минут и более 30 минут

При анализе полученных данных обнаружена тенденция к увеличению веса полученного образца с увеличением длительности II периода родов (от 81,91±3 71 при длительности менее 15 минут до 92,01 ±4,52 при длительности более 30 минут) однако недостоверная (р=0,1) (рис 1)

95 92,5 90 87,5 85 82,5 80 77,5 75

Рис 1 Зависимость веса образца ПК от длительности безводно! о промежутка Количество околоплодных вод

В анализ вошли 437 родов В 370 случаях отмечалось нормальное количество околоплодных вод, в 27 случаях - мно! оводие, в 40 — маловодие

При проведении анализа получено достоверное увеличение веса собираемого образца при многоводии (до 97,27±7,36, р=0,05) Масса плаценты

Было проанализировано 989 сопроводительных документов, в которых доступны такие данные Средняя масса плаценты составил - 580 57±4,92, диапазон - 77,0 1 - 1138 0 г При анализе полученных данных отмечена слабая достоверная положительная корреляция между весом полученного образца и массой плаценты (гЧ>,2749, р<0 0001) Затем все новорожденные были разделены на 3 группы с массой плаценты менее 400 г. 400-700 г и более 700 г При сравнении этих групп получены следующие данные В группе с массой плаценты более 700 г отмечается достоверное увеличение массы получаемого образца, по сравнению с двумя другими группами (р<0,0001) (таблица 8)

<15 минут 15-30 минут >30 минут

-♦-Чистый вес образца

Таблица 8. Зависимость массы образца ПК от массы плаценты.

ЧиС 1'ЬЕЙ ьсс образна

<400 г Количество I2Í!

Среднее значение 82,27

Медиана 81.83

Стандартное отклонение 22 35

Стандартная ошибка среднего 2.04

Минимальное значение 23.28

Максимальное значение 144,56

_ 400-700 г Количество 650

V Среднее значений 81,70

IÍ и Медиана 78.67

3 Стандартное отклонение 22.72

я Стандартная ошибка среднего 0,8 У

Минимальное значаще 22.15

а Максимальное значение 186,67

>700 г Ксишчество 219

Среднее значение 99,63

Медиана 92.56

Стандартное от кло 11е ни с 31.47

Стандартная ошибка среднего 2.13

Минимальное значение 31.41

Максимальное значение 251.13

р <0.0001

М п ш1 почоромдтш ого

Данные о массс новорожденного при рождении доступны у 1000 па имен ion. Обнаружена слабая достоверная положительная корреляция с массой ребенка при рождении (г-0,28; р-<0.0001) (рис. 2).

Scahet- of: Spreaísneeí i 1 dv 11 Var3 i

55001 ■ ■ ■ ^-.......

2000 .........■...........—.....—---—-"-1——-'

0 Я0 4ft 50 80 ICO 1-20 140 1B0 '-BO POD 220

j f-D £7^5: P=0^w!q**~] Uar*

Рисунок 2. Зависимость песа образца ПК от массы тела новорожденного.

Далее все случаи были разбиты на группы согласно массе тела новорожденного при рождении <2500 г, 2500-3000 г, 3000-4000 г и >4000 г При сравнении полученных данных отмечено, что с увеличением массы ребенка при рождении увеличивается и вес собираемого образца - от 64,41±4 19 в группе с массой до 2500 г до 99,77±2 66 в группе с массой >4000 г (р<0 0001) (рис 3)

120 100 80 60 40 20

<2500 г 2500-3000 г 3000-4000 г >4000 г

♦ --Чистый вес образца

Рисунок 3 Зависимость среднего веса образца ПК от массы теча новорожденного Сбор пуповинной крови до отделения плаценты или после

Такие данные доступны у 1007 пациентов При проведении анализа бьпо выявлено чго при проведении сбора пуповинной крови до отделения плаценты, всь полученною образца достоверно выше (р=0,025) (таблица 9)

