Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Прогностическое значение ZAP-70, интерлейкина-8 и состояние иммунологической реактивности у больных хроническим лимфолейкозом

На правах пукописи □□3454526 #

у /

УДК: 616.155.392.2-036.12:567.96-612Г112.94.015.2.017.1-07

ШЕРСТНЕВА Елена Сергеевна

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ 2АР-70, ИНТЕРЛЕИКИНА-8 И СОСТОЯНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ

14.00.29 гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2008 0 5 дек ¿..^

003454526

Работа выполнена в ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии переливания крови Росмедтехнологий»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Шардаков Виктор Иванович

кандидат медицинских наук, доцент Загоскина Тамара Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бессмельцев Станислав Семенович

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталья Михайловна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования»

заседании диссертационного совета Д 208.074.01 Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Т.В. ГЛАЗАНОВА

Защита состоится «

»

2008г. в

часов на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хронический лимфолейкоз (XJ1JI) является наиболее распространенным видом лейкоза среди всех гемобластозов [Волкова М.А., 2001]. Заболевание крайне гетерогенно по своему течению, характеризуется различными темпами прогрессирования, а также различной выживаемостью больных. У ряда пациентов болезнь неуклонно прогрессирует, и, несмотря на лечение, продолжительность жизни составляет всего 2-3 года. В то же время примерно у 15-20% больных клинические и гематологические признаки заболевания на протяжении многих лет остаются стабильными и минимально выраженными [Никитин Е.А., 2006]. Для определения прогноза течения заболевания в настоящее время предложены различные критерии, но ни один из них не является абсолютным. Недостаточно надежны и неоднозначны такие традиционные факторы прогноза как стадия заболевания на момент установления диагноза, время удвоения количества лимфоцитов, характер поражения костного мозга, уровень бета-2-микроглобулина, иммунофенотипические особенности опухолевых клеток.

В настоящее время имеется возможность проведения эффективной терапии в оптимальные сроки, поэтому актуальным является разработка информативных стратификационных параметров для прогнозирования течения XJ1JI. Изучая клиническое течение XJ1JI, Е.А. Никитин отметил, что на смену традиционной тактике приходит адаптированная к риску терапия, при этом в дебюте болезни должны определяться факторы прогноза XJIJI [2001]. На практике адаптированную к риску терапию XJIJI можно применять, используя генетические или статичные факторы прогноза. Классические или динамичные маркеры прогноза, такие как тип инфильтрации костного мозга, уровень лейкоцитов, уровень растворимого CD23 и другие, коррелируют с массой опухоли и меняются со временем. Напротив, независимые факторы прогноза, такие как мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов, не меняются со временем и уже в дебюте позволяют предсказать неблагоприятное течение XJIJI Hamblin Т.J., 2004, Пунанов Ю.А., 2005]. Особенно важно то, что мутационный статус позволяет выделять подгруппы больных с разным прогнозом в пределах ранних стадий [Stilgenbauer S., 2002, Rassenti L.Z., 2004]. Вместе с тем, исследование мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов является технологически сложным, долговременным, дорогостоящим и недоступным практическому здравоохранению. В настоящее время выделен белок ZAP-70, который коррелирует с мутациями гена IgVH и, следовательно, может явиться удачной лабораторной заменой определения мутационного статуса.

Рядом работ последних лет показано, что многообразные клинические проявления XJIJI связаны с нарушениями цитокинового статуса [Till K.J., 1999, Бережная Н.М., 2000]. Выявлено, что при любом опухолевом росте имеются нарушения в системе интерлейкинов, которые проявляются дисбалансом продукции этих биологически активных веществ, а также

изменением экспрессии соответствующих рецепторов [Демьянова A.B., 2003, Симбирцев A.C., 2004]. Известно, что цитокины продуцируются различными клетками организма и являются факторами взаимодействия между клетками всех его органов и систем [Tobler А., 1993, Airoldi I, 2004]. Во многих случаях они проявляют себя как факторы аутокринной регуляции.

В результате проведенных исследований выявлено, что повышенная секреция цитокинов при XJIJI приводит к их системному воздействию на организм, в результате чего формируются значимые субпопуляционные изменения со стороны клеток иммунной системы [Антонов В.Г., 2004]. JI.A. Грачева обнаружила, что в процессе возникновения и развития опухоли происходит, прежде всего, нарушение баланса между секрецией проопухолевых, противоопухолевых и регуляторных цитокинов [1996]. Секреция определенных цитокинов может обеспечивать преимущества роста для клеток опухоли аутокринным и паракринным путем. Показана связь увеличения уровня цитокинов с повышенной пролиферативной активностью клеток и ускорением процессов метастазирования, проведена оценка влияния цитокинов на основные свойства злокачественных опухолей, благодаря чему они могут использоваться в качестве маркеров опухолевой прогрессии и для определения прогноза заболевания [Симбирцев A.C., 2004].

Опухолевые клетки при XJIJ1 постоянно экспрессируют интерлейкин-8 (ИЛ-8), а также рецепторы к нему. ИЛ-8 функционирует как аутокринный ростовый фактор и фактор устойчивости к апоптозу, увеличивая выживаемость лейкозных клеток посредством усиления экспрессии bcl-2. Полагают, что внутриклеточная и растворимая формы интерлейкина-8 составляют единую биологическую систему, в которой функциональная активность данного цитокина зависит от относительной концентрации и скорости клиренса ее компонентов, и в первую очередь от дисбаланса между синтезом ИЛ-8 и рецепторов к нему [Di Celle P.F., 2000]. Исходя из этого, представляло интерес изучение ИЛ-8 при ХЛЛ в зависимости от скорости прогрессирования заболевания и стадии.

Необходимо отметить, что само возникновение опухоли в организме связано с нарушением противоопухолевого иммунитета, к тому же, В-клетки являются одними из участников иммунных реакций и в то же время субстратом опухоли [Баранчук Н.В., 2003, Антонов В.Г., 2004]. Представленные в современной литературе сведения часто затрагивают лишь некоторые показатели иммунной системы, без комплексной оценки иммунного статуса с учетом агрессивности течения заболевания, кроме того, не проведена оценка иммунного статуса у больных в зависимости от экспрессии ZAP-70.

Из сказанного вытекает, что необходим всесторонний анализ экспрессии ZAP-70, цитокинового статуса и перестройки иммунной системы у пациентов в зависимости от динамики опухолевого процесса.

Целью настоящего исследования явилась оценка содержания ZAP-70 и интерлейкина-8, а также иммунного статуса у больных хроническим лимфолейкозом.

Задачи исследования

1. Определить экспрессию ZAP-70 опухолевыми клетками у больных с различными вариантами течения хронического лимфолейкоза.

2 Оценить прогностическую значимость экспрессии ZAP-70 в течении хронического лимфолейкоза.

3 Установить взаимосвязь уровня интерлейкина-8 (растворимого и внутриклеточного) с вариантом течения и стадией заболевания.

4. Изучить состояние клеточного, гуморального иммунитета и факторов неспецифической резистентности у больных XJIJ1 в зависимости от варианта течения заболевания и уровня экспрессии ZAP-70.

Научная новизна. На основе всестороннего анализа полученных результатов исследований выделен индивидуальный прогностический фактор течения заболевания - суррогатный маркер мутационного статуса ZAP-70, позволяющий прогнозировать вариант течения заболевания и определять тактику терапии на ранних стадиях XJ1J1. Впервые у этих пациентов проведен анализ уровня ИЛ-8 у больных в зависимости от стадии и варианта течения заболевания. Определена информативность нового прогностического фактора ZAP-70. Установлена значимость ZAP-70 и ИЛ-8 в качестве прогностических маркеров клинического течения ХЛЛ. Выявлены закономерности дисбаланса иммунной системы и цитокинового статуса в динамике лейкозного процесса.

Теоретическая и практическая значимость работы. Предложены новые прогностические критерии для определения характера клинического течения ХЛЛ. Для каждого варианта течения заболевания определен индивидуальный статический прогностический фактор - ZAP-70. Установлена зависимость уровня ИЛ-8 от динамики лейкозного процесса. Полученные результаты послужат основой для назначения дифференцированной терапии ХЛЛ.

Показана глубина дисфункции основных звеньев иммунитета и их зависимость от варианта течения заболевания. Это имеет немаловажное значение в плане определения терапевтической тактики у больных ХЛЛ на ранних стадиях заболевания, а также проведение иммунокоррекции для предупреждения возникновения инфекционных осложнений, затрудняющих проведение таргетной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Скорость прогрессировать ХЛЛ зависит от уровня экспрессии ZAP-70 Больные с положительной экспрессией данного маркера отличаются прогрессирующим течением заболевания, тогда как в группе с отрицательной экспрессией ZAP-70 заболевание имеет благоприятное течение.

2. Более высокий уровень ИЛ-8 наблюдался у больных со стадиями В и С и с прогрессирующим вариантом течения, чем у пациентов со стадией А и доброкачественным вариантом течения.

3. У больных XJIJI с положительной экспрессией ZAP-70 и прогрессирующим вариантом течения заболевания выявлены значительные нарушения в системе иммунитета, выражающиеся в сочетанном угнетении клеточного иммунитета, гуморальных факторов, а также дисбалансом регуляторных цитокинов (ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6).

4. Экспрессия ZAP-70 и высокое содержание растворимого и внутриклеточного ИЛ-8 у больных ХЛЛ в дебюте заболевания может рассматриваться в качестве дополнительного критерия неблагоприятного прогноза: при положительной экспрессии ZAP-70 и высоких уровнях ИЛ-8 прогноз течения заболевания неблагоприятный.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови».

Апробация результатов работы. Основные положения и результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях областного научного общества гематологов и трансфузиологов (2005), научно-практической конференции ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий» «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (2007).

Личное участие автора в получении результатов. Автором лично проведено клиническое обследование пациентов с хроническим лимфолейкозом в условиях поликлиники и стационара. В лаборатории проведена подготовка образцов крови для анализа уровня экспрессии ZAP-70 и внутриклеточного интерлейкина-8 на проточном цитофлюориметре. Выполнена оценка результатов обследования, анализ и статистическая обработка данных 136 больных хроническим лимфолейкозом.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследованных пациентов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 24 таблицы, 5 рисунков. Список литературы включает 186 источников, из них 52 отечественных и 134 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика обследованных больных

Под нашим наблюдением находилось 136 больных хроническим лимфолейкозом гематологической клиники ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий» (директор иститута-д.м.н., профессор С.Л. Шарыгин).

Всем больным диагноз ХЛЛ устанавливался согласно общепринятым критериям, включавшим результаты исследования общего анализа крови, данные миелограммы, иммунофенотипирования лимфоидных элементов

периферической крови и .костного мозга, трепанобиоптата задней ости подвздошной кости, гистологического исследования лимфоузла с иммуногистохимией. Возраст обследованных пациентов с ХЛЛ колебался в пределах от 35 до 81 года, средний возраст составил 62,39±10,81. Среди пациентов оказалось 73 больных (54%) мужчины и 63 (46%) женщины. Средний возраст у мужчин составил 55,10±11,54 лет, у женщин 65,45±9,10.

В нашем исследовании все больные были разделены на две группы в зависимости от стадии заболевания. Применялась стадийная система .1-Ь. Вше! (1989). В первую группу включен 81 больной в стадии А, во вторую объединены 55 больных в стадии В и С. Стадию констатировали на момент установления диагноза.

В зависимости от особенностей клинического течения пациенты с ХЛЛ были разделены на 2 группы. Первая группа пациентов включала 70 человек (52%) и характеризовалась доброкачественным течением заболевания. Во второй группе больных, включавшей 66 человек (48%), заболевание носило прогрессирующий характер.

Для диагностики доброкачественной формы ХЛЛ использовались общепринятые критерии. К ним относили: отсутствие увеличенных лимфоузлов и селезенки или их минимальное увеличение, нормальный уровень гемоглобина и тромбоцитов, уровень лейкоцитов менее 30 тыс., отсутствие перехода в более позднюю стадию в течение 12 мес.

К проявлениям опухолевой прогрессии были отнесены следующие признаки: усиление признаков заболевания в течение 12 мес. (сокращение времени удвоения лимфоцитов, изменение стадии заболевания с переходом в более тяжелую, развитие пролимфоцитарной трансформации или синдрома Рихтера). Распределение на варианты течения в настоящем исследовании носило исключительно клинический характер.

Для подтверждения диагноза, а также для контроля эффективности терапии и констатации рецидива заболевания, всем пациентам проводилось исследование пунктата костного мозга. Морфологическая оценка препарата проводилась в лаборатории патоморфологии крови и костного мозга (руководитель лаборатории - к.м.н., Н.С. Федоровская).

Трепанобиопсия задней ости подвздошной кости выполнялась больным до начала терапии и для определения полноты ремиссии. Данные трепанобиопсии были доступны у 61 пациента.

Гистологическое исследование препарата лимфоузла проводилось в лаборатории патоморфологии крови ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий»

У всех обследованных больных были проанализированы показатели периферической крови. В качестве группы сравнения использованы результаты обследования в нашем регионе 50 здоровых людей — доноров крови в возрасте от 20 до 60 лет. В эту группу вошли социально благополучные лица, не связанные с воздействие профессиональных и бытовых факторов.

Методы исследования

В нашей работе у обследованных больных проведен разносторонний спектр иммунологических исследований, Включавший оценку иммунофенотипических маркеров, уровня растворимого и внутриклеточного ИЛ-8, экспрессию ZAP-70, которые проводилась в лаборатории иммуногематологии ФГУ «КНИИГПК Росмедтехнологий» (руководитель лаборатории - д.м.н., профессор Г.А. Зайцева). У больных в процессе выполнения работы определяли количественный состав CD3+-, CD4-, CD8\ CD3+/16+-, С020+-лимфоидных клеток крови, а также экспрессию активационных маркеров CD25+, CD95+ и HLA-DR. Для изучения гуморального звена иммунитета проводили определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов G, А, М. Проведен анализ факторов неспецифического иммунитета (определение фагоцитарной и микробицидной активности нейтрофилов). У всех пациентов в сыворотке крови определяли уровень цитокинов - ИФНу, ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, а также уровень бета-2-микроглобулина (руководитель лаборатории -д.м.н., профессор В.И. Шардаков).

Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. Результаты в большинстве таблиц представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка уровня растворимого ИЛ-8

Анализ растворимого ИЛ-8 (рИЛ-8) проведен у 125 больных ХЛЛ, средний возраст которых составил 61 год. Контрольная группа состояла из 20 первичных доноров крови соответствующего возраста.

ИЛ-8, пг/мл

25 20

¡1

1

Я_1

□ группа сравнения ■ больные ХЛЛ

группа сравнения

больные ХЛЛ

Рис. 1. Содержание растворимого ИЛ-8 у больных ХЛЛ (р<0,05)

Результаты наших исследований показали (рис. 1), что имеются различия в высвобождении ИЛ-8 лейкозными клетками у больных ХЛЛ и лимфоидными клетками здоровых лиц.

При исследовании рИЛ-8 выявлено, что его уровень оказался значительно выше у больных ХЛЛ по сравнению со здоровыми лицами. В контрольной группе уровень данного цитокина в сыворотке крови составил 12,72±1,10 пг/мл (7-25,5 пг/мл), тогда как у больных - 34,7±5,01 пг/мл (5,5-200 пг/мл), (р<0,05).

Содержание рИЛ-8 у больных ХЛЛ в зависимости от стадии и варианта течения заболевания.

Представляло большой интерес оценить уровень рИЛ-8 в зависимости от стадии заболевания. При обследовании больных ХЛЛ выявлены следующие показатели рИЛ-8 (табл. 1).

Таблица 1

Содержание рИЛ-8 в сыворотке крови больных ХЛЛ с различными

стадиями

(М±т)

Больные Стадия А Стадия В и С

ХЛЛ Уровень рИЛ-8, пг/мл Уровень рИЛ-8, пг/мл

п Среднее Интервал п Среднее Интервал

значение значений значение значении

Всего 22 10,1±0,48 5,5-14,2 31 48,1±8,00* 7-200

Мужчины 11 10,8±0,72 5,5-14,2 22 57,5±11,20* 17-200

Женщины 11 9,4±0,59 6,2-11,6 9 29,6±3,80* 18-54,5

Примечание: * - различия между группами достоверны, р<0,05.

Обнаружено, что у пациентов со стадией В и С уровень рИЛ-8 оказался достоверно выше, чем у больных со стадией А. Полученные данные, вероятно, свидетельствуют о повышенной продукции ИЛ-8 клетками опухолевого клона, чем у пациентов со стадией А. Сходные результаты о связи уровня ИЛ-8 с опухолевой прогрессией получил \Vierda с группой авторов [2003]. В то же время у всех больных со стадией А уровень ИЛ-8 незначительно отклонялся от уровня данного цитокина у здоровых людей, что, возможно, связано с малым объемом опухолевой массы и неагрессивным течением заболевания.

Представляло интерес оценить цитокинобразующую функцию лейкемических клеток в зависимости от скорости прогрессирования заболевания (табл. 2).

У больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания уровень рИЛ-8 составил 48,13+8,01 пг/мл, в то же время у пациентов с доброкачественным вариантом течения - 10,42+0,57 пг/мл. Следовательно, у больных с прогрессирующим вариантом течения ХЛЛ уровень рИЛ-8 оказался достоверно выше, чем в 1 группе, что может свидетельствовать о зависимости уровня рИЛ-8 и активности лейкозного процесса.

Таблица 2

Содержание рИЛ-8 у больных ХЛЛ в зависимости от варианта течения заболевания

(М±т)

Показатель Доброкачественный вариант течения Прогрессирующий вариант течения

п Уровень рИЛ-8, пг/мл п Уровень рИЛ-8, пг/мл

Среднее значение Интервал значений Среднее значение Интервал значений

Больные ХЛЛ 23 10,4±0,57 5,5-18 31 48,1±8,01* 17-200

Мужчины 11 10,7±0,72 5,5-14,2 21 57,(ЪЫ 1,20* 17-200

Женщины 12 10,1±0,90 6,2-18 10 28,4±3,67* 17,5-54,5

Примечание: * - различия между группами достоверны, р<0,01

Кроме того, обнаружены достоверные различия в содержании ИЛ-8 у больных 2 группы. В связи с тем, что в момент постановки диагноза уровень рИЛ-8 у больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания оказался достоверно выше, чем у пациентов другой группы, можно рассматривать данный критерий в качестве дополнительного прогностического фактора течения ХЛЛ.

Анализ экспрессии внутриклеточного ИЛ-8 у больных ХЛЛ

Доказано, что уровни цитокинов в сыворотке крови отражают синтез цитокинов клетками in vivo [Симбирцев A.C., 2004]. Л.А. Грачева отмечает, что определение уровней продукции цитокинов изолированными клетками in vitro позволяет оценить функциональное состояние клеток [1996]. Спонтанная продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови в культуре свидетельствует о том, что клетки уже активированы in vivo, а стимулированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток [Wierda W.G., 2003]. Повышенная стимулированная продукция цитокинов служит одним из признаков высокой клеточной реактивности. Исходя из этого, мы оценили оба варианта продукции цитокинов.

Как видно из приведенных результатов (табл. 3), у больных ХЛЛ со стадией В или С уровень экспрессии внутриклеточного ИЛ-8 значительно выше, чем у больных со стадией А заболевания. Причем, после стимуляции увеличивается количество клеток, продуцирующих ИЛ-8, что, возможно, указывает на высокую реактивность опухолевых клеток. Полученные данные, вероятно, свидетельствуют о более высокой реактивности опухолевых клеток при продвинутых стадиях заболевания.

Таблица 3

Спонтанная и стимулированная экспрессия ИЛ-8 у больных ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания

_(М±т)

Больные Больные в стадии А Больные в стадии В и С

ХЛЛ п Уровень ИЛ-8, кол-во клеток (%) п Уровень ИЛ-8, кол-во клеток (%)

Спонтанная продукция Стимулированная продукция Спонтанная продукция Стимулированная продукция

Всего 66 2,0±0,20 3,2±1,10 38 22,1±16,01* 41,4±6,57**

Мужчины 38 1,6±0,30 3,4±1,60 25 22,2±3,50* 44,5±8,10**

Женщины 28 2,5±0,46 2,1±1,20 13 22,7±3,90* 39,6±11,90**

Примечание: * - различия в спонтанной продукции ИЛ-8 между группами достоверны, р<0,05

** - различия в стимулированной продукции ИЛ-8 между группами достоверны, р<0,05

При изучении зависимости секреции внутриклеточного ИЛ-8 от варианта течения заболевания выявлено, что у больных с доброкачественным течением только 3,09+0,67% С019+/С05+-клеток спонтанно экспрессировапи ИЛ-8 (табл.4).