Далеко не всегда объем пуповинной крови является основным фактором при окончательном принятии решения о сохранении образца ПК и проведении НЬА-типирования Достаточно часто в большом образце ПК окашвается недостаточное количество клеток для обеспечения потребностей трансплантационного центра С другой стороны, образец пограничного объема (60-64 мл) может содержать очень большое количество ядросодержащич клеток, в том числе предшественников юмопола что делает ею ценным для сохранения Поэтому определение факторов оказывающих влияние на количественный и качественный состав клеток ПК еще до начала сбора является крайне важным Именно с этой целью было проведено исследование влияния факторов течения беременности и состояния новорожденного

Таблица 9 Зависимость веса образца ПК от сбора крови до или после отделения

плаценты

Чистый вес образца

сбор крови до отделения плаценты Количество 992

Среднее значение 86 09

Медиана 82,12

Стандартное отклонение 26 82

Стандартная ошибка среднего 0 85

Минимальное значение 18 79

Максимальное значение 285 46

сбор крови после отделения плаценты Количество 15

Среднее значение 72 79

Медиана 72 33

Стандартное отклонение 22 51

Стандартная ошибка среднего 581

Минимальное значение 23 28

Максимальное значение 11721

Р 0 025

Количество предшествующих родов

В зависимости от котичества предшествующих родов проанализированы 1004 образца пуповшшой крови, из них 585 образцов - первые роды, 340 - вторые 63 - зрезьи и 16 образцов - четвертые и более (12 - 4-е роды, 2 - 5-е и 2 - 6-е)

При сравнении параметров пуповинной крови между 1руппами бычи получены следующие данные при увеличении количества родов в анамнезе уменьшается количество лейкоцитов в пуповинной крови (18 14+0,22 х10%- первые роды 16 22:10 25 х109/л — 2-е, 15 44±0 61 х10ч/л-3-ии 15,1±1,37 х10ч/л - 4-е и бочее, р<0 0001) (габл 4 7) Также уменьшается абсолютное количество нейтрофилов (с 8,91±0 13 \10ч/л при первых ролах до 6 86±0 65 х10% при 4-х, /><0 0001) абсонотное количество тимфоцитов (с 5 8±0,09 х10ч/т при первых родах до 5 17±0,58 х!0% при 4-х /;<0 0001) абсолютное кочичество моноцитов (с 2,54±0,04 х109/л при первых родах до 2 1±0 09 х10''/л при 3-х р<0 0001) и абсолютное количество базофилов (с 0,24±0 01 х10ч/л при первых родах до 0 16.t0.01 х 10Ч/л при 3-х,/7=0,017)

Параметры красной крови и тромбоцитов в зависимости от количества родов в анамнезе не изменялись

Согласно способу родоразрешения все 1013 новорожденных были разделены на группы самостоятетьные роды и оперативные роды путем кесарева сечения

При сравнении показателей путювшшой крови обнаружены следующие отличия: при оперативных родах путем кесарева сечения выявлено меньшее количество лейкоцитов (14.29-^0.57 *Ю9/л против 17.38±0,!7 х10%; р<0.0001 ), за счет меньшего количества нейтрофидов (¿><0.[КЮ1), лимфоцитов (/>=0.02). моноцитов (/7=0,003) и зозипофюов (/>=0.002).

Также при оперативных родах отмечается меньшее количество эритроцитов (43-1:0,05 хШ|2/л против 4,4-НШ х10!г/л; /)=0,04) и тромбоцитов (2К4.88±<Ш хЮ^/л против 308.59=2,01 дЮ'/л; /?-"0,015). МРУ при этом имеет достоверно большее значение

Данные о длительности безводного промежутка доступны в 368 случаях родов. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часок (диапазон - от 20 минут до 19 часов 20 минут).

По длительности безводного промежутка новорожденные были разделены на фи группы; менее Ь часов; 3-10 часов и более 10 часов. При сравнении параметров пуповиниой крови между группами было обнаружено увеличение абсолюмшго количества лимфоцитов с увеличением времени (5.3:1 ±0,12 х10'7л при дли телыюсти менее б часов, 61-0.35 *1й'/д - т.ри длительности более 6 часов; /з-0.05). Также имеется ТсчдеШйй к увеличению количества лейкоцитов (/)~0,089) и нейтрофнлов (у>=0.3) при увеличений дл и тел ь пост и безводного промежутка

Обнаружена слабая достоверная положительная корреляционная взаимосвязь между абсолютным количеством лимфоцитов в нуповинной крови и длительностью безводного промежутка (в минутах) (р=0Л658; /7=0,0014) (рис. 4).

Уиг? =

^[>1-.-^.............- .....■-■ ..........

10

_£_¡йО у 00 1 ГНС .20а иСГг

|г=0 р= 0,0014 | Дцитэпьность безпсдцоно (мин)

Рису4. Зависимость абсолютного количества лоЧкоциго в ;!\[КЧ'.ЧН Н'И крови юг длительности безводного периода.

1-е

Если рассматривать пуповипную кровь как пример стресс-мобилизованной крови (в качестве стрессового фактора принимать протекание процесса родов), то различия между физиологическими и оперативными родами становятся легко объяснимыми Различия показателей у мальчиков и девочек также можно объяснить неодинаковым 1енетически детерминированным ответом на воздействие стрессовых факторов, в том числе и при рождении

Влияние различных состояний острой и хронической гипоксии плода на особенности клеточного состава пуповинной крови доношенных новорожденных

Гипоксия является мощным стрессовым фактором, и, предположительно должна приводить не только к повышению количества эритроцитов с компенсаторной целью, но и к повышению количества других клеток крови, как следствие цитокиновой мобилизации в ответ стресс

Из 722 проанализированных новорожденных у 96 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (93 - зеленые воды и 3 - кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода При сравнении параметров пуповиннои крови выявлено, что при изменении цвета околоплодных вод отмечается тенденция к увеличению количества лейкоцитов (16,81±0,24 х109/л - без патологии, 18,19±0,62 х 104/ ( — изменение цвета вод, />=0,06) за счет достоверного увеличения абсолютного количества лимфоцитов (5,37±0 09 х109/л - без патопогии, 6,03±0,32 х10ч/п - изменение цвета вод, /7=0 022) и базофилов (0,18±0.007 х109/л - без патологии, 0 31±0 02 х10ч/л - изменение цвета вод, /><0,0001) Количество эозинофилов, наоборот имеет тенденцию к уменьшению (0,67±0 02 хЮ'/л - без патологии, 0,53±0 04 хЮ9/л - изменение цвета вод /7=0,009) Со стороны парамефов красной крови отмечается достоверное увеличение гематокрита при изменении цвета околоплодных вод (/>^0,031) и уменьшение RDW (/>=0,04) Отмечается также тенденция к увеличению концентрации гемоглобина (/>=0,061) Различий в процентном и абсолютном содержании С034+клеток в ПК не получено Выявлено что при изменении цвета околоплодных вод уменьшается количество КОЬ-mix на 10' MNC (48,46±2,98 - нормальные воды, 33,46±7 - зеленые воды, р=0 044) КОН-'.) (17 62±1 84 -нормальные воды 9 88±2,63 - зеленые воды, р=0,074) и общего количества колонии (123 53±5 74 - нормальные воды, 95,18±14,91 - зеленые воды р=0,052) Из 722 новорожденных у 116 отмечалось обвитие пуповины при рождении При анализе показателей пуповинной крови выявлено, что при обвитии пуповины наблюдается достоверное увеличение количества лейкоцитов (16 57±0 23 хЮ'/л - без обвития 18 83±0,42 х109/л - обвитие пуповины, /><0 0001) за счет увеличения абсолютного