Таблица 4

Спонтанная и стимулированная экспрессия внутриклеточного ИЛ-8 у

больных ХЛЛ в зависимости от варианта течения заболевания

_* _(Mim)

Исследуемая группа Доброкачественный вариант течения ХЛЛ Профессирующий вариант течения ХЛЛ

п Уровень ИЛ-8, кол-во клеток (%) п Уровень ИЛ-8, кол-во клеток (%)

Спонтанная продукция Стимулированная продукция Спонтанная продукция Стимулирова н-ная продукция

Больные ХЛЛ 23 3,09±0,67 6,4±2,30 31 21,10±3,08* 50,4±6,06**

Мужчины 11 4,50±0,03 8,1±2,10 21 23,3±2,2* 50,0±3,01**

Женщины 12 2,99±0,21 6,2±1,01 10 19,30±1,6* 52,6±4,90**

Примечание: * - различия в спонтанной секреции ИЛ-8 между группами достоверны, р<0,01

** - различия в стимулированной секреции ИЛ-8 между группами достоверны, р<0,01

У больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания экспрессия ИЛ-8 регистрировалась на значительно большем количестве клеток.

После стимуляции клеток наблюдалось значительное повышение их количества, экспрессирующих ИЛ-8.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что у больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания имелась достоверно более высокая спонтанная и стимулированная экспрессия внутриклеточного ИЛ-8 С019+/С05+-лимфоцитами, по сравнению с пациентами с доброкачественным течением ХЛЛ.

Анализ экспрессии ZAP-70 у больных ХЛЛ.

Данные литературы в отношении экспрессии ZAP-70 у больных ХЛЛ крайне противоречивы. Поэтому представляло большой интерес изучить экспрессию ZAP-70 у больных ХЛЛ и определить его роль в прогнозе заболевания.

Анализ ZAP-70 у больных ХЛЛ с различными вариантами течения

заболевания

Данные по суррогатному маркеру мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов получены у 44 больных ХЛЛ, среди которых было 25 мужчин и 19 женщин. Возраст пациентов колебался от 45 до 68 лет (средний возраст больных составил 56,3 ± 5,1 лет).

В настоящем исследовании ZAP-70 определяли в клетках опухолевого клона CD19+/CD5+. В зависимости от варианта течения заболевания больные были разделены на две группы В первую группу включено 25 больных с доброкачественным течением ХЛЛ. Во вторую группу объединены 19 больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания. При исследовании уровня данного белка выявлены следующие закономерности (табл. 5).

Из приведенных в таблице данных видно, что 89% пациентов в группе с прогрессирующим течением характеризовались положительной экспрессией ZAP-70. В 1 группе количество больных, положительных по данному маркеру, составило 28% от общего количества пациентов данной выборки. При установлении клинико-иммунологических параллелей оказалось, что больные отрицательные по ZAP-70 из группы с доброкачественным течением, при дальнейшем наблюдении в течение трех лет характеризовались отсутствием прогрессии заболевания. В то же время 6 больных из 7 (86%) ZAP-70+ пациентов данной группы проявили признаки прогрессирования заболевания.

Таблица 5

Уровень экспрессии ZAP-70 клетками CD19+/CD5+у больных ХЛЛ с

различными вариантами течения заболевания

Экспрессия ZAP-70 Доброкачественный вариант течения ХЛЛ (п=25) Прогрессирующий вариант течения ХЛЛ (п=19)

Количество случаев

п % п %

ZAP-70" 7 28 17 89

ZAP-70" 18 72 2 11

Полученные данные согласуются с результатами исследований зарубежных и отечественных авторов. Так, A. Weistner (2003) и Е.А. Никитин с соавт. (2004) приводят данные, в которых указывается, что среди пациентов с доброкачественным вариантом течения XJUI у половины больных заболевание в дальнейшем будет прогрессировать, а у другой части пациентов течение заболевания останется благоприятным.

Следовательно, быстрота прогрессии заболевания связана с экспрессией ZAP-70. Положительная экспрессия соответствовала быстрой прогрессии, в то же время при отрицательной экспрессии ZAP-70 клиническое течение оставалось благоприятным. Основываясь на полученных данных, можно заключить, что у пациентов с положительной экспрессией ZAP-70 необходимо в дебюте заболевания думать о более интенсивном или направленном лечении, чтобы достичь ремиссии, в то время как у больных с отрицательной экспрессией данного белка можно воздержаться от интенсивной терапии.

Таким образом, проведенные исследования показали, что вариант течения ХЛЛ зависит от экспрессии ZAP-70, что имеет прогностическое значение при данном заболевании. Суммируя полученные данные, можно отметить, что группа пациентов с отрицательной экспрессией ZAP-70 характеризовалась более стабильным, а группа ZAP-70+ прогрессирующим течением ХЛЛ.

Содержание актнвационных маркеров у больных ХЛЛ с различной экспрессией ZAP-70

Нами изучена экспрессия поверхностных маркеров в группах ZAP-70" и ZAP-70*-naiuieHTOB. Проанализировано три кластера иммунофенотипических маркеров: дифференцировочные (CD19, CD20, CD22), дифференциально-диагностические (CD5, CD10, CD23) и активационные (CD25,CD38).

В исследованиях не выявлено статистически достоверных различий в экспрессии дифференцировочных и дифференциально-диагностических антигенов с учетом экспрессии ZAP-70. Среди активационных маркеров единственным антигеном, различия по которому достигли статистической значимости, был CD38.

В имеющейся литературе нам не встретилось работ, посвященных изучению уровня CD38 у больных ХЛЛ с различной экспрессией ZAP-70 Однако в работах G. Del Poeta (2001) подчеркивается, что прогностическое значение данного маркера велико и экспрессия данного антигена на опухолевых лимфоцитах неблагоприятна для прогноза. В связи с этим прослежено содержание данного маркера в двух группах больных ХЛЛ.

В группе ZAP-70" он ни в одном случае не экспрессировался более чем на 20% клеток. В группе ZAP-70+ он экспрессировался на более чем 20% клеток в 22 из 24 случаев (91%).

Следовательно, при положительной экспрессии ZAP-70 CD38 регистрируется в большинстве случаев (у 22 из 24 больных) более чем на 20% клеток, тогда как у ZAP-70(-) пациентов в 100% случаях наблюдается отрицательная экспрессия данного маркера.

Анализ экспрессии ZAP-70 и других факторов прогноза при XJIJI

Согласно данным литературы, установлению биологической роли данного маркера может способствовать изучение взаимосвязи с другими прогностическими признаками [Shanafelt T.D., 2004]. В исследованиях проведен сравнительный анализ экспрессии ZAP-70 со следующими прогностическими факторами XJIJI: полом, исходным уровнем лимфоцитов, временем их удвоения, характером гистоструктуры костного мозга, содержанием бета-2-микроглобулина.

В наших наблюдениях в группе ZAP-70+ оказалось 18 мужчин и 6 женщин (соотношение примерно 3:1), тогда как в группе ZAP-70" соотношение мужчин и женщин было примерно равным, составив: 11 и 9 (1,2:1) (таблица 6).

Таблица б

Анализ факторов прогноза XJIJI в группах больных с различной экспрессией ZAP-70

Показатель Экспрессия ZAP-70 Достоверность различий

ZAP-70" ZAP-70+

Пол I м 11 (54%) 18(80%) р>0,05

ж 9 (46%) 6 (20%)

Абс. к-во лимфоцитов, х 109/л 32,6±0,03 69,6±0,32 р<0,05

Время удвоения лимфоцитов,мес. >12 мес. 9,1±1,1

В группе пациентов, положительных по ZAP-70, среднее абсолютное количество лимфоцитов составило 69,6 тыс/мкл, а в группе с ZAP-70" - 32,6 тыс/мкл (р<0,05).