количества нейтрофилов (8 17±0,13 х109/л - без обвития 9,2!±0 26 \10ч/л - обвитие пуповины, /5=0,003) лимфоцитов (5,16±0.09 х10''/л - без обвитя 6,13±0 21 х109/л -обвитне пуповины р <0 000!) и моноцитов (2,24±0,04 х109/л - без обвития 2 73±0 1 х 10ч/л - обвитие пуповины, /7=0,001)

Из 722 новорожденных с известным анамнезом у 88 отмечалась хроническая внутриутробная гипоксия При сравнении параметров пуповинной крови обнаружены следующие различия у детей с внутриутробной гипоксиеи огмечаегся достоверное увеличение количества лейкоцитов (16,72±0 26 х109/л - без гипоксии 18,84±0 92 х109/л -с гипоксией /7=0 008), за счет увеличения абсолютного количества нейтрофилов (8,19±0,16 хЮ'/л - без гипоксии, 9.4±0,44 х109/л - с гипоксией, /7=001) лимфоцитов (5,35±0,1 х 10 /л - без гипоксии, 6,05±0,4 х 109/л - с гипоксией /7=0 026) и баюфилов (0 19±0 01 х 10% - без гипоксии 0 3±0,05 х 109/л - с 1 ипоксией, р<0 0001)

Показано что в группе с внутриутробной гипоксией плода в 1 мл ПК отмечается статистически значимое увеличение количества КОЕ-ГМ (946,87±79 - без гипоксии 1974 36±886 - при наличии гипоксии, р=0 01), КОЬ-М (549 04±60 - бе! гипоксии 1313 41±651 8 - при наличии гипоксии, р=0,01), увеличение КОЕ-гшх (р=0 4) и КОЕ-Г (р=0,1) Также при гипоксии плода отмечается достоверное увеличение общею количества колоний в 1 мл ГТК (4675,46±277 - без гипоксии, 7260 48±2343 - при наличии гипоксии, р=0,025)

Данные о длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) доступны у 368 рожениц Медиана длитетыгости этого периода составила 30 минут (диапазон - от 10 минут до 1 часа 15 минут) Роженицы бычи разделены на группы по длительности II периода родов менее 15 минут, 15-30 минут и более 30 минут При сравнении параметров пуповинной крови между группами были получены следующие результаты при увеличении длительности этою периода увеличивалось количество лейкоцитов в периферической крови (15,23±0,72 хЮ'/л при 1<15 минуг 18 29±0,6 \10 /л при 1>30 минут, /7=0 014), в основном за счет абсолютного количества лимфоцитов (4,7±0,24 х 109/л при К15 минут, 6,24±0,3 х10ч/л при 1>30 минуг, /7<0 0001) Отмечалась также тенденция к увеличению абсолютного количества нейтрофилов (7 61-ь043 \109/ч при 1<15 минуг 8 56±0 34 х10ч/л при С>30 минут /7=0,318) и моноцитов (2,06±0,11 х10"/л при К15 минут 2 52±0 09 х109/л при г>30 минут, /7=0,065)

Имеется тенденция к снижению процентного содержания С 1)3 4' клеток при длительности II периода родов более 30 минут (рис 5)

<1 5 минут

15-30 минут

>30 минут

Рисунок 5 Количество С034 клеток в зависимости от дчительности периода изгнания (р - дисперсионный анализ)

Таким образом выявленные изменения свидетельствуют, что гипоксические состояния, не требующие реанимационного пособия для новорожденною не только не являются противопоказанием к сбору ПК, но и создают условия для повышенной мобилизации ГСК что делает такую ПК особенно ценой для дальнейшего процессиша