При сравнении времени удвоения лимфоцитов в группах с различной экспрессией ZAP-70 выявлены достоверные отличия (р<0,01). В группе больных с ZAP-70+ время удвоения составило 9,1 месяц, тогда как в группе с ZAP-70" данный показатель оказался более 12 месяцев.

Постадийный анализ выявил существенные различия. Стадию констатировали на момент установления диагноза. Из таблицы 7 видно, что в группе больных, отрицательных по ZAP-70, было достоверное преобладание больных в стадии А (р<0,001). В группе ZAP-70+ пациенты распределились по стадиям примерно в равных соотношениях.

Таблица 7

Сравнительная оценка стадий ХЛЛ по Вше1 в группах ХЛЛ с различной

экспрессией гАР-70

Стадии ZAP-70+ ZAP-70" Достоверность

(п=24) (п=20) различии, р

А 7 16 р<0,05

В 9 4 р<0,05

С 8 0 р<0,05

При изучении характера инфильтрации костного мозга (диффузный или очаговый/очагово-интерстициальный) у 44 больных в зависимости от экспрессии гАР-70 получены следующие результаты (таблица 8).

Таблица 8

Анализ зависимости характера поражения костного мозга у больных ХЛЛ

от экспрессии гАР-70

Больные ХЛЛ Характер поражения костного мозга

Диффузный Очагово-интерстициальный

п % п %

Всего (п=44) 27 61 17 39

ZAP-70" (п=20) 8 44 12 56

ZAP-70+ (п=24) 18* 84 6* 16

Примечание: * р<0,05 - различия между группами достоверны

В нашей выборке статистически достоверными оказались различия в характере инфильтрации костного мозга в двух группах с различной экспрессией ZAP-70. В группе с отрицательной экспрессией ZAP-70 очаговый или очагово-интерстициальный рост отмечался у 12 из 20 больных (56%), а в группе ZAP-70+ у 6 из 24 больных (16%, р<0,05).

Содержание бета-2- микроглобулина у больных ХЛЛ в зависимости от

экспрессии ZAP-70

При проведении сравнительной оценки содержания бета-2 микроглобулина у больных в зависимости от экспрессии ZAP-70 выявлено, что достоверно более высокое содержание бета-2-микроглобулина отмечалось у ZAP-70 положительных больных, что может свидетельствовать о повышенном

клеточном обороте и усилении пролиферативной активности опухолевых клеток у данной категории больных (табл. 9).

Таблица 9

Содержание бета-2-микроглобулина у больных XJIJI в зависимости от

экспрессии ZAP-70

(М±т)

Исследуемые группы Содержание бета-2-микроглобулина, пг/мл Пределы колебаний исследуемого показателя (min-max)

ZAP-70" (п=20) 3,8±0,09 3,76-3,95

ZAP-70" (п=24) 5,7±0,36* 2,51-9,32

Группа сравнения (п=50) 2,6±0,80 1,9-2,8

Примечание: * - различия между группой сравнения и 2 группой достоверны, р<0,05

Следовательно, полученные нами данные свидетельствовали о том, что существует два варианта XJIJI (с положительной и отрицательной экспрессией ZAP-70), которые имеют биологические особенности. Группа ZAP-70(+) больных отличалась достоверно более высоким уровнем абсолютного количества лимфоцитов в дебюте заболевания, временем удвоения лейкоцитов менее 12 мес. Данная категория больных также характеризовалась преобладанием больных с продвинутыми стадиями заболевания, наличием диффузного типа инфильтрации костного мозга опухолевыми клетками, достоверно более высоким уровнем бета-2-микроглобулина.

Особенности иммунного статуса у больных XJIJI с различными вариантами течения заболевания и в зависимости от экспрессии ZAP-70

Среди показателей иммунной системы оценивалось количество лимфоцитов, несущих маркеры CD3, CD4, CD8, CD16, а также изучались такие маркеры активации, как CD25, и индикатор готовности к апоптозу — CD95. Кроме того, определяли уровни сывороточных иммуноглобулинов классов G, А, М, а также изучались уровни некоторых цитокинов: ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-а, ИФН-у в сыворотке крови. В работе оценивались функциональные свойства нейтрофилов: фагоцитарная активность и кислородзависимая микробицидность.

Анализ показателей иммунитета у больных ХЛЛ с различным вариантом течения заболевания

При изучении показателей клеточного иммунитета у больных ХЛЛ с прогрессирующим вариантом течения заболевания в иммунограмме наблюдалось значительное достоверное снижение относительного и

абсолютного количества CD3+, CD4\ CD8+, СОЗ+/16+-лимфоцитов относительно пациентов с доброкачественным вариантом течения, что указывает на более глубокий иммунодефицит у данной категории пациентов.

Кроме того, выявлено, что у лиц с доброкачественным вариантом течения заболевания отмечалось повышенное содержание С095+-клеток, который является рецептором для Fas-лиганда, что свидетельствует о более высокой способности клеток к апоптозу, чем у лиц с прогрессирующим вариантом.

При анализе неспецифических факторов защиты, не выявлено снижения фагоцитарной активности нейтрофилов у больных с доброкачественным вариантом течения заболевания (60,1±1,30%). Однако у больных с прогрессирующим вариантом течения ХЛЛ отмечено достоверное снижение ФАН в 2 раза (32,2±1,40%) при показателях контрольной группы 68,1±1,25%.

При изучении показателей гуморального иммунитета у больных ХЛЛ с различным вариантом течения заболевания установлено, что у больных с прогрессирующим вариантом течения наблюдалась достоверно более выраженная гипоиммуноглобулинемия, выражающаяся в снижении IgA (1,7 г/л,), IgG(9,l г/л), IgM (1,4 г/л), чем у пациентов с доброкачественным вариантом течения ХЛЛ (рис. 2).

IgA IgM IgG

□Доброкачественный ШПрогрессирующи* ИГруппа сравнения I

Рис.2 Содержание иммуноглобулинов у больных ХЛЛ с различными вариантами течения заболевания

При анализе цитокинового статуса у больных ХЛЛ, можно заключить, что у пациентов с прогрессирующим вариантом течения наблюдалось достоверное повышение уровня ИФН-у (табл. 10).

Высокая концентрация ФНО-а отмечалась в обеих группах больных ХЛЛ, однако достоверных различий в содержании данного цитокина между группами не выявлено.

Уровень ИЛ-2 у больных с доброкачественным вариантом течения заболевания оставался стабильным. Более низкое содержание ИЛ-2 у больных ХЛЛ при опухолевой прогрессии, по мнению ряда авторов, связано с тем, что злокачественные клетки способны вырабатывать ряд веществ, которые ингибируют, а в ряде случаев даже полностью блокируют продукцию ИЛ-2. По

данным литературы, некоторые авторы также отмечают достоверное снижение продукции ИЛ-2 на поздних стадиях1 болезни (стадии В и С) при отсутствии изменений на ранних стадиях процесса [Бережная Н.М., 1992].