Проведенные собственные исследования и выявленные закономерности влияния анте- и интранатальных факторов на объем, качественный и количественный состав клеток собираемой пуповинной крови позволили в значительной степени оптимизировать подход к сбору пуповинной крови в условиях родовспом01ательных учреждении г Москвы Так, ранее относимые к противопоказаниям к сбору ПК состояния матери (негсмотрансмиссивные инфекции, ряд состояний соматической патологии) и плода (гипоксия) не являются таковыми, поскольку не оказывают не1агивною влияния на объем и ктсточный состав ПК

Нами предложен ачгоритм подхода к сбору пуповинной крови, позволяющий наиболее подробно прогнозировать и осуществлять сбор попноценных образцов ПК что снижает как процент отбраковки поступающих в банк стволовых клеток образцов так и финансовые затраты на сбор единицы ПК

I этап Знакомство с медицинской документацией беременной женщины для выявления абсолютных противопоказаний (гемотранмиссивные инфекции тяжелые пороки развития плода) и условий, менее благоприятных для донации ПК (задержка внутриутробного развития плода, 4 и более беременность, мноюп полная беременность срок гестации свыше 40 недели)

II этап. Проведение беседы с беременной женщиной с целью получения информированного согласия на донацию ПК

III этап. В случае согласия на донацию - более подробный сбор анамнеза о состоянии здоровья матери и наследственных заболеваниях в семье (выявление гематологических и иммунологических заболеваний нанесение татуировок и пирсинга и i д )

IV этап Роды путем кесарева сечения и гипоксия плода не требующая реанимационного пособия новорожденному, не явчяются противопоказаниями к сбору пуповинной крови

V этап Сбор пуповинной крови необходимо проводить не позднее чем через 10 минут после пережатия и пересечения пуповины

Соблюдение указанных принципов позволяет обеспечить сбор наиболее полноценных

образцов ПК пригодных для трансплантации не только детям но также подросткам и

взрослым

ВЫВОДЫ

1 Установлено что на состав и объем собираемой пуповинной крови не оказывают вчияние анемия матери во время беременности видимо вследствие адекватной терапии препаратами железа, угроза прерывания беременности количество околоплодных вод, внутриутробная задержка развития плода и фетоплацентарная недостаточность

2 Объем собираемой пуповинной крови в среднем составляет 85 5±0 84 мл увеличивается с увеличением массы тела новорожденного при рождении и максимален при сборе пуповинной крови до отделения плаценты

3 Наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности приводит к снижению концентрации гемоглобина (р=0 02) и гематокрита (р<0 0001)

4 Повышение количества лейкоцитов отмечается при увеличении длительности безводного периода, увеличении длительности периода изгнания плода, обвитии пуповины с увеличением массы тела ребенка при рождении

5 Внутриутробная гипоксия приводит к увеличению количества нормобластов -11 94 ±311 100 лейкоцитов против 5,42 ± 0 53 100 лейкоцитов (р<0 0001) Увечичения количества нормобластов при острой гипоксии в родах не выявлено б 21 ± 0,66 100 лейкоцитов против 5 32 ± 1,25 100 лейкоцитов (р=0,55)

6 При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше чем у девочек как в процентном соотношении (0,88±0 03 - мальчики.

О 77±0,03 - тевочки р=0,01) так и в абсолютом количестве (0 106±0,005 -мальчики, 0,095±0,005 - девочки, р=0,002) Количество С1}34+клегок имеет тенденцию к увеличению при повышении массы тела новорожденного зависит от веса плаценты статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4 родов но сравнению 1 - 3 родами Статистически значимо выше при острой гипоксии птода и ниже при хронической гипоксии плода

ПРЛКТИЧГСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Полученные данные о влиянии особенностей течения беременности и родов на количество С034+ клеток пуповиннои крови рекомендуется использовать при определении показаний и противопоказаний к сбору клеток пуповиннои крови для безвозмездного донорства

2 Процедуру сбора пуповшшой крови рекомендуется проводить не позднее 10 минут после пересечения пуповины