Таблица 10

Анализ показателей цитокинового статуса у больных ХЛЛ с доброкачественным и прогрессирующим вариантом течения

Исследуемые показатели Доброкачественный вариант течения ХЛЛ (п=70) Прогрессирующий вариант течения ХЛЛ (п=66) Группа сравнения (п=50)

ИФН-у, пг/мл ФНО-а, пг/мл ИЛ-2, пг/мл ИЛ-4, пг/мл ИЛ-6, пг/мл 115,1±2,20 71,3±2,10 13,2±1,31 44,1 ±3,78 28,9±2,03 135,1±1,20* 73,3±2,10 10,3±1,10 69,7±4,10* 39,7±2,10* 104,1±18,19** 41,3±2,81** 13,6±1,08 21,3±2,36** 40,5±15,44**

Примечание: * - различия между 1 и 2 группами больных, р<0,05

** - различия между 1 и 2 группами больных и группой сравнения достоверны, р<0,05

Содержание ИЛ-4 у больных обеих групп оказалось достоверно выше, чем в группе контроля. Однако у больных с прогрессирующим течением заболевания уровень данного цитокина в 1,5 раза превышал показатели пациентов с доброкачественным течением опухолевого процесса.

В нашей работе выявлен повышенный уровень ИЛ-6 у больных с прогрессирующим течением заболевания относительно второй группы пациентов

Следовательно, полученные данные свидетельствовали о более существенных изменениях в цитокиновом статусе и более значимой дефектности в системе иммунитета у больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания, выражающемся в более значительном угнетении Т-клеточного звена и гуморальных факторов, дисбаланса в системе цитокинов, а также повышении выживаемости лейкозных клеток. Выявленные нарушения в системе иммунитета носили однонаправленный характер, различия касались только степени иммунодефицита.

Анализ показателей иммунитета у больных ХЛЛ с различной экспрессией ZAP-70

При анализе показателей клеточного иммунитета у больных с различной экспрессией ZAP-70 выявлено достоверное снижение относительного и абсолютного содержания клеток с маркерами CD3+, CD4+, CD8+, а также индекса CD4+/CD8+ у больных, положительных по ZAP-70 (таблица 11).

Таблица 11

Анализ показателей иммунного статуса у больных XJIJI с различной экспрессией ZAP-70

Исследуемые ZAP-70' ZAP-70+ Группа сравнения

показатели (n=20) (n=24) (n=50)

Лимфоциты:

-% 56,0±0,12 78,1±0,16* 30,4±0,82**

-х109/л 5,1±0,20 1,7±2,10* 1,8±0,052**

-CD3+,xl0% 0,5±2,53 0,2±0,40* 30,4±1,42**

С04+,хЮ9/л 0,2±1,10 0,1±0,09* 0,4±0,022**

-CD8+,xl0% 0,1±0,70 0,05±0,45* 0,21±0,01**

-Тх/Тс 2,0±0,10 2,0±0,03* 2,2±0,07**

-CD3+,% 36,I±3,80 29,9±5,33* 56,5±2,33**

-CD4\% 22,1±2,71 17,1±3,40* 50,0±0,95**

-CD8\% 15,6±1,84 12,8±2,40* 22,7±0,56**

-CD3/16+,% 4,5±1,90 2,7±1,09* 34,4±3,26**

-CD25+,% 25,7±2,40 34,2±1,30* 24,6±2,55**

-CD95+,% 28,5±1,80 61,8±1,10* 27,6±2,01 **

-HLA-DR,% 0,5±0,12 5,5±1,30* 41,6±2,64**

□ZAP-70-■ ZAP-70+ Огруппа сравнения

Рис. 3 Содержание иммуноглобулинов у больных XJIJI в зависимости от экспрессии ZAP-70

Примечание: * - различия между группами больных с положительной и отрицательной экспрессией ZAP-70 достоверны, р<0,05

** - различия между группой сравнения и 1 и 2 группой пациентов с XJIJI достоверны, р<0,05

Исследование содержания NK-клеток показало достоверное снижение данного показателя у больных XJIJI, по сравнению с контрольной группой. Нарушения носили более глубокий характер у пациентов с положительной экспрессией ZAP-70.

иммуноглобулины, г/л

Изучение показателей гуморального иммунитета выявило достоверное снижение иммуноглобулинов класса А и М (1,9 и 0,8 г/л соответственно) в группе ZAP-70(+) больных и всех классов иммуноглобулинов в группе ZAP-70(-) пациентов (р<0,05) (рис. 3).

Сравнительная оценка показателей цитокинового статуса показала, что в группе больных, положительных по ZAP-70, наблюдалась достоверно более высокая продукция ИФН-у (133 пг/мл), ФНО-а (50 пг/мл), ИЛ-4 (40 пг/мл) и ИЛ-6 (72,3 пг/мл) (р<0,05), чем у больных с отрицательной экспрессией, что свидетельствует об активации механизмов противоопухолевого иммунитета, а также усилении аутокринных и паракринных механизмов регуляции функций опухолевых клеток (рис. 4). Кроме того, в данной группе пациентов оказался сниженным уровень ИЛ-2.

ИФН-? ФИО-? ИЛ-2 ИЛ-4 ИЛ-6

Рис. 4. Содержание цитокинов у больных ХЛЛ в зависимости от экспрессии

ZAP-70

Выявлены достоверные различия между группами больных с различной экспрессией ZAP-70 в активности кислородзависимого метаболизма. В группе больных с положительной экспрессией ZAP-70 отмечается достоверно более низкое значение ФАН, тогда как у пациентов с отрицательной экспрессией ZAP-70 данный показатель не отличается от группы сравнения (38,2±0,11% и 66,2±3,30% соответственно). По остальным показателям неспецифической защиты отклонений в значениях относительно контрольной группы не выявлено.

Следовательно, иммунологическим паттерном нарушений иммунитета при наличии положительной экспрессии ZAP-70, по нашим данным, являются комбинированные нарушения противоопухолевого иммунитета с угнетением нескольких звеньев иммунной системы (клеточный и неспецифический), которые обусловлены не только количественным снижением иммунокомпетентных клеток, но и регуляторными нарушениями.

выводы

1. Экспрессия ZAP-70 является ранним прогностическим критерием течения хронического лимфолейкоза: при положительной экспрессии данного маркера в 89% случаев развивается прогрессирующее течение заболевания, при отрицательной - прогрессия отсутствует. Определение ZAP-70 в дебюте заболевания может использоваться в качестве раннего критерия прогноза течения ХЛЛ.

2. Прогрессирующее течение хронического лимфолейкоза и стадии В и С характеризуются повышенным уровнем растворимого и внутриклеточного интерлейкина-8 в сравнении с доброкачественным вариантом и стадией А. У пациентов со стадией В и С и с прогрессирующим вариантом течения заболевания концентрация растворимого ИЛ-8 в 4 раза превышала показатели больных со стадией А и доброкачественным течением (р<0,05). Уровень внутриклеточного ИЛ-8 в 11 раз выше у больных со стадией В и С, чем со стадией А, и в 8 раз выше у больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания, чем у пациентов с доброкачественным вариантом течения хронического лимфолейкоза (р<0,05).

3. Высокий уровень растворимого и экспрессия внутриклеточного ИЛ-8 клетками опухолевого клона в дебюте хронического лимфолейкоза характеризуют активацию популяции лейкемических клеток.

4. У больных ХЛЛ с положительной экспрессией ZAP-70 и прогрессирующим вариантом течения заболевания выявлены нарушения в системе иммунитета, выражающиеся сочетанным угнетением клеточного звена, гуморальных факторов, а также дисбалансом регуляторных цитокинов (ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-4, ИЛ-6).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У больных ХЛЛ целесообразно в дебюте заболевания исследовать экспрессию ZAP-70, что позволит предсказать доброкачественный или прогрессирующий вариант течения, а также позволит дифференцированно подходить ко времени начала химиоиммунотерапии.

2. У больных ХЛЛ целесообразно определять уровень растворимого и внутриклеточного ИЛ-8 для прогнозирования благоприятного и неблагоприятного течения заболевания.

3. Анализ иммунной системы у больных ХЛЛ, включающий комплексное тестирование клеточного и гуморального иммунитета, неспецифической защиты и регуляторного нейроиммунного аппарата (по содержанию и соотношению цитокинов), позволяет получить представление об иммунореактивности пациентов с различными темпами прогрессирования заболевания и экспрессией ZAP-70.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Шерстиева Е.С. Клиническое значение определения уровня ИЛ-8 у больных хроническим лимфолейкозом / Е.С. Шерстнева, Т.П. Загоскина, В.И. Шардаков, Н.В. Исаева // Материалы научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2005. - С. 32

2. Криницына Е.Е. Особенности инфекционных осложнений у больных лимфопролиферативными заболеваниями / Е.Е. Криницына, Т.П. Загоскина, О.В. Малых, Е.С. Шерстнева // Паллиативная медицина. - 2005. - №2. - С. 13

3. Исаева Н.В. Интерлейкин-8 при хроническом лимфолейкозе / Н.В. Исаева, Т.П. Загоскина, Е.С. Шерстнева, Г.А. Зайцева // Материалы научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2005. - С. 160

4. Криницына Е.Е. Инфекционные осложнения у больных опухолями лимфатической системы / Е.Е. Криницына, Т.П. Загоскина, О.В. Малых, М.Н. Хоробрых, Е.С. Шерстнева, Е.Н. Зотина // Материалы научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2007. - С. 150

5. Шерстнева Е.С. Содержание ИЛ-8 у больных с прогрессирующим течением хронического лимфолейкоза / Е.С. Шерстнева, Т.П. Загоскина, Г.А. Зайцева, Н.В. Исаева // Материалы научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2007. - С. 52

6. Шерстнева Е.С. Клиническое значение внутриклеточного ИЛ-8 у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом / Е.С. Шерстнева, Н.В. Исаева, Т.П. Загоскина, В.И. Шардаков // Вестник гематологии. - 2007. - Т. 3. -№2. - С. 49

7. Шерстнева Е.С. Прогностическое значение уровня интерлейкина-8 у больных хроническим лимфолейкозом / Е.С. Шерстнева, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, Н.В. Исаева, Г.А. Зайцева // Пермский медицинский журнал. - 2008. -Т. 25. -№3. - С. 89-94.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз ZAP-70 - zeta-ассоциируемый белок ИЛ - интерлейкин

рИЛ-8 - растворимый интерлейкин-8

ИФН-7 - интерферон гамма

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа

CD - claster differentiation (кластер дифференцировки)

Подписано в печать 14.11.08. Услпечл 1,5

Бумага офсетная Печать цифровая

Заказ 1787. Тираж 100.

Текст напечатан с оригинал-макета, изготовленного ООО «Фирма «Полекс» по материалам, предоставленным автором.

Изготовлено - ООО «Фирма «Полекс»

610 ООО, г. Киров, ул Дрелевского, 55, тел /факс (8332) 64-23-56

Хронический лимфолейкоз является наиболее распространенным видом лейкоза среди всех гемобластозов [12,29,62]. Заболевание крайне гетерогенно по своему течению, характеризуется различными темпами прогрессирования, а также различной выживаемостью больных. У ряда пациентов болезнь неуклонно прогрессирует, и, несмотря на лечение, продолжительность жизни составляет всего 2-3 года. В то же время примерно у 15-20% больных клинические и гематологические признаки заболевания на протяжении многих лет остаются стабильными и минимально выраженными [52]. Для определения прогноза течения заболевания в настоящее время предложены различные критерии, но ни один из них не является абсолютным. Такие традиционные факторы прогноза как стадия заболевания на момент установления диагноза, время удвоения количества лимфоцитов, характер поражения костного мозга, уровень бета-2-микроглобулина, иммунофенотипические особенности опухолевых клеток не отражают биологические особенности опухоли. В настоящее время имеется возможность проведения эффективной терапии в оптимальные сроки, поэтому актуальным является разработка информативных стратификационных параметров для прогнозирования течения ХЛЛ. Изучая клиническое течение ХЛЛ, авторы отмечают, что на смену традиционной тактике приходит адаптированная к риску терапия, при этом в дебюте болезни должны определяться факторы прогноза ХЛЛ [29]. На практике адаптированную к риску терапию ХЛЛ можно применять, используя генетические или статичные факторы прогноза. Классические или динамичные маркеры прогноза, такие как тип инфильтрации костного мозга, уровень лейкоцитов, уровень растворимого С023 и другие, коррелируют с массой опухоли и меняются со временем. Напротив, независимые факторы прогноза, такие как мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов, не меняются со временем и уже в дебюте позволяют предсказать неблагоприятное течение ХЛЛ [28].

Особенно важно то, что мутационный статус позволяет выделять подгруппы больных с разным прогнозом в пределах ранних стадий [38,62,77]. Вместе с тем, исследование мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов является технологически сложным, долговременным, дорогостоящим и недоступным практическому здравоохранению. В настоящее время выделен белок ZAP-70, который коррелирует с мутациями гена IgVH и, следовательно, может явиться удачной лабораторной заменой определения мутационного статуса.

Рядом работ последних лет показано, что многообразные клинические проявления XJIJI связаны с нарушениями цитокинового статуса [7]. Выявлено, что при любом опухолевом росте имеются нарушения в системе интерлейкинов, которые проявляются дисбалансом продукции этих биологически активных веществ, а также изменением экспрессии соответствующих рецепторов [14].

Известно, что цитокины продуцируются различными клетками организма и являются факторами взаимодействия между клетками всех его органов и систем [18,34]. Во многих случаях они проявляют себя как факторы аутокринной регуляции.

В результате проведенных исследований показано, что повышенная секреция цитокинов при XJIJI приводит к их системному воздействию на организм, в результате чего формируются значимые субпопуляционные изменения со стороны клеток иммунной системы [27]. JI.A. Грачева (1996) обнаружила, что в процессе возникновения и развития опухоли происходит, прежде всего, нарушение баланса между секрецией проопухолевых, противоопухолевых и регуляторных цитокинов [14]. Секреция определенных цитокинов может обеспечивать преимущества роста для клеток опухоли аутокринным и паракринным путем. Показана связь увеличения уровня цитокинов с повышенной пролиферативной активностью клеток и ускорением процессов метастазирования, проведена оценка влияния цитокинов на основные свойства злокачественных опухолей, благодаря чему они могут использоваться в качестве маркеров опухолевой прогрессии и для определения прогноза заболевания [15,100].