3 Процедуру сбора пуповинной крови рекомендуется проводить до отделения плаценты

4 Разработанный алгоритм необходимо использовать при получении образцов пуповинной крови для неродственных аллогенных трансплантации в крупных родовспомогательных учреждениях

СПИСОК РАЬОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМР ДИССЕРТАЦИИ

1 Майорова О А, Яковлева МВ, Румянцев С А, Подколзина ЭА Сухин ГМ Спиридонова ЕИ, Лебедева Л Л Организационные принципы создания и функционирования банков пуповинной крови (но стандартам Ь'е1Согс1 и РАНСТ) Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаюлогии в педиатрии 2005, т 4, №2, стр 7-12

2 Румянцев С А , Плясунова С А Боякова Ь В , Шутьева А Б Спиридонова Е И , Абдуллаев Р Т , Подколзина Э А , Карпова Е Э Румянцева Ю В , Яковлева М В Майорова О А Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от осложнений беременности и родов. Российский иммунологический журнал, 2006 т 9, 5ирр1 3 стр 116,

3 Румянцев С А Плясунова С А , Боякова Б В Шутьева А Б , Спиридонова Ь И Абдуллаев Р Т, Подколзина Э А , Карпова Е Э , Румянцева Ю В , Яковлева М В Майорова О А Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от гипоксии во время беременности и родов, Российский иммунологический журнал 2006, т 9 , Ьирр1 3, стр 115,

4 Подколзина Э А , Румянцев С А , Плясунова С А , Боякова Е В , Шутьева А Б , Спиридонова Е И , Абдутлаев Р Т , Карпова Е Э , Румянцева Ю В Яковлева М В Майорова О А Факторы, влияющие на эффективность выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови, Российский иммунологический журнал, 2006, г 9 . Бирр! 3, стр 137,

5 Подколзина Э А , Румянцев С А , Плясунова С А Боякова Ь В , Шутьева А Ь , Спиридонова Е И Абдуллаев Р Т , Карпова Е Э Румянцева Ю В , Яковлева М В Майорова О А Сравнение эффективности процедуры выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови ручным и аппаратным методом Российский иммунологический журнал, 2006, т 9 , Suppl 3, стр 136,

6 Румянцев С А, Плясунова С А Боякова ЕВ, Шугьева А Б Подколзина ЭА Карпова Е Э , Румянцева Ю В Спиридонова Е И , Майорова О А Клеточный состав пуповинной крови у доношенных новорожденных Вопросы гемаюлогии/онкотогии и иммунопатологии в педиатрии, 2006 т 5 №4, с 23-29

7 PodkolzinaEA Karpova Е Е , Spiridonova Е I, Boyakova Е V ShulyevaAB Yakovleva М V , Mayorova О A Roumiantsev S A Effect of pregnancy and intranatal factors on stem cell count m cord blood leukokoncentrat unit Stem cell therapy meeting Regensburg. Germany, 2007 p 96

8 Podkolzina E A , Karpova E E , Spiridonova E I, Boyakova Ь V Shutyeva А В , Yakovleva M V , Mayorova О A Roumiantsev S A Comparison of cord blood volume reduction methods efficacy Stem cell therapy meeting Regensburg Germany, 2007 p 102

9 Румянцев С А Боякова E В Шутьева А Б , Плясунова С А Сабирова С Э , Спиридонова Е И Подколзина Э А , Карпова Е О , Румянцева Ю В Майорова О А Гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови доношенных новорожденных Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2007 т 6 №1, с 1418

10 PodkolzinaEA Karpova Е Е , Spiridonova Е I Mayorova О A Roumiantsev SA Cord blood unit volume Ante- intranatal and technological factors The Hematology lournal 2007, vol 7 suppl 2, p 226

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CD - (clasters of differentiations) кластер дифференцировки

ЬПК - банк пуповинной крови

ГСК - гемопоэтические ствотовые клетки

KOE-mix - колониеобразующая единица смешанная

КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-М - колониеобразующая единица макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроцитарная

ПК - пуповинная кровь

ЭК - эффективность клонирования

Подписано в печать 24 10 2007 г Исполнено 25 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 931 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Актуальность темы

Развитие и внедрение трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (ПК) диктует необходимость досконального изучения ее свойств и характеристик [35, 47, 58]. Пуповинная кровь является уникальной средой, отражающей колебания параметров в системе «мать-плод». Исследования последних лет показали, что плацента, пуповина и циркулирующая кровь плода содержат большое количество клеток-предшественников, ростовых факторов и цитокинов, определяющих развитие плода в пренатальный и ранний постнатальный период [22, 23]. Физиологические и патологические состояния течения беременности оказывают влияние на клеточный состав пуповинной- крови доношенных новорожденных [2, 7, 12]. Исследования значимости факторов обычно проводятся без учета пригодности пуповинной крови-для хранения в банках пуповинной крови (ВПК), предназначенных для обеспечения материала для неродственной трансплантации. [3, 5, 6] Влияние различных факторов здоровья матери, расовой и национальной принадлежности родителей, течения антенатального * периода, родов, характеристик состояния плода и новорожденного на количество собираемой-пуповинной. крови, предназначенной для сохранения! в банках пуповинной крови, и ее состав ^ фрагментарно проанализировано в публикациях в зарубежной литературе [14, 57, 74]. Тем не менее, аналогичный подробный анализ для российской популяции не проводился, поскольку отсутствовали предпосылки' для-заготовки пуповинной крови с трансплантационными целями.

Сбор образцов достаточного объема является одним из лимитирующих моментов работы государственных БПК, что делает чрезвычайно важным прогнозирование получения образцов пуповинной крови достаточной клеточности и объема на основании особенностей'антенатального и интранатального периода. Применение сложных методик отбора доноров и прогнозирования качества образцов пуповинной крови в рутинной работе родовспомогательных учреждений неприменимо, поскольку дополнительная, нагрузка на персонал приводит к снижению количества получаемых образцов [59, 78, 90,93].

Своевременное прогнозирование количества гемопоэтических стволовых клеток и их пролиферативной активности, а так же учет факторов оказывающих влияние на состав и биологические свойства клеток ПК является актуальной задачей при проведении сбора ПК [13, 24]. Наличие несложного алгоритма работы позволяет максимально быстро обучить персонал работе по заготовке ПК, однако применение методик работ, разработанных в других учреждениях без учета специфики ведения беременности, наблюдения за будущей матерью и плодом, особенностей организации родовспоможения в различных странах, а также учреждениях с отличающейся интенсивностью работы, приводит к значительному сужению донорского контингента, сбору образцов ПК недостаточного объема и со сниженным содержанием клеток [42, 80, 98].

В связи с этим целью настоящего исследования является определение влияния состояния здоровья матери, течения беременности и родов, состояний перинатального риска на эффективность сбора пуповинной крови доношенных новорожденных для аллогенных неродственных трансплантаций.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Определить анте- и интранатальные факторы, влияющие на объем собираемой пуповинной крови, взятой в обработку в БПК.

2. Определить особенности течения беременности и родов, оказывающие влияние на клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных из образцов, допущенных к дальнейшему хранению.

3. Изучить анте- и интранатальные факторы, влияющие на содержание гемопоэтических клеток-предшественников в образцах пуповинной крови, допущенных к дальнейшему хранению.

4. Изучить возможность использования в качестве трансплантационного материала пуповинной крови, полученной при различных состояниях внутриутробной гипоксии.

5. Разработать алгоритм подбора доноров для сбора пуповинной крови для крупных государственных банков пуповинной крови.

Научная новизна

Подробно охарактеризован клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных из образцов, принятых для обработки и хранения в государственном БПК. Показано изменение клеточного состава пуповинной крови в зависимости от течения и сроков беременности и родов, состояния, физического развития и пола новорожденного.

Установлено, что наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности не влияет на количество и состав лейкоцитарного пула.

Увеличение длительности безводного периода и периода изгнания плода, внутриутробной гипоксии, обвитии пуповины новорожденных, приводит к повышению содержания количества лейкоцитов в пуповинной крови.

Количество С034+ клеток имеет тенденцию к повышению при увеличении массы новорожденного, зависит от массы плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4-х родов по сравнению 1 - 3-ми родами. Показано, что количество С034+ клеток в ПК статистически значимо выше при острой гипоксии плода во время родов и статистически значимо ниже при хронической гипоксии плода в период беременности.

Практическое значение

Получены значения, характеризующие состав лейкоцитов ПК, которые рекомендуется использовать в качестве факторов, определяющих показания и противопоказания к сбору ПК для безвозмездного донорства ГСК. Кроме того, полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток.

Разработан комплекс практических рекомендаций по усовершенствованию технологических операций отбора доноров и сбора ПК для последующей трансплантации, изменен перечень относительных противопоказаний к донации ПК.

Научно-практическое значение имеет тот факт, что различные состояния острой и хронической гипоксии плода, не требующие реанимационного пособия, приводят к повышению количества лейкоцитов и гемопоэтических клеток-предшественников и не являются противопоказанием к отбору потенциальных доноров для неродственных трансплантаций.

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев), на базе отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии (зав. - д.м.н. Румянцев С.А.), лаборатории контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» (директор - д.м.н., профессор О.А.Майорова).

выводы

1. Установлено, что на состав и объем собираемой пуповинной крови не оказывают влияние: анемия матери во время беременности, видимо, вследствие адекватной терапии препаратами железа; угроза прерывания беременности; количество околоплодных вод; внутриутробная задержка развития плода и фетоплацентарная недостаточность.

2. Объем собираемой пуповинной крови в среднем составляет 85,5±0,84 мл, увеличивается с увеличением массы тела новорожденного при рождении и максимален при сборе пуповинной крови до отделения плаценты.

3. Наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности приводит к снижению концентрации гемоглобина (р=0.02) и гематокрита (р<0,0001).

4. Повышение количества лейкоцитов отмечается при увеличении длительности безводного периода; увеличении длительности периода изгнания плода; обвитии пуповины; с увеличением массы тела ребенка при рождении.

5. Внутриутробная гипоксия приводит к увеличению количества нормобластов -11,94 ±3,11 : 100 лейкоцитов против 5,42 ± 0,53 : 100 лейкоцитов (р<0,0001). Увеличения количества нормобластов при острой гипоксии в родах не выявлено 6,21 ± 0,66 : 100 лейкоцитов против 5,32 ± 1,25 : 100 лейкоцитов (р~0,55).

6. При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков СБ34+ клеток больше, чем у девочек как в процентном соотношении (0,88±0,03 - мальчики; 0,77±0,03 - девочки; р=0,01), так и в абсолютном количестве (0,106±0,005 -мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002). Количество С034+клеток имеет тенденцию к увеличению при повышении массы тела новорожденного, зависит от веса плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4 родов по сравнению 1 — 3 родами. Статистически значимо выше при острой гипоксии плода и ниже при хронической гипоксии плода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные о влиянии особенностей течения беременности и родов на количество СЭ34+ клеток пуповинной крови рекомендуется использовать при определении показаний и противопоказаний к сбору клеток пуповинной крови для безвозмездного донорства.

2. Процедуру сбора пуповинной крови рекомендуется проводить не позднее 10 минут после пересечения пуповины.

3. Процедуру сбора пуповинной крови рекомендуется проводить до отделения плаценты.

4. Разработанный алгоритм необходимо использовать при получении образцов пуповинной крови для неродственных аллогенных трансплантаций в крупных родовспомогательных учреждениях. 4