Опухолевые клетки ХЛЛ постоянно экспрессируют интерлейкин-8 (ИЛ-8), а также рецепторы к нему. ИЛ-8 функционирует как аутокринный ростовый фактор и фактор устойчивости к апоптозу, увеличивая выживаемость лейкозных клеток посредством усиления экспрессии bcl-2. Полагают, что внутриклеточная и растворимая формы интерлейкина-8 составляют единую биологическую систему, в которой функциональная активность данного цитокина зависит от относительной концентрации и скорости клиренса ее компонентов, и в первую очередь от дисбаланса между синтезом ИЛ-8 и рецепторов к нему[159]. Исходя из того, что при ХЛЛ одним из механизмов патогенеза является блокада апоптоза, представляет интерес изучение ИЛ-8 как фактора устойчивости к апоптозу.

Необходимо отметить, что само возникновение опухоли в организме связано с нарушением противоопухолевого иммунитета, к тому же, В-клетки являются одними из участников иммунных реакций и в то же время субстратом опухоли [18].

Из сказанного вытекает, что необходим всесторонний анализ экспрессии ZAP-70, цитокинового статуса и перестройки иммунной системы у пациентов в зависимости от динамики опухолевого процесса.

Целью настоящего исследования явилась оценка содержания ZAP-70 и интерлейкина-8, а также иммунного статуса у больных хроническим лимфолейкозом.

Для достижения данной цели в этой работе были поставлены следующие задачи.

1. Определить экспрессию ZAP-70 опухолевыми клетками у больных с различными вариантами течения хронического лимфолейкоза.

2. Оценить прогностическую значимость экспрессии 2АР-70 в течении хронического лимфолейкоза.

3. Установить взаимосвязь уровня интерлейкина-8 (растворимого и внутриклеточного) с вариантом течения и стадией заболевания.

4. Изучить состояние клеточного, гуморального иммунитета и факторов неспецифической резистентности у больных ХЛЛ в зависимости от варианта течения заболевания и уровня экспрессии 2АР-70.

Научная новизна заключается в том, что на основе всестороннего анализа полученных результатов исследований выделен индивидуальный прогностический фактор течения заболевания — суррогатный маркер мутационного статуса 2АР-70, позволяющий прогнозировать вариант течения заболевания. Впервые, у этих пациентов проведен анализ уровня ИЛ-8 у больных в зависимости от стадии и варианта течения заболевания. Определена информативность нового прогностического фактора 2АР-70. Установлена значимость 2АР-70 и ИЛ-8 в качестве прогностических маркеров клинического течения ХЛЛ. Выявлены закономерности дисбаланса иммунной системы и цитокинового статуса в динамике лейкозного процесса.

Теоретическая и практическая значимость работы

Предложены новые прогностические критерии для определения характера клинического течения ХЛЛ. Для каждого варианта течения заболевания определен индивидуальный статический прогностический фактор - 2АР-70. Установлена зависимость уровня ИЛ-8 от динамики лейкозного процесса. Полученные результаты послужат основой для назначения дифференцированной терапии ХЛЛ.

Показана глубина дисфункции основных звеньев иммунитета и их зависимость от варианта течения заболевания. Это имеет немаловажное значение в плане определения терапевтической тактики у больных ХЛЛ на ранних стадиях заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Скорость прогрессирования ХЛЛ зависит от экспрессии 2АР-70. Больные с положительной экспрессией данного маркера отличаются прогрессирующим течением заболевания, тогда как в группе с отрицательной экспрессией 2АР-70 заболевание имеет благоприятное течение.

2. Уровень ИЛ-8 повышен у больных со стадиями В и С и с прогрессирующим вариантом течения, чем у пациентов со стадией А и доброкачественным вариантом течения.

3. У больных ХЛЛ с положительной экспрессией 2АР-70 и прогрессирующим вариантом течения заболевания выявлены значительные нарушения в системе иммунитета, выражающиеся в сочетанном угнетении клеточного иммунитета, гуморальных факторов, а также дисбалансом регуляторных цитокинов (ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6).

4. Экспрессия 2АР-70 и высокое содержание растворимого и внутриклеточного ИЛ-8 у больных ХЛЛ в дебюте заболевания может рассматриваться в качестве дополнительного критерия неблагоприятного прогноза: при положительной экспрессии 2АР-70 и высоких уровнях ИЛ-8 прогноз течения заболевания неблагоприятный.

Апробация и внедрение результатов исследований

Основные положения и результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях областного научного общества гематологов и трансфузиологов (2005), научно-практической конференции ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий» «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (2007). По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследованных пациентов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 26 таблиц, 5 рисунков. Список литературы включает 186 источников, из них 52 отечественных и 134 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Экспрессия ZAP-70 является ранним прогностическим критерием течения хронического лимфолейкоза: при положительной экспрессии данного маркера в 89% случаев развивается прогрессирующее течение заболевания, при отрицательной - прогрессия отсутствует. Определение 2АР-70 в дебюте заболевания может использоваться в качестве раннего критерия прогноза течения ХЛЛ.

2. Прогрессирующее течение хронического лимфолейкоза и стадии В и С характеризуются повышенным уровнем растворимого и внутриклеточного интерлейкина-8 в сравнении с доброкачественным вариантом и стадией А. У пациентов со стадией В и С и с прогрессирующим вариантом течения заболевания концентрация растворимого ИЛ-8 в 4 раза превышает показатели больных со стадией А и доброкачественным течением (р<0,05). Уровень внутриклеточного ИЛ-8 в 11 раз выше у больных со стадией В и С, чем со стадией А, и в 8 раз выше у больных с прогрессирующим вариантом течения заболевания, чем у пациентов с доброкачественным вариантом течения хронического лимфолейкоза (р<0,05).

3. Высокий уровень растворимого и экспрессия внутриклеточного ИЛ-8 клетками опухолевого клона в дебюте хронического лимфолейкоза характеризуют активацию популяции лейкемических клеток.

4. У больных ХЛЛ с положительной экспрессией 2АР-70 и прогрессирующим вариантом течения заболевания выявлены нарушения в системе иммунитета, выражающиеся сочетанном угнетением клеточного звена, гуморальных факторов, а также дисбалансом регуляторных цитокинов (ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-4, ИЛ-6).

Практические рекомендации

1. У больных ХЛЛ целесообразно в дебюте заболевания исследовать экспрессию 2АР-70, что позволит предсказать доброкачественный или прогрессирующий вариант течения, а также позволит дифференцированно подходить ко времени начала химиоиммунотерапии.

2. У больных ХЛЛ целесообразно определять уровень растворимого и внутриклеточного ИЛ-8 для прогнозирования благоприятного и неблагоприятного течения заболевания.

3. Анализ иммунной системы у больных ХЛЛ, включающий комплексное тестирование клеточного и гуморального иммунитета, неспецифической защиты и регуляторного нейроиммунного аппарата (по содержанию и соотношению цитокинов), позволяет получить представление об иммунореактивности пациентов с различными темпами прогрессирования заболевания и экспрессией 2АР-70.

100